CN114869931A - 鼠尾草花提取物的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了鼠尾草花提取物的应用，涉及中医药领域。本发明要求保护鼠尾草花提取物在制备变异链球菌的抑制剂、预防和/或治疗龋病的药物或改善龋病的口腔护理用品中的应用。本发明的实验表明鼠尾草花提取物具有变异链球菌抑制活性，可以抑制浮游状态变异链球菌的生长，抑制变异链球菌生物膜状态的形成，抑制变异链球菌胞内乳酸脱氢酶活性，以及抑制变异链球菌在体外的产酸。因此鼠尾草花提取物可用于制备变异链球菌抑制剂，以及制备预防和/或治疗龋病的药物和改善龋病的口腔护理用品。

Description

鼠尾草花提取物的应用
技术领域
本发明涉及中医药领域，特别是涉及鼠尾草花提取物的应用。
背景技术
龋病(dental caries)是口腔中最常见的与生物膜相关的人类传染病。是一种在细菌感染等多因素作用下导致牙体硬组织进行性破坏的疾病，如果没有及时治疗，可引发牙髓炎、根尖周炎甚至颌骨炎症等并发症。它是由很多因素之间的长期接触引起的，其中的影响因素之一牙菌斑，就是典型的细菌生物膜，由包裹在细胞外的多糖(EPS)、蛋白质和DNA中的表面附着细菌群落组成。牙齿表面的这些生物膜群落通常比它们的浮游生物对抗生素以及免疫性药物更耐受。变异链球菌(streptococcus mutans)是龋齿最重要的致病菌，定植于牙齿表面，导致牙齿结构脱钙，是牙菌斑生物膜的重要组成部分。变异链球菌代谢生物膜中的一些糖类并产生多种酸，这会进一步降低环境的pH值并导致牙釉质脱矿。而且变异链球菌是生物膜中发现的产酸最多的微生物之一，因为它可以从除任何口腔链球菌之外的发酵碳水化合物中产生酸。目前使用的化学抗生物膜剂，例如季铵盐、碘化合物和氟化物，会导致各种副作用。此外，抗菌药物的过量和长期给药会导致抗菌素耐药性，因此，在口腔领域中有很多天然药物作为新型抗菌药物的来源。
鼠尾草花(Salvia deserta Schang)为唇形科(Labiatae)鼠尾草属(Salvia)植物，一般称为新疆鼠尾草，拉丁学名为沙漠鼠尾草，系多年生植物，主产于中国新疆北部，生于田野荒地，沟边，沙滩草地及林下，海拔270-1850米。鼠尾草花的化学成分类型主要为多酚类，二萜类、三萜类、和甾体化合物等。主要化学成分有迷迭香酸，咖啡酸，熊果酸，齐墩果酸，丹参素，原儿茶醛，原儿茶酸，丹酚酸K等。新疆鼠尾草主要功效为活血止血，寒热下痢，脓血不止，跌打损伤，风湿骨痛等。迄今为止还未发现鼠尾草花关于变异链球菌的报道。
发明内容
本发明的目的是提供鼠尾草花提取物的应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明表明鼠尾草花提取物对变异链球菌表现出明显的抑制作用。。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供鼠尾草花提取物在制备变异链球菌的抑制剂中的应用。
本发明还提供一种变异链球菌的抑制剂，所述抑制剂的活性成分为鼠尾草花提取物。
进一步地，所述抑制剂还包括药学上可接受的辅料。
本发明还提供鼠尾草花提取物在制备预防和/或治疗龋病的药物中的应用。
本发明还提供一种预防和/或治疗龋病的药物，所述药物的活性成分为鼠尾草花提取物。
进一步地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
进一步地，所述药物的剂型为片剂、散剂、含潄剂、喷雾剂或凝胶剂。
本发明还提供鼠尾草花提取物在制备改善龋病的口腔护理用品中的应用。
进一步地，所述口腔护理用品为牙膏、口香糖或漱口水。
本发明还提供一种改善龋病的口腔护理用品，包括活性成分鼠尾草花提取物和口腔护理用品上可接受的辅料。
本发明的鼠尾草花提取物在变异链球菌引起的龋病方面的应用，可以将鼠尾草花提取物制成不同剂型的药物使用。具体来说，可以将鼠尾草花提取物制成包括片剂、散剂、含潄剂、喷雾剂、凝胶剂等剂型。具体的药物可包括鼠尾草花提取物和其它药学上可接受的载体，对于药物中各成分的用量可以按照药物制剂中对于成分的配比要求进行调整即可，对于鼠尾草花提取物的有效含量也可以按照不同剂型等常规的剂型要求添加，本发明并不作具体的限定。
本发明的鼠尾草花提取物在变异链球菌引起的龋病方面的应用，可以将鼠尾草花提取物直接或间接加入制备不同口腔护理用品时所需的口腔护理用品中可接受的各种常用辅料，以常规制剂方法，制成常用口腔护理用品。该口腔护理用品包括但不限于牙膏、口香糖以及漱口水。
本发明公开了以下技术效果：
本发明提供了鼠尾草花提取物的新应用，尤其是鼠尾草花提取物在制备变异链球菌抑制剂中的应用。实验表明鼠尾草花提取物具有变异链球菌抑制活性，可以抑制浮游状态变异链球菌的生长，抑制变异链球菌生物膜状态的形成，抑制变异链球菌胞内乳酸脱氢酶活性，以及抑制变异链球菌在体外的产酸。因此鼠尾草花提取物可用于制备变异链球菌抑制剂，以及制备预防和/或治疗龋病的药物和改善龋病的口腔护理用品，具有较高的应用价值和开发前景。而且鼠尾草花提取物是天然药物，可避免传统抗生素类、氟化物等产品对人体造成的副作用以及细菌耐药性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为50mg/mL(A)和25mg/mL(B)的鼠尾草花提取物对变异链球菌药敏示意图，A中，Y为阳性对照，K为阴性对照，S1-S3均为50mg/mL的鼠尾草花提取物；B中，Y为阳性对照，K为阴性对照，S4-S6均为25mg/mL的鼠尾草花提取物；
图2为鼠尾草花提取物对变异链球菌的生长曲线影响示意图；
图3为通过结晶紫实验验证的鼠尾草花提取物对变异链球菌生物膜存活率影响示意图；
图4为通过MTT实验验证的鼠尾草花提取物对变异链球菌生物膜存活率影响示意图；
图5为鼠尾草花提取物对变异链球菌胞内乳酸脱氢酶活性影响示意图；
图6为鼠尾草花提取物对变异链球菌体外产酸影响示意图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
实验所用材料和试剂：BHI平板/液体培养基(北京索莱宝科技有限公司)；复方氯己定含漱液(江苏晨牌邦德药业有限公司)；MTT(德国Biofroxx公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(白鲨生物科技有限公司)；乳酸脱氢酶比色法测试盒(武汉伊莱瑞特生物科技有限公司)；培养箱(311二氧化碳培养箱，美国Thermo公司)；酶标仪(SMP500，德国Spectro Max公司)；pH计(pHS-3C，上海精密科学仪器有限公司雷磁仪器厂)。
实施例1鼠尾草花提取物的制备
取干燥后粉碎的鼠尾草花，按照料液质量比1：25，加入体积分数为40％的乙醇溶液，超声提取1h后过滤，将滤液冷冻干燥后，得到提取物，备用。
本发明所用鼠尾草花提取物均为本实施例制备得到的鼠尾草花提取物。需要说明的是，本实施例仅是示例性提供一种鼠尾草花提取物的制备方法，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下通过现有技术获得的所有鼠尾草花的提取物均能实现本发明。
实施例2变异链球菌菌悬液的制备
取常规复苏的变异链球菌磁珠冻存管(ATCC 700610，购买于中国普通微生物菌种保藏中心)标准菌株接种于BHI液体培养基中，于37℃恒温培养箱中培养24h后，在BHI平板上划线培养24h，挑取单菌落在2mLBHI液体培养基中37℃恒温培养箱中纯培养，24h后对菌液进行倍比稀释，并涂布于平板上，培养后计数以确定菌液浓度，将其稀释至浓度为1～5×106CFU/mL的变异链球菌菌悬液，备用。
实施例3鼠尾草花提取物药敏试验
将鼠尾草花提取物用双蒸水溶解后制成终浓度为50mg/mL的母液；取母液稀释，分别得到浓度为25mg/mL和12.5mg/mL的药液。取100μL实施例2制备得到的菌悬液，均匀涂布在BHI平板中，打孔器打孔；设置多组试验，每孔内添加40μL药液，试验组药液分别为不同浓度(50、25、12.5mg/mL)的鼠尾草花提取物，阴性对照组药液为双蒸水，阳性对照组药液为复方氯己定含漱液。BHI平板放入37℃恒温培养箱中培养24h，以十字交叉法测定抑菌圈直径，每个浓度平行3个孔，求其平均值。培养结果发现不同浓度鼠尾草花提取物对变异链球菌均产生了抑菌圈，且随着提取物浓度的增大，抑菌圈直径增大，结果见表1和图1。
表1本发明鼠尾草花提取物对变异链球菌的影响
Figure BDA0003634286330000051
由表1可以看出，鼠尾草花提取物的浓度在12.5～50mg/mL时对浮游状态下的变异链球菌具有生长抑制作用，随着药物浓度增加作用越明显。
实施例4最小抑菌浓度(MIC)及最低杀菌浓度(MBC)测定试验
采用液体倍比稀释法，将鼠尾草花提取物用BHI液体培养基分别稀释为不同浓度梯度的样品溶液。将100μL实施例2制备的菌悬液(1～5×106CFU/mL)和不同浓度的鼠尾草花提取物溶液以1:1的比例加入96孔板中混合均匀，每个浓度3个复孔，阴性对照组为含有双蒸水的BHI菌悬液，阳性对照组为含有复方氯己定含漱液的BHI菌悬液，37℃，5％CO2培养24h后，肉眼观察无细菌生长的孔对应的药物浓度为MIC，根据MIC值测定结果，选择药液浓度大于等于MIC值的各孔分别划线于BHI平板上，37℃恒温培养24h，肉眼观察无可见菌落形成的最低浓度为最低杀菌浓度(MBC)。结果发现，鼠尾草花提取物对变异链球菌的最小抑菌浓度为14mg/mL，最低杀菌浓度为15mg/mL。可见，鼠尾草花提取物对变异链球菌具有很好的抑菌及杀菌效果。
实施例5对变异链球菌生长曲线测定试验
在96孔细胞培养板每孔中均加入100μL实施例2制备得到的菌悬液，之后再分别加入100μL的MIC(最小抑菌浓度)、1/2MIC、1/4MIC和1/8MIC浓度的鼠尾草花提取物，放入37℃恒温培养箱中培养，酶标仪波长600nm下分别测定培养0、2、4、6、8、12、24、36h后的OD值，以未加鼠尾草花提取物的孔为对照组，为避免药液本身颜色的影响，取不同时段OD600的差值，实验重复3次，计算ΔOD600均值，绘制细菌的生长曲线图。生长曲线如图2所示，相对于对照组，培养6小时以后不同浓度鼠尾草花提取物均对变异链球菌的生长具有显著抑制作用。
实施例6对变异链球菌生物膜生长活性影响试验
采用结晶紫染色法和MTT比色法检测对变异链球菌细菌生物膜生长活性的影响。在96孔细胞培养板每孔中加入100μL的菌悬液和相同体积的药液(浓度为4MIC、2MIC、MIC、1/2MIC或1/4MIC)，每个浓度重复3个孔，含有双蒸水的菌悬液作为对照，然后置于培养箱中37℃恒温培养24h后取出96孔板，对于结晶紫实验，去除96孔中的培养基，用PBS润洗2次后干燥，每孔分别加入200μL 0.1％的结晶紫染色液对形成的生物膜染色15min。多余未结合的结晶紫染色液用无菌PBS缓冲液冲洗去除，待干燥后各孔分别加入200μL 95％乙醇溶液，以洗脱与生物膜结合的结晶紫，静置后于酶标仪分别检测600nm处各孔的OD值；对于MTT实验，去除孔中的培养基，用PBS润洗2次后向孔中加入100μL，5mg/mL的MTT染液。37℃避光染色3h，小心吸除上清液后，在室温加入200μLDMSO溶解染液10min后在590nm下测定OD值。按照以下方式计算抑制率。
抑制率计算公式为：抑制率＝(1-OD实验组/OD对照组)*100％；
生物膜存活率＝100％-抑制率。
试验结果如图3和图4所示，无论是结晶紫实验还是MTT比色法，实验组与对照组相比，鼠尾草花提取物对生物膜的抑制作用显著(*P<0.05)，且随着提取物浓度的升高，生物膜的存活率降低。可见，鼠尾草花提取物对变异链球菌生物膜的生长存在明显抑制作用。
实施例7对乳酸脱氢酶(LDH)活性的影响的试验
将4mL实施例2制备的菌悬液分别与用实施例1制备的提取物加双蒸水配制成的系列药液(MIC、1/2MIC、1/4MIC和1/8MIC)按1:1(v/v)混合，以不含药液的菌悬液作为对照组，每个浓度重复三次，培养24h。取出后3000r/min，离心5min后吸弃上清液，收集菌体沉淀，用PBS轻柔洗涤两次后向其中加入1mL含5mg/mL的溶菌酶的TE缓冲液，振荡器振动混合均匀后放置在培养箱37℃孵育1h后，3000r/min离心10min后，收集上清液放在4℃备用。
使用BCA法测定细菌的蛋白质，测定流程按照试剂盒说明操作，操作表如表2所示，以牛血清白蛋白(BSA)含量为横坐标，以A562为纵坐标，绘制标准曲线，计算样品中的蛋白质浓度。
表2 BCA法测定变异链球菌蛋白质操作表
Figure BDA0003634286330000071
采用乳酸脱氢酶比色法测试盒测定LDH活性，试剂盒具体测定步骤按照表3所示。LDH活力(U/gprot)＝(ΔA450-b)×f×1000*/(a×Cpr)，定义为每克组织蛋白37℃与基质作用15min，在反应体系中产生1μmol丙酮酸为1个LDH活力单位(U)。(注：ΔA450:测定孔OD值-对照品OD值；a:标曲的斜率；b:标曲的截距；f:待测样品加入检测体系之前的稀释倍数；Cpr:待测样本的蛋白质浓度(gprot/L)；1000*:1L＝1000mL。)
表3 LDH比色法测定变异链球菌胞内LDH活性操作表
Figure BDA0003634286330000072
实验结果如图5所示，与对照组相比，鼠尾草花提取物浓度在14mg/mL-3.5mg/mL范围内，对细菌胞内乳酸脱氢酶活性均有明显的抑制作用，且抑制作用呈浓度依赖性。
实施例8对变异链球菌体外产酸影响的试验
采用pH计测定鼠尾草花提取物对变异链球菌的产酸能力的影响，将4mL实施例2制备的菌悬液3000r/min，离心5min后弃上清，用PBS轻柔洗涤两次后，菌体沉淀用4mL缓冲液(含50mmol/L氯化钾，1mmol/L的氯化镁，1％w/v的葡萄糖)重悬，设置含浓度为4MIC、2MIC、MIC、1/2MIC、1/4MIC的鼠尾草花提取物的缓冲液为实验组，以不含药液的缓冲液为对照组。用pH计监测3h内每0.5h各组溶液体系pH值的变化。实验结果显示，各实验组的终产酸量与对照组相比均有统计学差异(P＜0.5)，高浓度组明显能抑制3h最终的产酸量，且各实验组呈现剂量依赖效应。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.鼠尾草花提取物在制备变异链球菌的抑制剂中的应用。
2.一种变异链球菌的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂的活性成分为鼠尾草花提取物。
3.根据权利要求2所述的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂还包括药学上可接受的辅料。
4.鼠尾草花提取物在制备预防和/或治疗龋病的药物中的应用。
5.一种预防和/或治疗龋病的药物，其特征在于，所述药物的活性成分为鼠尾草花提取物。
6.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型为片剂、散剂、含潄剂、喷雾剂或凝胶剂。
8.鼠尾草花提取物在制备改善龋病的口腔护理用品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述口腔护理用品为牙膏、口香糖或漱口水。
10.一种改善龋病的口腔护理用品，其特征在于，包括活性成分鼠尾草花提取物和口腔护理用品上可接受的辅料。
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