CN114854770A - BcSpd1基因在植物灰霉病防治和提高抗病性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种与灰霉病菌致病性和生长发育相关的BcSpd1基因及其在灰霉病治理中的应用。BcSpd1基因的缺失导致灰霉病菌侵染结构形成率及致病力显著降低，同时其菌核形成受阻，草酸分泌减少，黑色素形成增多，BcSpd1基因是灰霉病菌引起植物灰霉病所必需的基因同时对其自身的生长发育，代谢产物生成发挥重要作用。筛选能够阻止该基因表达与其蛋白质的表达、修饰及定位的化合物，可以有效控制灰霉病的发生，从而有助于开发新型杀菌剂。BcSpd1基因的一个重要用途是该基因的表达与其编码的蛋白质产物可以作为重要候选靶标位点，用于抗灰霉病菌药剂的设计与筛选。

Description

BcSpd1基因在植物灰霉病防治和提高抗病性中的应用

技术领域

本发明属微生物基因工程技术领域，具体涉及灰霉病菌BcSpd1基因在植物灰霉病防治和提高抗病性中的应用。

背景技术

灰霉病菌(Botrytis cinerea)通常又称作灰葡萄孢菌，是引起灰霉病的病原菌，有性态为富氏葡萄孢盘菌【Botryotinia fuckeliana(de Bary)Whetzal】，为子囊菌门葡萄孢盘菌属成员；无性态为灰葡萄孢(Botrytis cinerea Pers)，为无性真菌类葡萄孢属成员。灰霉菌寄主范围广泛，能侵染包括茄科、葫芦科、蔷薇科、豆科，葡萄科等1400余种植物，危害寄主植物的花、果实、叶和茎等部位，据不完全统计每年在全球范围内灰霉菌能造成100亿到1000亿美元的经济损失。由于寄主范围广泛，生产上危害严重，再加上相关分子研究技术成熟，灰霉菌已成为最重要的模式植物病原真菌之一，受到广泛研究。

灰葡萄孢菌是典型的死体营养型病原真菌，当与寄主植物建立关系以后，会迅速杀死寄主植物的组织和细胞从中获得生长和发育所需的营养物质。其致病过程中会牵涉到附着、侵入、病斑扩展和调节寄主免疫反应等不同阶段，每个阶段又会牵涉到许多蛋白质、细胞壁降解酶类、角质酶、毒素、植物激素、抵抗寄主反应的酶类、小分子化合物与SiRNA等致病因子的分泌以及复杂的调控网络，最终通过多方面协同作用达到侵染寄主植物的目的。自然条件下灰葡萄孢菌主要通过无性繁殖产生的分生孢子，借助风、雨水等条件做为初侵染和再侵染来源。当外界条件不适合其生存和传播时灰霉菌会以孢子、菌丝和菌核的方式度过逆境，菌丝生长后期产生数量众多的分生孢子，在适宜环境条件下侵染，周而复始对寄主的生存和发育带来较大威胁。

侵染垫作为一种侵染结构，其形成对于病原菌能否顺利侵入植物细胞至关重要，如果侵染垫发育受到影响，灰霉病菌将难以侵入寄主，其危害程度随之会受到严重削弱。

菌核是灰葡萄孢菌在生长后期形成的一种特殊结构具有较强的抗逆能力，能长期潜伏在寄主植物和土壤中完成越冬越夏当外界条件合适时迅速萌发产生菌丝，继续生长产生大量的分生孢子，在病害侵染循环中占据重要地位，周而复始对寄主的生存和发育带来较大威胁。

草酸作为灰葡萄孢分泌的一种非寄主特异性毒素因子，能够通过调节PH控制致病相关胞外酶活性与植物抗病相关酶的活性，为灰葡萄孢菌的入侵和定殖创造有利条件。

黑色素是广泛存在于各类真菌中的一种多酚类聚合物，在很多的病原真菌中发现黑色素在病原菌与寄主植物互作过程中发挥着重要作用，灰霉菌也能够产生黑色素然而黑色素在该菌中的功能尚不明确。

从分生孢子萌发到与寄主成功建立关系以及度过逆境完成初侵染循环与再侵染循环，是一个精细的调控过程，鉴定该调控过程的重要组分，并验证相关基因的致病功能，有可能从中发现可以作为杀真菌剂作用靶标的蛋白质，为开发防治灰霉病及其它类似病害的高效药剂奠定理论和技术基础。

Zn₂C₆锌簇蛋白作为真菌所独有的一类转录因子，能够参与氨基酸代谢、多药抗性(PDR)、细胞逆境反应、影响真菌麦角甾醇以及次级代谢产物的生物合成。锌簇蛋白家族成员BcSpd1基因对于揭示灰霉病菌等死体营养型病原真菌致病的分子机制、研发防治包括灰霉病菌在内的植物病原真菌的药剂具有重要应用价值。评价该基因在灰霉病菌致病过程的作用，有利于鉴定潜在的防治靶标，用于筛选新型杀真菌药剂。

发明内容

本发明的目的提供灰霉病菌BcSpd1基因与其编码的蛋白在调控灰霉病菌致病力中的应用，所述BcSpd1基因和核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。如SEQ ID NO:1所示的DNA序列为BcSpd1基因开放阅读框，由1504个核苷酸组成，其中包含3个外显子，分别位于SEQ ID NO:1的第1位至1120位核苷酸之间，第1172位至1275位核苷酸之间，和第1331位至1504位核苷酸之间，组成的编码区长度合计为1398个核苷酸。所述BcSpd 1基因所编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，该序列由465个氨基酸组成。

本发明具体提供所述BcSpd1基因与其编码的蛋白在调控灰霉病菌侵染结构发育中的应用。

本发明具体提供所述BcSpd1基因与其编码的蛋白在调控灰霉病菌菌核形成中的应用。

本发明具体提供所述BcSpd1基因与其编码的蛋白在调控灰霉病菌草酸分泌量中的应用。

本发明具体提供所述BcSpd1基因与其编码的蛋白在调控灰霉病菌黑色生成素量中的应用。

本发明还提供所述BcSpd1基因或蛋白在防治由灰霉病菌导致的植物灰霉病中的应用，所述防治是通过阻断或者抑制BcSpd1基因的表达来实现的。

本发明还提供所述阻断或者抑制BcSpd1基因的表达所使用的药剂在药物制备中的应用，所述药剂是BcSpd1基因的反义RNA或SiRNA，所述药物用于防治灰霉病。

本发明还提供所述BcSpd1基因或蛋白作为用于植物病害防治药物的靶标的应用，所述病害是灰霉病菌导致的植物灰霉病。

本发明还提供所述BcSpd1基因在提高植物灰霉病抗病性中的应用，具体是使用生物诱导剂，所述生物诱导剂含有敲除BcSpd1基因的突变体。

本发明还提供所述BcSpd1基因在制备土壤逆境修复菌剂中的应用，所述土壤逆境修复菌剂含有敲除BcSpd1基因的突变体。

发明还有一个目的是提供如SEQ ID NO.1所示的灰霉病菌BcSpd1基因或其编码的如SEQ ID NO.2所示的蛋白作为防治靶标在制备灰霉病菌杀菌剂中的应用。

本发明还提供一种防治灰霉病菌的生物防治菌剂，所述菌剂含有阻断或抑制灰霉病菌BcSpd1基因表达的载体。所述生物防治菌剂特征在于灰霉病菌侵染结构发育或、灰霉病菌菌核形成受阻、草酸分泌减少或黑色素生成增多。

本发明所述植物为灰霉病菌的寄主植物。

本发明所述生防菌剂含有灰霉病菌BcSpd1基因的敲除载体。

本发明还提供一种防治灰霉病菌的方法，通过所述敲除表达载体阻断或抑制灰霉病菌BcSpd1基因的表达，获得致病力降低的生物防治菌株。

本发明还提供一种抗灰霉病菌植物的培育方法，包括如下步骤：构建植物灰霉病菌BcSpd1基因敲除载体；将所述灰霉病菌BcSpd1基因敲除菌株处理植物，诱导植物对灰霉病菌的抗性。

本发明证明了BcSpd1基因的缺失，导致灰霉病菌侵染结构形成率及致病力显著降低，同时其菌核形成受阻，草酸分泌减少，黑色素形成增多，说明BcSpd1基因是灰霉病菌引起植物灰霉病所必需的基因同时对其自身的生长发育，代谢产物生成发挥重要作用。

因此，筛选能够阻止该基因表达与其蛋白质的表达、修饰及定位的化合物，可以有效控制灰霉病的发生，从而有助于开发新型杀菌剂。即本发明所提供的BcSpd1基因的一个重要用途是该基因的表达与其编码的蛋白质产物，可以作为重要候选靶标位点，用于抗灰霉病菌药剂的设计与筛选。

本发明通过所述敲除表达载体阻断或抑制灰霉病菌BcSpd1基因的表达，获得致病力降低的突变体，用于植物抗病性的诱导。

本发明还通过所述敲除表达载体阻断或抑制灰霉病菌BcSpd1基因的表达，获得致病力降低的突变体，用于植物抗非生物逆境的诱导，提高植物抗逆境胁迫。

附图说明

图1为BcSpd1在灰霉病菌基因组中的基因结构图谱；

其中BcSpd1基因编号为BCIN06G05230，预测该基因具有一个Zn₂C₆结构功能域；

图2为灰霉病菌BcSpd1基因的敲除策略(通过同源重组进行基因替换)示意图；

其中B05.10为野生型菌株，pXEH为敲除载体，ΔBcSpd1为BcSpd1基因缺失突变体；

图3为BcSpd1基因缺失突变体的PCR验证电泳图与QPCR表达示意图；

其中使用潮霉素引物，野生型DNA模板无条带缺失突变体具有条带；使用BcSpd1基因引物，野生型DNA模板有条带缺失突变体无条带；使用BcSpd1基因QPCR引物，野生型CDNA具有表达量而敲除体ΔBcSpd1-2、ΔBcSpd1-5、BcSpd1-7和ΔBcSpd1-10无表达量；

图4为敲除突变体ΔBcSpd1与野生型菌株B05.10及回补体ΔBcSpd1-C的培养特征对比照片

其中ΔBcSpd1为敲除突变体，B05.10为野生型，ΔBcSpd1-C为回补体，培养基为PDA，培养时间72h。

图5为敲除突变体ΔBcSpd1与野生型菌株B05.10及回补体ΔBcSpd1-C的侵染垫发育对比分析

其中ΔBcSpd1为敲除突变体，B05.10为野生型，ΔBcSpd1-C为回补体，侵染垫发育时间24h、48h、72h，标尺100μm。

图6为敲除突变体ΔBcSpd1与野生型菌株B05.10及回补体ΔBcSpd1-C的菌核发育对比分析

其中ΔBcSpd1为敲除突变体，B05.10为野生型，ΔBcSpd1-C为回补体，培养基为PDA and CM，培养时间28d。

图7为敲除突变体ΔBcSpd1与野生型菌株B05.10及回补体ΔBcSpd1-C的黑色素产生对比分析

其中ΔBcSpd1为敲除突变体，B05.10为野生型，ΔBcSpd1-C为回补体，培养基为液体CM，摇培时间5d。

图8为敲除突变体ΔBcSpd1与野生型菌株B05.10及回补体ΔBcSpd1-C的草酸产生对比分析

其中ΔBcSpd1为敲除突变体，B05.10为野生型，ΔBcSpd1-C为回补体，培养基为CM，指示剂为溴酚蓝与溴麋香草酚蓝。

图9为敲除突变体ΔBcSpd1与野生型菌株B05.10及回补体ΔBcSpd1-C的致病力对比分析

其中ΔBcSpd1为敲除突变体，B05.10为野生型，ΔBcSpd1-C为回补体，寄主为人参和拟南芥叶片，均采用活体接种。

具体实施方式

为了更好地描述本发明，下面通过具体的实施例予以进一步的说明，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

本发明的实施例中提供如SEQ ID NO.1所示的灰霉病菌BcSpd1基因或其编码的如SEQ ID NO.2所示的蛋白在调控植物灰霉病菌的致病力中的应用。如SEQ ID NO:1所示的DNA序列为BcSpd1基因开放阅读框，由1504个核苷酸组成，其中包含3个外显子，分别位于SEQ ID NO:1的第1位至1120位核苷酸之间，第1172位至1275位核苷酸之间，和第1331位至1504位核苷酸之间，组成的编码区长度合计为1398个核苷酸。所述BcSpd 1基因所编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，该序列由465个氨基酸组成。所述植物为茄科、葫芦科、蔷薇科、豆科植物中的一种。

本发明的实施例中提供了一种防控灰霉病菌的生物防治菌剂及其制备方法，其含有阻断或抑制灰霉病菌BcSpd1基因表达的载体，所述载体为灰霉病菌BcSpd1基因的敲除载体，所述载体阻断或抑制灰霉病菌BcSpd1基因的表达。

实施例1、BcSpd1基因的相关性分析

灰霉病菌BcSpd1基因的开放阅读框由1504个核苷酸组成，其中包含3个外显子，组成的编码区长度合计为1398个核苷酸。编码的蛋白质产物由465个氨基酸组成。对BcSpd1基因在灰霉病菌基因组网站(http://fungi.ensembl.org/Botrytis_cinerea/Location/View？r＝6:1774070-1777326；g＝BCIN06G05230；db＝core)中进行预测分析，BcSpd1基因编号为BCIN06G05230，该基因具有一个保守Zn₂C₆结构域，属于典型的锌簇蛋白(如图1所示)。

实施例2、BcSpd1基因的敲除与遗传互补

1)敲除载体构建

利用DNAMAN设计引物，并由上海生工生物技术有限公司进行引物合成，采用引物BcSpd1-UP-F(5’-GGCGGCCTCGAGAGTCTAACCCTCAAGAGCCAG-3’)与BcSpd1-UP-R(5’-ATGAGCTCGAATTGGAGTTCCAAGTTGAGTGAT-3’)，以灰霉病菌菌株B05.10的基因组DNA为模板扩增BcSpd1基因上游998片段；采用引物BcSpd1-DN-F(5’-GCTCTAGAGCCTCTTTTCAAGGCAGAACGGT-3’)与BcSpd1-DN-R(5’-AACTGCAGTATCAACGCGAGCGCGAGCACT-3’)，以灰霉病菌菌株B05.10的基因组DNA为模板扩增BcSpd1基因下游995bp片段。反应体系(25μL)：Takara PrimerSTARMax DNA Polymerase(2×)12.5μL；上下游引物(10μM)各1μL；模板DNA 1μL；ddH₂O 9.5μL。扩增程序：(1)98℃10s；(2)53℃15s；(3)72℃10s将1-3步循环35次。使用塔克拉胶回收试剂盒对PCR产物进行回收纯化，分别使用EcoRⅠ与KpnⅠ以及PstⅠ与HindⅢ将上下游片段与pXEH载体进行连接构建敲除载体(策略如图2所示)。

2)灰霉病菌的转化

A、根癌农杆菌AGL-1的培养

挑取含有双元载体BcSpd1的根癌农杆菌菌株AGL-1单菌落，接种至含50μg/mL卡那霉素、25μg/mL利福平的LB液体培养基中，摇培36h至OD₆₀₀＝0.8左右。制备IM液体培养基(100mL:90mL ddH₂O；1mL 50％甘油；1mL 20％葡萄糖；4mL 1M MES；2mL M-N buffer；1mLTracelement；80μL K-buffer；250μL20％NH₄NO₃；100μL 1％CaCl₂；1mL 0.01％FeSO₄；200μL19.2％As),首先在90mL ddH₂O中加除了FeSO₄和As的药品，混匀，将摇的菌液取5ml在15ml的离心管，4000转，离心5分钟，弃上清，加IM培养基(不加FeSO₄，As)5ml,吹一下，4000转，离心5分钟，弃上清，加FeSO₄和As在IM培养基里，取5ml加进15ml离心管里，吹一下转到空瓶，28℃摇床摇4h。剩下的IM液体培养基放4℃冰箱(报纸包好)。

B、灰霉病菌的产孢培养

活化B05.10菌株，两天时打菌饼接于PDA培养基(马铃薯20％煮烂过滤，葡萄糖2％，琼脂1.5％)，置于25℃培养箱，倒置培养10-15天，待菌体表面产生大量灰色孢子，使用IM液体培养基将孢子洗下，显微镜观察，利用血球计数器调节孢子浓度为5×10⁵/mL。

C、根癌农杆菌与灰霉病菌分生孢子共培养

将在IM液体培养基中诱导完成的农杆菌菌液与调好浓度的灰葡萄孢孢子等体积混合，取100μL涂布于贴好玻璃纸的IM固体培养基上，涂6个板，封板，避光28℃培养2天。共培养完毕后，将玻璃纸转移至含有100μg/mL潮霉素的PDA培养基上，相同条件下继续培养。4～7天后挑取扩展的菌落到含有同样抗生素的筛选培养基上进行二次筛选。

D、转化子的验证

使用潮霉素引物与BcSpd1基因引物通过PCR扩增对转化子进行筛选。扩增结果符合如下结果的确定为BcSpd1基因缺失突变体:潮霉素抗性基因内部引物HpTa(5'-GTCGTTTGACAAGATGGTTCA-3')和HpTb(5'-CGTCTGCTGCTCCATACAA-3')可以扩增到993bp片段(野生型菌株无扩增条带)；Spd1基因引物(5'-TCTCCTGGCTCGATTATCAGC-3')与(5'-GAGCAAATGGGTCGGACTG-3')扩增不出条带(野生型菌株有扩增条带)(如图3A所示)；同时更进一步在RNA水平上由于BcSpd1基因的缺失则无法顺利进行转录活动，此时使用BcSpd1基因QPCR引物(5'-TTCAGCAACCGAAACACC-3')与(5'-TGTAGACGAGGCAGACAACG-3')检测不到其表达(如图3B所示)。结果，从转化子中筛选到4株独立的BcSpd1基因缺失突变体：ΔBcSpd1-2、ΔBcSpd1-5、ΔBcSpd1-7和ΔBcSpd1-10(如图3所示)，用于后续功能分析。

实施例3、BcSpd1基因在灰霉病菌生长发育过程中的作用

将B05.10、△BcSpd1、△BcSpd1-C保存于-80℃度的滤纸片在PDA培养基上进行活化，25℃培养箱倒置培养2d后，使用打孔器打出6mm均匀的菌饼，接种于新的PDA平板上，25℃培养箱倒置培养，每隔12h测量菌落直径并拍照记录。结果发现△BcSpd1的菌丝生长速率要小于野生型与回补体，且随着时间的延长差距越来越明显，第72h时野生型与回补体的菌落平均直径分别为7.21cm与7.26cm而敲除体仅为5.94cm，显示△BcSpd1的生长速率要慢于B05.10(如图4所示)。表明在野生型菌株中，BcSpd1正调控菌丝生长，当敲除该基因后菌丝生长减慢。

实施例4、BcSpd1基因在灰霉病菌侵染结构——侵染垫发育过程中的作用

将B05.10、ΔBcSpd1及ΔBcSpd1-C菌饼接种于玻璃载玻片上，放入保湿盒，28℃培养箱保湿培养，在不同时间观察突变体菌株与野生型和互补菌株侵染垫形成情况，观察发现B05.10、ΔBcSpd1-C在接种36h时已开始形成侵染垫，48h时多数侵染垫发育良好，而ΔBcSpd1培养至72h仍未见侵染垫结构形成，突变体ΔBcSpd1侵染垫形成受阻(如图5所示)。表明BcSpd1基因在灰葡萄孢菌侵染垫形成过程中具有重要作用，对灰葡萄孢的致病发育至关重要。

实施例5、BcSpd1基因在灰霉病菌菌核形成方面的作用

将B05.10、△BcSpd1、△BcSpd1-C接种到PDA与CM培养基上，在25℃度培养箱黑暗倒置培养28d观察菌核形成情况。黑暗培养28d后，B05.10与△BcSpd1-C在CM培养基与PDA培养基上均产生大量菌核，而△BcSpd1在两种培养基上均无菌核产生(如图6A、B所示)。以上结果说明BcSpd1参与调控灰葡萄孢菌菌核形成，当敲除掉BcSpd1以后敲除体菌核形成受阻。

实施例6、BcSpd1基因在灰霉病菌黑色素形成方面的作用

通过采取在CM液体培养基中摇培的方法，探究了BcSpd1基因在灰霉菌黑色素形成过程中所具有的作用，同时通过黑色素抑制剂三环唑进一步证明BcSpd1基因参与调控黑色素与否。结果发现当每100mL CM液体培养基添加6个直径6mm的菌饼28℃摇床160rpm摇培5d时，添加BcSpd1的CM培养基液体颜色明显变黑，对其进行过滤，发现无论过滤液还是菌丝，敲除体的颜色明显变黑(如图7A所示)。当添加0.01％三环唑时敲除体的过滤液与菌丝颜色与野生型和回补体一致，与不添加三环唑时相比均明显变浅(如图7B所示)。通过孢子液与菌饼摇培以及三环唑试验，我们可以得出结论BcSpd1负调控灰葡萄孢菌黑色素的形成，当敲除掉BcSpd1以后，敲除体产生黑色素能力增强，黑色素明显增多。

实施例7、BcSpd1基因在灰霉病菌草酸形成方面的作用

草酸是灰葡萄孢分泌的一种非寄主特异性毒素因子，能为灰葡萄孢菌的入侵和定殖创造有利条件，其分泌能力的强弱可通过酸碱指示剂溴酚蓝和溴麋香草酚蓝进行指示：溴酚蓝指示方法：0.1g的溴酚蓝粉末溶解于2mL 20％的乙醇溶液配置成溴酚蓝母液。每100mL的CM固体培养基中加入2mL溴酚蓝母液，混匀倒板，将活化完成的菌株打菌饼倒扣在培养基上做好标记，25℃度恒温培养箱避光培养，每天观察并拍照记录(如图8A所示)；溴麋香草酚蓝指示方法：溴麋香草酚蓝不同于溴酚蓝，由于其PH指示范围的特殊性，需提前配制PH＝7.5的固体CM培养基与溴麋香草酚蓝母液(0.1g的溴麋香草酚蓝粉末溶解于2mL 20％的乙醇溶液)。将100mL PH等于7.5的CM固体培养基融化，待其稍微冷却加入2mL溴麋香草酚蓝母液，混匀倒板，将活化完成的菌株打菌饼倒扣在培养基上做好标记，25℃度恒温培养箱避光培养，每天观察并拍照记录(如图8B所示)。溴酚蓝和溴麋香草酚蓝实验结果表明，与B05.10和ΔBcSpd1-C相比，敲除掉BcSpd1以后敲除体基本不能产生草酸。

实施例8、BcSpd1基因在灰霉病菌致病性方面的作用

孢子液接种：相同培养条件下培养各菌株进行产孢，收集并浓缩孢子液，使用volbuffer将离心得到的孢子液稀释至2.5×10⁵个/mL充分混匀，使用移液枪吸取4μL孢子液点滴到同一批次大小相同，状态良好的寄主植物叶片两侧，将接种完成的寄主进行保湿培养，注意观察发病情况并拍照记录；菌饼接种：将菌株在PDA上活化，待其生长2d时，使用打孔器打出均匀的菌饼，倒扣在寄主植物叶片上，将接种完成的寄主进行保湿培养，注意观察发病情况并做好拍照记录。通过孢子液和菌饼相结合的方式，探究了野生型，敲除体与回补体对人参、拟南芥寄主植物致病性方面的差异(如图9所示)。结果表明当敲除掉BcSpd1以后灰葡萄孢菌对寄主植物的致病能力大大降低，而回补体的致病力与野生型基本相同，说明BcSpd1基因参与调控灰葡萄孢菌对寄主植物的致病过程，是灰葡萄孢菌维持对寄主植物毒力的不可或缺的关键基因。

由上述实施例可知，本发明提供的BcSpd1基因能够有效调控灰霉病菌侵染结构发育、菌核形成、草酸分泌、黑色素生成以及致病性，将所述BcSpd1基因应用于灰霉病菌防治和植物抗逆性提高中，通过阻断或者抑制BcSpd1基因达到病害防治和提高植物抗逆性。

本发明通过制备包含致病力降低的突变体的植物诱导剂提高了植物抗病性。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.灰霉病菌BcSpd1基因与其编码的蛋白在调控灰霉病菌致病力中的应用，所述BcSpd1基因和核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.如权利要求1所述应用，其特征在于：所述BcSpd1基因与其编码的蛋白在调控灰霉病菌侵染结构发育中的应用。

3.如权利要求1所述应用，其特征在于：所述BcSpd1基因与其编码的蛋白在调控灰霉病菌菌核形成中的应用。

4.如权利要求1所述应用，其特征在于：所述BcSpd1基因与其编码的蛋白在调控灰霉病菌草酸分泌量中的应用。

5.如权利要求1所述应用，其特征在于：所述BcSpd1基因与其编码的蛋白在调控灰霉病菌黑色素生成量中的应用。

6.如权利要求1所述基因或蛋白在防治由灰葡萄孢导致的植物灰霉病中的应用，其特征在于：所述防治是通过阻断或者抑制BcSpd1基因的表达来实现的。

7.如权利要求6所述阻断或者抑制BcSpd1基因的表达所使用的药剂在药物制备中的应用，其特征在于：所述药剂是BcSpd1基因的抑制剂，所述药物用于防治灰霉病。

8.如权利要求1所述基因或蛋白作为用于植物病害防治药物的靶标的应用，其特征在于：所述病害是灰霉病菌导致的植物灰霉病。

9.如权利要求1所述BcSpd1基因在提高植物灰霉病抗性中的应用，其特征在于，使用免疫诱导剂，所述免疫诱导剂含有敲除BcSpd1基因的突变体。

10.如权利要求1所述BcSpd1基因在制备土壤逆境修复菌剂中的应用，其特征在于，所述土壤逆境修复菌剂含有敲除BcSpd1基因的突变体。

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