CN114867754A - 多价和多特异性纳米颗粒平台和方法 - Google Patents

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Abstract

一种融合蛋白，该融合蛋白包括：纳米笼单体的第一纳米笼单体亚基；和与该第一纳米笼单体亚基连接的生物活性部分；其中该融合蛋白与包括第二纳米笼单体亚基的蛋白质自组装以形成纳米笼单体。

Description

多价和多特异性纳米颗粒平台和方法
技术领域
本发明涉及纳米颗粒。具体地，本发明涉及纳米颗粒亚基融合蛋白、疫苗、包括该纳米颗粒的预防剂和治疗剂，以及相关的组合物和方法。
背景技术
纳米颗粒为各个学科的进步做出了贡献。它们的使用具有赋予靶向递送的潜力，并且可以实现有序微芯片工程化、缓释和催化过程的笼形微环境。
对于制造含有敏感性且亚稳态的蛋白质的纳米颗粒，蛋白质自组装是一种有吸引力的方法。实际上，自组装纳米颗粒在生理条件下通过非共价相互作用形成，并且可靠地产生均匀且通常对称的纳米胶囊或纳米笼。自组装蛋白纳米颗粒具有三个不同的表面：外表面、内表面和亚基间表面，这些表面都可以被调整以增加其功能性。
包括自组装蛋白的融合蛋白目前已有报道。例如，已知有在组装的纳米笼的外表面上展示抗原以用作疫苗。
但目前仍需要涉及纳米笼的改进的组合物和方法。
发明内容
本文的各方面描述了允许在单个纳米颗粒上呈递和调整多个货物分子(例如，相同货物分子和/或不同货物分子的多个拷贝)的融合蛋白和自组装纳米笼，以及相关的组合物和方法。在一些实施方案中，本发明所公开的融合蛋白、纳米笼、组合物和方法允许对不同货物分子的比率进行控制，例如，以优化自组装纳米笼用于特定的治疗目的和/或预防目的。
根据一个方面，本发明提供了融合蛋白，该融合蛋白包括：
纳米笼单体的第一纳米笼单体亚基；和
与该第一纳米笼单体亚基连接的生物活性部分；
其中该融合蛋白与包括第二纳米笼单体亚基的蛋白质自组装以形成纳米笼单体。
在一个方面，该生物活性部分修饰该组装的纳米笼的内表面和/或外表面。
在一个方面，该生物活性部分包括：抗体或其片段、抗原、可检测部分、药剂、诊断剂或它们的组合。
在一个方面，该抗体或其片段包括Fc片段。
在一个方面，该Fc片段是IgG1 Fc片段。
在一个方面，该Fc片段包括一个或多个突变，例如LS、YTE、LALA和/或LALAP，所述一个或多个突变调节该融合蛋白的半衰期，例如从几分钟或几小时调节至几天、几周或几个月。
在一个方面，该抗体或其片段包括Fab片段。
在一个方面，该抗体或其片段包括scFab片段、scFv片段或sdAb片段。
在一个方面，该抗体或其片段包括Fab片段的重链和/或轻链。
在一个方面，该抗体或其片段包括轻链和重链两者，或者在Fc片段的情况下，包括任选地由接头分开的第一链和第二链。
在一个方面，该接头包括与以下序列具有至少70％(诸如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，或由其组成：
GGSSGSGSGSTGTSSSGTGTSAGTTGTSASTSGSGSGGGGGSGGGGSAGGTATAGASSGSGSSGSSSSGGTG。
在一个方面，该融合蛋白与分开产生的Fab轻链和/或重链缔合。
在一个方面，该抗体或其片段特异性结合到与抗体可预防的病症和/或抗体可治疗的病症相关的抗原。
在一个方面，该抗原与以下相关：传染原，包括病毒(例如，HIV(包括HIV-1)、流感病毒、RSV、轮状病毒)、细菌(例如，TB、艰难梭菌(C.difficile))、寄生虫(例如，疟疾)、真菌或酵母；癌症(例如，CD19、CD22、CD79、BCMA或CD20)，包括实体癌症和液体癌症；或免疫疾病，包括自身免疫疾病。
在一个方面，该抗原与HIV-1相关，并且该抗体或其片段包括例如ibalizumab-A12P、10E8、10E8.v4、N49P7、PGDM1400、10-1074、VRC01或它们的组合。
在一个方面，该抗体或其片段包括与以下序列具有至少70％(诸如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，或由其组成：
Fc链1：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK；
Fc链2：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK；
Ibalizumab-A12P轻链：
DIVMTQSPDSLPVSLGERVTMNCKSSQSLLYSTNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQYYSYRTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC；
Ibalizumab-A12P重链：
QVQLQQSGPEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVIHWVRQKPGQGLDWIGYINPYNDGTDYDEKFKGKATLTSDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREKDNYATGAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGSR；
10E8.v4轻链：
SELTQDPAVSVALKQTVTITCRGDSLRSHYASWYQKKPGQAPVLLFYGKNNRPSGIPDRFSGSASGNRASLTITGAQAEDEADYYCSSRDKSGSRLSVFGGGTKLTVLSQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTEC；
10E8.v4重链：
EVRLVESGGGLVKPGGSLRLSCSASGFDFDNAWMTWVRQPPGKGLEWVGRITGPGEGWSVDYAESVKGRFTISRDNTKNTLYLEMNNVRTEDTGYYFCARTGKYYDFWSGYPPGEEYFQDWGQGTLVIVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCSR；
N49P7轻链：
QSALTQPRSVSASPGQSVTISCTGTHNLVSWCQHQPGRAPKLLIYDFNKRPSGVPDRFSGSGSGGTASLTITGLQDDDDAEYFCWAYEAFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTEC；
N49P7重链：
ADLVQSGAVVKKPGDSVRISCEAQGYRFPDYIIHWIRRAPGQGPEWMGWMNPMGGQVNIPWKFQGRVSMTRDTSIETAFLDLRGLKSDDTAVYYDRSNGSGKRFESSNWFLDLWGRGTAVTIQSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDSR；
PGDM1400轻链：
DFVLTQSPHSLSVTPGESASISCKSSHSLIHGDRNNYLAWYVQKPGRSPQLLIYLASSRASGVPDRFSGSGSDKDFTLKISRVETEDVGTYYCMQGRESPWTFGQGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC；
PGDM1400重链：
QAQLVQSGPEVRKPGTSVKVSCKAPGNTLKTYDLHWVRSVPGQGLQWMGWISHEGDKKVIVERFKAKVTIDWDRSTNTAYLQLSGLTSGDTAVYYCAKGSKHRLRDYALYDDDGALNWAVDVDYLSNLEFWGQGTAVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDSR；或
它们的组合。
在一个方面，该抗体或其片段偶联至或缔合至另外的部分，诸如抗原、可检测部分(例如，小分子、荧光分子、放射性同位素或磁性颗粒)、药剂、诊断剂或它们的组合。
在一个方面，该抗体或其片段包括抗体药物偶联物。
在一个方面，该抗原与疫苗可预防的病症和/或疫苗可治疗的病症相关。
在一个方面，该抗原与以下相关：传染原，包括病毒、细菌、寄生虫、真菌或酵母；癌症，包括实体癌症和液体癌症；或免疫疾病，包括自身免疫疾病。
在一个方面，该可检测部分包括荧光蛋白，诸如GFP、EGFP、紫黄晶和/或基于黄素的荧光蛋白诸如LOV蛋白(诸如iLOV)。
在一个方面，该药剂包括小分子、肽、脂质、碳水化合物或毒素。
在一个方面，约3个至约100个纳米笼单体，诸如24、32或60个单体，或约4个至约200个纳米笼单体亚基，诸如4、6、8、10、12、14、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50或更多个亚基，任选地与一个或多个完整的纳米笼单体组合，自组装以形成纳米笼。
在一个方面，该纳米笼单体选自铁蛋白、脱铁铁蛋白、封装蛋白、SOR、二氧四氢蝶啶合酶、丙酮酸脱氢酶、羧基体、穹窿体蛋白、GroEL、热休克蛋白、E2P、MS2外壳蛋白、其片段、以及其变体。
在一个方面，该纳米笼单体是脱铁铁蛋白。
在一个方面，该第一纳米笼单体亚基和该第二纳米笼单体亚基可互换地包括脱铁铁蛋白的“N”区和“C”区。
在一个方面，脱铁铁蛋白的“N”区包括与以下序列具有至少70％(诸如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，或由其组成：
MSSQIRQNYSTDVEAAVNSLVNLYLQASYTYLSLGFYFDRDDVALEGVSHFFRELAEEKREGYERLLKMQNQRGGRALFQDIKKPAEDEW。
在一个方面，脱铁铁蛋白的“C”区包括与以下序列具有至少70％(诸如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，或由其组成：
GKTPDAMKAAMALEKKLNQALLDLHALGSARTDPHLCDFLETHFLDEEVKLIKKMGDHLTNLHRLGGPEAGLGEYLFERLTLRHD。
在一个方面，该融合蛋白还包括在该纳米笼单体亚基和该生物活性部分之间的接头。
在一个方面，该接头是柔性的或刚性的，并且包括约1个至约30个氨基酸残基，诸如约8个至约16个氨基酸残基。
在一个方面，该接头包括GGS重复，诸如1个、2个、3个、4个或更多个GGS重复。
在一个方面，该接头包括与以下序列具有至少70％(诸如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，或由其组成：
ASTASSASSGGGGGGSGGSGGSGGS。
在一个方面，该融合蛋白还包括C末端接头。
在一个方面，该C末端接头包括与以下序列具有至少70％(诸如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，或由其组成：
GGSGGSGGSGGSGGGASGGS。
根据一个方面，本发明提供了一种本文所述的融合蛋白的融合蛋白对，其中该融合蛋白对自组装以形成纳米笼单体，其中该第一纳米笼单体亚基和该第二纳米笼单体亚基融合至不同的生物活性部分。
根据一个方面，本发明提供了一种纳米笼，该纳米笼包括至少一个本文所述的融合蛋白和至少一个与该融合蛋白自组装以形成纳米笼单体的第二纳米笼单体亚基。
根据一个方面，本发明提供了一种纳米笼，该纳米笼包括至少一个本文所述的融合蛋白对。
在一个方面，每个纳米笼单体包括本文所述的融合蛋白或融合蛋白对。
在一个方面，约20％至约80％的该纳米笼单体包括本文所述的融合蛋白或融合蛋白对。
在一个方面，该融合蛋白包括至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个不同的生物活性部分。
在一个方面，该纳米笼包括至少一个完整的纳米笼单体，该纳米笼单体任选地融合至可与本文所述的生物活性部分相同或不同的生物活性部分。
在一个方面，该纳米笼是多价的和/或多特异性的。
在一个方面，该纳米笼包括本文所述的第一融合蛋白、第二融合蛋白和第三融合蛋白，以及至少一个任选地融合至生物活性部分的完整的纳米笼单体，其中该第一融合蛋白、该第二融合蛋白和该第三融合蛋白的生物活性部分以及该完整的纳米笼单体的生物活性部分彼此均不相同。
在一个方面，该第一融合蛋白、该第二融合蛋白和该第三融合蛋白各自包括融合至N铁蛋白或C铁蛋白的抗体或其片段，其中该第一融合蛋白、该第二融合蛋白和该第三融合蛋白中的至少一个融合至N铁蛋白，并且该第一融合蛋白、该第二融合蛋白和该第三融合蛋白中的至少一个融合至C铁蛋白。
在一个方面，该第一融合蛋白的抗体或其片段是Fc片段；其中该第二融合蛋白和该第三融合蛋白各自包括对病毒(诸如HIV)的不同抗原有特异性的抗体或其片段，或者其中该第二融合蛋白和该第三融合蛋白中的一个包括对病毒(诸如HIV)的抗原有特异性的抗体或其片段，并且该第三融合蛋白包括对不同抗原(诸如CD4受体)有特异性的抗体或其片段；并且其中该完整的纳米笼单体融合至对另一种不同的抗原，任选地为相同的病毒(诸如HIV)的不同抗原有特异性的生物活性部分。
在一个方面，该Fc片段包括一个或多个突变，例如LS、YTE、LALA和/或LALAP，所述一个或多个突变调节该融合蛋白的半衰期，例如从几分钟或几小时调节至几天、几周或几个月。
在一个方面，该第二融合蛋白的抗体或其片段是N49P7或iMab A12P；其中该第三融合蛋白的抗体或其片段是10E8v4。
在一个方面，该纳米笼包括以下四种融合蛋白或由以下四种融合蛋白组成：
a.融合至全长铁蛋白的PGDM1400(任选地为scPGDM1400)；
b.融合至N铁蛋白的Fc(任选地为scFc)；
c.融合至C铁蛋白的N49P7或iMab A12P(任选地为scN49P7或sciMab A12P)；和
d.融合至C铁蛋白的10E8v4(任选地为sc10E8v4)。
在一个方面，该纳米笼包括4:2:1:1的a:b:c:d比率。
在一个方面，该纳米笼包括与以下序列中的一个或多个具有至少70％(诸如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，或由其组成，其中铁蛋白亚基以粗体示出，接头用下划线标出，轻链以斜体示出，并且重链以小写字母示出：
a.PGDM1400-hFerr：
Figure GDA0003734850320000071
b.Fc-N-hFerr LS
Figure GDA0003734850320000072
c1.N49P7-C-hFerr
Figure GDA0003734850320000073
Figure GDA0003734850320000081
c2.Ibalizumab-A12P-C-hFerr
Figure GDA0003734850320000082
d.10E8.v4-C-hFerr
Figure GDA0003734850320000083
在一个方面，该纳米笼携带货物分子，例如药剂、诊断剂和/或成像剂。
在一个方面，该货物分子不融合至该融合蛋白并且被包含在该纳米笼内部。
在一个方面，该货物分子是蛋白质并且融合至该融合蛋白，使得该货物分子被包含在该纳米笼内部。
在一个方面，该货物分子是荧光蛋白，诸如GFP、EGFP、紫黄晶和/或基于黄素的荧光蛋白诸如LOV蛋白(诸如iLOV)。
在一个方面，该货物分子被包含在内部以提供T细胞表位，但任选地不提供B细胞表位。
在一个方面，该货物分子融合至该融合蛋白并且被包含在内部以提供T细胞表位，但任选地不提供B细胞表位。
在一个方面，该货物分子是小分子、放射性同位素或磁性颗粒。
在一个方面，该纳米笼还包括表面上的抗原。
在一个方面，该抗原表达为具有纳米笼单体的融合蛋白。
根据一个方面，本发明提供了一种疫苗，该疫苗包括本文所述的纳米笼。
根据一个方面，本发明提供了一种治疗性组合物或预防性组合物，该组合物包括本文所述的纳米笼。
根据一个方面，本发明提供了一种核酸分子，该核酸分子编码本文所述的融合蛋白或融合蛋白对。
根据一个方面，本发明提供了一种载体，该载体包括本文所述的核酸分子。
根据一个方面，本发明提供了一种宿主细胞，该宿主细胞包括本文所述的载体并且产生本文所述的融合蛋白或融合蛋白对。
根据一个方面，本发明提供了一种使受试者免疫的方法，该方法包括给予本文所述的纳米笼或疫苗。
根据一个方面，本发明提供了一种用于治疗和/或预防疾病或病症的方法，该方法包括给予本文所述的纳米笼或疫苗。
在一个方面，该疾病或病症是癌症、感染性疾病如HIV、疟疾、流感、RSV、轮状病毒或自身免疫疾病。
根据一个方面，本发明提供了一种用于诊断成像的方法，该方法包括：给予受试者、组织或样品本文所述的纳米笼，其中该纳米笼包括诊断标记，诸如荧光蛋白或磁成像部分；以及对该受试者、组织或样品进行成像。
根据一个方面，本发明提供了一种本文所述的纳米笼或疫苗的用于使受试者免疫的用途。
根据一个方面，本发明提供了一种本文所述的纳米笼或疫苗的用于治疗和/或预防疾病或病症的用途。
在一个方面，该疾病或病症是癌症、感染性疾病如HIV、疟疾、流感、RSV、轮状病毒或自身免疫疾病。
根据一个方面，本发明提供了一种本文所述的纳米笼的用于受试者、组织或样品的诊断成像的用途，其中该纳米笼包括诊断标记，诸如荧光蛋白或磁成像部分，并且对受试者、组织或样品进行成像。
根据一个方面，本发明提供了一种本文所述的融合蛋白、融合蛋白对或纳米笼作为研究工具的用途，例如在FACS或ELISA中。
根据一个方面，本发明提供了本文所述的纳米笼或疫苗用于使受试者免疫。
根据一个方面，本发明提供了本文所述的纳米笼或疫苗用于治疗和/或预防疾病或病症。
在一个方面，该疾病或病症是癌症、感染性疾病如HIV、疟疾、流感、RSV、轮状病毒或自身免疫疾病。
根据一个方面，本发明提供了本文所述的纳米笼用于受试者、组织或样品的诊断成像，其中该纳米笼包括诊断标记，诸如荧光蛋白或磁成像部分，并且对该受试者、组织或样品进行成像。
根据一个方面，本发明提供了本文所述的融合蛋白、融合蛋白对或纳米笼用于作为研究工具，例如在FACS或ELISA中。
根据一个方面，本发明提供了一种纳米笼，该纳米笼包括多个融合蛋白，
其中每个融合蛋白包括铁蛋白轻链和Fab片段，
其中每个Fab片段能够特异性结合抗原，
其中每个Fab片段修饰该纳米笼的外表面，并且
其中所述多个融合蛋白包括至少12个融合蛋白。
在一个方面，所述多个融合蛋白包括至少19个融合蛋白。
在一个方面，所述多个融合蛋白包括至少24个融合蛋白。
在一个方面，所述多个融合蛋白是24个融合蛋白。
在一个方面，所述多个融合蛋白的Fab片段能够特异性结合相同的抗原。
在一个方面，该纳米笼不包括任何铁蛋白重链。
在一个方面，该Fab片段是中和抗体的Fab片段。
在一个方面，该抗原与传染原相关。
在一个方面，该传染原是病毒。
在一个方面，该病毒是人免疫缺陷病毒(HIV)。
在一个方面，该纳米笼能够以相对于对照至少100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍或500倍的中和活性中和该传染原。
在一个方面，该对照包括全长形式的中和抗体。
在一个方面，该中和抗体是IgG抗体。
根据一个方面，本发明提供了一种纳米笼，该纳米笼包括多个第一融合蛋白和多个第二融合蛋白，
其中每个第一融合蛋白包括纳米笼单体或其亚基和能够特异性结合抗原的Fab片段，并且
其中每个第二融合蛋白包括纳米笼单体或其亚基和Fc片段。
在一个方面，该纳米笼单体选自铁蛋白、脱铁铁蛋白、封装蛋白、硫加氧酶还原酶(SOR)、二氧四氢蝶啶合酶、丙酮酸脱氢酶、羧基体、穹窿体蛋白、GroEL、热休克蛋白、E2P、MS2外壳蛋白、其片段，以及其变体。
在一个方面，该纳米笼单体是脱铁铁蛋白或铁蛋白。
在一个方面，该纳米笼单体是铁蛋白轻链。
在一个方面，该纳米笼单体不包括任何铁蛋白重链。
根据一个方面，本发明提供了一种纳米笼，该纳米笼包括多个第一融合蛋白和多个第二融合蛋白，其中
(a)(i)该第一融合蛋白包括铁蛋白轻链和能够特异性结合第一抗原的Fab片段，并且
(ii)该第二融合蛋白包括铁蛋白轻链和能够特异性结合第二抗原的Fab片段，或者
(b)(i)该第一融合蛋白包括N铁蛋白和能够特异性结合第一抗原的Fab片段，并且
(ii)该第二融合蛋白包括C铁蛋白和能够特异性结合第二抗原的Fab片段，
其中，在每个融合蛋白内，该Fab片段融合至该铁蛋白轻链的N末端、该N铁蛋白的N末端或该C铁蛋白的N末端，并且
其中该第一抗原不同于该第二抗原。
根据一个方面，本发明提供了一种纳米笼，该纳米笼包括多个第一融合蛋白、多个第二融合蛋白和多个第三融合蛋白，其中
(a)该第一融合蛋白包括铁蛋白轻链和能够特异性结合第一抗原的Fab片段，
(b)该第二融合蛋白包括C铁蛋白和能够特异性结合第二抗原的Fab片段，并且
(c)该第三融合蛋白包括N铁蛋白和Fc片段，
其中，在每个融合蛋白内，该Fab片段或该Fc片段融合至该铁蛋白轻链的N末端、该C铁蛋白的N末端或该N铁蛋白的N末端，并且
其中该第一抗原不同于该第二抗原。
在一个方面，该纳米笼还包括多个第四融合蛋白，其中该第四融合蛋白包括C铁蛋白和能够特异性结合第三抗原的Fab片段，其中该第三抗原不同于该第一抗原和该第二抗原。
在一个方面，该Fab片段是中和抗体的Fab片段。
在一个方面，该第一抗原和该第二抗原各自与传染原相关。
在一个方面，该第一抗原和该第二抗原与相同的传染原相关。
在一个方面，该传染原是病毒。
在一个方面，该病毒是人免疫缺陷病毒(HIV)。
在一个方面，该第一抗原和该第二抗原各自与病毒相关，
其中该纳米笼能够中和假病毒组中100％的假病毒，并且
其中对于该纳米笼内能够特异性结合与该病毒相关的抗原的每个Fab片段，该假病毒组包括至少一种对对应于该Fab片段的中和抗体具有抗性的假病毒。
在一个方面，该假病毒组包括至少10种、至少11种、至少12种、至少13种或至少14种假病毒。
在一个方面，该第一抗原和该第二抗原各自与病毒相关，
其中该纳米笼能够以小于1nM、小于500pM、小于250pM、小于100pM、小于50pM、小于10pM或小于5pM的IC50中和假病毒组，并且
其中对于该纳米笼内能够特异性结合与该病毒相关的抗原的每个Fab片段，该假病毒组包括至少一种对对应于该Fab片段的中和抗体具有抗性的假病毒。
在一个方面，该第一抗原和该第二抗原各自与病毒相关，
其中该纳米笼能够以一个或多个对照的IC50(摩尔浓度)的至多1/10、至多1/20、至多1/30、至多1/40、至多1/50、至多1/60、至多1/70、至多1/80、至多1/90或至多1/100的IC50中和假病毒组，并且
其中对于该纳米笼内能够特异性结合与该病毒相关的抗原的每个Fab片段，该假病毒组包括至少一种对对应于该Fab片段的中和抗体具有抗性的假病毒。
在一个方面，该一个或多个对照包括对应于该纳米笼内的Fab片段的中和抗体，该Fab片段能够特异性结合与该病毒相关的抗原。
在一个方面，该中和抗体是IgG抗体。
在一个方面，所述一个或多个对照包括中和抗体的混合物，其中对于该纳米笼内的能够特异性结合与该病毒相关的抗原的每个Fab片段，该混合物包括对应于该Fab片段的中和抗体。
在一个方面，这些中和抗体是IgG抗体。
在一个方面，所述一个或多个对照包括一个或多个多特异性抗体，其中所述一个或多个多特异性抗体集体能够结合该第一抗原和该第二抗原，并且任选地结合该第三抗原。
在一个方面，所述一个或多个对照包括能够特异性结合该第一抗原、该第二抗原和该第三抗原的三特异性抗体。
在一个方面，该第一抗原、该第二抗原和该第三抗原与HIV-1相关；并且其中：
该第一融合蛋白的Fab片段是PDGM1400 Fab，
该第二融合蛋白的Fab片段是10E8v4 Fab，
该第三融合蛋白的Fc片段是人IgG1 Fc片段，并且
该第四融合蛋白的Fab片段是N49P7 Fab。
在一个方面，该第一抗原和该第二抗原与HIV-1相关；其中该第三抗原与CD4相关；并且其中：
该第一融合蛋白的Fab片段是PDGM1400 Fab，
该第二融合蛋白的Fab片段是10E8v4 Fab，
该第三融合蛋白的Fc片段是人IgG1 Fc片段，并且
该第四融合蛋白的Fab片段是iMab Fab。
根据一个方面，本发明提供了一种治疗性组合物或预防性组合物，该组合物包括本文所述的纳米笼。
根据一个方面，本发明提供了一种用于治疗或预防疾病或病症的方法，该方法包括给予有需要的受试者本文所述的纳米笼或组合物。
根据一个方面，本发明提供了一种制备多特异性自组装纳米笼的方法，该纳米笼的特征在于不同特异性的预选比率，该方法包括以下步骤：
用包括多个多核苷酸的一个或多个表达质粒共转染宿主细胞，每个多核苷酸编码融合蛋白，
其中每个融合蛋白包括：(i)纳米笼单体或其亚基和(ii)具有给定特异性的抗体或抗体片段，
其中该共转染的步骤包括：以基于该预选比率的比率共转染该多核苷酸；
获得由该宿主细胞产生的多肽；以及
通过亲和选择纯化组装的纳米笼中存在的所有不同特异性的多肽。
在一个方面，所述多个多核苷酸包括至少一个编码第一融合蛋白的多核苷酸和至少一个编码第二融合蛋白的多核苷酸，
其中该第一融合蛋白包括第一纳米笼单体亚基，并且
其中该第二融合蛋白包括能够与该第一纳米笼单体亚基自组装的第二纳米笼单体亚基。
在审查本发明的以下详细描述之后，本发明的新颖特征对于本领域的技术人员将变得显而易见。然而，应当理解，尽管本发明的详细描述和所提供的具体实施方案指出了本发明的某些方面，但是仅是出于说明目的而提供，因为根据本发明的详细描述和所附权利要求，在本发明的精神和范围内的各种变化和修改形式对于本领域的技术人员将变得显而易见。
附图说明
通过以下参照附图的描述，将进一步理解本发明，其中：
图1.多特异性多亲和性抗体(MULTi-specific,multi-Affinity antiBODY，multabody)平台的自组装的示意图。单链Fab(轻链(LC)和重链(HC)分别为淡粉红色和深粉红色)和单链Fc区(绿色)通过GGS样的柔性接头(深色)连接至人脱铁铁蛋白的轻链(灰色)的N末端。脱铁铁蛋白的24个亚基自组装成12nm的球形核，该球形核被空间上分散的抗体片段包围。
图2.不同效价的HIV-1多特异性多亲和性抗体的表征。(a)展示在人脱铁铁蛋白上的不同Fab密度的示意图。编码scFab-人脱铁铁蛋白的质粒与不同比率的未偶联脱铁铁蛋白一起共转染产生5价(深黄色)、12价(黑色)、19价(蓝色)和24价(红色)的scFab，如在体积排阻色谱法和SDS-PAGE中的早期洗脱体积和较少的未偶联脱铁铁蛋白所证实。图中示出了具有最低(20％)效价和最高(100％)效价的样品的负染色电子显微照片。(b)五种bNAb中和5-PsV组(PVO.04、JRCSF、BG505 T332N、THRO4156.18和t278-50)的亲合力效应。由于中和抗性，在以下情况中省略了IC50增加倍数分析：N49P7-t278-50、VRC01-T278-50和10-1074-THRO4156.18。效力增加倍数的计算方式为亲本IgG IC50(nM)除以多特异性多亲和性抗体IC50(nM)。
图3.32-N多特异性多亲和性抗体和32-I多特异性多亲和性抗体的设计、组装和生物物理表征。(a)有利于scFab-人脱铁铁蛋白亚基的异二聚化的人脱铁铁蛋白分割设计的示意图。所得的称为N铁蛋白和C铁蛋白的两半分别跨越残基1至95和残基95至175。scFc连接在N铁蛋白半部的N末端，而N49P7、iMab(在本文中也称为ibalizumab)和10E8v4连接在C铁蛋白半部的N末端。分割的两半的异二聚化驱动不同抗体片段的自组装，导致形成具有两个货物分子的单个人脱铁铁蛋白亚基。这些构建体与连接到全长人脱铁铁蛋白亚基的PGDM1400 scFab进一步组合，引起在多特异性多亲和性抗体表面上展示32个scFab/scFc混合物的纳米颗粒的组装。图中示出了负染色电子显微照片、scFab/scFc 32-N/32-I设计的模型示意图以及32-N和32-I多特异性多亲和性抗体的具体组成。基于驱动自组装所必需的异寡聚化，具有四种组分的多特异性多亲和性抗体的纯化可通过两步纯化实现：蛋白A(Fc结合)和蛋白L(PGDM1400结合)。(b)24聚体PGDM1400多特异性多亲和性抗体(黑色)、32-N多特异性多亲和性抗体(深品红色)和32-I多特异性多亲和性抗体(蓝色)的体积排阻色谱法与多角度光散射联用。每个洗脱峰(UV吸光度线下方)的摩尔质量显示该样品是单分散的，并且由于在该设计中有额外的抗体片段，32-N/32-I多特异性多亲和性抗体明显大于24聚体形式的多特异性多亲和性抗体。(c)32-N/32-I多特异性多亲和性抗体、12聚体多特异性多亲和性抗体、亲本IgG和N6/PGDM1400x10E8v4三特异性抗体的Tm温度和Tagg温度对比。(d)32-N和32-I多特异性多亲和性抗体与多个表位的结合的浓度-响应曲线。PGDM1400结合位点、N49P7结合位点和10E8结合位点在HIV Env(灰色)的表面示意图中分别为红色、蓝色和粉色。使用可溶性CD4评估iMab的结合，同时通过测量在pH 7.5和pH 5.6时的结合来测试Fc与人FcRn的功能性结合。分别选择BG505 SOSIP.664_D368R三聚体和93TH057 gp120单体作为PGDM1400和N49P7的表位特异性配体。
图4.分割设计对多特异性多亲和性抗体的生物物理特性和功能特性的影响。由6个拷贝的PGDM1400和6个拷贝的Fc构成的12聚体多特异性多亲和性抗体与全长脱铁铁蛋白亚基(左图)或铁蛋白半部(Fc附接到N铁蛋白半部并且PGDM1400连接到C铁蛋白半部，右图)多聚化的对比。a)BG505.664与加载到抗hIgG Fc捕获(AHC)生物传感器上的12聚体多特异性多亲和性抗体的结合的生物膜干涉技术(BLI)浓度-响应曲线。b)重心平均荧光(BCM)和在266nm处的静态光散射(SLS)与温度的关系图。Tm和Tagg用黄色的线表示。c)对BG505T332NPsV的中和试验。
图5.多特异性多亲和性抗体亲和纯化方案。蛋白A和蛋白L的依序亲和纯化。与蛋白A的结合使具有Fc(绿色)的多特异性多亲和性抗体富集，而与蛋白L的结合使具有κ链FabPGDM1400(蓝色)的多特异性多亲和性抗体富集。引入iMab的κ链第12号位点的丙氨酸到脯氨酸点突变以破坏与蛋白质L的结合75。人脱铁铁蛋白的两半的互补确保在蛋白A纯化步骤期间(融合至C铁蛋白的)N49P7/iMab scFab(橙色)和10E8 scFab(粉红色)的存在。执行凝胶过滤以分离任何聚集的物质。
图6.32-N多特异性多亲和性抗体的批间变化最小。a)SEC色谱图。b)BCM和在266nm处的SLS与温度的关系图。热转变温度(Tm和Tagg)用黄色的线表示。c)93TH057 gp120与32-N内的N49P7结合的浓度-响应曲线。d)32-N对4-PsV组的中和分布，该4-PsV组被选择为包括一个对多特异性多亲和性抗体中的每个Fab具有抗性的PsV。
图7.热稳定性分析。32-N和32-I多特异性多亲和性抗体、它们各自的12聚体多特异性多亲和性抗体、亲本IgG和N6/PGDM1400x10E8三特异性抗体的BCM(上图)和266nm处的SLS(下图)与温度的关系图。热转变温度(Tm和Tagg)用黄色的线表示。
图8.bNAb PGDM1400、10E8v4、N49P7和iMab的结合特征。IgG与固定在Ni-NTA生物传感器上的93TH057 gp120、BG505 SOSIP.664_D368R、MPER-mVenus和CD4的结合的BLI响应曲线。
图9.32-N和32-I多特异性多亲和性抗体对14种假病毒的组的中和特性。多特异性多亲和性抗体(红色菱形)、亲本bNAb(黑色圆形)、IgG组合(黑色三角形)和N6/PGDM1400x10E8v4三特异性抗体(黑色正方形)的宽度值和IC50中值(μg/mL)。IgG混合物中的各亲本抗体的相对含量与多特异性多亲和性抗体样品中的相对含量相同(即，66％PGDM1400、17％N49P7/iMab和17％10E8v4)。基于对亲本IgG的易感性和抗性选择14-PsV组。
图10.32-N和32-I多特异性多亲和性抗体对14种假病毒的组的中和特性。多特异性多亲和性抗体(红色菱形)、亲本bNAb(黑色圆形)、IgG组合(66％PGDM1400、17％N49P7/iMab和17％10E8v4，黑色三角形)和N6/PGDM1400x10E8v4三特异性抗体(黑色正方形)的宽度和IC50中值(nM)。
图11.小鼠中的免疫原性和多特异性多亲和性抗体的暴露量。使用每组五只雄性C57BL/6小鼠来评估皮下给予5mg/kg小鼠替代多特异性多亲和性抗体和Fc-修饰的多特异性多亲和性抗体(LALAP突变以破坏Fc受体结合)之后抗药物抗体和多特异性多亲和性抗体在血液中的循环。将参考样品HpFerritin-PfCSP疟疾肽以及亲本小鼠IgG1和亲本小鼠IgG2a同种型分别用于免疫原性和暴露量的对比。
具体实施方式
定义
除非另有说明，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。分子生物学常用术语的定义可见于Benjamin Lewin，Genes V，牛津大学出版社出版，1994年(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等，(编)，TheEncyclopedia of Molecular Biology，Blackwell Science Ltd.出版，1994年(ISBN 0-632-02182-9)；和Robert A.Meyers(编)，Molecular Biology and Biotechnology:aComprehensive Desk Reference，VCH Publishers,Inc.出版，1995年(ISBN 1-56081-569-8)。虽然本文描述了典型的材料和方法，但任何与本文所述的方法和材料类似或等同的方法和材料均可用于检验本发明的实践。在描述和要求保护本发明时，将使用以下术语。
还应理解，本文所用的术语并非意在对本发明进行限制，仅是出于描述特定方面的目的。本文中引用了许多专利申请、专利和出版物以帮助理解所描述的方面。这些参考文献中的每一篇全文均以引用方式并入本文。
在理解本申请的范围时，冠词“一个”、“一种”、“该”和“所述”旨在表示存在一个或多个要素。另外，如本文所用，术语“包括”及其派生词为开放式术语，其指定所述特征、要素、组分、组、整体和/或步骤的存在，但不排除其他未提及的特征、要素、组分、组、整体和/或步骤的存在。前述内容也适用于具有类似含义的词语，例如术语“包括”、“具有”及其派生词。
应当理解，描述为“包括”某些组分的任何方面也可以“由这些组分组成”或“基本上由这些组分组成”，其中“由这些组分组成”具有封闭或限制性的含义，并且“基本上由这些组分组成”是指包括指定的组分但不包括除了作为杂质存在的材料、作为用于提供这些组分的方法的结果存在的不可避免的材料和为了实现本发明的技术效果以外的目的而添加的组分之外的其他组分。例如，使用短语“基本上由……组成”定义的组合物涵盖任何已知的可接受的添加剂、赋形剂、稀释剂和载体等。通常，基本上由一组组分组成的组合物将包含小于5重量％，通常小于3重量％，更通常小于1重量％，甚至更通常小于0.1重量％的未指定组分。
应当理解，本文中定义为被包括的任何组分可以通过附带条件或负面限制明确地排除在要求保护的本发明之外。例如，在一些方面，本文所述的纳米笼和/或融合蛋白可不包括铁蛋白重链和/或可不包括铁结合组分。
此外，本文给出的所有范围包括范围的端点以及任何中间范围点，无论是否明确说明。
如本文所用，程度术语例如“基本上”、“约”和“近似”是指所修饰术语的不会使最终结果发生显著改变的合理偏差量。若该偏差并非否定其所修饰的词语的含义，则这些程度术语应该理解为包括所修饰术语的至少±5％的偏差。
还应理解，对于核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子质量值均为近似值，并且出于描述目的而提供。虽然下文描述了合适的方法和材料，但与本文所述的方法和材料类似或等同的方法和材料均可用于本公开的实践和检验。缩略词“e.g.”源自拉丁语exempli gratia，并且在本文中用于指示非限制性示例。因此缩略词“e.g.”与术语“例如”同义。词语“或”旨在包括“和”，除非上下文另有明确指示。
术语“蛋白纳米颗粒”、“纳米笼”和“多特异性多亲和性抗体”在本文中可互换使用，并且是指多亚基蛋白质多面体形结构。亚基或纳米笼单体各自由蛋白质或多肽(例如糖基化多肽)构成，并且任选地由以下单个或多个特征构成：核酸、辅基、有机和无机化合物。蛋白纳米颗粒的非限制性实例包括铁蛋白纳米颗粒(参见，例如Zhang,Y.，Int.J.Mol.Sci.，12:5406-5421，2011年，以引用方式并入本文)，封装蛋白纳米颗粒(参见，例如Sutter等，Nature Struct.and Mol.Biol.，15:939-947，2008年，以引用方式并入本文)，硫加氧酶还原酶(SOR)纳米颗粒(参见，例如Urich等，Science，311:996-1000，2006年，以引用方式并入本文)，二氧四氢蝶啶合酶(参见，例如Zhang等，J.Mol.Biol.，306:1099-1114，2001年)或丙酮酸脱氢酶纳米颗粒(参见，例如Izard等，PNAS，96:1240-1245，1999年，以引用方式并入本文)。铁蛋白、脱铁铁蛋白、封装蛋白、SOR、二氧四氢蝶啶合酶和丙酮酸脱氢酶为自组装成球状蛋白复合物的单体蛋白，在一些情况下，这些球状蛋白复合物分别由24、60、24、60和60个蛋白亚基组成。铁蛋白和脱铁铁蛋白在本文中通常可互换地提及，并且被理解为均适用于本文所述的融合蛋白、纳米笼和方法。本文考虑使用还产生纳米笼的羧基体、穹窿体蛋白、GroEL、热休克蛋白、E2P和MS2外壳蛋白。此外，完全或部分合成的自组装单体也预期用于本文。
应当理解，每个纳米笼单体可分成两个或更多个将自组装成功能性纳米笼单体的亚基。例如，铁蛋白或脱铁铁蛋白可被分成N亚基和C亚基，例如，通过将全长铁蛋白基本上分成两半而获得的N亚基和C亚基，使得每个亚基可单独结合不同的生物活性部分，用于随后自组装成纳米笼单体，再自组装成纳米笼。“功能性纳米笼单体”意指纳米笼单体能够与其他此类单体自组装成如本文所述的纳米笼。
术语“铁蛋白”和“脱铁铁蛋白”在本文中可互换使用，并且通常是指能够组装成通常包括24个蛋白质亚基的铁蛋白复合物的多肽(例如铁蛋白链)。应当理解，铁蛋白可来自任何物种。通常，铁蛋白是人铁蛋白。在一些实施方案中，铁蛋白是野生型铁蛋白。例如，铁蛋白可以是野生型人铁蛋白。在一些实施方案中，铁蛋白轻链被用作纳米笼单体，和/或铁蛋白轻链的亚基被用作纳米笼单体亚基。在一些实施方案中，组装的纳米笼不包括任何铁蛋白重链或能够结合铁的其他铁蛋白组分。
如本文所用，术语“多特异性”指具有至少两个结合位点，且至少两种不同的结合配偶体例如抗原或受体(例如Fc受体)可在所述的至少两个结合位点处结合的特征。例如，包括至少两个Fab片段且其中两个Fab片段种的每一个都结合不同的抗原的纳米笼是“多特异性的”。作为另外的示例，包括Fc片段(能够结合Fc受体)和Fab片段(能够结合抗原)的纳米笼是“多特异性的”。
如本文所用，术语“多价”指具有至少两个结合位点，且结合配偶体例如抗原或受体(例如Fc受体)可在所述的至少两个结合位点处结合的特征。可以结合到所述的至少两个结合位点的结合配偶体可相同或不同。
“疫苗”是在受试者中诱导预防性或治疗性免疫应答的药物组合物。在一些情况下，免疫应答是保护性免疫应答。通常，疫苗诱导针对病原体例如病毒病原体的抗原或针对与病理状况相关的细胞成分的抗原特异性免疫应答。疫苗可包括多核苷酸(例如编码已公开的抗原的核酸)、肽或多肽(例如已公开的抗原)、病毒、细胞或一种或多种细胞成分。在一个具体的非限制性实例中，疫苗诱导免疫应答，与对照相比，该免疫应答降低与疟疾感染相关的症状的严重程度和/或降低寄生虫载量。在另一个非限制性实例中，疫苗诱导免疫应答，与对照相比，该免疫应答减少和/或预防疟疾或HIV感染。
本文所用的术语“抗体”，在本领域中也称为“免疫球蛋白”(Ig)，指由成对的重多肽链和轻多肽链构建的蛋白质；存在多种Ig同种型，包括IgA、IgD、IgE、IgG(如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)以及IgM。应当理解，抗体可来自任何物种，包括人、小鼠、大鼠、猴、美洲驼或鲨鱼。当抗体正确折叠时，每条链折叠成多个不同的球状结构域，这些球状结构域由更线性的多肽序列连接。例如，免疫球蛋白轻链折叠成一个可变结构域(VL)和一个恒定结构域(CL)，而重链折叠成一个可变结构域(VH)和三个恒定结构域(CH、CH2、CH3)。重链可变结构域和轻链可变结构域(VH和VL)的相互作用导致抗原结合区(Fv)的形成。每个结构域具有本领域技术人员熟悉的已建立的结构。
轻链可变区和重链可变区负责结合靶抗原，并因此可在抗体之间显示出显著的序列多样性。恒定区显示较低的序列多样性，并且负责结合许多天然蛋白质以引发重要的免疫事件。抗体的可变区包含分子的抗原结合决定簇，并因此决定了抗体对其靶抗原的特异性。大多数序列变异性发生在六个超变区中，可变重链和可变轻链各三个；超变区组合形成抗原结合位点，并帮助抗原决定簇的结合和识别。抗体对其抗原的特异性和亲和力由超变区的结构以及它们呈递给抗原的表面的大小、形状和化学性质决定。
如本文所指的“抗体片段”可包括本领域已知的任何合适的抗原结合抗体片段。抗体片段可以是天然存在的抗体片段，或者可通过操控天然存在的抗体或通过使用重组方法获得。例如，抗体片段可包括但不限于Fv、单链Fv(scFv；由VL和VH与连接肽连接组成的分子)、Fc、单链Fc、Fab、单链Fab、F(ab')2、单结构域抗体(sdAb；由单个VL或VH构成的片段)和这些中任何一种的多价形式。
如本文所用，术语“合成抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体。该术语还应解释为意指通过合成编码抗体的DNA分子而产生的抗体，并且该DNA分子表达抗体蛋白或指示该抗体的氨基酸序列，其中该DNA或氨基酸序列是使用本领域可获得的且公知的DNA或氨基酸序列合成技术获得的。
术语“表位”是指抗原决定簇。表位是分子上特定的抗原性(即，引发特异性免疫应答)化学基团或肽序列。抗体特异性结合(例如，多肽上的)特定抗原表位。表位可由连续的氨基酸形成或者由通过蛋白的三级折叠而并置的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留，而由三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丧失。表位通常包括至少3个，更通常至少5个、约9个、约11个或约8至约12个呈独特空间构象的氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括例如X射线晶体学和2维核磁共振。参见，例如，Methods in Molecular Biology，第66卷，“Epitope Mapping Protocols”，GlennE.Morris编，1996年。
如本文所用，术语“抗原”定义为激发免疫应答的分子。这种免疫应答可涉及抗体产生或特异性免疫感受态细胞的活化或上述两者。技术人员将理解，任何大分子，包括几乎所有的蛋白质或肽，均可作为抗原。此外，抗原可源自重组或基因组DNA。本领域的技术人员将理解，包括编码引发免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA因此编码如本文所用的术语“抗原”。此外，本领域的技术人员将理解，抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本文所述的方面包括但不限于使用多于一个基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列可以以各种组合排列以引发所需的免疫应答。此外，技术人员将理解抗原完全不需要由“基因”编码。很明显，抗原可以是合成的或者可源自生物样品。这样的生物样品可包括但不限于组织样品、细胞或生物流体。
因此，本文所述的组合物可适于防护或治疗脊椎动物受试者以对抗多种疾病状态，例如病毒、细菌、真菌或寄生虫感染、癌症和自身免疫疾病。应当认识到，这些具体的疾病状态仅以举例的方式提及，并非旨在进行限制。
可与本文所述的组合物组合使用的合适抗原包括如本文所定义的任何抗原。抗原是可商购的，或者本领域技术人员能够生产抗原。抗原可以是经修饰的活微生物或灭活的微生物，或从微生物或其他细胞(包括但不限于肿瘤细胞)纯化的天然产物，合成产物，基因工程蛋白质、肽、多糖或类似产物，或过敏原。抗原部分也可以是蛋白质、肽、多糖或类似产物的亚基。抗原也可以是遗传抗原，即产生免疫应答的DNA或RNA。
可使用的抗原的代表包括但不限于，源自病毒、细菌、真菌、寄生虫和除自身免疫疾病外的其他传染原的天然、重组或合成产物，激素，或可用于预防性或治疗性疫苗的肿瘤抗原，以及过敏原。在一个实施方案中，抗原包括来自各种病毒如流感病毒、HIV、RSV、新城疫病毒(NDV)等的病毒样颗粒(VLP)。参见PCT/US2006/40862、PCT/US2004/022001、美国专利序列号11/582,540，美国专利序列号60/799,343，美国专利序列号60/817,402和美国专利序列号60/859,240，其全文以引用方式并入本文。在另一个实施方案中，抗原包括嵌合VLP。“嵌合VLP”指含有来自至少两种不同来源(生物体)的蛋白质或其部分的VLP。通常，其中一种蛋白质源自可驱动宿主细胞形成VLP的病毒。因此，在一个实施方案中，嵌合VLP包括RSV M蛋白。在另一个实施方案中，嵌合VLP包括NDV M蛋白。在另一个实施方案中，嵌合VLP包括流感病毒M蛋白。
病毒或细菌产物可以是生物体通过酶切产生的组分，或者可以是通过本领域的普通技术人员熟知的重组DNA技术产生的生物体的组分。
抗原的一些具体实例是衍生自由甲、乙、丙、丁和戊3型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、疱疹病毒1、2、6和7型、巨细胞病毒、水痘带状疱疹病毒、乳头瘤病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、副流感病毒、腺病毒、布尼亚病毒(例如汉坦病毒)、柯萨奇病毒、小RNA病毒、轮状病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、风疹病毒、乳头多瘤空泡病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒(多种类型)、腺病毒(多种类型)、副流感病毒(多种类型)、禽流感或大流行性流感病毒(多种类型)、季节性流感病毒、航运热病毒、西部和东部马脑脊髓炎病毒、日本乙型脑脊髓炎病毒、俄罗斯春夏季脑脊髓炎病毒、猪瘟病毒、新城疫病毒、禽痘病毒、狂犬病病毒、猫和犬瘟热病毒等病毒、慢脑病毒、劳斯肉瘤病毒(RSV)、乳头多瘤空泡病毒科、细小病毒科、细小RNA病毒科、痘病毒科(例如天花或牛痘病毒)、呼肠孤病毒科(例如轮状病毒)、逆转录病毒科(HTLV-I、HTLV-II、慢病毒)和披膜病毒科(风疹病毒属)导致的病毒感染的抗原。属于这些家族的病毒可以引起多种疾病或症状，包括但不限于：关节炎、细支气管炎、脑炎、眼部感染(例如，结膜炎、角膜炎)、慢性疲劳综合征、日本乙型脑炎、阿根廷出血热、基孔肯雅热、裂谷热、黄热病、脑膜炎、机会性感染(例如，AIDS)、肺炎、伯基特淋巴瘤、水痘、出血热、麻疹、流行性腮腺炎、副流感、狂犬病、普通感冒、脊髓灰质炎、白血病、风疹、性传播疾病、皮肤疾病(例如，卡波西氏病、疣)和病毒血症。
抗原也可源自细菌和真菌感染，例如：来源于导致TB和麻风病的分枝杆菌属(Mycobacteria)、肺炎球菌、需氧型革兰氏阴性杆菌、支原体、葡萄球菌感染、链球菌感染、沙门氏菌和衣原体、百日咳杆菌(B.pertussis)、波摩那钩端螺旋体(Leptospira pomona)和出血性黄疸螺旋体导致的感染的抗原。具体的实施方案包括甲型和乙型副伤寒沙门菌(S.Paratyphi)、白喉杆菌(C.diphtheriae)、破伤风梭菌(C.tetani)、肉毒梭菌(C.botulinum)、产气荚膜梭菌(C.perfringens)、鸣疽梭状芽胞杆菌(C.feseri)和其他气性坏疽菌、炭疽杆菌(B.anthracis)、鼠疫杆菌(P.pestis)、多杀巴斯德氏菌(P.multocida)、脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)、淋病双球菌(N.gonorrheae)、流感嗜血杆菌(Hemophilus influenzae)、放线菌(Actinomyces；例如诺卡氏菌属(Norcardia))、不动杆菌属、芽孢杆菌科(例如炭疽杆菌(Bacillus anthrasis))、拟杆菌属(Bacteroides；例如脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis))、皮炎芽生菌(Blastomycesdermatitidis)、博德特氏菌属(Bordetella)、疏螺旋体属(Borrelia；例如博氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi))、布鲁氏菌属(Brucella)、念珠菌(Candidia)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、衣原体属(Chlamydia)、球孢菌属(Coccidioides)、棒状杆菌(Corynebacterium；例如白喉棒状杆菌(Corynebacterium diptheriae))、隐球菌属(Cryptococcus)、Dermatocycoses、大肠杆菌(E.coli；例如产肠毒素大肠杆菌和肠出血性大肠杆菌)、肠杆菌属(Enterobacter；例如产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes))、肠杆菌科(克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙门氏菌属(Salmonella；例如伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis))、沙雷氏菌属(Serratia)、耶尔辛氏菌属(Yersinia)、志贺氏菌属(Shigella))、丹毒丝菌属(Erysipelothrix)、嗜血杆菌属(Haemophilus；例如乙型流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenza))、螺杆菌属(Helicobacter)、军团菌属(Legionella；例如嗜肺军团菌(Legionella pneumophila))、钩端螺旋体属(Leptospira)、李斯特菌属(Listeria；例如单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes))、支原体属(Mycoplasma)、分枝杆菌属(Mycobacterium；例如麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis))、弧菌属(Vibrio；例如霍乱弧菌(Vibrio cholerae))、巴斯德氏菌、变形杆菌属(Proteus)、假单胞菌属(Pseudomonas；例如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、立克次体科、螺旋体门(例如密螺旋体属(Treponema)物种、钩端螺旋体属(Leptospira)物种、疏螺旋体属(Borrelia)物种)、志贺氏菌属物种、脑膜炎双球菌、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、链球菌属(Streptococcus；例如肺炎链球菌以及一型、二型和三型链球菌)、解脲脲原体、波纹密螺旋体(Treponema pollidum)等；金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、疟原虫属(Plasmodium)物种(恶性疟原虫(Pl.falciparum)、间日疟原虫(Pl.vivax)等)、曲霉菌属(Aspergillus)物种、白色念珠菌(Candida albicans)、溶血巴斯德菌(Pasteurella haemolytica)、白喉棒状杆菌类毒素、脑膜炎球菌多糖、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertusis)、肺炎链球菌(肺炎球菌)多糖、破伤风梭菌(Clostridium tetani)类毒素、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、以及伤寒沙门氏菌、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)和曲霉菌属的灭活细胞。
抗原也可源自寄生性疟疾、利什曼病、锥虫病、弓形虫病、血吸虫病、丝虫病疟疾、阿米巴病、巴贝西虫病、球虫病、隐孢子虫病、双核阿米巴病、马锥虫病、外寄生虫、贾第鞭毛虫病、蠕虫病、泰勒虫病、毛滴虫和孢子虫(例如间日疟原虫、恶性疟原虫、三日疟原虫(Plasmodium malariae)、诺氏疟原虫(Plasmodium knowlesi)和卵形疟原虫(Plasmodiumovale))。这些寄生虫可引起多种疾病或症状，包括但不限于：疥疮、恙螨病、眼部感染、肠道疾病(例如，痢疾、贾第鞭毛虫病)、肝病、肺病、机会性感染(例如，AIDS相关)、疟疾、妊娠并发症和弓形虫病。
适用于本文所述的组合物的肿瘤相关抗原包括突变和非突变分子，其可指示单一肿瘤类型、由若干类肿瘤共享和/或与正常细胞相比在肿瘤细胞中特异性表达或过表达。除了蛋白质和糖蛋白，还记载了糖类、神经节苷脂、糖脂和粘蛋白的肿瘤特异性表达模式。用于本发明癌症疫苗的示例性肿瘤相关抗原包括癌基因、肿瘤抑制基因和具有肿瘤细胞特有的突变或重排的其他基因的蛋白产物、再活化的胚胎基因产物、癌胚抗原、组织特异性(但非肿瘤特异性)分化抗原、生长因子受体、细胞表面糖残基、外源病毒蛋白和许多其他自身蛋白。肿瘤相关抗原的具体实施方案包括，例如：突变抗原，如Ras p21原癌基因、肿瘤抑制基因p53和HER-2/neu和BCR-ab1癌基因的蛋白产物，以及CDK4、MUM1、半胱天冬酶8和β连环蛋白；过表达抗原，如半乳凝素4、半乳凝素9、碳酸酐酶、醛缩酶A、PRAME、Her2/neu、ErbB-2和KSA，癌胚胎抗原，例如甲胎蛋白(AFP)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)；自身抗原如癌胚抗原(CEA)，和黑素细胞分化抗原如Mart 1/Melan A、gp100、gp75、酪氨酸酶、TRP1和TRP2；前列腺相关抗原，例如PSA、PAP、PSMA、PSM-P1和PSM-P2；再活化的胚胎基因产物，如MAGE 1、MAGE3、MAGE 4、GAGE 1、GAGE 2、BAGE、RAGE，和其他癌睾丸抗原，如NY-ESO1、SSX2和SCP1；粘蛋白，如Muc-1和Muc-2；神经节苷脂如GM2、GD2和GD3，中性糖脂和糖蛋白如Lewis(y)和globo-H；以及糖蛋白，如Tn、Thompson-Freidenreich抗原(TF)和sTn。作为肿瘤相关抗原包括在本文中的还有全细胞和肿瘤细胞裂解物及其免疫原性部分，以及在B淋巴细胞的单克隆增殖上表达的用于抗B细胞淋巴瘤的免疫球蛋白独特型。肿瘤相关抗原和它们各自的肿瘤细胞靶点包括，例如，作为癌症抗原的细胞角蛋白，特别是细胞角蛋白8、18和19。上皮膜抗原(EMA)、EphA1、EphA2、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA10、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4、EphB6、人胚胎抗原(HEA-125)、人乳脂肪球、MBr1、MBr8、Ber-EP4、17-1A、C26和T16也是已知的癌抗原。结蛋白和肌肉特异性肌动蛋白是肌源性肉瘤的抗原。胎盘碱性磷酸酶、β-人绒毛膜促性腺激素和甲胎蛋白是滋养层和生殖细胞肿瘤的抗原。前列腺特异性抗原是前列腺癌的抗原，结肠腺癌的癌胚抗原。HMB-45是黑色素瘤的抗原。在宫颈癌中，有用的抗原可由人乳头瘤病毒编码。嗜铬粒蛋白-A和突触囊泡蛋白是神经内分泌和神经外胚层肿瘤的抗原。特别感兴趣的是形成具有坏死区的实体瘤块的侵袭性肿瘤。这种坏死细胞的裂解是抗原呈递细胞的抗原的丰富来源，因此本治疗可存在与常规化疗和/或放射治疗联合的有利用途。抗原可源自任何肿瘤或恶性细胞系。
抗原也可源自引起过敏的常见过敏原。过敏原包括源自各种人造或天然来源的有机或无机材料，如植物材料、金属、化妆品或洗涤剂中的成分、胶乳等。用于本文所述的组合物和方法的合适的过敏原的种类可包括但不限于花粉、动物皮屑、草、霉菌、灰尘、抗生素、刺痛性昆虫毒液和各种环境(包括化学品和金属)药物和食物过敏原。常见的树木过敏原包括来自棉白杨、胡杨、白蜡树、桦树、枫树、橡树、榆树、山核桃树和美洲山核桃树的花粉；常见的植物过敏原包括来自黑麦、豕草、长叶车前、酸模和藜的过敏原；植物接触过敏原包括来自毒橡树、毒葛和荨麻的过敏原；常见的草过敏原包括猫尾草、石茅、狗牙根草、羊茅草和早熟禾过敏原；常见的过敏原也可从霉菌或真菌中获得，如链格孢属(Alternaria)、镰孢菌属(Fusarium)、单孢枝霉属(Hormodendrum)、曲霉菌属、小多孢菌属(Micropolyspora)、毛霉菌属(Mucor)和嗜热放线菌(thermophilic actinomycetes)；青霉素和四环素是常见的抗生素过敏原；表皮过敏原可从室内或有机灰尘(通常来源于真菌)、从昆虫如屋螨(dermalphagoides pterosinyssis)、或从动物来源如羽毛以及猫和犬皮屑中获得；常见的食物过敏原包括牛奶和奶酪(乳制品)、蛋、小麦、坚果(例如花生)、海产品(例如贝类)、豌豆、豆和谷蛋白过敏原；常见的环境过敏原包括金属(镍和金)、化学品(甲醛、三硝基苯酚和松节油)、胶乳、橡胶、纤维(棉或羊毛)、粗麻布、染发剂、化妆品、洗涤剂和香水过敏原；常见的药物过敏原包括局部麻醉剂和水杨酸酯过敏原；抗生素过敏原包括青霉素和磺胺过敏原；常见的昆虫过敏原包括蜜蜂、黄蜂和蚂蚁毒液以及蟑螂杯状结构过敏原。经特别充分表征的过敏原包括但不限于Der pI过敏原(Hoyne等，1994年，Immunology，83:190-195)、蜂毒磷脂酶A2(PLA；Akdis等，1996年，J.Clin.Invest.，98:1676-1683)，桦树花粉过敏原Bet v1(Bauer等，1997年，Clin.Exp.Immunol.，107:536-541)和多表位重组草过敏原rKBG8.3(Cao等，1997年，Immunology，90:46-51)的主要和隐蔽表位。这些和其他合适的过敏原是可商购的和/或可按照已知技术作为提取物容易地制备。
抗原可以是纯化或部分纯化抗原的形式，并且可以源自任何上述抗原、抗原性肽、本领域已知和可获得的蛋白、以及可使用常规技术鉴定的其他抗原。抗原通常为其毒素或毒性特性已被降低或破坏的形式，并且当以适当形式被引入时，将诱导针对用于抗原制剂的特定微生物、提取物或微生物产物的免疫应答，或者在过敏原的情况下，将有助于减轻由于特定过敏原引起的过敏的症状。抗原可单独使用或组合使用；例如，多种细菌抗原、多种病毒抗原、多种细菌抗原、多种寄生虫抗原、多种细菌、病毒类毒素、多种肿瘤抗原、多种过敏原或任何前述产物的组合可与佐剂组合物组合以产生多价抗原组合物和/或疫苗。在本文所述的组合物中，抗原可以是包载在、吸附到组合物的囊泡组分中或与组合物的囊泡组分混合的抗原。
在一个实施方案中，用于本文所述组合物的合适抗原包括免疫原性差的抗原，例如疟疾抗原、登革热抗原和HIV抗原，或旨在赋予针对大流行性疾病的免疫性的抗原，例如流感抗原。本文所述或已知的任何此类抗原的组合预期用于本文所述的融合蛋白、融合蛋白对和纳米笼。
“编码”是指多核苷酸如基因、cDNA或mRNA中的特定核苷酸序列，在生物过程中，作为合成具有确定的核苷酸序列(例如rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列和由此产生的生物学性质的其他聚合物和大分子的模板的固有性质。因此，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因编码该蛋白质。核苷酸序列与mRNA序列相同且通常在序列表中提供的编码链和用作基因或cDNA转录的模板的非编码链均可被称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其他产物。
本文所用的术语“表达”定义为由其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
“分离的”是指从天然状态改变或去除。例如，在活动物中天然存在的核酸或肽不是“分离的”，但是与其天然状态的共存物质部分或完全分离的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以基本上纯化的形式存在，或可以存在于非天然环境中，例如宿主细胞。
除非另有说明，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括互为简并形式的并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列还可包括内含子，其程度使得编码蛋白质的核苷酸序列在某些形式中可含有内含子。
如本文所用，术语“调节”是指与不存在治疗或化合物的受试者中的应答水平相比，和/或与其他方面相同但未治疗的受试者中的应答水平相比，介导受试者中的应答水平的可检测的升高或降低。该术语涵盖扰乱和/或影响天然信号或应答，从而介导受试者(通常是人)的有益治疗应答。
术语“可操作地连接”是指调控序列和异源核酸序列之间的功能性连接，导致后者表达。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列存在功能性关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列可操作地连接。通常，可操作地连接的DNA序列是连续的，并且在需要连接两个蛋白质编码区的情况下，在相同的阅读框中。
免疫原性组合物的“肠胃外”给药包括例如皮下(s.c.)、静脉(i.v.)、肌内(i.m.)或胸骨内注射或输注技术。
本文所用的术语“多核苷酸”定义为核苷酸链。此外，核酸是核苷酸的聚合物。因此，如本文所用，核酸和多核苷酸是可互换的。本领域的技术人员具有核酸是多核苷酸，且可水解成单体“核苷酸”的一般知识。单体核苷酸可水解成核苷。如本文所用，多核苷酸包括但不限于通过本领域任何可用的方式获得的所有核酸序列，所述方式包括但不限于重组方式(即使用普通克隆技术和PCR等从重组文库或细胞基因组中克隆核酸序列等)以及通过合成方式。
如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可组成蛋白质或肽的序列的氨基酸的最大数目没有限制。多肽包括任何包括两个或多个通过肽键彼此连接的氨基酸的肽或蛋白质。如本文所用，该术语不仅指短链(在本领域中通常也被称为例如肽、寡肽和寡聚体)，也指长链(在本领域中通常被称为蛋白质，存在许多类型)。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽变体、经修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。所述多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。
如本文关于抗体所用，术语“特异性结合”是指识别特定抗原，但基本上不识别或结合样品中的其他分子的抗体。例如，特异性结合来自一个物种的抗原的抗体也可结合来自一个或多个物种的该抗原。但是，这种跨物种反应性本身并不改变抗体被分类为特异性的。在另一个实例中，特异性结合抗原的抗体也可结合抗原的不同等位基因形式。然而，这种交叉反应性本身并不改变抗体被分类为特异性的。在一些情况下，术语“特异性结合”可用于指抗体、蛋白质或肽与第二化学物质的相互作用，以意指该相互作用取决于该化学物质上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体识别并结合特定的蛋白质结构而不是一般的蛋白质。如果抗体对表位“A”是特异性的，则在含有被标记的“A”和抗体的反应中，含有表位A(或游离的、未标记的A)的分子的存在将减少结合到抗体的被标记的A的量。
术语“治疗有效量”、“有效量”或“足够量”是指当给予受试者(包括哺乳动物，例如人)时，足以实现期望结果的量，例如有效引起保护性免疫应答的量。本文所述的化合物的有效量可根据诸如免疫原、受试者的年龄、性别和体重的因素而变化。如技术人员所理解的，可调整剂量或治疗方案以提供最佳治疗反应。例如，给予治疗有效量的本文所述的融合蛋白在某些方面足以增强针对病原体(如疟原虫或HIV)的免疫力。在另一些方面，给予治疗有效量的本文所述的融合蛋白足以治疗疾病或病症，例如癌症、HIV、疟疾或自身免疫疾病。在再一些方面，给予治疗有效量的本文所述的融合蛋白足以充当佐剂以增加疫苗的有效性。在又一些方面，给予治疗有效量的本文所述的融合蛋白足以预防罹患疾病或受到感染。
此外，给予受试者治疗有效量的治疗方案可由单次给药组成，或另选地包括一系列施用。治疗期的时长取决于多种因素，例如免疫原、受试者的年龄、药物的浓度、患者对药物的反应性或其组合。还应理解，用于治疗的药物的有效剂量可在特定治疗方案的过程中增加或减少。由此可产生剂量的变化，并且通过本领域已知的标准诊断测定变得显而易见。在一些方面，可在用常规疗法治疗目标疾病或病症(如疟疾、HIV或癌症)之前、期间或之后给予本文所述的融合蛋白。例如，本文所述的融合蛋白可特别用于与免疫疗法组合以治疗癌症。
如本文所用，术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已用外源核酸转染、转化或转导的细胞。该细胞包括原代受试者细胞及其后代。
如本文所用，短语“在转录控制下”或“可操作地连接”是指启动子相对于多核苷酸处于正确的位置和取向，以控制由RNA聚合酶执行的转录的起始和多核苷酸的表达。
“载体”是包括分离的核酸且可用于将分离的核酸递送至细胞内部的物质组合物。本领域已知许多载体，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制质粒或病毒。该术语还应被理解为包括有利于核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的示例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。
如本文所用的术语“受试者”是指动物界的任何成员，通常为哺乳动物。术语“哺乳动物”是指被分类为哺乳动物的任何动物，包括人、其他高级灵长类、家畜和农场动物，以及动物园动物、运动动物或宠物动物，例如狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔等。通常，哺乳动物是人。
与一种或多种其他治疗剂“联合”给药包括同时(并行)和以任何顺序连续给药。
术语“药学上可接受的”是指化合物或化合物的组合与药用制剂的其余成分相容，并且根据已制定的政府标准(包括美国食品和药物管理局公布的标准)给予人时通常是安全的。
术语“药学上可接受的载体”包括但不限于溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂、抗真菌剂、等渗剂和/或吸收延迟剂等。药学上可接受的载体的使用是公知的。
术语“佐剂”是指存在于疫苗中并增强对存在于疫苗中的抗原的免疫应答的化合物或混合物。例如，佐剂可增强对如本文所考虑的疫苗中存在的多肽或对如本文所考虑的其免疫原性片段或变体的免疫应答。佐剂可作为缓慢释放抗原的组织贮库，也可作为非特异性增强免疫应答的淋巴样系统激活剂。可使用的佐剂的示例包括MPL-TDM佐剂(单磷酰脂A/合成海藻糖二杆菌分枝菌酸酯，例如可从GSK Biologics获得)。另一种合适的佐剂是免疫刺激佐剂AS021/AS02(GSK)。这些免疫刺激性佐剂被配制成产生强T细胞应答，并且包括QS-21、来自皂树(Quillay saponaria)的皂苷、TL4配体、单磷酰脂A，以及脂质或脂质体载体。其他佐剂包括但不限于非离子嵌段共聚物佐剂(例如CRL 1005)、磷酸铝(例如AlPO4)、R-848(Th1样佐剂)、咪喹莫特、PAM3CYS、聚(I:C)、洛索立宾、BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)、CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、霍乱毒素衍生抗原(例如CTA1-DD)、脂多糖佐剂、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、皂苷、矿物凝胶例如氢氧化铝、表面活性物质例如溶血卵磷脂、普流尼克多元醇、聚阴离子、肽、油或烃的水乳液(例如可从诺华疫苗获得的MF59或Montanide ISA 720)、钥孔血蓝蛋白和二硝基苯酚。
“变体”是由于在对比序列中的一个或多个氨基酸残基的插入、缺失、修饰和/或取代而具有与比较序列不同的序列的生物活性融合蛋白、抗体或其片段。变体通常具有与对比序列相比小于100％的序列同一性。然而，通常，生物活性变体将具有与对比序列相比具有至少约70％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，例如至少约71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。变体包括保留了对比序列的一定水平的生物活性的至少10个氨基酸的肽片段。变体还包括其中在对比序列的N或C末端或内部添加了一个或多个氨基酸残基的多肽。变体还包括其中多个氨基酸残基缺失并且任选地被一个或多个氨基酸残基取代的多肽。变体也可被共价修饰，例如通过用非天然存在的氨基酸的部分取代或通过修饰氨基酸残基以产生非天然存在的氨基酸。
“百分比氨基酸序列同一性”在本文中定义为在比对序列并在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性之后，且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分，候选序列中与目标序列(例如本发明的多肽)中的残基相同的氨基酸残基的百分比。候选序列的N末端、C末端或内部延伸、缺失或插入均不应被解释为影响序列同一性或同源性。用于比对的方法和计算机程序是本领域公知的，例如“BLAST”。
“活性的”或“活性”在此指本文所述融合蛋白的生物学和/或免疫学活性，其中“生物学”活性指由融合蛋白引起的生物学功能(抑制或刺激)。
本文所述的融合蛋白可包括修饰。这样的修饰包括但不限于与效应分子如抗疟疾药物或佐剂偶联。修饰还包括但不限于与可检测的报告部分偶联。延长半衰期的修饰(例如聚乙二醇化)也包括在内。蛋白质和非蛋白质药物可通过本领域已知的方法与融合蛋白偶联。偶联方法包括直接连接、通过共价连接的接头连接和特异性结合成对成员(例如抗生物素蛋白-生物素)。这些方法包括，例如，Greenfield等，Cancer Research，50:6600-6607，1990年所述的方法，该文献以引用方式并入本文；以及Amon等，Adv.Exp.Med.Biol.，303:79-90，1991年和Kiseleva等，Mol.Biol.(USSR)，25:508-514，1991年所述的方法，两文献均以引用方式并入本文。
融合蛋白
本文描述了融合蛋白。融合蛋白包括与生物活性部分连接的纳米笼单体的第一纳米笼单体亚基。该融合蛋白与包括第二纳米笼单体亚基的蛋白质一起自组装以形成纳米笼单体。多个此类融合蛋白对自组装以形成纳米笼。如此，生物活性部分可修饰组装的纳米笼的内表面、组装的纳米笼的外表面或两者。
生物活性部分可以是能够作为融合蛋白的一部分的任何部分，并且通常是蛋白质。通常，生物活性部分包括：抗体或其片段、抗原、可检测部分、药剂、诊断剂或它们的组合。
当生物活性部分是抗体及其片段时，可包括例如Fc片段的一条或两条链。如将理解的，该Fc片段可衍生自任何类型的抗体，但通常是gG1 Fc片段。该Fc片段还可包括一个或多个调节融合蛋白和/或所得的包括融合蛋白的组装的纳米笼的半衰期的突变，诸如LS、YTE、LALA和/或LALAP。例如，半衰期可以以分钟、天、周或甚至月为单位。
此外，设想了本文所述的融合蛋白和纳米笼中的其他替代方案，包括Fc序列修饰和添加其他试剂(例如，人血清白蛋白肽序列)，这些替代方案允许生物利用度的变化并且将被技术人员所理解。此外，本文所述的融合蛋白和纳米笼可被调节序列或通过添加其他试剂来进行调节以减弱其免疫原性和抗药物反应(治疗性，例如，将序列与宿主进行匹配，或者添加免疫抑制疗法[诸如，例如，当给予英利昔单抗用于治疗类风湿性关节炎或诱导新生儿的耐受性时给予降低FVIII抑制剂的发生率的主要策略甲氨蝶呤(参见：DiMicheleDM，Hoots WK，Pipe SW，Rivard GE，Santagostino E，International workshop on immunetolerance induction:consensus recommendations，Haemophilia，2007年，13:1-22，其全文以引用方式并入本文)]，或者增强免疫应答(例如，用于疫苗的细菌序列)。
在其他方面，当生物活性部分是抗体或其片段时，可包括例如Fab片段的重链和/或轻链。该抗体或其片段可包括例如scFab片段、scFv片段或sdAb片段。应当理解，任何抗体或其片段均可用于本文所述的融合蛋白。
通常，本文所述的融合蛋白与Fab轻链和/或重链缔合，该Fab轻链和/或重链可与该融合蛋白分开或连续产生。
在抗体或其片段包括两条链的情况下，诸如在Fc片段的情况下第一链和第二链，或者诸如重链和轻链，该两条链任选地由接头分开。接头可以是柔性的或刚性的，但它通常是柔性的，以允许链适当地折叠。尽管应当理解该接头的长度将根据纳米笼单体和生物活性部分的序列以及融合蛋白的三维构象而变化，但该接头通常足够长以赋予融合蛋白一些柔性。因此，该接头通常为约1个至约30个氨基酸残基，诸如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个至约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸残基，诸如约8个至约16个氨基酸残基，诸如8个、10个或12个氨基酸残基。
该接头可以是任何氨基酸序列，并且在一个典型的示例中，接头包括GGS重复，并且更通常地，该接头包括约2个、3个、4个、5个或6个GGS重复，诸如约4个GGS重复。在一些具体方面，该接头包括与以下序列具有至少70％(诸如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，或由其组成：
GGSSGSGSGSTGTSSSGTGTSAGTTGTSASTSGSGSGGGGGSGGGGSAGGTATAGASSGSGSSGSSSSGGTG。
在一些典型的方面，该抗体或其片段特异性结合到与抗体可预防和/或抗体可治疗病症相关的抗原。例如，结合到该抗体或其片段的抗原可与以下相关：传染原，包括病毒(例如，HIV(包括HIV-1)、流感病毒、RSV、轮状病毒)、细菌(例如，TB、艰难梭菌)、寄生虫(例如，疟疾)、真菌或酵母；癌症(例如，CD19、CD22、CD79、BCMA或CD20)，包括实体癌症和液体癌症；或免疫疾病，包括自身免疫疾病。通常，该抗原与HIV-1相关，并且该抗体或其片段包括例如ibalizumab-A12P、10E8、10E8.v4、N49P7、PGDM1400、10-1074、VRC01或它们的组合。
在具体的示例中，该抗体或其片段包括与以下序列中的一个或多个序列具有至少70％(诸如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，或由其组成：
Fc链1：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK；
Fc链2：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK；
Ibalizumab-A12P轻链：
DIVMTQSPDSLPVSLGERVTMNCKSSQSLLYSTNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQYYSYRTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC；
Ibalizumab-A12P重链：
QVQLQQSGPEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVIHWVRQKPGQGLDWIGYINPYNDGTDYDEKFKGKATLTSDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREKDNYATGAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGSR；
10E8.v4轻链：
SELTQDPAVSVALKQTVTITCRGDSLRSHYASWYQKKPGQAPVLLFYGKNNRPSGIPDRFSGSASGNRASLTITGAQAEDEADYYCSSRDKSGSRLSVFGGGTKLTVLSQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTEC；
10E8.v4重链：
EVRLVESGGGLVKPGGSLRLSCSASGFDFDNAWMTWVRQPPGKGLEWVGRITGPGEGWSVDYAESVKGRFTISRDNTKNTLYLEMNNVRTEDTGYYFCARTGKYYDFWSGYPPGEEYFQDWGQGTLVIVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCSR；
N49P7轻链：
QSALTQPRSVSASPGQSVTISCTGTHNLVSWCQHQPGRAPKLLIYDFNKRPSGVPDRFSGSGSGGTASLTITGLQDDDDAEYFCWAYEAFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTEC；
N49P7重链：
ADLVQSGAVVKKPGDSVRISCEAQGYRFPDYIIHWIRRAPGQGPEWMGWMNPMGGQVNIPWKFQGRVSMTRDTSIETAFLDLRGLKSDDTAVYYDRSNGSGKRFESSNWFLDLWGRGTAVTIQSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDSR；
PGDM1400轻链：
DFVLTQSPHSLSVTPGESASISCKSSHSLIHGDRNNYLAWYVQKPGRSPQLLIYLASSRASGVPDRFSGSGSDKDFTLKISRVETEDVGTYYCMQGRESPWTFGQGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC；
PGDM1400重链：
QAQLVQSGPEVRKPGTSVKVSCKAPGNTLKTYDLHWVRSVPGQGLQWMGWISHEGDKKVIVERFKAKVTIDWDRSTNTAYLQLSGLTSGDTAVYYCAKGSKHRLRDYALYDDDGALNWAVDVDYLSNLEFWGQGTAVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDSR；或
它们的组合。
在进一步的方面，该抗体或其片段偶联至或缔合至另外的部分，诸如抗原、可检测部分(例如，小分子、荧光分子、放射性同位素或磁性颗粒)、药剂、诊断剂或它们的组合，并且可包括例如抗体药物偶联物。
在其中生物活性部分是抗原的方面，抗原可与例如疫苗可预防的病症和/或疫苗可治疗的病症相关。在此类情况下，该抗原可与以下相关，例如：传染原，包括病毒、细菌、寄生虫、真菌或酵母；癌症，包括实体癌症和液体癌症；或免疫疾病，包括自身免疫疾病。
在其中生物活性部分是可检测部分的方面，可检测部分可包括荧光蛋白，诸如GFP、EGFP、紫黄晶和/或基于黄素的荧光蛋白诸如LOV蛋白(诸如iLOV)。
在其中生物活性部分是药剂的方面，该药剂可包括例如小分子、肽、脂质、碳水化合物或毒素。
在一些典型的方面，由本文所述的融合蛋白组装的纳米笼包括约3个至约100个纳米笼单体，诸如约3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、55、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96或98个至约4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、55、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98或100个纳米笼单体，诸如24个、32个或60个纳米笼单体。纳米笼单体可以是任何已知的天然的、合成的或部分合成的纳米笼单体，并且在一些方面选自铁蛋白、脱铁铁蛋白、封装蛋白、SOR、二氧四氢蝶啶合酶、丙酮酸脱氢酶、羧基体、穹窿体蛋白、GroEL、热休克蛋白、E2P、MS2外壳蛋白、其片段，以及其变体。通常，纳米笼单体是铁蛋白或脱铁铁蛋白。
当选择脱铁铁蛋白作为纳米笼单体时，通常第一纳米笼单体亚基和第二纳米笼单体亚基可互换地包括脱铁铁蛋白的“N”区和“C”区。应当理解，其他纳米笼单体可被分成两个亚基，非常类似于如本文所述的脱铁铁蛋白，使得亚基可自组装并且分别适于与生物活性部分融合。
通常，脱铁铁蛋白的“N”区包括与以下序列具有至少70％(诸如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，或由其组成：
MSSQIRQNYSTDVEAAVNSLVNLYLQASYTYLSLGFYFDRDDVALEGVSHFFRELAEEKREGYERLLKMQNQRGGRALFQDIKKPAEDEW。
通常，脱铁铁蛋白的“C”区包括与以下序列具有至少70％(诸如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，或由其组成：
GKTPDAMKAAMALEKKLNQALLDLHALGSARTDPHLCDFLETHFLDEEVKLIKKMGDHLTNLHRLGGPEAGLGEYLFERLTLRHD。
在一些方面，本文所述的融合蛋白还包括在纳米笼单体亚基和生物活性部分之间的接头，非常类似于上述接头。同样，该接头可以是柔性的或刚性的，但它通常是柔性的，以允许生物活性部分保留活性并允许纳米笼单体亚基对保留自组装特性。尽管应当理解该接头的长度将根据纳米笼单体和生物活性部分的序列以及融合蛋白的三维构象而变化，但该接头通常足够长以赋予融合蛋白一些柔性。因此，该接头通常为约1个至约30个氨基酸残基，诸如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个至约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸残基，诸如约8个至约16个氨基酸残基，诸如8个、10个或12个氨基酸残基。
该接头可以是任何氨基酸序列，并且在一个典型的示例中，接头包括GGS重复，并且更通常地，该接头包括约2个、3个、4个、5个或6个GGS重复，诸如约4个GGS重复。在一些具体方面，该接头包括与以下序列具有至少70％(诸如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，或由其组成：
ASTASSASSGGGGGGSGGSGGSGGS。
类似地，融合蛋白还可包括用于改善改融合蛋白的一个或多个属性的C末端接头。在一些方面，该接头包括GGS重复，并且更通常地，该接头包括约2个、3个、4个、5个或6个GGS重复，诸如约4个GGS重复。在一些具体的方面，该C末端接头包括与以下序列具有至少70％(诸如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，或由其组成：
GGSGGSGGSGGSGGGASGGS。
本文还描述了上述融合蛋白的融合蛋白对，其中融合蛋白对自组装以形成纳米笼单体，其中第一纳米笼单体亚基和第二纳米笼单体亚基融合至不同的生物活性部分。这为由该亚基对组装的单个纳米笼单体提供多价性和/或多特异性。
在某些方面，融合蛋白还可包括抗原。这些方面在国际专利申请号WO 2019/023812中有明确的描述，其全文以引用方式并入本文。简言之，在这些方面，该抗原具有至少第一抗体结合表位和第二抗体结合表位；以及对至少第一抗原表位有特异性的抗体或其片段。抗体或其片段与第一抗原表位的结合呈递用于结合抗原结合部分的第二抗原表位，并且/或者该第一抗体结合表位与该抗体或其片段结合，并且其中在该抗体或其片段的情形下所述结合呈递所述第二抗体结合表位。
在其他方面，抗体或其片段可针对任何抗原，诸如上文列出的那些抗原。通常，抗原源自癌症或传染原，诸如甲型、乙型、丙型肝炎、HIV、分枝杆菌、疟疾病原体、SARS病原体、疱疹病毒、流感病毒、脊髓灰质炎病毒，或者源自细菌病原体诸如衣原体属和分枝杆菌，或者源自自身反应性B细胞或用于共募集和细胞毒性杀伤的任何T细胞。
本文所述的融合蛋白可另选地用作治疗剂或诊断剂。因此，在一些方面，抗体或其片段可对例如肿瘤抗原或自身抗原有特异性。
基本上相同的序列可包括一个或多个保守氨基酸突变。本领域已知，参考序列上的一个或多个保守氨基酸突变可产生在生理、化学或功能特性上与该参考序列相比没有实质性改变的突变肽；在这种情况下，该参考序列和突变序列将被认为是“基本上相同的”多肽。保守氨基酸突变可包括氨基酸的插入、缺失或取代；“保守氨基酸取代”在本文中被定义为氨基酸残基被具有类似化学特性(例如，大小、电荷或极性)的另一氨基酸残基取代。
在非限制性示例中，保守突变可以是氨基酸取代。此类保守氨基酸取代可用同一组中的另一个氨基酸取代碱性、中性、疏水性或酸性氨基酸。术语“碱性氨基酸”是指具有大于7的侧链pK值、在生理pH下通常带正电荷的亲水性氨基酸。碱性氨基酸包括组氨酸(His或H)、精氨酸(Arg或R)和赖氨酸(Lys或K)。术语“中性氨基酸”(也称为“极性氨基酸”)是指具有在生理pH下不带电荷的侧链的亲水性氨基酸，但其具有至少一个其中由两个原子共用的电子对被该两个原子中的一个原子更紧密地持有的键。极性氨基酸包括丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、半胱氨酸(Cys或C)、酪氨酸(Tyr或Y)、天冬酰胺(Asn或N)和谷氨酰胺(Gln或Q)。术语“疏水性氨基酸”(也称为“非极性氨基酸”)是指包括根据Eisenberg归一化共识疏水性量表(1984年)表现出大于零的疏水性的氨基酸。疏水氨基酸包括脯氨酸(Pro或P)、异亮氨酸(Ile或I)、苯丙氨酸(Phe或F)、缬氨酸(Val或V)、亮氨酸(Leu或L)、色氨酸(Trp或W)、甲硫氨酸(Met或M)、丙氨酸(Ala或A)和甘氨酸(Gly或G)。
“酸性氨基酸”是指具有小于7的侧链pK值、在生理pH下通常带负电荷的亲水性氨基酸。酸性氨基酸包括谷氨酸(Glu或E)和天冬氨酸(Asp或D)。
使用序列同一性来评估两个序列的相似性；通过计算当对两个序列进行比对以获得残基位置之间的最大对应性时相同的残基的百分比来确定序列同一性。任何已知的方法可用于计算序列同一性；例如，计算机软件可用于计算序列同一性。不希望进行限制，序列同一性可通过软件诸如由瑞士生物信息学研究所(Swiss Institute of Bioinformatics)维护的NCBI BLAST2服务(亦可见ca.expasy.org/tools/blast/)、BLAST-P、Blast-N或FASTA-N来计算，或者通过本领域已知的任何其他合适的软件来计算。
本发明的基本上相同的序列可具有至少85％的同一性；在另一个示例中，基本相同的序列可以是与本文所述的序列在氨基酸水平上具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其间的任何百分比)同一性的序列。在一些具体的方面，基本上相同的序列保留了参考序列的活性和特异性。在非限制性实施方案中，序列同一性的差异可能是由于保守氨基酸突变。
本发明的多肽或融合蛋白也可包括另外的序列以帮助它们的表达、检测或纯化。可使用本领域技术人员已知的任何此类序列或标签。例如，并且不希望进行限制，该融合蛋白可包括靶向序列或信号序列(例如，但不限于ompA)、检测标签、示例性标签盒包括Strep标签或其任何变体；参见，例如，美国专利号7,981,632，His标签、具有序列基序DYKDDDDK的Flag标签、Xpress标签、Avi标签、钙调蛋白标签、聚谷氨酸标签、HA标签、Myc标签、Nus标签、S标签、SBP标签、Softag 1、Softag 3、V5标签、CREB-结合蛋白(CBP)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、绿色荧光蛋白(GFP)、硫氧还蛋白标签，或它们的任意组合；纯化标签(例如，但不限于His5或His6)，或它们的组合。
在另一个示例中，该另外的序列可以是生物素识别位点，诸如Cronan等在WO 95/04069中或者Voges等在WO/2004/076670中所述。如本领域技术人员还已知的，接头序列可与该另外的序列或标签联合使用。
更具体地，标签盒可包括能以高亲和力或高亲合力特异性结合到抗体的胞外组分。在单链融合蛋白结构中，标签盒可位于(a)连接区域的氨基末端的紧邻处，(b)插入在接头模块之间并连接接头模块，(c)结合结构域的羧基末端的紧邻处，(d)插入在结合结构域(例如，scFv或scFab)与效应结构域之间并连接二者，(e)插入在结合结构域亚基之间并连接结合结构域亚基，或者(f)在单链融合蛋白的氨基末端处。在某些实施方案中，一个或多个连接氨基酸可以被设置在标签盒与疏水部分之间并连接二者，或者被设置在标签盒与连接区域之间并连接二者，或者被设置在标签盒与接头模块之间并连接二者，或者被设置在标签盒与结合结构域之间并连接二者。
本文还涵盖使用各种方法固定在表面上的分离的或纯化的融合蛋白、多肽或它们的片段；例如，并且不希望进行限制，该多肽可以通过His标签偶联、生物素结合、共价结合、吸附等与表面连接或偶联。该固体表面可以是任何合适的表面，例如但不限于微量滴定板的孔表面、表面等离子体共振(SPR)传感器芯片的通道、膜、珠(诸如基于磁性的珠或基于琼脂糖的珠或其他层析树脂)、玻璃、薄膜或任何其他有用的表面。
在其他方面，该融合蛋白可与货物分子连接；该融合蛋白可将该货物分子递送至期望的位点，并且可使用本领域已知的任何方法(重组技术、化学偶联、螯合等)来与该货物分子连接。该货物分子可以是任何类型的分子，诸如治疗剂或诊断剂。例如，并且不希望以任何方式进行限制，该治疗剂可以是放射性同位素，其可用于放射免疫疗法；毒素，诸如免疫毒素；细胞因子，诸如免疫细胞因子；细胞毒素；细胞凋亡诱导剂；酶；用于免疫治疗的抗癌抗体；或本领域已知的任何其他合适的治疗性分子。另选地，诊断剂可包括但决不限于：放射性同位素、顺磁标记诸如钆或氧化铁、荧光基团、近红外(NIR)荧光染料或染料(诸如Cy3、Cy5.5、Alexa680、Dylight680或Dylight800)、融合至可检测的基于蛋白质的分子的亲和标记(例如，生物素、抗生物素蛋白等)，或者可通过成像方法检测的任何其他合适的试剂。在具体的非限制性示例中，该融合蛋白可与荧光剂诸如FITC连接，或者遗传性地融合至增强型绿色荧光蛋白(EGFP)。
在一些方面，该货物分子是蛋白质并且融合至该融合蛋白，使得该货物分子被包含在该纳米笼内部。在其他方面，该货物分子不融合至该融合蛋白并且被包含在该纳米笼内部。该货物分子通常是蛋白质、小分子、放射性同位素或磁性颗粒。
本文所述的融合蛋白特异性结合其靶标。“抗体特异性”是指抗体对抗原的特定表位的选择性识别，本文所述的抗体或片段的抗体特异性可基于亲和力和/或亲合力来确定。由抗原和抗体之间的解离平衡常数(KD)表示的亲和力测量抗原决定簇(表位)和抗体结合位点之间的结合强度。亲合力是抗体与其抗原之间的结合强度的量度。抗体通常以10-5M至10-11M的KD结合。任何大于10-4M的KD通常被认为指示非特异性结合。该KD值越小，该抗原决定簇与该抗体结合位点之间的结合强度就越强。在一些方面，本文所述的抗体具有小于10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10-12M的KD。
本文还描述了纳米笼，该纳米笼包括至少一个本文所述的融合蛋白和至少一个与该融合蛋白自组装以形成纳米笼单体的第二纳米笼单体亚基。此外，本文描述了融合蛋白对，其中融合蛋白对自组装以形成纳米笼单体，并且其中第一纳米笼单体亚基和第二纳米笼单体亚基融合至不同的生物活性部分。
应当理解，该纳米笼可由以下自组装而成：多个相同的融合蛋白、多个不同的融合蛋白(并因此该纳米笼是多价的和/或多特异性的)、融合蛋白和野生型蛋白的组合，以及它们的任何组合。例如，该纳米笼可通过本文所述的至少一个融合蛋白与至少一个用于免疫治疗的抗癌抗体组合来进行内部修饰和/或外部修饰。在一些典型的方面，约20％至约80％的该纳米笼单体包括本文所述的融合蛋白。鉴于本文所述的模块化解决方案，该纳米笼理论上可包括多达纳米笼中的单体两倍的生物活性部分，因为每个纳米笼单体可被分成两个亚基，每个亚基可独立地结合不同的生物活性部分。应当理解，可利用这种模块性实现如本文在具体示例中所述的生物活性部分的任何期望的比率，在一些具体示例中，四种不同生物活性部分为4:2:1:1比率。例如，本文所述的纳米笼可包括至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个不同的生物活性部分。如此，该纳米笼可以是多价的和/或多特异性的，并且其程度可以相对容易地被控制。
在一些方面，本文所述的纳米笼还可包括至少一个完整的纳米笼单体，该纳米笼单体任选地融合至可与本文所述的与纳米笼单体亚基连接的生物活性部分相同或不同的生物活性部分。
在典型的方面，本文所述的纳米笼包括第一融合蛋白、第二融合蛋白和第三融合蛋白，以及至少一个任选地融合至生物活性部分的完整的纳米笼单体，其中该第一融合蛋白、该第二融合蛋白和该第三融合蛋白的该生物活性部分和该完整纳米笼单体的该生物活性部分彼此均不相同。
更典型地，该第一融合蛋白、该第二融合蛋白和该第三融合蛋白各自包括融合至N铁蛋白或C铁蛋白的抗体或其片段，其中该第一融合蛋白、该第二融合蛋白和该第三融合蛋白中的至少一个融合至N铁蛋白，并且该第一融合蛋白、该第二融合蛋白和该第三融合蛋白中的至少一个融合至C铁蛋白。例如，该第一融合蛋白的抗体或其片段通常是Fc片段；该第二融合蛋白和该第三融合蛋白通常各自包括对病毒(诸如HIV)的不同抗原有特异性的抗体或其片段，或者该第二融合蛋白和该第三融合蛋白中的一个包括对病毒(诸如HIV)的抗原有特异性的抗体或其片段，并且该第三融合蛋白包括对不同抗原(诸如CD4受体)有特异性的抗体或其片段；并且该完整的纳米笼单体融合至对另一种不同的抗原，任选地为相同的病毒(诸如HIV)的不同抗原有特异性的生物活性部分。
在一些方面，该第二融合蛋白的抗体或其片段是N49P7或iMab A12P；并且该第三融合蛋白的抗体或其片段是10E8v4。在一个典型的方面，本文所述的纳米笼包括任选地为4:2:1:1比率的以下四种融合蛋白：
a.融合至全长铁蛋白的PGDM1400(任选地为scPGDM1400)；
b.融合至N铁蛋白的Fc(任选地为scFc)；
c.融合至C铁蛋白的N49P7或iMab A12P(任选地为scN49P7或sciMab A12P)；和
d.融合至C铁蛋白的10E8v4(任选地为sc10E8v4)。
在一些方面，本文所述的纳米笼包括与以下序列中的一个或多个具有至少70％(诸如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，或由其组成，其中铁蛋白亚基以粗体示出，接头用下划线标出，轻链以斜体示出，并且重链以小写字母示出：
a.PGDM1400-hFerr：
Figure GDA0003734850320000371
b.Fc-N-hFerr LS
Figure GDA0003734850320000372
Figure GDA0003734850320000381
c1.N49P7-C-hFerr
Figure GDA0003734850320000382
c2.Ibalizumab-A12P-C-hFerr
Figure GDA0003734850320000383
d.10E8.v4-C-hFerr
Figure GDA0003734850320000384
Figure GDA0003734850320000391
应当理解，通常本文所述的纳米笼是中空的，因此能够携带货物分子诸如药剂、诊断剂和/或成像剂。通常，该货物分子不融合至该融合蛋白并且被包含在该纳米笼内部，然而，该货物分子可另选地为蛋白质并且融合至该融合蛋白，使得该货物分子被包含在该纳米笼内部。
在一些方面，该货物分子被包含在内部以提供T细胞表位，但任选地不提供B细胞表位。或者，该货物分子融合至该融合蛋白并且被包含在内部以提供T细胞表位，但任选地不提供B细胞表位。
该货物分子可以是荧光蛋白，诸如GFP、EGFP、紫黄晶和/或基于黄素的荧光蛋白诸如LOV蛋白(诸如iLOV)，并且/或者该货物分子可以是小分子、放射性同位素或磁性颗粒。
此外，纳米笼还可包括在表面上的抗原，该抗原可表达为具有纳米笼单体的融合蛋白。
本文还描述了包括本文所述的纳米笼的疫苗，以及包括该纳米笼的组合物，诸如治疗性组合物或预防性组合物。本文还描述了用于治疗和/或预防疾病或病症的相关方法和用途，其中该方法或用途包括给予有需要的受试者本文所述的纳米笼、疫苗或组合物。该纳米笼可用于治疗生物活性疗法，或更具体地，抗体疗法可用的任何疾病或病症，但例如，该疾病或病症通常是癌症、感染性疾病诸如HIV、疟疾、流感、RSV、轮状病毒或自身免疫疾病。
本文还描述了编码本文所述的融合蛋白和多肽的核酸分子，以及包括该核酸分子的载体和包括该载体的宿主细胞。
编码本文所述的融合蛋白的多核苷酸包括具有与本发明的多核苷酸的核酸序列基本上相同的核酸序列的多核苷酸。“基本上相同的”核酸序列在本文中定义为当两个序列进行最佳比对(具有适当的核苷酸插入或缺失)并且进行比较以确定两个序列之间的核苷酸的精确匹配时，与另一个核酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％同一性的序列。
编码抗体片段的多核苷酸的合适的来源包括表达全长抗体的任何细胞，诸如杂交瘤和脾细胞。如上所述，该片段自身可用作抗体等同物，或可重组成等同物。本节中描述的DNA缺失和重组可通过已知的方法进行，诸如上文列出的公开专利申请中名称为“抗体的功能等同物”的章节中描述的方法，以及/或者诸如下文所述的其他标准DNA重组技术。DNA的另一个来源是由噬菌体展示文库产生的单链抗体，如本领域已知的。
另外，本文提供了包含如前文所述的多核苷酸序列的表达载体，该多核苷酸序列可操作地连接至表达序列、启动子序列和增强子序列。已经开发了用于在原核(诸如细菌)和真核系统(包括但不限于酵母和哺乳动物细胞培养系统)中有效合成抗体多肽的各种表达载体。本发明的载体可包括染色体、非染色体和合成的DNA序列的片段。
可使用任何合适的表达载体。例如，原核克隆载体包括大肠杆菌的质粒，诸如colEl、pCRl、pBR322、pMB9、pUC、pKSM和RP4。原核载体还包括噬菌体DNA(诸如M13和其他丝状单链DNA噬菌体)的衍生物。用于酵母的载体的示例是2μ质粒。用于在哺乳动物细胞中表达的合适载体包括SV-40的公知衍生物、腺病毒、源自逆转录病毒的DNA序列和源自诸如上文所述的功能性哺乳动物载体的组合的穿梭载体，以及功能性质粒和噬菌体DNA。
另外的真核表达载体是本领域已知的(例如，P J.Southern和P.Berg，J.Mol.Appl.Genet，1:327-341，1982年；Subramani等，Mol.Cell.Biol，1:854-864，1981年；Kaufinann和Sharp，"Amplification And Expression of Sequences Cotransfectedwith a Modular Dihydrofolate Reductase Complementary DNA Gene"，J.Mol.Biol，159:601-621，1982年；Kaufhiann和Sharp，Mol.Cell.Biol，159:601-664，1982年；Scahill等，"Expression And Characterization Of The Product Of A Human ImmuneInterferon DNA Gene In Chinese Hamster Ovary Cells"，Proc.Nat'lAcad.Sci USA，80:4654-4659，1983年；Urlaub和Chasin，Proc.Nat'l Acad.Sci USA，77:4216-4220，1980年，上述文献均以引用方式并入本文)。
该表达载体通常包含至少一个可操作地连接至要表达的DNA序列或片段的表达控制序列。将该控制序列插入该载体中以便控制和调节克隆的DNA序列的表达。有用的表达控制序列的示例是lac系统、trp系统、tac系统、trc系统、λ噬菌体的主要操纵子区和启动子区、fd外壳蛋白的控制区、酵母的糖酵解启动子(例如，3-磷酸甘油酸激酶的启动子)、酵母酸性磷酸酶的启动子(例如，Pho5)、酵母α-交配因子的启动子，以及衍生自多瘤、腺病毒、逆转录病毒和猿猴病毒(例如，SV40的早期启动子和晚期启动子)的启动子，以及已知的控制原核细胞或真核细胞及其病毒或它们的组合的基因表达的其他序列。
本文还描述了包含如前文所述的表达载体的重组宿主细胞。本文所述的融合蛋白可在细胞系中而不是在杂交瘤中表达。包括编码根据本发明的多肽的序列的核酸可用于转化合适的哺乳动物宿主细胞。
基于目标蛋白质的高水平表达、组成型表达和来自宿主蛋白的最小污染来选择特别优选的细胞系。可作为宿主用于表达的哺乳动物细胞系是本领域公知的，并且包括许多无限增殖细胞系，诸如但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞和许多其他细胞。其他合适的真核细胞包括酵母和其他真菌。有用的原核宿主包括：例如，大肠杆菌(诸如大肠杆菌SG-936、大肠杆菌HB 101、大肠杆菌W3110、大肠杆菌X1776、大肠杆菌X2282、大肠杆菌DHI和大肠杆菌MRC1)、假单胞菌属、芽孢杆菌属(Bacillus；诸如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))和链霉菌属(Streptomyces)。
这些重组宿主细胞可用于通过在允许多肽表达的条件下培养细胞并从该宿主细胞或该宿主细胞周围的培养基中纯化该多肽来产生融合蛋白。可通过在编码抗体的目标基因的5'端插入编码信号肽或分泌前导肽的序列(参见，Shokri等，2003年，Appl MicrobiolBiotechnol.，60(6):654-664；Nielsen等，Prot.Eng.，10:1-6，1997年；von Heinje等，Nucl.Acids Res.，14:4683-4690，1986年，上述文献均以引用方式并入本文)来促进表达的多肽在重组宿主细胞中的靶向分泌。这些分泌前导肽元件可源自原核序列或真核序列。因此，适当地，使用分泌前导肽，分泌前导肽是连接至多肽的N末端以指导多肽移出宿主细胞胞质溶胶并分泌到培养基中的氨基酸。
本文所述的融合蛋白可融合至另外的氨基酸残基。例如，此类氨基酸残基可以是促进分离的肽标签。也设想了用于将抗体靶向于特定器官或组织的其他氨基酸残基。
应当理解，Fab纳米笼可以通过HC铁蛋白和LC的共转染产生。另选地，可使用仅需要转染一个质粒的单链Fab-铁蛋白纳米笼，如图1C所示。这可通过LC和HC之间不同长度(例如，60个或70个氨基酸)的接头来实现。当使用单链Fab时，可确保重链和轻链是成对的。也可以在构建体的N末端或接头内添加标签(例如，Flag、HA、myc、His6x、Strep等)以易于如上所述的纯化。此外，当共转染不同的Fab-纳米颗粒质粒时，可使用标签系统通过串联/加性亲和层析步骤确保相同的纳米颗粒上存在许多不同的Fab。这为纳米颗粒提供了多特异性。如果需要，可插入蛋白酶位点(例如，TEV、3C等)以在表达和/或纯化后裂解接头和标签。此类构建体的示例是用于抗HIV广谱中和scFab 10E8：
YELTQETGVSVALGRTVTITCRGDSLRSHYASWYQKKPGQAPILLFYGKNNRPSGVPDRFSGSASGNRASLTISGAQAEDDAEYYCSSRDKSGSRLSVFGGGTKLTVLSQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECGGSSGSGSGSTGENLYFQGSAGTTGTSASTSGYPYDVPDYAGGGGSAGGTATLEVLFQGPSSGSSSSGGTGEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCSASGFDFDNAWMTWVRQPPGKGLEWVGRITGPGEGWSVDYAAPVEGRFTISRLNSINFLYLEMNNLRMEDSGLYFCARTGKYYDFWSGYPPGEEYFQDWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCSRGGGGGSGGSGGSGGSMSSQIRQNYSTDVEAAVNSLVNLYLQASYTYLSLGFYFDRDDVALEGVSHFFRELAEEKREGYERLLKMQNQRGGRALFQDIKKPAEDEWGKTPDAMKAAMALEKKLNQALLDLHALGSARTDPHLCDFLETHFLDEEVKLIKKMGDHLTNLHRLGGPEAGLGEYLFERLTLRHD
在另一个方面，本文描述了通过给予有需要的哺乳动物(通常是幼年的、未成年的或新生的哺乳动物)治疗有效量的本文所述的融合蛋白来为受试者接种疫苗的方法。“治疗有效量”是指有效产生期望的治疗效果(诸如提供针对目标抗原的保护性免疫应答)的量。
任何合适的方法或途径均可用于给予本文所述的融合蛋白和疫苗。给药途径包括例如口服、静脉内、腹膜内、皮下或肌内给药。
应当理解，本文所述的融合蛋白在哺乳动物中用于预防或治疗目的时将以另外包括药学上可接受的载体的组合物的形式给药。合适的药学上可接受的载体包括：例如，水、盐水、磷酸盐缓冲液、右旋葡萄糖、甘油、乙醇等中的一者或多者，以及它们的组合。药学上可接受的载体还可包括少量的辅料诸如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其中该辅料延长结合蛋白的保质期或提高结合蛋白的有效性。如本领域所熟知的，可以配制注射剂组合物以在给予哺乳动物后提供活性成分的快速释放、持续释放或延迟释放。
尽管人抗体特别适用于给予人类，但它们也可以给予其他哺乳动物。如本文所使用的术语“哺乳动物”旨在包括但不限于：人、实验动物、家庭宠物和农场动物。
本文还包括用于疫苗接种的试剂盒，该试剂盒包括治疗有效量的或预防有效量的本文所述的融合蛋白。该试剂盒还可包括例如任何合适的佐剂。该试剂盒包括说明书。
上述公开内容整体描述了本发明。通过参考以下具体的实施例可以获得更完整的理解。除非另有说明，否则这些实施例仅是出于说明的目的而提供，并且不旨在进行限制。因此，本发明决不应被理解为限于以下实施例，而是应被理解为涵盖由于本文提供的教导而变得显而易见的任何和所有变化形式。
以下实施例不包括常规方法的详细描述，诸如用于构建载体和质粒、将编码多肽的基因插入到此类载体和质粒中、或将质粒引入宿主细胞中的方法。这些方法是本领域普通技术人员熟知的，并且描述于多个出版物包括Sambrook,J.，Fritsch,E.F.和Maniatis,T.，1989年，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press出版，其以引用方式并入本文。
在没有进一步描述的情况下，相信本领域普通技术人员可使用前述的描述和以下说明性实施例来制备和利用本发明的化合物并实施所要求保护的方法。因此，以下工作实施例具体地指出本发明的典型的方面，并且不应被理解为以任何方式对本公开的其余部分进行限制。
实施例
实施例1
简介
尽管经过30年的努力，但对于人类免疫缺陷病毒I型(HIV-1)仍不存在有效的疫苗或治疗方法。然而在这项探索中激动人心的事实是，小部分HIV-1感染个体产生了具有对循环的HIV-1分离株的优秀中和效力的抗体。自从发现第一代广谱中和抗体(bNAb)2F51、4E102,3、2G124和b125,6以来，由于Env特异性单B细胞分选7–9、抗体克隆和高通量中和测定10–13等新技术以及最近的蛋白质组去卷积技术14的实施，bNAb的目录显著增加。现在已经描述了几十种HIV bNAb，靶向三聚体HIV包膜(Env)上的六个保守位点，包括三聚体顶点处的V1/V2环、V3环糖基、CD4结合位点(CD4bs)、gp120-g41界面、融合肽和近膜端外部区(MPER)7,9,19,10,12–18。
对bNAb作为治疗分子在对抗HIV-1中的关注来自于在猕猴20–24和人源化小鼠25–28的攻毒实验中观察到的一些强效抗病毒活性，以及当bNAb被治疗性输注时在感染的人中实现了减少病毒血症29–33。此外，与口服抗逆转录病毒治疗(ART)相比，抗体具有关键的优势：它们具有较长的循环半衰期，并且可形成增强宿主对病毒的免疫力的免疫复合物。这些观察结果导致了对抗体疗法通过被动给予bNAb替代或补充常规免疫学赋予对HIV-1的防护的临床评价，并导致了在受感染的个体中控制和/或清除HIV-1的努力。
bNAb临床应用的主要限制之一是快速选择耐中和病毒群体30–32,34,35。RNA病毒如HIV表现出异常的遗传多样性36，使得病毒能够发展出抗性突变以逃避mAb识别。然而，消除与某些bNAb结合的突变对病毒适合度存在显著的不利影响37–39。与HIV-1治疗方案中不同药物联用类似，该观察结果提示成功的抗HIV-1抗体疗法应包括bNAb特异性的组合。因此，最近已有开发对Env具有双特异性40–42或三特异性43–45的不同形式的抗体样分子的研究。另外的考虑是体内功效所需的抗体的量。实际上，在针对使用结构指导设计或生物信息学方法(如VRC0146、10E847,48和NIH45-4649)改造bNAb以提高其效力方面已进行了大量工作，但迄今为止尚未完全成功。对于靶向Env中多个表位的双特异性和三特异性抗体，效力通常受到其亲本mAb效力的限制。因此，迄今为止，虽然中和宽度已有显著改善，但抗病毒效力仍然相对较弱40,43,44,45。
抗体与同一病毒上多于一个表位相互作用的能力对其效力有极大影响50–52。这种效应通常被称为亲合力(表观亲和力增强)，是IgM抗体在自然界中用于补偿其通常的低亲和力的性质。因此，已将IgM的μ尾部添加到IgG的恒定区中进行了研究，以产生具有改善的生物活性的十二价IgM样分子53,54。工程化以远超进化的速度产生了多种非天然抗体形式，克服了IgG二价的限制。这些设计中的一些包括以线性头-尾方式的Fab串联融合55、串联双抗体组合(Tamdabs)56或与IgG的CH3融合的双抗体(di-diabody)57、附加IgG58–60和多聚化支架的使用(例如p5361、亮氨酸拉链螺旋62、链霉亲和素63、芽孢杆菌RNA酶-芽胞杆菌RNA酶抑制蛋白模块64，以及自组装成五聚体形式65并且可进一步工程化成十价66的大肠杆菌(Escherichia coli)Vero细胞毒素B亚基)。这些抗体架构对于它们作为治疗剂的成功开发面临不同的挑战。依赖于抗体的可变片段(Fv)的多聚体抗体形式通常与低稳定性和由此而来的高聚集倾向相关67。此外，由复合物的亲和常数决定的二聚化模块的解离可限制该分子在体内的长期稳定性。此外，用上述大多数抗体形式达到的效价通常最多为3-5价，因此排除了高亲合力和多特异性的组合。
本文描述了多特异性多亲和性抗体(multabody)平台，在一些方面，该平台使用脱铁铁蛋白原体作为模块亚基，用于在单个分子中多达32个抗体片段(抗原结合片段[Fab]和可结晶片段[Fc])的多聚化。使用该方法，我们将4种不同的特异性有效地组合到一个单分子中，包括三种最好的抗HIV-1bNAb的Fab部分和来自IgG1的可结晶片段(Fc)，以赋予该分子多特异性、高亲合力以及效应子功能和延长的血清半衰期。与它们的单独亲本抗体或IgG的组合相比，所得的多特异性多亲和性抗体显示出泛病毒中和宽度和显著更高的中和效力。引人注目的是，与抗HIV三特异性N6/PGDM1400x10E8抗体或由目前最了解的bNAb制成的混合物相比，多特异性多亲和性抗体针对14种假病毒(PsV)的组的平均IC50中值在质量和摩尔浓度上分别低1和2个数量级。本文所述的多特异性多亲和性抗体设计代表了使抗体多聚化以增强其抑制HIV-1感染的治疗特性的稳健且强大的即插即用型平台。
材料和方法
基于仅Fab的脱铁铁蛋白的多特异性多亲和性抗体的表达和纯化。合成编码人脱铁铁蛋白轻链和scFab-人脱铁铁蛋白融合蛋白的基因，并通过GeneArt(LifeTechnologies)克隆到pHLsec表达载体中。将200mL HEK293F细胞(Thermo FisherScientifics)以0.8×106细胞/mL的密度接种在Freestyle表达培养基中，并在MultitronPro摇床(Infors HT)中于37℃、8％CO2和70％湿度下以125rpm振荡温育。接种后24小时内，用与转染试剂FectoPRO(Polyplus Transfections)以1:1的比例在室温(RT)预温育10分钟的50μg过滤DNA瞬时转染细胞。将编码scFab-人脱铁铁蛋白和人脱铁铁蛋白的质粒以1:4、1:1、4:1和1:0的比例混合，分别获得20％、50％、80％和100％scFab效价的纳米颗粒。6-7天后，通过在5000×g离心15分钟收获细胞悬浮液，并用0.22μm的Steritop滤器(EMDMillipore)过滤上清液。通过对Fab进行亲和层析并洗涤洗脱来纯化纳米颗粒。合并含有蛋白质的级分，浓缩，并在20mM磷酸钠pH 8.0、150mM NaCl中上样到Superose 6 10/300GL体积排阻色谱柱(GE Heathcare)上。
32-N和32-I多特异性多亲和性抗体的设计、表达和纯化。使用KOD-plus诱变试剂盒(Toyobo，日本大阪)通过人脱铁铁蛋白轻链的残基1至95(C铁蛋白)和95至175(N铁蛋白)的缺失产生编码与半个铁蛋白连接的scFab和scFc片段的基因。此外，使用相同的诱变试剂盒，通过将抗体轻链的丙氨酸12突变为脯氨酸残基的定点诱变，来破坏蛋白L对iMab-C铁蛋白的结合特异性75。通过将66μg质粒PGDM1400与scFab-人脱铁铁蛋白:Fc-人脱铁铁蛋白:N49P7scFab-C铁蛋白:10E8 scFab-C铁蛋白的4:2:1:1混合物进行混合，将32-N多特异性多亲和性抗体瞬时转染至HEK 293F细胞中。对于32-I多特异性多亲和性抗体，使用iMabscFab-C铁蛋白替代N49P7 scFab-C铁蛋白质粒。加入细胞培养物之前，过滤DNA混合物，并在室温下用60μL FectoPRO温育。首先使用HiTrap Protien A HP色谱柱(GE Healthcare)，用20mM Tris pH 8.0、3M MgCl2和10％甘油洗脱缓冲液通过亲和层析纯化多特异性多亲和性抗体。在使用PD-10脱盐柱(GE Healthcare)进行换液后，通过使用HiTrap Protien L色谱柱(GE Healthcare)进行第二次亲和层析进一步纯化多特异性多亲和性抗体。浓缩含有蛋白质的级分，并在Superose 610/300GL色谱柱(GE Healthcare)上进一步通过凝胶过滤进行纯化。
负染色电子显微镜检。将3μL浓度约为0.02mg/mL的多特异性多亲和性抗体加入到碳涂覆的铜网格中，静置30秒，并用3μL 2％甲酸铀酰染色。立即用Whatman No.1滤纸从网格中除去过量染料并加入另外的3μL 2％甲酸铀酰，静置20秒。使用在200kV下操作并配备有Orius电荷耦合器件(CCD)摄像头(Gatan公司)的场发射FEI Tecnai F20电子显微镜对网格进行成像。
生物膜薄层干涉。使用Octet RED96 BLI系统(Pall ForteBio)在PBS pH 7.4、0.01％BSA和0.002％Tween中进行结合动力学测量。选择每种多特异性多亲和性抗体组分的独特His标记配体并上样到Ni-NTA生物传感器上以达到0.8nm的信号响应。通过将已上样的生物传感器分别转移到含多特异性多亲和性抗体连续稀释液(50-25-12.5-6.25-3.1-1.5nM)的孔和含缓冲液的孔中来测量结合速率。通过将生物传感器浸入含有缓冲液的孔中来测量解离速率。这两个步骤各持续180秒，为了实现与PGDM1400的选择性结合，引入了BG5050 SOSIP.664三聚体的CD4bs中的D368R突变，因此，N49P7与该抗原的结合被破坏。类似地，分别产生gp120亚基93TH057、与mVenus融合的MPER肽、可溶性CD4以及与β2-微球蛋白复合的hFcRn作为N49P7、10E8、iMab和Fc的唯一配体。通过测量在生理(7.5)和酸性(5.6)pH下多特异性多亲和性抗体与hFcRnβ2-微球蛋白复合物的结合，测试其进行内体再循环的能力。
体积排阻色谱与多角度光散射联用(SEC-MALS)。MiniDAWN TREOS和Optilab T-rEX折射计(Wyatt)与Agilent Technologies 1260Infinity II HPLC联用。将50μg 24聚体PGDM1400scFab多特异性多亲和性抗体、多特异性多亲和性抗体32-N和多特异性多亲和性抗体32-I在20mM磷酸钠pH 8.0、150mM NaCl中上样到Superose 6 10/300色谱柱(GEHealthcare)上。使用ASTRA软件(Wyatt)进行数据收集和分析。
解链和聚集温度测量。使用UNit系统(Unchained Labs)测定多特异性多亲和性抗体、亲本IgG、12聚体同源寡聚Fab和Fc以及N6/PGDM1400x10E8三特异性抗体的解链温度(Tm)和聚集温度(Tagg)。Tm通过测量重心平均荧光获得，而Tagg则是266nm波长下观察到静态光散射相对于基线增加50％时的温度。将样品浓缩至1.0mg/mL，并以1℃梯度从25℃递增至95℃。使用UNit分析软件计算3次独立测量的平均值和标准误差。
病毒生产和TZM-bl中和试验。通过用HIV-1亚型B骨架NL4-3.Luc.R-E(AIDS研究和参考试剂计划(ARRRP))和编码全长Env克隆的质粒共转染293T细胞产生如前文所述的14种HIV-1假型病毒的组73。HIV分离株X2988、ZM106.9和3817由艾滋病疫苗研发合作组织(CAVD)提供，SF162由J.L.Nieva.(Biofisika Institute)提供，pCNE8、1632、THRO、278、ZM197、JRCSF、t257、Du422和BG505由NIH ARRRP提供。中和在使用标准TZM-bl中和试验法在单循环中和试验中测定。简言之，将抗体和基于抗体的颗粒与10-15％组织培养感染剂量的假病毒在37℃下温育1小时，然后与TZM-bl细胞温育44-72小时。通过向细胞添加Britelite Plus试剂(PerkinElmer)并使用Synergy Neo2多模式分析酶标仪(Biotek Instruments)测量相对光单位(RLU)的发光值来监测病毒中和。
药代动力学和免疫原性研究。使用20g C57BL/6雄性小鼠进行体内研究。使用由融合到小鼠脱铁铁蛋白轻链N末端的小鼠HD37 IgG2a的scFab和scFc片段构成的替代多特异性多亲和性抗体进行研究。HD37 scFab-mFerritin、Fc-mFerritin和mFerritin按照上述方法以2:1:1的比率进行转染和纯化。在小鼠IgG2a Fc构建体中引入L35A、L234A和P329G突变，以沉默多特异性多亲和性抗体的效应子功能74。皮下单次注射5mg/kg多特异性多亲和性抗体或对照样品(HD37IgG1、HD37 IgG2a和hpFerritin-PfCSP疟疾肽)的200μL PBS(pH7.5)溶液。在多个时间点收集血液样品，并通过ELISA评价血清样品中的循环抗体和ADA水平。简言之，96孔Pierce镍包被的平板(Thermo Fisher)用50μL 0.5μg/mL His6x标记的抗原hCD19包被，以使用IgG和多特异性多亲和性抗体的试剂特异性标准曲线测定循环HD37特异性浓度。抗药物抗体测定中，用12聚体HD37 scFab多特异性多亲和性抗体或用hpFerritinPfCSP疟疾肽包被Nunc MaxiSorp平板(Biolegend)。HRP-ProteinA(Invitrogen)用作第二分子，使用Synergy Neo2多模式分析酶标仪(Biotek Instruments)对化学发光信号进行定量。
结果
多特异性多亲和性抗体可以比黄金标准IgG高500倍的效力中和HIV-1。人脱铁铁蛋白轻链的强自组装特性被用于将Fab多聚化到由24个单体形成的中空球形蛋白质笼的表面上。实际上，脱铁铁蛋白自组装成由24个相同多肽构成的12nm直径的结构，并且易于进行基因融合70。每个脱铁铁蛋白亚基的N末端指向球形笼的外部，因此可实现目的蛋白的基因融合。为了保持IgG分子的所有特性，包括高热稳定性和正确的链配对，我们生成了脱铁铁蛋白与单链Fab(scFab)和单链Fc(scFc)片段的融合物。在折叠时，脱铁铁蛋白亚基充当驱动融合至其N末端的24个蛋白质的多聚化的基础材料(图1)。重要的是，在相同分子上呈现多种特异性(例如Fab和Fc)可通过共转染选定比例的编码各组分的DNA以及选择所有特异性的严格的亲和纯化方案(例如，蛋白L与蛋白A组合的亲和层析分别选择Fab和Fc)来实现和控制。
首先，我们研究了展示在我们的新型多特异性多亲和性抗体平台上的HIV-1bNAb的多效价对其阻断病毒感染的能力的影响，并将其与相同bNAb的标准二价IgG展示进行了比较。选择对Env具有不同特异性的bNAb组，通过scFab-人脱铁铁蛋白编码质粒与不同比例的未偶联脱铁铁蛋白共转染，使它们的scFab以不同的密度多聚化(图2a)。多特异性多亲和性抗体组装成单分散的、良好形成的球形颗粒，该球形颗粒具有不间断的致密环和规则间隔的突出Fab(图2a)。引人注目的是，与其针对五种假病毒的组的IgG形式相比，PGDM1400，迄今为止描述的最有效的抗HIV bNAb(IC50中值＝0.003μg/mL)作为24聚体多特异性多亲和性抗体显示出100至500倍的中和(改善倍数为IC50(nM)中值的倍数)(图2b)。相比于其IgG，bNAb 10-1074作为多特异性多亲和性抗体也显示出中和效力的显著改善，而bNAb 10E8、N49P7和VRC01尽管仍然有效，但未显示相同的增强。
脱铁铁蛋白改造导致32聚体多特异性多亲和性抗体的有效异寡聚化。其次，我们试图通过赋予分子多特异性来改进异常有效的24聚体PGDM1400多特异性多亲和性抗体的宽度。为此，除了人IgG1同种型的Fc片段之外，我们将PGDM1400 Fab与近泛中和抗体10E8v4(具有改善的溶解度的经修饰的10E871)和N49P7的Fab组合。为了实现这一水平的四组分(三种Fab和一种Fc)异寡聚化，我们将人脱铁铁蛋白结构分成两个亚基(N铁蛋白和C铁蛋白)并将Fab分别连接到这两半的N末端(图3a)。分割的脱铁铁蛋白的互补导致两半的自缔合，并因此导致融合蛋白的非常有效的异源二聚化过程。重要的是，在用分割的和全长脱铁铁蛋白组装的多特异性多亲和性抗体的生物物理和功能特性之间未观察到显著差异(图4)。这种设计允许简单的两步式纯化程序来选择具有四种不同特异性的多特异性多亲和性抗体(图5)并且显示出较高的批间均一性(图6)。此外，与标准脱铁铁蛋白基础材料相比，将脱铁铁蛋白分为两半允许容纳额外的Fab/Fc片段，每分子最多32个组分(图3b)。8个额外的位置(在我们的工程化平台中从常规的24个提高到32个)在提供多特异性方面起重要作用，且不牺牲在24聚体PGDM1400多特异性多亲和性抗体中观察到的大部分效力增加。因此，多特异性多亲和性抗体32-N被设计成通过编码scFab和scFc质粒的共转染以4:2:1:1的比例获得16拷贝的PGDM1400、8拷贝的Fc、4拷贝的10E8v4和4拷贝的N49P7(图3a)。多特异性多亲和性抗体32-N形成高度修饰且均一的颗粒(图3b)并且显示与相应IgG分子的Tm和Tagg分布相似的解折叠和聚集转变温度，并且也如先前针对IgG所报道的72(图3c和图7)。结合动力学实验用于证明多特异性多亲和性抗体的每个组分(PDGM1400、N49P7、10E8v4和Fc片段)能够通过结合表位特异性分子(分别为BG505 SOSIP D368R、93TH057 gp120、MPER肽和人FcRn)接合其表位(图3d)。单独的IgG分子均不具有结合所有抗原的能力(图8)。32-N接合其多种抗原的能力表明，由多特异性多亲和性抗体的寡聚体形式所赋予的几何结构不会对抗原结合造成负面影响，推测是因为结合界面是朝外的。
为了探究是否也能设计出交叉靶向HIV Env和T细胞受体CD4的多特异性多亲和性抗体，我们用iMab(一种经证实能有效根除HIV的CD4定向的附着后抑制剂68,69)取代了N49P7。含有PDGM1400、iMab、10E8v4和Fc片段的多特异性多亲和性抗体(称为32-I)显示与32-N相似的均一性、热稳定性和多特异性(图3、图7和图8)，强调了能容易地交换抗体序列以改变特异性的多特异性多亲和性抗体平台的强大即插即用特性。
HIV-1多特异性多亲和性抗体显示出异常的泛中和活性和效力。在标准化的体外TZM-bl中和试验73中，评价了多特异性多亲和性抗体32-N和32-I针对14种假病毒(PsV)的组的中和效力和宽度。14种PsV的组被设计成包括低灵敏度PsV，每个被评价的bNAb最少有一个耐药性PsV。将多特异性多亲和性抗体的IC50值和宽度与以下各项进行对比：(i)各个单独的IgG，(ii)含有存在于多特异性多亲和性抗体中的相同相对量的各IgG的IgG混合物和(iii)N6/PGDM1400x10E8三特异性抗体43。32-N和32-I多特异性多亲和性抗体均显示出对于该组的100％宽度，IC50中值分别为0.0093μg/mL(4pM)和0.0085μg/mL(3.5pM)(图9和图10)。还通过IgG混合物和三特异性抗体实现了完全的病毒覆盖。然而，混合物或三特异性抗体联用针对所有测试的PsV的效力与单独测试时最佳mAb的效力相似(表1)。这样，与IgG混合物和三特异性抗体的IC50值相比，以μg/mL和nM计，多特异性多亲和性抗体的IC50中值分别降低了超过90％和99％(图9和图10，表1和表2)。
表1.
Figure GDA0003734850320000491
表2.
Figure GDA0003734850320000501
多特异性多亲和性抗体的体内药代动力学和抗药物抗体谱与相应的IgG相似。我们接着检测了在小鼠皮下5mg/kg给药后多特异性多亲和性抗体的体内毒性、免疫原性和生物利用度。为了评估我们的新平台技术，我们使用了物种匹配的替代物多特异性多亲和性抗体，其由与小鼠脱铁铁蛋白亚基融合的小鼠Fab和小鼠Fc(IgG2a同种型)组成，与用于以用于人为目的的HIV-1多特异性多亲和性抗体的全人组分相反。为该替代多特异性多亲和性抗体选择的Fab特异性是不结合内源性小鼠蛋白的Fab特异性，与不会结合内源性人蛋白的HIV-1人mAb类似。多特异性多亲和性抗体给药的耐受性良好，体重未见降低、无可见的毒性迹象。替代多特异性多亲和性抗体未在小鼠中诱导显著的免疫原性应答；14天后检测到的抗药抗体(ADA)的水平对于替代多特异性多亲和性抗体和其测序匹配的IgG2a都是可忽略的(图11b)。这与用作免疫原性阳性对照的在幽门螺杆菌(Helicobacter Pylori)铁蛋白(hpFerritin)的表面上展示疟疾环子孢子蛋白(CSP)的高免疫原性颗粒相反。此外，替代多特异性多亲和性抗体显示与亲本IgG1和IgG2a分子在接近范围内的体内暴露天数(图11b)。通过引入被报道能沉默Fc效应子功能的LALAP突变74可延长血清半衰期。总之，这些数据证明了调整我们的多特异性多亲和性抗体平台的生物利用度性质的可行性，并提供一组激动人心的关于开发性的初始体内验证数据。
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Claims (120)

1.一种融合蛋白，所述融合蛋白包括：
纳米笼单体的第一纳米笼单体亚基；和
与所述第一纳米笼单体亚基连接的生物活性部分；
其中所述融合蛋白与包括第二纳米笼单体亚基的蛋白质自组装以形成纳米笼单体。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述生物活性部分修饰所述组装的纳米笼的内表面和/或外表面。
3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其中所述生物活性部分包括：抗体或其片段、抗原、可检测部分、药剂、诊断剂或它们的组合。
4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其中所述抗体或其片段包括Fc片段。
5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其中所述Fc片段是IgG1 Fc片段。
6.根据权利要求4或5所述的融合蛋白，其中所述Fc片段包括一个或多个突变，例如LS、YTE、LALA和/或LALAP，所述一个或多个突变调节所述融合蛋白的半衰期，例如从几分钟或几小时调节至几天、几周或几个月。
7.根据权利要求3所述的融合蛋白，其中所述抗体或其片段包括Fab片段。
8.根据权利要求3所述的融合蛋白，其中所述抗体或其片段包括scFab片段、scFv片段或sdAb片段。
9.根据权利要求3所述的融合蛋白，其中所述抗体或其片段包括Fab片段的重链和/或轻链。
10.根据权利要求9所述的融合蛋白，其中所述抗体或其片段包括轻链和重链两者，或者在Fc片段的情况下，包括任选地由接头分开的第一链和第二链。
11.根据权利要求10所述的融合蛋白，其中所述接头包括与以下序列具有至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，或由其组成：
GGSSGSGSGSTGTSSSGTGTSAGTTGTSASTSGSGSGGGGGSGGGGSAGGTATAGASSGSGSSGSSSSGGTG。
12.根据权利要求9所述的融合蛋白，所述融合蛋白与分开产生的Fab轻链和/或重链缔合。
13.根据权利要求3至12中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗体或其片段特异性结合到与抗体可预防的病症和/或抗体可治疗的病症相关的抗原。
14.根据权利要求13所述的融合蛋白，其中所述抗原与以下相关：传染原，包括病毒(例如，HIV(包括HIV-1)、流感病毒、RSV、轮状病毒)、细菌(例如，TB、艰难梭菌(C.difficile))、寄生虫(例如，疟疾)、真菌或酵母；癌症(例如，CD19、CD22、CD79、BCMA或CD20)，包括实体癌症和液体癌症；或免疫疾病，包括自身免疫疾病。
15.根据权利要求14所述的融合蛋白，其中所述抗原与HIV-1相关，并且所述抗体或其片段包括例如ibalizumab-A12P、10E8、10E8.v4、N49P7、PGDM1400、10-1074、VRC01或它们的组合。
16.根据权利要求15所述的融合蛋白，其中所述抗体或其片段包括与以下序列具有至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，或由其组成：
Fc链1：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK；
Fc链2：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK；
Ibalizumab-A12P轻链：
DIVMTQSPDSLPVSLGERVTMNCKSSQSLLYSTNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQYYSYRTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC；
Ibalizumab-A12P重链：
QVQLQQSGPEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVIHWVRQKPGQGLDWIGYINPYNDGTDYDEKFKGKATLTSDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREKDNYATGAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGSR；
10E8.v4轻链：
SELTQDPAVSVALKQTVTITCRGDSLRSHYASWYQKKPGQAPVLLFYGKNNRPSGIPDRFSGSASGNRASLTITGAQAEDEADYYCSSRDKSGSRLSVFGGGTKLTVLSQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTEC；
10E8.v4重链：
EVRLVESGGGLVKPGGSLRLSCSASGFDFDNAWMTWVRQPPGKGLEWVGRITGPGEGWSVDYAESVKGRFTISRDNTKNTLYLEMNNVRTEDTGYYFCARTGKYYDFWSGYPPGEEYFQDWGQGTLVIVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCSR；
N49P7轻链：
QSALTQPRSVSASPGQSVTISCTGTHNLVSWCQHQPGRAPKLLIYDFNKRPSGVPDRFSGSGSGGTASLTITGLQDDDDAEYFCWAYEAFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTEC；
N49P7重链：
ADLVQSGAVVKKPGDSVRISCEAQGYRFPDYIIHWIRRAPGQGPEWMGWMNPMGGQVNIPWKFQGRVSMTRDTSIETAFLDLRGLKSDDTAVYYDRSNGSGKRFESSNWFLDLWGRGTAVTIQSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDSR；
PGDM1400轻链：
DFVLTQSPHSLSVTPGESASISCKSSHSLIHGDRNNYLAWYVQKPGRSPQLLIYLASSRASGVPDRFSGSGSDKDFTLKISRVETEDVGTYYCMQGRESPWTFGQGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC；
PGDM1400重链：
QAQLVQSGPEVRKPGTSVKVSCKAPGNTLKTYDLHWVRSVPGQGLQWMGWISHEGDKKVIVERFKAKVTIDWDRSTNTAYLQLSGLTSGDTAVYYCAKGSKHRLRDYALYDDDGALNWAVDVDYLSNLEFWGQGTAVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDSR；或
它们的组合。
17.根据权利要求3至16中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗体或其片段偶联至或缔合至另外的部分，诸如抗原、可检测部分(例如，小分子、荧光分子、放射性同位素或磁性颗粒)、药剂、诊断剂或它们的组合。
18.根据权利要求17所述的融合蛋白，其中所述抗体或其片段包括抗体药物偶联物。
19.根据权利要求3所述的融合蛋白，其中所述抗原与疫苗可预防的病症和/或疫苗可治疗的病症相关。
20.根据权利要求19所述的融合蛋白，其中所述抗原与以下相关：传染原，包括病毒、细菌、寄生虫、真菌或酵母；癌症，包括实体癌症和液体癌症；或免疫疾病，包括自身免疫疾病。
21.根据权利要求3所述的融合蛋白，其中所述可检测部分包括荧光蛋白，诸如GFP、EGFP、紫黄晶和/或基于黄素的荧光蛋白诸如LOV蛋白(诸如iLOV)。
22.根据权利要求3所述的融合蛋白，其中所述药剂包括小分子、肽、脂质、碳水化合物或毒素。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的融合蛋白，其中约3个至约100个纳米笼单体，诸如24、32或60个单体，或约4个至约200个纳米笼单体亚基，诸如4、6、8、10、12、14、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50或更多个亚基，任选地与一个或多个完整的纳米笼单体组合，自组装以形成纳米笼。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的融合蛋白，其中所述纳米笼单体选自铁蛋白、脱铁铁蛋白、封装蛋白、SOR、二氧四氢蝶啶合酶、丙酮酸脱氢酶、羧基体、穹窿体蛋白、GroEL、热休克蛋白、E2P、MS2外壳蛋白、其片段、以及其变体。
25.根据权利要求24所述的融合蛋白，其中所述纳米笼单体是脱铁铁蛋白。
26.根据权利要求25所述的融合蛋白，其中所述第一纳米笼单体亚基和所述第二纳米笼单体亚基可互换地包括脱铁铁蛋白的“N”区和“C”区。
27.根据权利要求26所述的融合蛋白，其中所述脱铁铁蛋白的“N”区包括与以下序列具有至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，或由其组成：
MSSQIRQNYSTDVEAAVNSLVNLYLQASYTYLSLGFYFDRDDVALEGVSHFFRELAEEKREGYERLLKMQNQRGGRALFQDIKKPAEDEW。
28.根据权利要求26或27所述的融合蛋白，其中所述脱铁铁蛋白的“C”区包括与以下序列具有至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，或由其组成：
GKTPDAMKAAMALEKKLNQALLDLHALGSARTDPHLCDFLETHFLDEEVKLIKKMGDHLTNLHRLGGPEAGLGEYLFERLTLRHD。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的融合蛋白，所述融合蛋白还包括在所述纳米笼单体亚基和所述生物活性部分之间的接头。
30.根据权利要求29所述的融合蛋白，其中所述接头是柔性的或刚性的，并且包括约1个至约30个氨基酸残基，诸如约8个至约16个氨基酸残基。
31.根据权利要求29或30所述的融合蛋白，其中所述接头包括GGS重复，诸如1个、2个、3个、4个或更多个GGS重复。
32.根据权利要求29所述的融合蛋白，其中所述接头包括与以下序列具有至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，或由其组成：
ASTASSASSGGGGGGSGGSGGSGGS。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的融合蛋白，所述融合蛋白还包括C末端接头。
34.根据权利要求33所述的融合蛋白，其中所述C末端接头包括与以下序列具有至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，或由其组成：
GGSGGSGGSGGSGGGASGGS。
35.一种根据权利要求1至34中任一项所述的融合蛋白的融合蛋白对，其中所述融合蛋白对自组装以形成纳米笼单体，其中所述第一纳米笼单体亚基和所述第二纳米笼单体亚基融合至不同的生物活性部分。
36.一种纳米笼，所述纳米笼包括至少一个根据权利要求1至34中任一项所述的融合蛋白和至少一个与所述融合蛋白自组装以形成纳米笼单体的第二纳米笼单体亚基。
37.一种纳米笼，所述纳米笼包括至少一个根据权利要求35所述的融合蛋白对。
38.根据权利要求36或37所述的纳米笼，其中每个纳米笼单体包括根据权利要求1至34中任一项所述的融合蛋白或根据权利要求35所述的融合蛋白对。
39.根据权利要求36或37所述的纳米笼，其中约20％至约80％的所述纳米笼单体包括根据权利要求1至34中任一项所述的融合蛋白或根据权利要求35所述的融合蛋白对。
40.根据权利要求36至39中任一项所述的纳米笼，所述纳米笼包括至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个不同的生物活性部分。
41.根据权利要求36至40中任一项所述的纳米笼，所述纳米笼包括至少一个完整的纳米笼单体，所述纳米笼单体任选地融合至可与根据权利要求1至37中任一项所述的生物活性部分相同或不同的生物活性部分。
42.根据权利要求36至41中任一项所述的纳米笼，其中所述纳米笼是多价的和/或多特异性的。
43.根据权利要求36至42中任一项所述的纳米笼，所述纳米笼包括根据权利要求1至34中任一项所述的第一融合蛋白、第二融合蛋白和第三融合蛋白，以及至少一个任选地融合至生物活性部分的完整纳米笼单体，其中所述第一融合蛋白、第二融合蛋白和第三融合蛋白的所述生物活性部分和所述完整的纳米笼单体的所述生物活性部分彼此均不相同。
44.根据权利要求43所述的纳米笼，其中所述第一融合蛋白、所述第二融合蛋白和所述第三融合蛋白各自包括融合至N铁蛋白或C铁蛋白的抗体或其片段，其中所述第一融合蛋白、所述第二融合蛋白和所述第三融合蛋白中的至少一个融合至所述N铁蛋白，并且所述第一融合蛋白、所述第二融合蛋白和所述第三融合蛋白中的至少一个融合至所述C铁蛋白。
45.根据权利要求44所述的纳米笼，其中所述第一融合蛋白的所述抗体或其片段是Fc片段；其中所述第二融合蛋白和所述第三融合蛋白各自包括对病毒(诸如HIV)的不同抗原有特异性的抗体或其片段，或者其中所述第二融合蛋白和所述第三融合蛋白中的一个包括对病毒(诸如HIV)的抗原有特异性的抗体或其片段，并且所述第三融合蛋白包括对不同抗原(诸如CD4受体)有特异性的抗体或其片段；并且其中所述完整的纳米笼单体融合至对另一种不同的抗原，任选地为相同的病毒(诸如HIV)的不同抗原有特异性的生物活性部分。
46.根据权利要求45所述的纳米笼，其中所述Fc片段包括一个或多个突变，例如LS、YTE、LALA和/或LALAP，所述一个或多个突变调节所述融合蛋白的半衰期，例如从几分钟或几小时调节至几天、几周或几个月。
47.根据权利要求45或46所述的纳米笼，其中所述第二融合蛋白的所述抗体或其片段是N49P7或iMab A12P；其中中所述第三融合蛋白的所述抗体或其片段是10E8v4。
48.根据权利要求47所述的纳米笼，所述纳米笼包括以下四个融合蛋白：
a.融合至全长铁蛋白的PGDM1400(任选地为scPGDM1400)；
b.融合至所述N铁蛋白的Fc(任选地为scFc)；
c.融合至所述C铁蛋白的N49P7或iMab A12P(任选地为scN49P7或sciMab A12P)；和
d.融合至所述C铁蛋白的10E8v4(任选地为sc10E8v4)。
49.根据权利要求48所述的纳米笼，所述纳米笼包括4:2:1:1的a:b:c:d比率。
50.根据权利要求48或49所述的纳米笼，所述纳米笼包括与以下序列中的一个或多个具有至少70％(诸如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，或由其组成，其中铁蛋白亚基以粗体示出，接头用下划线标出，轻链以斜体示出，并且重链以小写字母示出：
a.PGDM1400-hFerr：
DFVLTQSPHSLSVTPGESASISCKSSHSLIHGDRNNYLAWYVQKPGRSPQLLIYLASSRASGVPDRFSGSGSDKDFTLKISRVETEDVGTYYCMQGRESPWTFGQGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGSSG SGSGSTGTSSSGTGTSAGTTGTSASTSGSGSGGGGGSGGGGSAGGTATAGASSGSGSSGSSSSGGTGqaqlvqsgpevrkpgtsvkvsckapgntlktydlhwvrsvpgqglqwmgwishegdkkviverfkakvtidwdrstntaylqlsgltsgdtavyycakgskhrlrdyalydddgalnwavdvdylsnlefwgqgtavtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdsrASTASSASSGGGGGGSGGSGGSGGSMSSQIRQNYSTDVEAAVNSLVNLYLQASYTYLSLGFYFDRDDVALEGVSHFFRELAEEKREGYERLLKMQNQRGGRALFQDIKKPAEDEWGKTPDAMKAAMALEKKLNQALLDLHALGSARTDPHLCDFLETHFLDEEVKLIKKMGDHLTNLHRLGGPEAGLGEYLFERLTLRHDGGSGGSGGSGGSGGGASG GS；
b.Fc-N-hFerr LS
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGKGGSSGSGSGSTGTSSSGTGTSAGTTGTSASTSGSGSGGGGGSGGGGSAGGTATAGASSGSGSSGSSSSGGTGdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvlhealhshytqkslslspgksrASTASSASSGGGGGGSGGSGGSGGSMSSQIRQNYSTDVEAAVNSLVNLYLQASYTYLSLGFYFDRDDVALEGVSHFFRELAEEKREGYERLLKMQNQRGGRALFQDIKKPAEDEW；
c1.N49P7-C-hFerr
QSALTQPRSVSASPGQSVTISCTGTHNLVSWCQHQPGRAPKLLIYDFNKRPSGVPDRFSGSGSGGTASLTITGLQDDDDAEYFCWAYEAFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECGGSSGSGSGSTGTSSSGTGT SAGTTGTSASTSGSGSGGGGGSGGGGSAGGTATAGASSGSGSSGSSSSGGTGadlvqsgavvkkpgdsvrisceaqgyrfpdyiihwirrapgqgpewmgwmnpmggqvnipwkfqgrvsmtrdtsietafldlrglksddtavyycvrdrsngsgkrfessnwfldlwgrgtavtiqsastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdsrASTASSASSGGGGGGSGGS GGSGGSGKTPDAMKAAMALEKKLNQALLDLHALGSARTDPHLCDFLETHFLDEEVKLIKKMGDHLTNLHRLGGPEAGLGEYLFERLTLRHDGGSGGSGGSGGSGGGASGGS；
c2.Ibalizumab-A12P-C-hFerr
DIVMTQSPDSLPVSLGERVTMNCKSSQSLLYSTNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQYYSYRTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGSSG SGSGSTGTSSSGTGTSAGTTGTSASTSGSGSGGGGGSGGGGSAGGTATAGASSGSGSSGSSSSGGTGqvqlqqsgpevvkpgasvkmsckasgytftsyvihwvrqkpgqgldwigyinpyndgtdydekfkgkatltsdtststaymelsslrsedtavyycarekdnyatgawfaywgqgtlvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygsrASTASSASSG GGGGGSGGSGGSGGSGKTPDAMKAAMALEKKLNQALLDLHALGSARTDPHLCDFLETHFLDEEVKLIKKMGDHLTNLHRLGGPEAGLGEYLFERLTLRHDGGSGGSGGSGGSGGGASGGS；或
d.10E8.v4-C-hFerr
SELTQDPAVSVALKQTVTITCRGDSLRSHYASWYQKKPGQAPVLLFYGKNNRPSGIPDRFSGSASGNRASLTITGAQAEDEADYYCSSRDKSGSRLSVFGGGTKLTVLSQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECGGSSGSGSGST GTSSSGTGTSAGTTGTSASTSGSGSGGGGGSGGGGSAGGTATAGASSGSGSSGSSSSGGTGevrlvesggglvkpggslrlscsasgfdfdnawmtwvrqppgkglewvgritgpgegwsvdyaesvkgrftisrdntkntlylemnnvrtedtgyyfcartgkyydfwsgyppgeeyfqdwgqgtlvivssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscsrASTASSA SSGGGGGGSGGSGGSGGSGKTPDAMKAAMALEKKLNQALLDLHALGSARTDPHLCDFLETHFLDEEVKLIKKMGDHLTNLHRLGGPEAGLGEYLFERLTLRHDGGSGGSGGSGGSGGGASGGS。
51.根据权利要求36至50中任一项所述的纳米笼，所述纳米笼携带货物分子，例如药剂、诊断剂和/或成像剂。
52.根据权利要求51所述的纳米笼，其中所述货物分子不融合至所述融合蛋白并且被包含在所述纳米笼内部。
53.根据权利要求51所述的纳米笼，其中所述货物分子是蛋白质并且融合至所述融合蛋白，使得所述货物分子被包含在所述纳米笼内部。
54.根据权利要求51至53中任一项所述的纳米笼，其中所述货物分子是荧光蛋白，诸如GFP、EGFP、紫黄晶和/或基于黄素的荧光蛋白诸如LOV蛋白(诸如iLOV)。
55.根据权利要求51至54中任一项所述的纳米笼，其中所述货物分子被包含在内部以提供T细胞表位，但任选地不提供B细胞表位。
56.根据权利要求51至54中任一项所述的纳米笼，其中所述货物分子融合至所述融合蛋白并且被包含在内部以提供T细胞表位，但任选地不提供B细胞表位。
57.根据权利要求51或52所述的纳米笼，其中所述货物分子是小分子、放射性同位素或磁性颗粒。
58.根据权利要求36至57中任一项所述的纳米笼，所述纳米笼还包括表面上的抗原。
59.根据权利要求58所述的纳米笼，其中所述抗原表达为具有纳米笼单体的融合蛋白。
60.一种疫苗，所述疫苗包括根据权利要求36至59中任一项所述的纳米笼。
61.一种治疗性或预防性组合物，所述组合物包括根据权利要求36至59中任一项所述的纳米笼。
62.一种核酸分子，所述核酸分子编码根据权利要求1至34中任一项所述的融合蛋白或根据权利要求35所述的融合蛋白对。
63.一种载体，所述载体包括根据权利要求62所述的核酸分子。
64.一种宿主细胞，所述宿主细胞包括根据权利要求63所述的载体并产生根据权利要求1至34中任一项所述的融合蛋白或根据权利要求35所述的融合蛋白对。
65.一种使受试者免疫的方法，所述方法包括给予根据权利要求36至59中任一项所述的纳米笼或根据权利要求60所述的疫苗。
66.一种用于治疗和/或预防疾病或病症的方法，所述方法包括给予根据权利要求36至59中任一项所述的纳米笼或根据权利要求60所述的疫苗。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症、感染性疾病如HIV、疟疾、流感、RSV、轮状病毒或自身免疫疾病。
68.一种用于诊断成像的方法，所述方法包括：给予受试者、组织或样品根据权利要求36至59中任一项所述的纳米笼，其中所述纳米笼包括诊断标记，例如荧光蛋白或磁性成像部分；以及对所述受试者、组织或样品进行成像。
69.根据权利要求36至59任一项所述的纳米笼或根据权利要求60所述的疫苗的用于使受试者免疫的用途。
70.根据权利要求36至59任一项所述的纳米笼或根据权利要求60所述的疫苗的用于治疗和/或预防疾病或病症的用途。
71.根据权利要求70所述的用途，其中所述疾病或病症是癌症、感染性疾病如HIV、疟疾、流感、RSV、轮状病毒或自身免疫疾病。
72.根据权利要求36至59中任一项所述的纳米笼的用于受试者、组织或样品的诊断成像的用途，其中所述纳米笼包括诊断标记，诸如荧光蛋白或磁成像部分，并且对所述受试者、组织或样品进行成像。
73.根据权利要求1至34中任一项所述的融合蛋白、根据权利要求35所述的融合蛋白对或根据权利要求36至59中任一项所述的纳米笼作为研究工具的用途，例如在FACS或ELISA中。
74.根据权利要求36至59中任一项所述的纳米笼或根据权利要求60所述的疫苗，用于使受试者免疫。
75.根据权利要求36至59中任一项所述的纳米笼或根据权利要求60所述的疫苗，用于治疗和/或预防疾病或病症。
76.根据权利要求70所述的纳米笼，其中所述疾病或病症是癌症、感染性疾病如HIV、疟疾、流感、RSV、轮状病毒或自身免疫疾病。
77.根据权利要求36至59中任一项所述的纳米笼，用于受试者、组织或样品的诊断成像，其中所述纳米笼包括诊断标记，诸如荧光蛋白或磁成像部分，并且对所述受试者、组织或样品进行成像。
78.根据权利要求1至34中任一项所述的融合蛋白、根据权利要求35所述的融合蛋白对或根据权利要求36至59中任一项所述的纳米笼，用于作为研究工具，例如在FACS或ELISA中。
79.一种纳米笼，所述纳米笼包括多个融合蛋白，
其中每个所述融合蛋白包括铁蛋白轻链和Fab片段，
其中每个所述Fab片段能够特异性结合抗原，
其中每个所述Fab片段修饰所述纳米笼的外表面，并且
其中所述多个融合蛋白包括至少12个融合蛋白。
80.根据权利要求79所述的纳米笼，其中所述多个融合蛋白包括至少19个融合蛋白。
81.根据权利要求80所述的纳米笼，其中所述多个融合蛋白包括至少24个融合蛋白。
82.根据权利要求82所述的纳米笼，其中所述多个融合蛋白是24个融合蛋白。
83.根据权利要求79至82中任一项所述的纳米笼，其中所述多个融合蛋白的所述Fab片段能够特异性结合相同的抗原。
84.根据权利要求79至83中任一项所述的纳米笼，其中所述纳米笼不包括任何铁蛋白重链。
85.根据权利要求79至84中任一项所述的纳米笼，其中所述Fab片段是中和抗体的Fab片段。
86.根据权利要求79至85中任一项所述的纳米笼，其中所述抗原与传染原相关。
87.根据权利要求86所述的纳米笼，其中所述传染原是病毒。
88.根据权利要求87所述的纳米笼，其中所述病毒是人免疫缺陷病毒(HIV)。
89.根据权利要求85至88中任一项所述的纳米笼，其中所述纳米笼能够以相对于对照至少100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍或500倍的中和活性中和所述传染原。
90.根据权利要求89所述的纳米笼，其中所述对照包括全长形式的所述中和抗体。
91.根据权利要求90所述的纳米笼，其中所述中和抗体是IgG抗体。
92.一种纳米笼，所述纳米笼包括多个第一融合蛋白和多个第二融合蛋白，
其中每个所述第一融合蛋白包括纳米笼单体或其亚基和能够特异性结合抗原的Fab片段，并且
其中每个所述第二融合蛋白包括纳米笼单体或其亚基和Fc片段。
93.根据权利要求92所述的纳米笼，其中所述纳米笼单体选自铁蛋白、脱铁铁蛋白、封装蛋白、硫加氧酶还原酶(SOR)、二氧四氢蝶啶合酶、丙酮酸脱氢酶、羧基体、穹窿体蛋白、GroEL、热休克蛋白、E2P、MS2外壳蛋白、其片段，及其变体。
94.根据权利要求93所述的纳米笼，其中所述纳米笼单体是脱铁铁蛋白或铁蛋白。
95.根据权利要求93所述的纳米笼，其中所述纳米笼单体是铁蛋白轻链。
96.根据权利要求94或95所述的纳米笼，其中所述纳米笼单体不包括任何铁蛋白重链。
97.一种纳米笼，所述纳米笼包括多个第一融合蛋白和多个第二融合蛋白，其中
(a)(i)所述第一融合蛋白包括铁蛋白轻链和能够特异性结合第一抗原的Fab片段，并且
(ii)所述第二融合蛋白包括铁蛋白轻链和能够特异性结合第二抗原的Fab片段，或者
(b)(i)所述第一融合蛋白包括N铁蛋白和能够特异性结合第一抗原的Fab片段，并且
(ii)所述第二融合蛋白包括C铁蛋白和能够特异性结合第二抗原的Fab片段，
其中，在每个所述融合蛋白内，所述Fab片段融合至所述铁蛋白轻链的N末端、所述N铁蛋白的N末端或所述C铁蛋白的N末端，并且
其中所述第一抗原不同于所述第二抗原。
98.一种纳米笼，所述纳米笼包括多个第一融合蛋白、多个第二融合蛋白和多个第三融合蛋白，其中
(a)所述第一融合蛋白包括铁蛋白轻链和能够特异性结合第一抗原的Fab片段，
(b)所述第二融合蛋白包括C铁蛋白和能够特异性结合第二抗原的Fab片段，并且
(c)所述第三融合蛋白包括N铁蛋白和Fc片段，
其中，在每个所述融合蛋白内，所述Fab片段或所述Fc片段融合至所述铁蛋白轻链的N末端、所述C铁蛋白的N末端或所述N铁蛋白的N末端，并且
其中所述第一抗原不同于所述第二抗原。
99.根据权利要求97或98所述的纳米笼，所述纳米笼还包括多个第四融合蛋白，其中所述第四融合蛋白包括C铁蛋白和能够特异性结合第三抗原的Fab片段，其中所述第三抗原不同于所述第一抗原和所述第二抗原。
100.根据权利要求97、98或99所述的纳米笼，其中所述Fab片段是中和抗体的Fab片段。
101.根据权利要求97至100中任一项所述的纳米笼，其中所述第一抗原和所述第二抗原各自与传染原相关。
102.根据权利要求101所述的纳米笼，其中所述第一抗原和所述第二抗原与相同的传染原相关。
103.根据权利要求101或102所述的纳米笼，其中所述传染原是病毒。
104.根据权利要求103所述的纳米笼，其中所述病毒是人免疫缺陷病毒(HIV)。
105.根据权利要求100所述的纳米笼，其中所述第一抗原和所述第二抗原各自与病毒相关，
其中所述纳米笼能够中和假病毒组中100％的假病毒，并且
其中对于所述纳米笼内能够特异性结合与所述病毒相关的抗原的每个所述Fab片段，所述假病毒组包括至少一种对对应于所述Fab片段的所述中和抗体具有抗性的假病毒。
106.根据权利要求105所述的纳米笼，其中所述假病毒组包括至少10种、至少11种、至少12种、至少13种或至少14种假病毒。
107.根据权利要求100、105或106中任一项所述的纳米笼，其中所述第一抗原和所述第二抗原各自与病毒相关，
其中所述纳米笼能够以小于1nM、小于500pM、小于250pM、小于100pM、小于50pM、小于10pM或小于5pM的IC50中和假病毒组，并且
其中对于所述纳米笼内能够特异性结合与所述病毒相关的抗原的每个所述Fab片段，所述假病毒组包括至少一种对对应于所述Fab片段的所述中和抗体具有抗性的假病毒。
108.根据权利要求100和105至107中任一项所述的纳米笼，其中所述第一抗原和所述第二抗原各自与病毒相关，
其中所述纳米笼能够以一个或多个对照的IC50(摩尔浓度)的至多1/10、至多1/20、至多1/30、至多1/40、至多1/50、至多1/60、至多1/70、至多1/80、至多1/90或至多1/100的IC50中和假病毒组，并且
其中对于所述纳米笼内能够特异性结合与所述病毒相关的抗原的每个所述Fab片段，所述假病毒组包括至少一种对对应于所述Fab片段的所述中和抗体具有抗性的假病毒。
109.根据权利要求108所述的纳米笼，其中所述一个或多个对照包括对应于所述纳米笼内的Fab片段的中和抗体，所述Fab片段能够特异性结合与所述病毒相关的抗原。
110.根据权利要求109所述的纳米笼，其中所述中和抗体是IgG抗体。
111.根据权利要求108、109或110所述的纳米笼，其中所述一个或多个对照包括中和抗体的混合物，其中对于所述纳米笼内的能够特异性结合与所述病毒相关的抗原的每个所述Fab片段，所述混合物包括对应于所述Fab片段的中和抗体。
112.根据权利要求111所述的纳米笼，其中所述中和抗体是IgG抗体。
113.根据权利要求108至112中任一项所述的纳米笼，其中所述一个或多个对照包括一个或多个多特异性抗体，其中所述一个或多个多特异性抗体集体能够结合所述第一抗原和所述第二抗原，并且任选地结合所述第三抗原。
114.根据权利要求113所述的纳米笼，其中所述一个或多个对照包括能够特异性结合所述第一抗原、所述第二抗原和所述第三抗原的三特异性抗体。
115.根据权利要求99至114中任一项所述的纳米笼，其中所述第一抗原、所述第二抗原和所述第三抗原与HIV-1相关；并且其中：
所述第一融合蛋白的所述Fab片段是PDGM1400 Fab，
所述第二融合蛋白的所述Fab片段是10E8v4 Fab，
所述第三融合蛋白的所述Fc片段是人IgG1 Fc片段，并且
所述第四融合蛋白的所述Fab片段是N49P7 Fab。
116.根据权利要求99至114中任一项所述的纳米笼，其中所述第一抗原和第二抗原与HIV-1相关；其中所述第三抗原与CD4相关；并且其中：
所述第一融合蛋白的所述Fab片段是PDGM1400 Fab，
所述第二融合蛋白的所述Fab片段是10E8v4 Fab，
所述第三融合蛋白的所述Fc片段是人IgG1 Fc片段，并且
所述第四融合蛋白的所述Fab片段是iMab Fab。
117.一种治疗性或预防性组合物，所述组合物包括根据权利要求79至116中任一项所述的纳米笼。
118.一种用于治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括给予有需要的受试者根据权利要求79至116中任一项所述的纳米笼或根据权利要求117所述的组合物。
119.一种制备多特异性自组装纳米笼的方法，所述纳米笼的特征在于不同特异性的预选比率，所述方法包括以下步骤：
用包括多个多核苷酸的一个或多个表达质粒共转染宿主细胞，每个所述多核苷酸编码融合蛋白，
其中每个所述融合蛋白包括：(i)纳米笼单体或其亚基和(ii)具有给定特异性的抗体或抗体片段，
其中所述共转染的步骤包括：以基于所述预选比率的比率共转染所述多核苷酸；
获得由所述宿主细胞产生的多肽；以及
通过亲和选择纯化组装的纳米笼中存在的所有所述不同特异性的所述多肽。
120.根据权利要求119所述的方法，其中所述多个多核苷酸包括至少一个编码第一融合蛋白的多核苷酸和至少一个编码第二融合蛋白的多核苷酸，
其中所述第一融合蛋白包括第一纳米笼单体亚基，并且
其中所述第二融合蛋白包括能够与所述第一纳米笼单体亚基自组装的第二纳米笼单体亚基。
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