CN114870007A - 一种具有拟勃姆石结构的铝佐剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有拟勃姆石结构的铝佐剂的制备方法，将铝醇盐与水在55～60℃条件下反应，将反应所得到的悬浊液在8000～15000rpm的速率下高速剪切后进行均质，得到所述铝佐剂。本发明方法对醇铝水解生产拟勃姆石的方法进行了改进，过程中仅使用了水和异丙醇铝两种原料，水解后产物无需烘烤，也无需加酸溶解，最终产品即为水溶解状态的胶体溶液。同时本方法还有水热温度低，水热时间短，工艺简单的优点。作为疫苗佐剂更可贵的是，本专利生产的铝佐剂，比常规沉淀法制备的铝佐剂和市售的具有拟勃姆石特征的铝佐剂相比，在诱发同等强度体液免疫水平的基础上，能诱发更高的细胞免疫水平，同时具有更好的悬浮稳定性。

Description

一种具有拟勃姆石结构的铝佐剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种具有拟勃姆石结构的铝佐剂及其制备方法。
背景技术
从1926第一次被许可用于疫苗至今，铝佐剂已有近百年的使用历史，作为有史以来使用范围最广，接种人数最多的疫苗佐剂，它显示了良好的安全性和有效性。一般认为铝佐剂能有效的黏附抗原，进入体内后发挥储库效应(depot effect)，缓慢释放抗原从而持久刺激；同时它能让游离的抗原聚集成颗粒，提高抗原提呈细胞对抗原的摄取效率(Marrack,P.,A.S.Mckee,and M.W.Munks."Towards an understanding of the adjuvantaction of aluminium."Nature Reviews Immunology 9.4(2009):287-293.)；保护抗原不被降解而提高抗原的稳定性(Colaprico,A.,et al."Adsorption onto aluminumhydroxide adjuvant protects antigens from degradation."Vaccine 38.19(2020).)；激活NLRP3炎性复合体，caspase-1等细胞靶点，诱导细胞产生危险信号，从而促进IL-1β，IL-18等细胞因子的分泌。
然而铝佐剂也有其应用局限性：虽然能诱导较强的体液免疫，产生抗体中和病原体，但由于缺乏细胞免疫刺激效果，对进入细胞内的病原难以清除，这对一些疾病的预防(如AIDS,疟疾等)至关重要。
为了提高铝佐剂对细胞免疫的刺激效果，一种常用的方式是让铝佐剂同免疫刺激物(如TLR激动剂)联用：如50μg 3-O-去酰基-4'-单磷酰脂质A(MPLA)吸附于500μg铝佐剂上得到的佐剂AS04，用于HPV疫苗能激发交叉保护作用。公开号CN113304257A和公开号CN113521273A的专利均使用铝佐剂和CpG混合作为新冠灭活疫苗佐剂，公开号CN112220920A的专利使用铝佐剂和CpG混合作为新冠重组蛋白苗佐剂，专利号CN112138155 A公开的专利使用铝佐剂同CpG混合用于重组带状疱疹疫苗，公开号CN111920946A的专利使用铝同STING激动剂混合作为新冠重组蛋白苗佐剂。另一种弥补方法是通过降低铝佐剂的粒径，让铝佐剂能进入CD8淋巴细胞更丰富的淋巴结，从而直接刺激CD8，理论上能提高细胞免疫水平(Theodora Fifis,Anita Gamvrellis,et al.Size-dependent immunogenicity:therapeutic and protective properties of nano-vaccines against tumors.J Immunol.2004(173):3148-3154.)，公开号CN104587464A的专利公布了一种基于氢氧化铝纳米粒的疫苗载体，作为递送载体同免疫刺激物CpG结合能比传统铝佐剂同CpG结合，由于其能有效靶向淋巴结更好的刺激免疫细胞，从而诱发更强的细胞免疫效果。
常用的铝佐剂包括氢氧化铝和磷酸铝两种，制备方法相似：通过两种物质混合，形成沉淀。如氢氧化铝制备时，使用铝盐(如氯化铝，硫酸铝，硝酸铝等)同碱性溶液(如氢氧化钠，氢氧化钾，尿素等)混合，发生反应形成沉淀。通过控制过程中盐的起始浓度，反应液的pH值，搅拌速度，反应温度等制备出具有不同形态的氢氧化铝佐剂。如专利CN 108066759 A公布的方法中使用氯化钠溶液中添加硫酸铝钾滴加氢氧化钠制备；专利CN 112569350 A公布的方法类似在盐溶液中添加氯化铝，而后滴加氢氧化钠，通过控制终点溶液的pH值得到具有不同晶形结构的铝佐剂；专利CN 113559255 A通过往氨水溶液中以喷雾形式加入氯化铝溶液得到氢氧化铝佐剂。
拟勃姆石是一种铝的结晶形式，化学式AlOOH，具有无定形或不规则晶体结构，同传统的氢氧化铝佐剂相比，具有更大的比表面积，这意味着同抗原混合时可能具有更好的吸附能力。其同工业上用于制备氧化铝的前驱原料勃姆石相比，具有类似的XRD衍射图谱，但拟勃姆石的图衍射峰宽于勃姆石的衍射峰。此外二者的差别还在于拟勃姆石是结晶完整度，含水量，比表面积的区别，拟勃姆石可以看作是结晶不良的勃姆石。Croda英国公司生产的Alhydrogel铝佐剂被作为铝佐剂的金标准，其具有拟勃姆石的晶体结构。专利CN112569350 A公开了一种号称具有拟勃姆石结构的铝佐剂的生产方法，但通过对比文献报道的XRD图与该专利中的XRD图，该专利得到的并不是拟勃姆石。
勃姆石的制备方法包含电化学法(ZHANG L,CHENG B,SHI W S,et al.In-situelectrochemical synthesis of 1-dimensional alumina nanostructures[J].Mater.Chem,2005(15):4889-4893.)，气相沉淀法(PROOST J,Van BOXEL S.Large-scalesynthesis of high purity,one-dimensionalα-Al2O3 structures[J].Mater Chem,2004(14):3058-3062.)，微乳法(GHOSH S,NASKAR M K.Synthesis of mesoporousγ-aluminananorods using a double surfactant system by reverse microemulsion process[J].RSC Advances,2013(3):4207-4211.)，水热法(VITORINO N,KOVALEVSKY A V,ABRANTES J C C,et al.Hydrothermal synthesis of boehmite in cellular aluminamonoliths for catalytic and separation applications[J].Journal of theEuropean Ceramic Society,2015(35):3119-3125.)等，通过使用不同方法能制备得到具有不同形态(如粒状，纤维状，片状，空心球状)的勃姆石，其中水热法具有反应条件容易控制，晶体形态易调节等特点被广泛使用。但水热法往往需要较长的水热处理时间，如使用AlCl3为原料，乙二醇为溶剂，需要在200℃下处理6小时(Ma,M.G.,and J.F.Zhu."A facilesolvothermal route to synthesis ofγ-alumina with bundle-like and flower-likemorphologies."Materials Letters 63.11(2009):881-883.)才能具有拟勃姆石结晶形态。使用通常的方法对醇铝水解，而后烘干得到勃姆石，可以作为铝佐剂的原料使用。但这种颗粒在水中无法形成溶胶，为了促进其溶解必须要加入强酸溶液，作为疫苗佐剂使用存在一定隐患。同时，现有技术中的方法利用醇铝水解制备铝佐剂时往往需要使用较高的温度处理超长的时间(Masood,H.,.,J.L.White,and S.L.Hem."Relationship betweenprotein adsorptive capacity and the X-ray diffraction pattern of aluminiumhydroxide adjuvants."Vaccine 12.2(1994):187-189.)，这给制备带来了困难。因此，急需要寻找一种新的铝佐剂的制备方法来解决上述问题。
发明内容
本发明的一个方面，是针对现有技术中利用醇铝水解制备铝佐剂的方法中，需要长时间的高温水热处理，以及需要加酸才能形成最终产品的缺陷，提供了一种新的具有拟勃姆石结构的铝佐剂及其制备方法。
本发明提供的技术方案为：
一种具有拟勃姆石结构的铝佐剂的制备方法，将铝醇盐与水在55～65℃条件下反应，将反应所得到的悬浊液在8000～15000rpm的速率下高速剪切后进行均质，得到所述铝佐剂。
在本发明中，所述铝醇盐的化学式为Al(OR)n，其与水完全作用时，水解形成氧化物和/或氧化物水和沉淀。作为优选，在本发明的一个实施方式中，n＝3，R＝C3H7，上述铝醇盐为异丙醇铝，其化学式为Al(C3H7O)3。
在本发明的某些实施方式中，铝醇盐与水的反应温度可以为55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃，作为优选，在本发明的一个实施方式中，上述反应的温度为60℃，上述反应的时间为3～5小时。
在本发明的一个实施方式中，上述反应是在铝醇盐中缓慢加入水，并且在缓慢搅拌下进行反应的，这样能够使反应所产生的气体快速挥发。在工业生产中，也可以使用带有搅拌排气装置的反应釜进行。
在本发明中，上述反应完成后生成水溶状态的胶体溶液，无需再额外进行加酸、水热等处理，即可直接用于佐剂的制备。
在本发明的某些实施方式中，在所述铝醇盐与水的反应完成后，还可以包括对反应得到的悬浊液进行洗涤的步骤。具体可以为，例如：
搅拌3～5小时，停止搅拌。放置澄清，至白色不可溶物完全沉淀，倒去上层液体；再次注入500ml注射用水，重悬后继续自然放置，至白色不可溶物完全沉淀，澄清，倒去上层液体，重复2遍。而后注入1000ml注射用水重悬。
作为优选，在本发明的某些实施方式中，上述高速剪切的时间为10～15分钟。更优选地，在本发明的一个实施方式中，上述高速剪切的时间为10分钟。上述高速剪切可以在高速剪切乳化机中进行。
作为优选，在本发明的某些实施方式中，上述铝醇盐与水的质量比为1:10～20。例如，1:10、1:11:、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20，作为优选，在本发明的一个实施方式中，上述铝醇盐与水的质量比为1:10。
在本发明的某些实施方式中，上述均质的方法可以为高压均质、液力超细化均质、超场波均质或剪切均质。作为优选，在本发明的某些实施方式中，上述均质的方法为高压均质，所述高压均质的压力为500bar～2000bar。上述均质可以在均质设备中进行，例如，高压均质机。
为了去除产物中的细菌，在本发明的某些实施方式中，上述步骤结束后，还可以包括对产物的灭菌过程，例如，对产物120℃高温灭菌30分钟。
本发明的另一个方面，是提供了一种铝佐剂，所述铝佐剂由上述的制备方法制得。
作为优选，在本发明的某些实施方式中，所述铝佐剂的粉末X射线衍射的衍射角2θ在14.14度附近具有特征峰，所述铝佐剂的粒径为426.0±34.08nm，所述铝佐剂的zeta电位为35.6±1.41mV。
作为优选，在本发明的一个实施方式中，上述铝佐剂的溶剂为水。
本发明的另一个方面，是提供了一种疫苗，所述疫苗包含上述的铝佐剂。
作为优选，在本发明的一个实施方式中，上述疫苗的抗原为乙肝表面抗原。
本发明的有益效果为：
1)本发明铝佐剂的制备方法中仅使用了水和异丙醇铝两种原料，无需烘烤，也无需加酸溶解，最终产品即为水溶解状态的胶体溶液，同时本发明方法还有反应温度低，时间短，工艺简单的优点。
2)本发明中的铝佐剂具有比单纯沉淀法制备的铝佐剂更快的蛋白吸附速度和更高的蛋白吸附量。
3)本发明中的铝佐剂作为疫苗佐剂比常规沉淀法制备的铝佐剂和市售的具有拟勃姆石特征的铝佐剂相比，在诱发同等强度体液免疫水平的基础上，能诱发更高的细胞免疫水平。
4)铝佐剂在配苗过程中若不易分散或悬浮稳定性较差，需要重新均质，分装过程中若沉降过快，也容易影响产品的均一性；而本发明中的铝佐剂本由于具有极佳的悬浮稳定性，易于分散，结构蓬松，保证了其在疫苗生产应用过程中得到均一性更好的产品。
附图说明
图1为本发明实施例1与对比例1和2中制备的铝佐剂放置24小时的状态比较图，其中，左上为对比例1放置0小时的状态，右上为实施例1放置0小时的状态，左下为对比例1放置24小时的状态，右下为实施例1放置24小时的状态；
图2为本发明实施例1中制备的铝佐剂的XRD结果图；
图3为本发明对比例1和2中制备的铝佐剂的XRD结果图，其中，A为对比例1中制备的铝佐剂的XRD结果图，B为对比例2中制备的铝佐剂的XRD结果图；
图4为本发明对比例3制备的以及其他两种市售铝佐剂的XRD结果图，其中，A为对比例3中制备的铝佐剂的XRD结果图，B为Alhydrogel铝佐剂的XRD结果图，C为SERVA铝佐剂的XRD结果图；
图5为本发明实施例中制备的铝佐剂的扫描电镜图；
图6为本发明实施例1和对比例3中制备的以及其他两种市售铝佐剂对蛋白的吸附效果比较结果图，其中，A为绿色荧光蛋白clover的结果图，B为红色荧光蛋白mRuby的结果图；
图7为本发明实施例1和对比例3中制备的以及其他两种市售铝佐剂对蛋白的吸附速率曲线图；
图8为本发明实施例1和对比例3中制备的以及其他两种市售铝佐剂的沉降试验比较结果图，其中，上排为放置0分钟的状态，下排为放置120分钟的状态，试管从左至右依次为实施例1中制备的(Hydrolysis)、Alhydrogel、Serva、对比例3中制备的铝佐剂(precipitation)；
图9为本发明实施例1和对比例3中制备的以及其他两种市售铝佐剂的悬浮稳定指数结果图；
图10为本发明实施例1和对比例3中制备的以及其他两种市售铝佐剂吸附HBsAg免疫后抗体滴度，其中，A为免疫2剂后的抗体滴度结果图，B为免疫3剂后的抗体滴度结果图；
图11为本发明实施例1和对比例3中制备的以及其他两种市售铝佐剂吸附HBsAg免疫后抗原特异性IFN-γ分泌细胞数的结果图；
图12为对比例3和本发明实施例1中制备的铝佐剂(不同剂量)吸附相同量HBsAg免疫后抗原特异性IFN-γ分泌细胞数的结果图。
具体实施方式
本发明公开了一种具有拟勃姆石结构的铝佐剂及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。需要特别指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明，并且相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围的基础上对本文所述内容进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。术语“如”、“例如”等旨在指示例性实施方案，而不意图限制本公开的范围。
下面就本发明中出现的部分术语作以解释。
术语“佐剂”，又称免疫佐剂，是指所有和抗原一起注射或预先注射，能增加机体对抗原的免疫应答或改变应答类型的一类物质。免疫佐剂的作用包括：①能使弱抗原物质增强抗原性；②增加特异性循环抗体水平，或产生有效的保护性免疫；③改变所产生的循环抗体类型；④增强细胞介导的超敏反应能力；⑤保护抗原(特别是DNA、RNA)不受体内酶的分解。佐剂对某些分子量小的多糖或多肽抗原性微弱的物质，尤能增强其产生特异性反应的作用。
术语“铝佐剂”，是目前应用最广的一种免疫佐剂，主要有氢氧化铝和磷酸铝两种,其中氢氧化铝的使用更广泛。目前认为,铝佐剂的疫苗佐剂效应机制主要有"储存库效应"和"免疫刺激效应"两种。常规的铝佐剂虽然可以增强体液免疫应答,但往往难以有效地诱导机体细胞免疫应答。此外,铝佐剂还可诱导Ig E介导的Ⅰ型超敏反应。
术语“拟勃姆石结构”，是水合氧化铝的一种结晶形式，结晶不完整，但结构蓬松，比表面积大。
术语“均质”，是指将液态物料中的固体颗粒打碎，使固体颗粒实现超细化，并形成均匀的悬浮乳化液的工艺过程。高压均质技术是物料在高压状态下，使物料发生物理、化学、结构性质等一系列变化，最终达到均质的效果。
术语“异丙醇铝”，是铝的异丙醇盐，分子式一般写作Al(O-i-Pr)3，其中i-Pr代表异丙基(—CH(CH3)2)。异丙醇铝为无色固体，是有机合成中很重要的试剂。其结构非常复杂，与溶剂等因素都有很大关系。
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：铝佐剂的制备
步骤1)称量50g异丙醇铝，加入干烤过的玻璃烧杯，缓慢注入500ml注射用水，缓慢搅拌，加热至60℃加速异丙醇铝水解产生的异丙醇挥发，继续缓慢搅拌。
步骤2)淘洗：搅拌3～5小时，停止搅拌。放置澄清，至白色不可溶物完全沉淀，倒去上层液体；再次注入500ml注射用水，重悬后继续自然放置，至白色不可溶物完全沉淀，澄清，倒去上层液体，重复2遍。而后注入1000ml注射用水重悬。
步骤3)均质：10000rpm高速剪切10min,而后高压均质。
步骤4)灭菌：120℃高温灭菌30min。
实施例2：铝佐剂的制备
步骤1)称量50g异丙醇铝，加入干烤过的玻璃烧杯，缓慢注入1000ml注射用水，缓慢搅拌，加热至55℃加速异丙醇铝水解产生的异丙醇挥发，继续缓慢搅拌。
步骤2)淘洗：搅拌3～5小时，停止搅拌。放置澄清，至白色不可溶物完全沉淀，倒去上层液体；再次注入500ml注射用水，重悬后继续自然放置，至白色不可溶物完全沉淀，澄清，倒去上层液体，重复2遍。而后注入1000ml注射用水重悬。
步骤3)均质：15000rpm高速剪切15min,而后高压均质。
步骤4)灭菌：120℃高温灭菌30min。
实施例3：铝佐剂的制备
步骤1)称量50g异丙醇铝，加入干烤过的玻璃烧杯，缓慢注入500ml注射用水，缓慢搅拌，加热至60℃加速异丙醇铝水解产生的异丙醇挥发，继续缓慢搅拌。
步骤2)淘洗：搅拌3～5小时，停止搅拌。放置澄清，至白色不可溶物完全沉淀，倒去上层液体；再次注入500ml注射用水，重悬后继续自然放置，至白色不可溶物完全沉淀，澄清，倒去上层液体，重复2遍。而后注入1000ml注射用水重悬。
步骤3)均质：8000rpm高速剪切15min,而后高压均质。
步骤4)灭菌：120℃高温灭菌30min。
对比例1：铝佐剂的制备
利用与实施例1中相同的方法制备铝佐剂，除了不包含步骤2)淘洗和步骤3)均质步骤。
对比例2：铝佐剂的制备
利用与实施例1中相同的方法制备铝佐剂，除了不包含步骤3)均质步骤。
观察实施例1、对比例1，对比例2得到的最终产物，如图1所示，可以发现：对比例1和对比例2所得产物类似，均为混浊液，放置后可以观察到颗粒快速下沉，而实施例1得到的产物为半透明的胶状液体，不加稀释，长时间放置未见有明显沉降。
同时对三者进行X射线衍射(XRD)分析，如图2、3所示，各产物均呈现拟勃姆石特征的衍射峰。对比(020)衍射峰位置2θ(020)可见，对比例1的中间产物为13.54°，对比例2产物的为13.86°，实施例1产物为14.14°。三者(020)衍射峰逐渐增强(对比例1：204，对比例2：226；实施例1：270)，通过对比可见实施例1得到的产物具有最好的结晶度。同常规的勃姆石制备时需要较高水热温度和超常水热时间相比，高压均质后只要采用常规的灭菌(120℃，30min)即可得到具有很好胶体状态的拟勃姆石铝佐剂。
对比例3：传统沉淀法制备铝佐剂
铝离子含量为0.25M的氯化铝(AlCl3)溶液200ml，加入干烤过的玻璃烧杯中搅拌。使用蠕动泵缓慢滴加0.25M浓度的氢氧化钠溶液，同时监测pH，当pH至5左右同时开始滴加铝盐溶液，调节两种溶液滴加速度，使pH恒定于5左右，继续滴加1小时。离心后沉淀使用0.3％氯化钠溶液洗涤2次，而后重新使用0.3％氯化钠溶液溶解。使用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)仪进行铝含量测定后，使用0.3％氯化钠溶液稀释至铝含量为0.5mg/ml。
实验例1：粒径与zeta电位检测
使用实施例1中的方法制备铝佐剂(记作Hydrolysis)。而后使用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)仪进行铝含量测定。水稀释至铝含量为0.5mg/ml，使用马尔文ZetasizerNano ZS90激光粒度分析仪测定粒径和zeta电位。同时分析两种市售铝佐剂(记作Alhydrogel和SERVA)和对比例3中传统沉淀法制备的铝佐剂(记作Precipitation)。结果如表1所示。
表1各种铝佐剂电位值、电导率和粒径值
铝佐剂 zeta potential(mV) con(mS/cm) size(nm) PdI
Alhydrogel 10.6±0.354 0.0185±0.00318 1260±77.07 0.058±0.080
SERVA 12.6±0.283 0.0304±0 1592±32.53 0.065±0.011
precipitation 10.1±0.233 4.81±0.870 12980±289.9 0.395±0.006
Hydrolysis 35.6±1.41 0.0017±0 426.0±34.08 0.489±0.056
分析结果可见，实施例1制备的铝佐剂具有较小的粒径，zeta电位大于另外3种铝佐剂。同时由于佐剂使用的溶液只是水，实施例1中得到的铝佐剂同Alhydrogel和SERVA铝佐剂一样，电导率极低，由于其溶液只是水，同缓冲液不同的抗原混合时对抗原的影响较小。
实验例2：XRD测定
取适量铝佐剂溶液(铝总含量约200mg)于50ml离心管中，10000g高速离心20min，弃上层溶液，而后用去离子水悬起。再次离心，弃上层溶液，加水悬起，离心，重复洗涤数次。沉淀倒出，自然晾干，检测时磨成细粉，铺展至基底样品台，确保进样测试平整，无翘起后使用X射线衍射仪(岛津，型号XRD-6100)进行扫描测试：Cu靶，电压40kV,电流30mA，扫描角度5-80°。
结果如图2、4所示，结果可见，同传统沉淀法制备的铝佐剂不同，实施例1中制备的铝佐剂具有同Alhydrogel，SERVA铝佐剂相似的XRD光谱特征，显示具有相似的拟勃姆石晶体结构。而只使用沉淀法未水热处理的铝佐剂(Precipitation)不具有这种特征。
实验例3：电镜检测
将实施例1中制备的铝佐剂样品摇晃均匀后，取1mL原液加入去离子水定容到4mL，用吸管滴加稀释后的样品在铝箔纸上，自然晾干。最后，将样品喷金，使用蔡司SIGMA 500扫描电镜观察。结果如图5所示，结果显示，实施例1中得到的铝佐剂电镜下粒径较小，形态为条形。
实验例4：铝佐剂对蛋白的吸附
1)吸附能力测试
为了便于观察铝对蛋白的吸附，使用荧光蛋白进行测试，本实验例选择了两种荧光蛋白：绿色荧光蛋白clover和红色荧光蛋白mRuby。过程如下，取5ml0.1mg/ml实施例1和对比例3中制备的铝佐剂、Alhydrogel铝佐剂和SERVA铝佐剂，分别加5ml 0.4mg/ml蛋白(clover或mRuby荧光蛋白)混合均匀，于不同时间点取样500μl,12000rpm离心5min，取200μl上清，测上清蛋白含量。蛋白吸附量为总蛋白量减去游离量。同时计算吸附平衡后吸附量的平均值，记为铝佐剂的蛋白吸附量。
结果如图6、表2所示。分析实验数据可见，混合后铝佐剂迅速吸附蛋白，短时间内即可到达平衡点。实施例1中制备的铝佐剂对clover蛋白的吸附能力同Alhydrogel，SERVA相当，高于传统方法制备的铝佐剂。对mRuby的吸附能力好于对照铝佐剂。
表2各铝佐剂对荧光蛋白(clover,mRuby)的吸附能力
Figure BDA0003589999050000101
2)吸附曲线绘制
取0.5ml 0.1mg/ml铝佐剂(实施例1和对比例3中制备的铝佐剂、Alhydrogel铝佐剂和SERVA铝佐剂)分别加0.5ml 0.4mg/ml蛋白(clover or mRuby荧光蛋白)混合均匀，于不同时间点使用200nm孔径滤芯过滤100μl，测滤液中未吸附蛋白浓度，总蛋白减未吸附的蛋白，为已吸附蛋白。实验中发现mRuby蛋白会发生聚合，过滤发生明显损失，故只绘制铝佐剂对clover蛋白的吸附速率曲线。
结果如图7所示，从图中可见不同铝佐剂对蛋白的吸附均十分迅速(2min即可达到平衡)，曲线斜率代表吸附速率，实施例1中制备的铝佐剂对蛋白的吸附速率远大于传统沉淀法比例3中制备的铝佐剂。
综合以上结果可见，具有拟勃姆石特征的铝佐剂对蛋白的吸附能力和吸附速度均大于不具有这种特征的铝佐剂。
实验例5：悬浮稳定性测试
取0.5mg/ml的各种铝佐剂(实施例1和对比例3中制备的铝佐剂、Alhydrogel铝佐剂和SERVA铝佐剂)各4ml于15ml离心管种，分别加入1.5mg绿色荧光蛋白(clover),补齐体积至5ml，混合均匀，而后竖直放置，让其自然沉降。铝佐剂吸附绿色荧光蛋白后能清晰的看到铝佐剂的沉降，观察记录，把佐剂沉降后体积/总体积记为悬浮稳定指数。结果如表3、图8、图9所示。
如结果所示，铝佐剂在配苗过程中若不易分散或悬浮稳定性较差，需要重新均质，分装过程中若沉降过快，也容易影响产品的均一性。而实施例1中制备的铝佐剂由于具有极佳的悬浮稳定性，易于分散，结构蓬松，保证了其在疫苗生产应用过程中得到均一性更好的产品。
表3：不同时间点各铝佐剂的悬浮稳定指数
Figure BDA0003589999050000111
实验例6：佐剂作用评价
为了评价实施例1中制备的铝佐剂的佐剂效果，使用同市售铝佐剂(Alhydrogel铝佐剂和SERVA铝佐剂)和传统方法(对比例3)制备的铝佐剂作为对照，所有使用的铝佐剂均通过了鲎试剂的内毒素检测，内毒素含量≤1EU/ml。
取鼠龄在6～8周的Babl/c小鼠25只，随机分成5组，分组如表4所示。
表4免疫分组
Figure BDA0003589999050000121
分别于0周，2周，4周进行三次肌肉注射免疫。第3周，5周采血，分离血清后使用酶联免疫吸附法(ELISA)测抗体滴度；同时第5周取小鼠脾，分离淋巴细胞，使用酶联免疫斑点法(ELISPOT)测抗原特异性细胞因子分泌。结果如图10、图11所示。
结果表明，免疫2针，3个不同批次的实施例1中制备的铝佐剂均能诱发较强的体液免疫，优于另外几种铝佐剂。第三针加强免疫后，各组抗体滴度差异变小。同时可见，具有拟勃姆石晶体结构，并不一定意味着更好的免疫水平，搭配乙肝表面抗原，传统沉淀未水热处理得到的佐剂能诱发比具有拟勃姆石结构特征的两种市售铝佐剂更强的体液免疫水平。
并且令人惊喜的是，实施例1中制备的铝佐剂能诱发比其余几种铝佐剂更强的细胞免疫水平。
为了进一步测试实施例1中制备的铝佐剂对细胞免疫刺激效果的佐剂使用量的关系，设置3个梯度的实施例1中制备的铝佐剂，使用传统沉淀法(对比例3)制备的铝佐剂作为对照，乙肝表面抗原作为模型抗原进行免疫效果评价，所有使用的铝佐剂均通过了鲎试剂的内毒素检测。
取鼠龄在6～8周的Babl/c小鼠25只，随机分成5组,按表5进行分组。
表5免疫分组
Figure BDA0003589999050000122
分别于0周，2周，4周进行三次肌肉注射免疫。第5周取小鼠脾，分离淋巴细胞,使用酶联免疫斑点法(ELISPOT)测抗原特异性细胞因子分泌。结果如图12所示。
结果可见，使用实施例1中的方法制备的铝佐剂诱发的细胞免疫水平远高于传统沉淀法(对比例3)制备的铝佐剂，即使在佐剂用量仅为后者1/25的条件下也依然如此。且这种对细胞免疫的刺激效果同铝佐剂用量呈现一定剂量相关性。
综合以上数据，例如实施例1或2或3中制备的具有拟勃姆石结构的铝佐剂同其余具有类似结构的铝佐剂相同，具有极好的抗原吸附能力。同时同不具有该特征的铝佐剂相似，能引发很强的体液免疫。数据证明拟勃姆石类铝佐剂的优势更多体现在对蛋白的吸附性上，而传统制备这类佐剂往往需要较高的水热温度和超长的水热时间，本发明的方法对此进行了改进，具有制备条件简单，时间短的优势。
同时作为使用历史最悠久，应用最广泛的佐剂类型，铝佐剂拥有公认的良好安全性和体液免疫诱导效果，但缺乏细胞免疫诱导效果一直是其短板。本专利得到的铝佐剂，除了能诱发较强体液免疫外，特别需要指出的是，这种铝佐剂在不添加任何额外免疫刺激物的情况下，单纯的铝佐剂也能引发很好的细胞免疫水平，这对于提高疫苗的保护效果极具意义。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种具有拟勃姆石结构的铝佐剂的制备方法，其特征在于，将铝醇盐与水在55～60℃条件下反应，将反应所得到的悬浊液在8000～15000rpm的速率下高速剪切后进行均质，得到所述铝佐剂。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述铝醇盐为异丙醇铝。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述反应的温度为60℃，所述反应的时间为3～5小时。
4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，在所述铝醇盐与水的反应完成后，还包括对反应得到的悬浊液进行洗涤的步骤。
5.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述高速剪切的时间为10～15分钟。
6.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述铝醇盐与水的质量比为1:10。
7.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述均质的方法为高压均质，所述高压均质的压力为500bar～2000bar。
8.一种铝佐剂，其特征在于，所述铝佐剂由如权利要求1～8任意一项中所述的制备方法制得。
9.根据权利要求8所述的铝佐剂，其特征在于，所述铝佐剂的粉末X射线衍射的衍射角2θ在14.14度附近具有特征峰，所述铝佐剂的粒径为426.0±34.08nm，所述铝佐剂的zeta电位为35.6±1.41mV。
10.一种疫苗，其特征在于，所述疫苗包含如权利要求8或9所述的铝佐剂；
优选地，所述疫苗的抗原为乙肝表面抗原。
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