CN114845811A - 细胞外囊泡聚糖的磁性分析 - Google Patents

细胞外囊泡聚糖的磁性分析 Download PDF

Info

Publication number
CN114845811A
CN114845811A CN202080081117.0A CN202080081117A CN114845811A CN 114845811 A CN114845811 A CN 114845811A CN 202080081117 A CN202080081117 A CN 202080081117A CN 114845811 A CN114845811 A CN 114845811A
Authority
CN
China
Prior art keywords
magnetic
fluid sample
glycans
extracellular
vesicular
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080081117.0A
Other languages
English (en)
Inventor
邵慧琳
王志刚
孙学成
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
National University of Singapore
Original Assignee
National University of Singapore
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National University of Singapore filed Critical National University of Singapore
Publication of CN114845811A publication Critical patent/CN114845811A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502761—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip specially adapted for handling suspended solids or molecules independently from the bulk fluid flow, e.g. for trapping or sorting beads, for physically stretching molecules
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/72—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating magnetic variables
    • G01N27/74—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating magnetic variables of fluids
    • G01N27/745—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating magnetic variables of fluids for detecting magnetic beads used in biochemical assays
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G01N33/54333—Modification of conditions of immunological binding reaction, e.g. use of more than one type of particle, use of chemical agents to improve binding, choice of incubation time or application of magnetic field during binding reaction
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G01N33/5434—Magnetic particles using magnetic particle immunoreagent carriers which constitute new materials per se
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
    • B01L2200/0668—Trapping microscopic beads
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0627—Sensor or part of a sensor is integrated
    • B01L2300/0663—Whole sensors
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0816—Cards, e.g. flat sample carriers usually with flow in two horizontal directions
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0883—Serpentine channels
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/043—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces magnetic forces
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/08—Regulating or influencing the flow resistance
    • B01L2400/084—Passive control of flow resistance
    • B01L2400/086—Passive control of flow resistance using baffles or other fixed flow obstructions
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/415—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from plants
    • G01N2333/42—Lectins, e.g. concanavalin, phytohaemagglutinin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4724—Lectins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Fluid Mechanics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Magnetic Means (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

描述了分析细胞外囊泡聚糖的装置和方法。根据实施方式，微流体装置包括：入口部分，其被配置为接收流体样本；混合部分，其流体联接至所述入口部分并且被配置为促进所述流体样本与磁性纳米粒子之间的混合，所述磁性纳米粒子被功能化以与细胞外囊泡结合并聚集成所述流体样本中的囊泡聚糖；磁分离部分，其流体联接至所述混合部分并且被配置为从所述流体样本分离磁性纳米粒子簇；以及磁传感器，其被配置为在所述流体样本已经通过所述磁分离部分之后测量所述流体样本的磁性质。所述磁性纳米粒子可以被配置为：当与携带目标聚糖的细胞外囊泡结合后，在存在相应凝集素的情况下聚集。在特定实施方式中，磁性粒子包括涂覆有聚多巴胺的磁性多核。

Description

细胞外囊泡聚糖的磁性分析
技术领域
本公开涉及细胞外囊泡聚糖(extracellular vesicle glycans)的分析，具体地，涉及用于分析细胞外囊泡聚糖的微流体装置和磁性纳米粒子。
背景技术
细胞外囊泡(EV)最近已成为一类有吸引力的循环生物标志物。这些纳米级膜结合囊泡几乎存在于所有体液中，由细胞主动分泌到循环中。作为细胞间通讯的鲁棒的信使，EV拥有丰富的分子含量，包括核酸、蛋白质、脂质以及多种聚糖——发现的游离或结合到蛋白质和脂质上的碳水化合物修饰。聚糖具有组成和结构的多样性；根据糖的类型及其组织化结合，多种聚糖组合是可能的，从而导致不同的生物物理性质和功能。在细胞中，这种聚糖多样性调节涉及蛋白质折叠、细胞识别、分化和增殖的许多过程。在囊泡中，最近的研究表明，EV聚糖介导了囊泡的生物发生、细胞间识别和通讯，以及疾病进展和转移。EV聚糖的灵敏和多路分析不仅可以允许更好地理解EV机制，还可以转化为新的疾病诊断和治疗应用。
尽管有这样的潜力，但对EV聚糖的研究明显落后于囊泡中发现的蛋白质和核酸的研究。与细胞研究一样，这种滞后主要是由于缺乏合适的分析技术。常规化验使用质谱法进行碳水化合物结构分析。虽然该方法能够实现全面测量，但它需要大量的处理(例如，EV隔离、样本裂解、酶消化和还原)、大量样本以及先进的仪器和数据分析，以使该化验适用于EV特异性聚糖分析。相比之下，凝集素微阵列提供了一种简化的替代方案。该方法依赖于称为凝集素的碳水化合物结合蛋白；在将凝集素固载到传感器芯片上后，在测量结合信号之前施加并清洗经荧光标记的EV。然而，对于特定EV的测量，该化验不仅需要纯化的EV制备，而且灵敏度有限。由于凝集素和聚糖的弱相互作用(解离常数，Kd＝10-3–10-6M)，这种固相固载进一步限制了该化验在稀有和复杂标本中检测罕见靶标方面的性能。
发明内容
根据本公开的第一方面，提供了一种用于分析细胞外囊泡聚糖的微流体装置。所述微流体装置包括：入口部分，所述入口部分被配置为接收流体样本；混合部分，所述混合部分流体联接至所述入口部分并且被配置为促进所述流体样本与磁性纳米粒子之间的混合，所述磁性纳米粒子被功能化以与细胞外囊泡结合并聚集成所述流体样本中的囊泡聚糖；磁分离部分，所述磁分离部分流体联接至所述混合部分并且被配置为从所述流体样本分离磁性纳米粒子簇；以及磁传感器，所述磁传感器被配置为在所述流体样本已经通过所述磁分离部分之后测量所述流体样本的磁性质。
在实施方式中，所述磁传感器是巨磁阻传感器。
在实施方式中，所述混合部分包括微柱阵列。
在实施方式中，所述磁分离部分包括覆盖有磁分离条带的蛇形通道。
在实施方式中，所述微流体装置包括被功能化以结合至所述入口部分中提供的所述流体样本中的细胞外囊泡的所述磁性纳米粒子。
在实施方式中，所述微流体装置包括凝集素，所述凝集素被选择为与所述流体样本中的目标细胞外囊泡聚糖结合。
根据本公开的第二方面，提供了一种用于分析流体样本中的细胞外囊泡聚糖的系统。所述系统包括多个微流体装置，其中，在所述多个微流体装置的相应入口部分中提供了不同的凝集素，以与所述流体样本中不同的相应目标细胞外囊泡聚糖结合。
根据本公开的第三方面，提供了一种磁性纳米粒子，所述磁性纳米粒子包括覆盖在聚合物涂层中的磁性多核，所述聚合物涂层被功能化以与细胞外囊泡结合。
所述聚合物涂层可以被功能化以与多个细胞外囊泡结合。所述聚合物涂层可以利用聚多巴胺来进行功能化。
所述聚合物涂层可以利用识别元素来进行功能化，所述识别元素被选择为与表示相应生物标志物的特定细胞外囊泡结合。
所述磁性纳米粒子可以被配置为：当与携带目标聚糖的细胞外囊泡结合后，在存在相应凝集素的情况下聚集。
所述磁性纳米粒子的直径可以被选择为对应于所述目标细胞外囊泡的直径。所述磁性纳米粒子的直径可以在20nm至1000nm的范围内。
根据本公开的第四方面，一种分析流体样本部分中的细胞外囊泡聚糖的方法。所述方法包括以下步骤：将所述流体样本与磁性纳米粒子和凝集素混合，所述磁性纳米粒子被功能化以与流体样本中的细胞外囊泡结合，所述凝集素被选择为与所述流体样本部分中的目标细胞外囊泡聚糖结合；对纳米粒子簇进行磁分离，所述纳米粒子簇是通过所述凝集素和所述目标细胞外囊泡聚糖的多价结合而形成的；测量剩余流体样本部分的磁性质；以及根据所述剩余流体样本部分的所述磁性质，确定所述流体样本中的所述细胞外囊泡聚糖的特性。
根据本公开的第五方面，提供了一种分析流体样本中的细胞外囊泡聚糖的方法。所述方法包括以下步骤：针对所述流体样本的相应流体样本部分，执行分析流体样本部分中的细胞外囊泡聚糖的方法，以根据相应的剩余流体样本部分的相应磁性质来确定所述流体样本中的多种相应目标细胞外囊泡聚糖中的每一种的特性。
所述流体样本中的相应目标细胞外囊泡聚糖中的每一种的特性可以根据相应的剩余流体样本部分的相应磁性质来确定，并且包括：识别至少一个保守聚糖特征(conserved glycan signature)。
所述保守聚糖特征是利用凝集素RCA120和/或WGA测量的。
根据本公开的第六方面，提供了一种区分患者预后的方法。所述方法包括：分析对应的流体样本中的细胞外囊泡聚糖。
可以选择相应的目标细胞外囊泡和关联的聚糖以区分结直肠癌和胃癌的患者预后。
所述磁性纳米粒子可以利用抗体CD24来进行功能化，以与癌症细胞外囊泡结合。
可以利用选自Jacalin、ConA、RCA120、PHA-E、STA、LEL、WGA和DSL的凝集素来测量预后聚糖特征。
附图说明
在下文中，将参照附图，作为非限制性示例描述本发明的实施方式，附图中：
图1A例示了根据本发明的实施方式的细胞外囊泡的磁标记；
图1B例示了根据本发明的实施方式的经磁标记的细胞外囊泡的聚集；
图1C例示了根据本发明实施方式的上清液(supernatant)的磁测量；
图2示出了根据本发明的实施方式的用于进行细胞外囊泡聚糖分析的化验盒；
图3A示出了根据本发明实施方式的化验盒的混合器的扫描电子显微照片；
图3B示出了根据本发明实施方式的化验盒的巨磁阻传感器的照片；
图4示出了根据本发明实施方式的用于进行细胞外囊泡聚糖分析的测量盒；
图5示出了本发明实施方式的嵌入式GMR传感器的截面图；
图6A至图6H示出了制造用于本发明实施方式的传感器的方法中的步骤；
图7A至图7D例示了根据本发明的实施方式的细胞外囊泡聚糖的分析方法；
图8A是较小Fe3O4粒子的透射电子显微照片，图8B是本发明实施方式中使用的多核粒子的透射电子显微照片；
图9A和图9B分别针对两种不同磁性纳米粒子示出了GMR输出信号和GMR输出信号变化；
图10A示出了不同功能性纳米粒子的EV标记效率的比较；
图10B示出了EV结合的动力学的研究结果；
图10C示出了磁聚集的特异性的研究结果；
图10D示出了磁信号与EV聚糖浓度的相关性的研究结果；
图11示出了用于测量EV结合聚糖的经尺寸匹配的PMP的研究结果；以及
图12A至图12C示出了癌症细胞外囊泡的分析以确定预后。
具体实施方式
本公开涉及磁性分析细胞外囊泡聚糖。本发明实施方式的底层平台集成了三个功能性步骤：细胞外囊泡(extracellular vesicles，EV)的磁标记；经标记的EV的聚集；以及磁测量。现在将参照图1A至图1C描述这些功能性步骤。
图1A例示了根据本发明的实施方式的细胞外囊泡的磁标记。EV 110是用磁性纳米粒子120来进行磁标记的。磁性纳米粒子120的尺寸与EV 110匹配。磁性纳米粒子120包括由多个磁性粒子形成的磁性多核122和功能性外壳124。功能性外壳124被涂覆在磁性纳米粒子120上以改善与EV 110的结合。功能性外壳124可以包括例如聚多巴胺或抗体。
图1B例示了根据本发明的实施方式的经磁标记的细胞外囊泡的聚集。如图1B所示，添加靶向凝集素130以促进经标记的EV的聚集。在细胞外囊泡110上存在特定聚糖部分112的情况下，靶向凝集素130的添加造成EV 110及其关联的磁性纳米粒子120的多价结合和聚集。对于EV生物物理特性和特定聚糖两者，这种聚集是双重选择性的。这形成了EV的聚集体140。聚集只响应于特定的聚糖，而不响应于自由浮动的糖基化蛋白。随着更多EV聚糖特异性聚集体140的形成，它们由于外部磁梯度150而沉淀并从溶液中消耗以留下上清液。
图1C例示了根据本发明实施方式的上清液的磁测量。用巨磁阻(GMR)传感器170实时测量上清液160中剩余的磁性纳米粒子120。GMR传感器170的输出耦合到电压表172。GMR信号180可以与EV聚糖谱直接相关。这可用于分析EV上发现的特定聚糖部分。
为了解决背景部分中提到的挑战，我们认为磁测量具有明显的优势。首先，磁性纳米材料可以是尺寸可控的和多功能的，以改善相互作用动力学(即，溶液相(solution-phase)反应)。其次，磁测量速度快，需要最少的样本处理，因为原生生物样本的背景敏感性可以忽略不计。因此，我们开发了用于直接分析原生临床生物流体中的EV聚糖的全磁平台。该技术利用合理设计的多核磁性粒子(PMP)将EV聚糖特征转换为磁信号。对于特定的信号转换，该平台使EV聚糖-凝集素能够在溶液相下相互作用，以诱导PMP的双重选择性聚集——这对EV生物物理特性及其聚糖组成均具有特异性，但对自由浮动的糖蛋白无响应——从而造成磁信号原位变化。产生的磁信号通过内置磁阻传感器实时量化，用于EV聚糖的直接分析。当在小型化微流体平台上实施时，该技术使得能够对复杂生物流体中的EV聚糖进行快速、免洗和多路分析(<30分钟，1μl原生样本)。我们进一步应用开发的平台来检查原生临床样本。该技术不仅可以揭示不同生物学背景下癌症EV的聚糖特征，还可以通过直接EV聚糖分析来区分患者的预后特征。
图2示出了根据本发明的实施方式的用于进行细胞外囊泡聚糖分析的化验盒。化验盒200被配置为由公共测量盒接纳。下面参照图4描述了测量盒。
如图2所示，化验盒包括四个关键区划：用于样本加载和磁标记的入口210、包括用于改善局部混合和聚集体形成的微柱222的阵列的混合器220、用于增加与用于消耗较大多核磁性粒子(PMP)聚集体的外部磁场的接触时间的蛇形分选器230，以及用于直接测量磁性上清液的嵌入式巨磁阻(GMR)传感器240。化验盒可以是可回收的并且可以重复用于不同样本的分析。
化验盒200设有沿着每一侧延伸的凹槽以允许插入测量盒中。化验盒200包括微流体通道，这些微流体通道形成入口210、混合器220、蛇形分选器230、与GMR传感器240重叠的感测区域和出口250。蛇形分选器230包括与公共测量盒上的磁分离条带对齐的通道，以消耗较大的PMP聚集体。出口250设有出口阀252，该出口阀252可以被移除以允许样本从入口210流过化验盒200的部件。一对电极242设置在凹槽之一上，以在将化验盒200插入测量盒时允许电连接到GMR传感器240。
将标准软光刻用于制造混合器中的微通道及其关联的微柱。我们使用SU-8负性抗蚀剂(SU8-2025，Microchem)来制备模具。将光刻胶以2000rpm的速度旋涂到硅晶片上30秒，并且分别在65℃和95℃下烘烤2分钟和5分钟。在UV光曝光后，抗蚀剂被再次烘烤，然后在搅拌下显影。在随后使用之前，将显影后的模具在干燥器内用三氯硅烷蒸汽进行化学处理15分钟。将聚二甲基硅氧烷聚合物(PDMS)和交联剂以10:1的比例混合并浇注到SU-8模具上。在65℃下固化4小时后，将PDMS层从模具切下并组装到GMR传感器上。
图3A示出了根据本发明实施方式的化验盒的混合器的扫描电子显微照片。如图3A所示，混合器220包括多个微柱222以增强凝集素混合和聚集。微柱222是圆柱形的。图3A中的比例尺表示50μm。
图3B示出了根据本发明实施方式的化验盒的巨磁阻传感器的照片。如俯视图图3B所示，GMR传感器240包括多个平行的条带244，它们连接到较宽的联接部分246。图3B中的比例尺表示50μm。GMR传感器240的截面如图5所示。我们实验中使用的GMR膜具有底部自旋阀结构。传感器芯片是通过将自旋阀以选定方向上的固定磁化设定薄膜沉积在4英寸硅晶片上制成的。每个芯片传感器由包括具有500μm×5μm电活性区域的4个自旋阀条带的8个检测区域组成。
图4示出了根据本发明实施方式的用于进行细胞外囊泡聚糖分析的测量盒。测量盒400包括多个槽410以接纳化验盒200。化验盒200可以切入测量盒400上的槽410中。磁分离条带420沿着测量盒400延伸并且与化验盒200的蛇形分选器230重叠。各个槽410设有电触点430的一部分，这些电触点430被布置成与联接到相应化验盒200的GMR传感器240的电极242接触，以允许测量来自GMR传感器240的信号。为了多路测量，可以将四个独立的化验盒装入测量盒中，从而使得能够并行执行四种不同的聚糖化验。该测量盒不仅将外部磁场与蛇形分选器对齐，而且还为同时进行GMR测量提供电触点，从而简化了化验过程。
图5示出了本发明实施方式的嵌入式GMR传感器的截面图。如图5所示，GMR传感器240包括3nm的钽层502，其铺设在2nm的铁镍合金层504上。2nm铁镍合金层504铺设在1.5nm钴铁合金层506上。1.5nm的钴铁合金层506下面是2.3nm的铜层508。2.3nm的铜层508铺设在2nm钴铁合金层510上。2nm钴铁合金层510下面是0.8nm钌层512。0.8nm钌层512铺设在2nm钴铁合金层514上。2nm钴铁合金层514下面是8nm铱锰层516。8nm铱-锰层516铺设在2nm铁镍合金层518上。2nm铁镍合金层518下面是5nm的钽层520。
图6A至图6H示出了制造用于本发明实施方式的传感器的方法中的步骤。传感器是在4英寸硅(Si)晶片上制造的。
如图6A所示，通过薄膜沉积，在硅晶片600上以选定方向上的固定磁化设定来沉积GMR膜610。在涂覆光刻胶620后，进行深紫外(DUV)光刻以限定传感器条带。
如图6B所示，经由深度反应离子蚀刻将图案转移到晶片上。这留下了由GMR膜610形成的条带图案。
如图6C所示，在去除电子束(e-beam)抗蚀剂之后，通过施加光刻胶630，利用光学光刻将引线图案覆盖在自旋阀传感器条带上。
如图6D所示，然后通过热蒸发将厚的铜(Cu)层640(100nm)沉积在晶片上。
如图6E所示，自旋阀传感器的电引线和焊盘在光刻胶剥离后形成。
如图6F所示，进行光学光刻以通过施加光刻胶660来限定焊盘区域。
如图6G所示，通过等离子体增强化学气相沉积(PECVD)在传感器和引线上沉积薄的SiO2保护层670(50nm)。
最后，如图6H所示，焊盘区域690通过光刻胶660的剥离而暴露。
图7A至图7D例示了根据本发明的实施方式的分析细胞外囊泡聚糖的方法。使用插入到图4所示的测量盒400中的上面参照图2描述的化验盒200来执行该方法。
如图7A所示，最初进行磁标记。细胞外囊泡和磁性纳米粒子被引入化验盒200的入口210中。随后将凝集素引入混合物中以诱导EV聚糖特异性聚集。对于EV聚糖的片上(on-chip)分析，化验盒被安装到公共测量盒上。简而言之，在化验盒的开放入口中，我们将1μl样本与1μl PMP(1mg/ml，利用用于直接标记的PDA或用于临床研究的抗体来进行功能化)混合，并将混合物培养5分钟以供磁标记。然后将2μl BSA(2％，在PBS中)添加到该混合物中以原位阻断任何非特异性结合位点。随后，我们在混合物中添加了过量的凝集素(VectorLaboratories)，以促进EV聚糖特异性聚集，并且即使在存在竞争性自由浮动糖蛋白的情况下也能确保凝集素结合位点的良好可用性。
如图7B所示，混合物流过化验盒200的混合器220，该混合器220包括微柱阵列以增强多价凝集素结合和聚集。所有流体流动均由在公共测量盒处施加负压的注射泵(HarvardInstruments)致动。
然后，如图7C所示，混合物流过化验盒200的蛇形通道230。当混合物流过蛇形通道230时，它经受由测量盒400的磁分离条带420施加的磁场。磁场使较大的聚集体沉降。较小的磁性粒子仍然悬浮在上清液中。施加的外部磁场强度为300mT，持续时间为5秒。
然后，如图7D所示，通过片上GMR传感器240实时测量上清液的磁含量，并且可以将其与EV聚糖组成相关。
具体而言，首先跨微流体柱阵列引入混合物以增强局部混合和聚集，然后进入蛇形通道以有效分离较大的聚集体。然后，我们经由嵌入式GMR传感器测量上清液中残留的较小PMP的磁信号。
为了开发化验平台，我们评估了涂覆有不同聚合物的功能性PMP，以对EV进行磁标记。具体来说，我们制备了可以诱导强GMR信号的多核磁性纳米材料。
图8A是较小的Fe3O4粒子的透射电子显微照片，图8B是用于本发明的实施方式中的多核粒子的透射电子显微照片。如图8B所示，多核粒子具有20nm至50nm范围内的直径。
图9A和图9B分别针对两种不同磁性纳米粒子示出了GMR输出信号和GMR输出信号变化。GMR信号的变化(ΔGMR)被确定为(Vef-VFe/Vref)，其中Vref是GMR传感器的固有电压信号输出，VFe是在一定Fe浓度下的信号输出。
图9示出了利用聚合物进行纳米粒子功能化的示意图。利用多巴胺(DA)接枝多核粒子以制备PMP-PDA。为了利用其他聚合物进行功能化，在利用3-丙烯酰胺基苯硼酸(AAPBA)、丙烯酸(AA)和甲基丙烯酸聚乙二醇酯(PEGMA)进行功能化以分别制备PMP-P(AAPBA)、PMP-PAA和PMP-P(PEGMA)之前，利用MATMS对多核进行改性以引入表面反应性双键。
为了评估这些功能性PMP对EV的标记效率，我们将等量的每种纳米材料与已知浓度的EV一起培养。在对PMP进行磁隔离后，我们测量了剩余的EV计数以及上清液中的分子含量，以确定相应的标记效率。通过这两项分析，涂覆有PDA的PMP表现出最高的标记效率(>90％)，即使是从不同细胞来源和复杂生物体液(即，血清和尿液)获得的EV也是如此。我们将这种高性能归因于PDA独特的粘附性质，从而使得能够与不同的EV表面生物分子进行各种相互作用(例如，共价和静电)。当在不同的EV浓度下进行评估时，PDA涂层不仅显示出高效的标记，而且显示出快速结合。即使在稀疏样本(<107EVs/ml)中，也可以在短短2分钟内完成完整的磁标记。因此，我们选择涂覆有PDA的PMP作为后续化验开发的最佳纳米材料。
图10A示出了不同功能性纳米粒子的EV标记效率的比较。PMP是利用不同的聚合物来接枝的，以研究它们与EV的相互作用。所有材料都准备好达到相当的流体动力学直径。将等量的相应PMP与从人肾癌细胞(A498)获得的已知浓度的EV一起培养。具有PDA涂层的PMP显示出最高的标记效率，并且被用于后续化验开发。
由于EV是具有多个表面生物分子的多价靶标(multivalent target)，因此我们研究了PMP尺寸在诱导纳米粒子聚集中的作用。我们制备了不同大小的PMP，并在针对相等浓度的EV和凝集素RCA120进行处理时测量了这些PMP的聚集。
图10B示出了EV结合的动力学的研究结果。我们制备了各种浓度的EV(从A498细胞获得；高，109/ml；中，108/ml；低，107/ml)并监测了与固定量PMP一起培养后的时间标记效率。标记效率由上清液中的囊泡计数确定。
图10C示出了磁聚集的特异性的研究结果。我们测量了PMP在不同实验条件(+，存在；-，不存在)下的平均流体动力学直径。PMP仅在EV(从A498细胞获得)和凝集素(RCA120，与EV中常见的半乳糖关联碳水化合物结合)都存在的情况下才聚集。通过添加半乳糖可以竞争性地抑制这种聚集。在没有EV或靶向凝集素的情况下，PMP保持分散，如同未处理的粒子那样。
图10D示出了磁信号与EV聚糖浓度的相关性的研究结果。当利用越来越多的EV聚糖进行处理时，PMP聚集得更广泛，如通过簇的流体动力学直径的增加示出的(上图)。这些磁性聚集体通过外部磁场而消耗，导致上清液中残留PMP的量减少(中图)。我们通过GMR传感器测量了上清液的磁信号。GMR信号显示为热图，并与EV聚糖的量呈正相关(下图)。所有测量进行三次，数据显示为平均值±标准差。
由于EV是具有多个表面生物分子的多价靶标，因此我们研究了PMP尺寸在诱导纳米粒子聚集中的作用。我们制备了不同大小的PMP，并在针对相等浓度的EV和凝集素RCA120进行处理时测量了这些PMP的聚集。
图11示出了用于测量EV结合聚糖的经尺寸匹配的PMP的研究结果。我们制备了不同大小的PMP，各个PMP涂覆有PDA，并在存在凝集素RCA120的情况下将纳米材料与等浓度的EV(A498细胞)一起培养。相对于未处理的PMP的直径，对聚集体的直径进行归一化。190-nmPMP显示出最高的信号。
图12A至图12C示出了癌症细胞外囊泡的分析以确定预后。
图12A示出了该分析的示意图。将生物流体(例如，尿液、血清、腹水)1210与利用抗体1220进行了功能化的PMP一起培养，以针对特定的癌症抗原1230进行靶向。这增强了利用PMP对推定的癌症EV的磁测量。无需进一步清洗，将样本用凝集素1240处理，以实现EV聚糖特异性聚集1250和分析。
图12B示出了模拟临床标本的分析。通过将肾癌(A498)和脑癌(GLI36)的EV分别掺入囊泡消耗的尿液和血清中来制备样本。使用根据本发明实施方式的方法和装置获得了标记为iMAGE的结果。我们使用利用anti-CD63抗体进行了功能化的PMP对EV进行磁标记并进行测量。在这两个样本中，该平台都显示出与纯癌症EV的聚糖特征的良好的相关性(R2>0.85)。所有信号都针对相应的纯EV测量结果进行了归一化。为了比较，图12B示出了来自酶联免疫吸附测定(ELISA)的结果。EV被吸附到ELISA板(Thermo Scientific)上，并在含有1％BSA的PBS中封闭，用于ELISA测量。清洗后，将生物素化抗体(anti-CD63，1μg/ml，BDBiosciences)或生物素化凝集素(2μg/ml，Vector Laboratories)添加到封闭溶液中，并在室温下培养2小时。在与FITC缀合的链霉亲和素(BD Biosciences)一起培养后，测定荧光信号(Tecan)。
图12C示出了临床癌症腹水中21种凝集素标志物的分析(n＝11)。经由anti-CD24功能化PMP来分析患者样本。通过患者标本(行)及其凝集素信号(列)的层次聚类，分析可以将临床样本分为两个不同的组。这种基于EV聚糖的分类与患者预后的独立临床评估具有很强的一致性。具体而言，凝集素标志物可以被分类为预后不良标志物(P<0.0001，双因素方差分析(two-way ANOVA))或非区分性标志物。(B-C)中的所有测量都与经样本匹配的对照组一起进行三次，数据显示为平均值。a.u.任意单位。
对于临床分析，直接使用腹水样本。为了能够选择性地测量癌症EV上的聚糖特征，我们将腹水样本与利用抗CD24抗体进行了功能化的PMP一起培养，然后引入不同的凝集素以诱导聚糖特异性聚集。对于所有测量，我们包括了经患者样本匹配的无凝集素对照组。相对于该对照组进行分析以说明样本匹配的非特异性聚集。患者特性的临床评估是独立确定的。具体而言，患者预后是通过从收集腹水时起的总生存期确定的。当总生存期超过十个月时，患者被认为预后良好。相反，如果总生存期少于五个月，则确定患者预后不良。所有测量都是在不知道这些临床评估的情况下进行的。
本发明实施方式的科学应用可能是广泛的。凭借其灵敏和特异性的检测，我们预计该平台可以很容易地扩展以测量其他EV表面标志物，包括已建立的和新的EV改性(例如泛素化)。其溶液相磁致动进一步提高了化验性能并简化了探针选择(例如，低亲和性结合剂)，以识别微弱但真实的相互作用，并且可以很容易地与其他技术集成以促进分子化验的开发。此类研究不仅会改善生物标志物的表征，还会赋予新的应用潜力。如本公开所证明的，保守的EV聚糖特征的识别可以使开发新的基于聚糖的方法成为可能，以用于复杂的生物流体中普遍存在的EV富集。
尽管前面的描述已经描述了示例性实施方式，但是本领域技术人员将理解，在本发明的范围和精神内可以对实施方式进行许多变化。

Claims (22)

1.一种用于分析细胞外囊泡聚糖的微流体装置，所述微流体装置包括：
入口部分，所述入口部分被配置为接收流体样本；
混合部分，所述混合部分流体联接至所述入口部分并且被配置为促进所述流体样本与磁性纳米粒子之间的混合，所述磁性纳米粒子被功能化以与细胞外囊泡结合并聚集成所述流体样本中的囊泡聚糖；
磁分离部分，所述磁分离部分流体联接至所述混合部分并且被配置为从所述流体样本分离磁性纳米粒子簇；以及
磁传感器，所述磁传感器被配置为在所述流体样本已经通过所述磁分离部分之后测量所述流体样本的磁性质。
2.根据权利要求1所述的微流体装置，其中，所述磁传感器是巨磁阻传感器。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的微流体装置，其中，所述混合部分包括微柱阵列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的微流体装置，其中，所述磁分离部分包括覆盖有磁分离条带的蛇形通道。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的微流体装置，所述微流体装置包括被功能化以结合至所述入口部分中提供的所述流体样本中的细胞外囊泡的所述磁性纳米粒子。
6.根据权利要求5所述的微流体装置，所述微流体装置还包括凝集素，所述凝集素被选择为与所述流体样本中的目标细胞外囊泡聚糖结合。
7.一种用于分析流体样本中的细胞外囊泡聚糖的系统，所述系统包括多个微流体装置，所述微流体装置是根据权利要求1至6中任一项所述的微流体装置，其中，在所述多个微流体装置的相应入口部分中提供了不同的凝集素，以与所述流体样本中不同的相应目标细胞外囊泡聚糖结合。
8.一种磁性纳米粒子，所述磁性纳米粒子包括覆盖在聚合物涂层中的磁性多核，所述聚合物涂层被功能化以与细胞外囊泡结合。
9.根据权利要求8所述的磁性纳米粒子，其中，所述聚合物涂层被功能化以与多个细胞外囊泡结合。
10.根据权利要求9所述的磁性纳米粒子，其中，所述聚合物涂层是利用聚多巴胺来进行功能化的。
11.根据权利要求8所述的磁性纳米粒子，其中，所述聚合物涂层是利用识别元素来进行功能化的，所述识别元素被选择为与表示相应生物标志物的特定细胞外囊泡结合。
12.根据权利要求8所述的磁性纳米粒子，所述磁性纳米粒子被配置为：当与携带目标聚糖的细胞外囊泡结合后，在存在相应凝集素的情况下聚集。
13.根据权利要求8至12中任一项所述的磁性纳米粒子，所述磁性纳米粒子的直径被选择为对应于目标细胞外囊泡的直径。
14.根据权利要求8至13中任一项所述的磁性纳米粒子，所述磁性纳米粒子的直径在20nm至1000nm的范围内。
15.一种分析流体样本部分中的细胞外囊泡聚糖的方法，所述方法包括以下步骤：
将所述流体样本与磁性纳米粒子和凝集素混合，所述磁性纳米粒子被功能化以与所述流体样本中的细胞外囊泡结合，所述凝集素被选择为与所述流体样本部分中的目标细胞外囊泡聚糖结合；
对纳米粒子簇进行磁分离，所述纳米粒子簇是通过所述凝集素和所述目标细胞外囊泡聚糖的多价结合而形成的；
测量剩余流体样本部分的磁性质；以及
根据所述剩余流体样本部分的所述磁性质，确定所述流体样本中的所述细胞外囊泡聚糖的特性。
16.一种分析流体样本中的细胞外囊泡聚糖的方法，所述方法包括以下步骤：针对所述流体样本的相应流体样本部分，执行根据权利要求15所述的方法，以根据相应的剩余流体样本部分的相应磁性质来确定所述流体样本中的多种相应目标细胞外囊泡聚糖中的每一种的特性。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，根据相应的剩余流体样本部分的相应磁性质来确定所述流体样本中的相应目标细胞外囊泡聚糖中的每一种的特性的步骤包括：识别至少一个保守聚糖特征。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述保守聚糖特征是利用凝集素RCA120和/或WGA测量的。
19.一种区分患者预后的方法，所述方法包括：根据权利要求16来分析与患者相对应的流体样本中的细胞外囊泡聚糖。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，选择相应的目标细胞外囊泡和关联的聚糖以区分结直肠癌和胃癌的患者预后。
21.根据权利要求19或权利要求20所述的方法，其中，所述磁性纳米粒子是利用抗体CD24来进行功能化的，以与癌症细胞外囊泡结合。
22.根据权利要求19至21中任一项所述的方法，其中，利用选自Jacalin、ConA、RCA120、PHA-E、STA、LEL、WGA和DSL的凝集素来测量预后聚糖特征。
CN202080081117.0A 2019-11-15 2020-11-16 细胞外囊泡聚糖的磁性分析 Pending CN114845811A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SG10201910706V 2019-11-15
SG10201910706V 2019-11-15
PCT/SG2020/050663 WO2021096434A1 (en) 2019-11-15 2020-11-16 Magnetic analysis of extracellular vesicle glycans

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114845811A true CN114845811A (zh) 2022-08-02

Family

ID=75912287

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080081117.0A Pending CN114845811A (zh) 2019-11-15 2020-11-16 细胞外囊泡聚糖的磁性分析

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20220412982A1 (zh)
CN (1) CN114845811A (zh)
WO (1) WO2021096434A1 (zh)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6606916B2 (ja) * 2015-08-21 2019-11-20 株式会社Ｊｖｃケンウッド エクソソームの捕捉方法
WO2017087940A1 (en) * 2015-11-20 2017-05-26 University Of Kansas Non-invasive monitoring cancer using integrated microfluidic profiling of circulating microvesicles
EP3602055B1 (en) * 2017-03-24 2021-01-13 Pfaffl, Michael W. Methods and kits for exosome isolation and quantification

Also Published As

Publication number Publication date
WO2021096434A1 (en) 2021-05-20
US20220412982A1 (en) 2022-12-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Lin et al. Microfluidic‐based exosome analysis for liquid biopsy
Sina et al. Label-free detection of exosomes using a surface plasmon resonance biosensor
Johnson et al. Proteomics, nanotechnology and molecular diagnostics
Wang et al. Dual-selective magnetic analysis of extracellular vesicle glycans
Bai et al. Microfluidic strategies for the isolation and profiling of exosomes
Gaikwad et al. Advances in point-of-care diagnostic devices in cancers
Wang et al. Magnetoresistive performance and comparison of supermagnetic nanoparticles on giant magnetoresistive sensor-based detection system
Kim et al. Magnetic force-based multiplexed immunoassay using superparamagnetic nanoparticles in microfluidic channel
CN108885191B (zh) 化学传感器
JP6237031B2 (ja) 成分分離方法、成分分析方法及び成分分離装置
JP6812986B2 (ja) センサ及びバイオチップ
JP6133780B2 (ja) 汎捕捉性の結合領域を備えている多方向マイクロ流体デバイス、及びその使用方法
JP2009545723A (ja) 検体検出のための三次元集積回路
Zhao et al. Si nanowire Bio-FET for electrical and label-free detection of cancer cell-derived exosomes
Sun et al. Nanomaterial-based microfluidic chips for the capture and detection of circulating tumor cells
WO2008156688A2 (en) Nonlinear magnetophoretic separation of biological substances
Yokota et al. Extracellular vesicles nanoarray technology: Immobilization of individual extracellular vesicles on nanopatterned polyethylene glycol-lipid conjugate brushes
WO2017031393A1 (en) Patterned plasmonic nanoparticle arrays for multiplexed, microfluidic biosensing assays
WO2017170230A1 (ja) バイオセンサ及びバイオチップ
Chen et al. From conventional to microfluidic: progress in extracellular vesicle separation and individual characterization
Khondakar et al. Prospects in Cancer Diagnosis: Exosome-Chip for Liquid Biopsy
Wang et al. N-(4-Aminobutyl)-N-ethylisopropanol and Co2+ dual-functionalized core–shell Fe3O4@ Au/Ag magnetic nanomaterials with strong and stable chemiluminescence for a label-free exosome immunosensor
JP2023528687A (ja) 分析物の検出および定量化のための磁性ナノ粒子の使用
Sonawane et al. Detection, quantification, and profiling of PSA: current microarray technologies and future directions
CN114845811A (zh) 细胞外囊泡聚糖的磁性分析

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination