CN114835907A - 一种提高pekk生物活性的方法及所得pekk和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于口腔种植体材料技术领域，具体涉及一种提高PEKK生物活性的方法及所得PEKK和应用，通过紫外线诱导自由基聚合，将polyNaSS接枝到PEKK表面，即可。本发明得到的表面接枝polyNaSS的PEKK具有优良的成骨活性及抗菌能力，在口腔种植体材料领域具有广阔的发展前景。

Description

一种提高PEKK生物活性的方法及所得PEKK和应用
技术领域
本发明属于口腔种植体材料技术领域，具体涉及一种提高PEKK生物活性 的方法及所得PEKK和应用。
背景技术
种植牙是治疗牙列缺损或缺失的基本方式。钛和钛合金是应用最广泛的牙科 植入材料。然而，钛和钛合金的金属离子释放和高弹性模量(钛合金的弹性模量 为110GPa，骨骼为6-20GPa)可能导致植入失败。高温热塑性聚合物聚芳醚酮 (PAEK)，尤其是它的代表物聚醚酮酮(PEKK)，因其具有合适的机械强度、 较高的耐化学性和良好的生物相容性而备受关注。PEKK已应用于脊柱外科、关 节置换术、颌面外科等，在口腔医学领域，PEKK可应用于牙体修复、种植以及 骨缺损修复等多个方面。
目前，人们一直致力于通过改变PEKK的表面特性来优化其生物性能，例 如生物活性涂层和修饰表面形貌。但是作为牙科植入材料时，需要材料有足够的 机械性能以承受较高的咬合力，因此PEKK骨整合的改善非常具有挑战性。磺 化是PEKK的经典表面改性方法；然而，磺化产生的多孔结构会降低PEKK的 机械性能。另外，磺化反应生成的残留的低价硫化合物具有细胞毒性，不适合口 腔种植体的应用。
感染是骨植入物术后的主要并发症之一，通常由菌斑生物膜引起。一旦细菌 生物膜成熟，免疫系统和常规抗生素就很难将其清除，最终导致种植手术失败。 口腔是人体五大细菌库之一，其中有700多种微生物，如细菌、真菌、螺旋体和 病毒。因此，与人体其他部位相比，口腔内的植入物更容易感染。种植体周围炎 是口腔植入物最严重的并发症之一，其10年发病率约为15％至30％。因此，理 想的口腔植入材料应具有抗菌活性。
经检索发现，还未有采用紫外接枝提高PEKK生物活性的报道。
发明内容
针对现有问题的不足，本发明的第一个目的是提供一种提高PEKK生物活 性的方法；本发明的第二个目的是提供前述提高PEKK生物活性的方法得到的 表面接枝polyNaSS的PEKK；本发明的第三个目的是提供前述PEKK的应用。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是：
一种提高PEKK生物活性的方法，通过紫外线诱导自由基聚合，将聚苯乙 烯磺酸钠(polyNaSS)接枝到PEKK表面，即可。
紫外接枝是一种简单、廉价且高效的改性方法，可以使活性分子通过强化学 键与材料表面牢固结合。PEKK含有一个光活性羰基(C＝O)。因此，当PEKK 受到紫外线照射时，发生Norrish I型反应，产生表面自由基和游离自由基，从 而引发单体的聚合。
通过紫外线诱导含有磺酸基团的分子(polyNaSS)接枝到材料表面可避免产 生低价硫化合物。同时，因为接枝反应只在材料表面发生，所以这种改性方法也 不会损害PEKK材料的机械性能。
作为本申请的优选技术方案，一种提高PEKK生物活性的方法，包括如下 具体步骤：
(1)将PEKK材料表面打磨后，清洗干净；
(2)将步骤(1)的样品浸入0.1～5mol/L的polyNaSS水溶液中，惰性气体氛围 下紫外线处理30～120min；
(3)将步骤(2)的样品清洗干净后，干燥即得。
作为本申请的优选技术方案，所述步骤(1)中，PEKK为PEKK圆盘。
作为本申请的优选技术方案，所述步骤(1)中，使用丙酮和双蒸水对材料 进行清洗。
作为本申请的优选技术方案，所述步骤(1)中，清洗时采用超声辅助清洗。
作为本申请的优选技术方案，所述步骤(2)中polyNaSS浓度为0.25～1mol/L。
优选的，所述步骤(2)中polyNaSS浓度选自0.25、0.5或1mol/L。
更优选的，所述步骤(2)中polyNaSS浓度为1mol/L。
作为本申请的优选技术方案，所述步骤(2)中，惰性气体为稀有气体或氮 气。
其中，所述稀有气体选自氦气、氖气、氩气、氪气或氙气等。
作为本申请的优选技术方案，所述步骤(2)中紫外处理时间为50～80min。
优选的，所述步骤(2)中紫外处理时间为60min。
作为本申请的优选技术方案，所述紫外线处理采用高压汞灯来来完成。
优选的，所述高压汞灯的功率为500W。
作为本申请的优选技术方案，所述步骤(3)中，干燥采用冷冻干燥方式。
优选的，干燥时间为12h。
本发明还提供前述提高PEKK生物活性的方法得到的表面接枝polyNaSS的 PEKK。
本发明还保护前述表面接枝polyNaSS的PEKK作为口腔种植体材料的应 用。
有益效果
本发明提供的一种提高PEKK生物活性的方法及前述方法得到的表面接枝polyNaSS的PEKK，与现有技术相比，具有以下有益效果：
(1)本发明表面接枝polyNaSS的PEKK具有优异的亲水性能；
(2)本发明表面接枝polyNaSS的PEKK蛋白质吸附容量较PEKK显著提高；
(3)本发明表面接枝polyNaSS的PEKK具有优异的细胞粘附性能；
(4)本发明表面接枝polyNaSS的PEKK可显著提高PEKK的早期骨诱导和 矿化；
(5)本发明表面接枝polyNaSS的PEKK可显著抑制细菌的粘附；
综上所述，本发明的方法得到的表面接枝polyNaSS的PEKK具有优良的成 骨活性及抗菌能力，在口腔种植体材料领域具有广阔的发展前景。
附图说明
图1(A)TB染色PAEK接枝polyNaSS前后的图像，(B)代表性扫描电子显 微镜图像(SEM)and(C)EDS spectra of PEEK；其中，(a),SE0.25(b),SE0.5(c), SE1.0(d),PEKK(e),SK0.25(f),SK0.5(g),and SK1.0(h)。
图2(A)ATR-FTIR光谱。(B)水接触角的代表性照片(C)水接触角值。(D) 吸附在样品上的牛血清白蛋白(BSA)荧光强度的CLSM显微照片和(E)定量 分析。标尺：40μm。*P<0.05，***P<0.001(与PEEK组相比)#P<0.05，P<0.001 (与PEKK组相比)&&&P<0.001(与SK1.0组相比)。
图3(A)代表性CLSM图像显示在材料片上培养1d的细胞的肌动蛋白微丝细 胞骨架蛋白(红色)和细胞核(蓝色，DAPI)染色。比例尺：40μm。(B)图(A) 的CLSM图像的细胞扩散面积定量分析，未接枝的聚醚醚酮作为对照。(C-D) hWJ-MSCs在材料盘上培养1d(C)和3d(D)的细胞活力**P<0.01，***P<0.001 (与PEEK组相比)##P<0.01，###P<0.001(与PEKK组相比)&&P<0.01，&&& P<0.001(与SK1.0组相比)。
图4在材料上培养1d的hWJ-MSCs中的基因表达水平。未接枝的PEEK作为 对照**P<0.01，***P<0.001。误差线代表标准差。n＝3。
图5HWJ-MSCs在成骨培养基中培养7d(A-C)和21d(D)。(A)代表性CLSM 图像显示RUNX-2(红色)和Col I(绿色)蛋白以及细胞核(蓝色，DAPI)的 染色。(B)hWJ-MSCs的ALP活性。未接枝的聚醚醚酮作为对照。(C)通过 ALP染色观测在PEEK(a),PEKK(b),SE1.0(c)andSK1.0(d)上生长的hWJ骨髓 间充质干细胞的ALP活性。(D)通过ARS染色观察在PEEK(a),PEKK(b),SE1.0 (c)and SK1.0(d)上生长的细胞中的细胞外钙沉积。标尺：40μm(A)；250μm(C-D) **P<0.01***P<0.001。误差线代表标准差。n＝3。
图6成骨诱导液中材料片上培养7天(A)和14天(B)的hWJ-MSCs中成骨 相关基因的表达水平。未接枝的聚醚醚酮作为对照 *P<0.05**P<0.01***P<0.001。误差线代表标准差。n＝3。
图7大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和牙龈卟啉单胞菌在材料片上培养1d。(A) 菌落形成单位的定量。(B)代表性CLSM图像显示细菌细胞的活/死染色。死 亡细胞用碘化丙啶(红色)染色，而活细胞用SYTO9(绿色)染色。标尺：40μm. *P<0.05***P<0.001。误差线代表标准差。n＝3。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步详细说明。所用试剂或者仪器设备未注明 生产厂商的，均视为可以通过市场购买的常规产品。
本申请一种提高PEKK生物活性的方法，通过紫外线诱导自由基聚合，将 polyNaSS接枝到PEKK表面，即可。
具体地，将PEEK作为对照组，与PEKK同时进行改性，方法如下：使用 尺寸为
Figure BDA0003509579010000052
的医用级PEEK和PEKK圆盘(中国深圳万家达塑料制品 有限公司)。用#1200SiC砂纸打磨圆盘，然后用丙酮和双蒸馏水(ddH2O)进行 超声清洗。将样品浸入不同浓度的脱氧NaSS(Sigma，USA)水溶液中，然后将 其暴露于高压汞灯中60min。反应在氮气下进行。最后，用ddH2O清洗所有样 品，冷冻干燥12小时，即得。
通过紫外线诱导自由基聚合，将polyNaSS接枝到PEEK和PEKK表面后， 本申请继续通过测定人脐带间充质细胞的增殖、粘附和成骨分化能力，确认接枝 的polyNaSS对PEKK材料成骨性能的影响。此外，还测定了复合材料对金黄色 葡萄球菌(S.aureus)、大肠杆菌(E.coli)和牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)的抗 菌性能。
实施例
使用尺寸为
Figure BDA0003509579010000053
的医用级PEEK和PEKK圆盘(中国深圳万家达 塑料制品有限公司)。用#1200SiC砂纸打磨圆盘，然后用丙酮和双蒸馏水 (ddH2O)进行超声清洗。将样品浸入不同浓度(0.25、0.5和1.0mol/L)的脱 氧NaSS(Sigma，USA)水溶液中，然后将其暴露于高压汞灯(500W，中国北 京天麦恒辉光源电器有限公司)中60min。反应在氮气下进行。最后，用ddH2O 清洗所有样品，冷冻干燥12小时。对照组表示为PEEK、SE0.25、SE0.5、SE1.0；样品组表示为PEKK、SK0.25、SK0.5和SK1.0(表1)。
表1 PolyNaSS接枝表面的制作参数
Figure BDA0003509579010000051
性能测试
1表面表征
使用扫描电子显微镜(SEM；TESCAN MAIA3，捷克共和国)检查样品的 表面形态，并使用能量色散X射线光谱法测定其元素组成。通过甲苯胺蓝比色 法(TB；中国阿拉丁生化技术有限公司)和傅里叶变换红外光谱法(FTIR；Nicolet IS10，美国)测定接枝表面上是否存在polyNaSS。对于TB分析，将样品在30℃ 的TB水溶液(5×10-4mol/L)中浸泡6h，使TB与SO3-络合。然后，使用氢氧 化钠水溶液(5×10-3mol/L)去除未结合的TB。最后，将样品浸泡在醋酸水溶 液(50:50，V/V)中1天以诱导TB分解。溶液中分解的TB的浓度通过使用微 孔板读取器(SpectraMax M2；美国加利福尼亚州桑尼维尔市分子器件有限责任 公司)在633nm处的吸光度测量。测量接触角(德国Dataphysics OCA50)以评 估样品的表面亲水性。
2蛋白质吸附
使用牛血清白蛋白(BSA)评估样品的蛋白质吸附。将圆盘置于含有0.5mL 异硫氰酸荧光素标记的1％BSA(BSA-FITC；中国北京索拉比奥科技有限公司) 的24孔板中，然后在37℃黑暗中培养1小时。样品用ddH2O洗涤三次以去除未 吸附的BSA，然后在蔡司LSM 710激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)下观察。
3细胞制备和培养
本研究的实验方案已经南京医科大学伦理委员会批准。在获得供体的书面知 情同意后，从新鲜人脐带中分离出hWJ-MSCs。简而言之，脐带用含有1％青霉 素和链霉素的磷酸盐缓冲液清洗三次(PS；Hyclone，奥地利)。将胶质切成1mm3的小块，置于25cm2的组织培养瓶中，然后在37℃的5％CO2湿润环境中培养。 细胞培养在基础培养基，即含有10％胎牛血清(FBS，GIBCO)和1％PS的 DMEM/F12(GIBCO Life Technology，美国纽约州格兰德岛)中进行。
4细胞粘附试验
将圆盘置于24孔板中，然后接种hWJ-MSCs(3×104细胞/cm2)。1天后，用 磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗样品，然后用4％多聚甲醛(PFA；Biosharp，中国 北京)固定20分钟。固定细胞用含有0.1％Triton X-100(中国上海Beyotime) 的PBS清洗五次，每次5分钟，然后在1/200稀释罗丹明-鬼笔环素中培养 (Beyotime，上海，中国)在室温下黑暗中60分钟。然后，用4'，6-二氨基-2- 苯基吲哚(DAPI；Beyotime，上海，中国)对细胞核染色30秒。最后，使用蔡 司LSM 710激光CLSM对样品进行观察。
5细胞活力测定
hWJ-MSCs以3×104个细胞/cm2的密度接种在24孔板中的样品上。在培养1 和3天后，使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化法(MTT法； Beyotime，上海，中国)测定细胞活力。使用微孔板读取器测量formazan在490 nm处的吸光度。
6碱性磷酸酶(ALP)染色和活性测定
接种3×104个/cm2 hWJ-MSCs细胞在材料上培养1天。之后，将细胞培养 在成骨培养基中。成骨培养基即含有2％成骨诱导液的基础培养基。该成骨诱导 液由0.1μM地塞米松、10mMβ-甘油磷酸和50μg/mL L-抗坏血酸-2-磷酸组成 (Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯市)培养14天后，使用ALP比色试剂 盒(Beyotime，中国上海)用5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐/硝基四氮唑蓝(BCIP/NBT) 对hWJ-MSCs进行染色。样品固定在4％PFA中，用含有NBT和BICP的混合物 染色4小时。细胞在RIPA裂解缓冲液(Beyotime，中国上海)中裂解0.5小时。 细胞裂解物在1小时后离心。
7茜素红S(ARS)染色
hWJ-MSCs以2.5×104个/cm2的密度接种在样品上培养1天，然后在碱性磷 酸酶染色和活性测定中提到的成骨培养基中培养21天。ARS染色用于确定矿化 结节的形成。将样品固定在4％PFA中，然后用1％(w/v)ARS(pH，4.2)染色 5分钟。用ddH2O冲洗两次后，对染色的细胞进行拍照。
8定量实时聚合酶链反应(qRT PCR)
qRT PCR用于定量分析成骨和粘附相关基因的表达。在分析成骨相关基因， 包括骨钙素(OCN)、骨桥蛋白(OPN)、I型胶原(Col1)、runt相关转录因子2 (RUNX-2)和碱性磷酸酶(ALP)时，使用TRIzol试剂从在成骨培养基中培养 7和14天的hWJ-MSCs中分离总RNA(Invitrogen，Carlsbad，CA，United States)。 在分析粘附相关基因时，包括粘着斑激酶(FAK)、vinculin(VCL)、paxillin(PXN)、 整合素β1(ITGβ1)、整合素β3(ITGβ3)和整合素α5(ITGα5)，如上所述，从 在基础培养基中培养1天的hWJ-MSCs中分离总RNA。互补DNA(cDNA)在T3热循环仪(MasterCycle 5333，Eppendorf，Hamburg，Germany)中使用 PrimeScriptcDNA合成试剂盒(日本东京TaKaRa)从1.0μg总RNA合成。在定 量实时扩增系统上使用FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)试剂盒(瑞 士巴塞尔罗氏)进行定量PCR(7900HT Fast，美国加利福尼亚州福斯特市应用 生物系统公司)。通过2-ΔCt方法计算靶基因的mRNA表达，然后将其标准化为 管家基因GAPDH的mRNA表达。表2列出了引物序列。
表2.用于qRT-PCR的引物
Figure BDA0003509579010000081
9免疫荧光
在成骨培养基中在材料表面培养7天后，将hWJ-MSCs固定并在PBS中用 0.1％Triton X-100渗透，然后在4℃下与1％抗Runx2抗体或抗Col I抗体(兔多 克隆抗体；细胞信号技术，美国马萨诸塞州波士顿)孵育过夜。最后，将细胞与 1％CoraLite594-和CoraLite488结合的山羊抗兔IgG(H+)(美国Proteintech) 在黑暗中放置1小时。然后用DAPI将细胞染色30秒，然后用蔡司LSM 710 CLSM 进行观察。
10细菌培养
牙龈卟啉单胞菌ATCC 33277在添加5mg/L氯化血红素(美国密苏里州圣 路易斯西格玛)和0.1mg/L维生素K(中国合肥博美)的脑心灌注琼脂(BHI； OXOID，英国巴辛斯托克)上进行有氧培养或在37℃的BHI液体培养基中厌氧 培养。金黄色葡萄球菌ATCC 25923和大肠杆菌BNCC 336902在Luria Bertani 琼脂培养基(LB；中国青岛Hopebio)中培养，然后在37℃的LB液体培养基 中培养。通过离心(5000×g，5min)收集细菌细胞，并用PBS洗涤三次。将1 毫升的细菌悬液(金黄色葡萄球菌或大肠杆菌的浓度为1×106细胞/mL；牙龈假 单胞菌的浓度为1×108细胞/mL)与材料在24孔板中培养1天。
11细菌粘附试验
通过量化菌落形成单位(CFU)确定粘附在材料上的细菌数量，并以CFU/mL 表示。简言之，用PBS轻轻清洗样品，并将粘附的细菌收集在Eppendorf管中， 然后连续稀释。最后，将100μL的每个稀释样品转移到BHI或LB板上，按照 前述方法进行培养。用菌落计数仪测定菌落形成单位。
12活/死染色
使用活/死染色法观察细菌活性(l7012，Invitrogen，美国)。让细菌粘附在 24孔板中的材料表面，然后用PBS清洗两次以去除未粘附的细菌。然后，将其 与活/死染色液混合，在黑暗中培养15分钟后，在Zen Lite显微镜(德国耶拿卡 尔蔡司meditec AG)下观察激发波长为488和561nm的样品。
14统计分析
本研究中的实验至少重复三次。数据以平均值表示±三个独立实验的SD。 通过单因素方差分析(ANOVA)确定显著性差异(p<0.05)。所有统计分析均采 用GraphPad Prism8.0统计软件进行。
测试结果
1未接枝和polyNaSS接枝PEKK的表面形态和元素分布
为确认polyNaSS的存在并检测其在PEKK表面的分布，使用TB染色以提 供宏观信息。所有样本的结合强度显著不同(图1A)。图像清楚地显示，经UV 诱导接枝后，蓝色物质均匀地分布在样品表面。随着NaSS单体浓度的增加，蓝 色变深。表面聚合物的接枝量通过TB比色法进行定量分析，结果总结在表3中。
表3.polyNaSS的TB染色计算的磺酸基团接枝率
Figure BDA0003509579010000091
对于接枝组，PEKK的接枝量从0.92±0.13逐渐增加到7.01±0.22mmol/cm2， 而PEEK的接枝量虽有提高，但仅增加到6.01±0.21mmol/cm2。这些结果表明， PEKK表面成功接枝了polyNaSS，接枝量随单体NaSS浓度的增加而增加。
通过SEM和EDS检查不同样品的微观形态和元素组成。如图1B所示，纯 PEEK和PEKK明显包含许多凹坑和划痕。紫外光接枝后，PEEK和PEKK的表 面相对光滑，表面光滑度随polyNaSS在表面的接枝程度而变化。在相同单体浓 度下，PEKK的表面比PEEK明显光滑。接枝的polyNaSS可以观察为“枝状”物 质(如图1B中的黄色箭头所示)。随着聚合物量的增加，“枝状”物质变得更厚， 并最终融合在一起(如图1B中的红色箭头所示)。SK1.0样品具有最高的熔合度， 因为一层polyNaSS可以更彻底地覆盖凹坑和划痕。EDS光谱用于检测样品表面 的C、O和S含量(图1C)。以元素总量百分比表示的硫的量随着接枝率的增加 而增加，这是由于SO3 -的存在。为了进一步确认polyNaSS的存在，通过ATR-FTIR 光谱分析样品(图2A)。与未接枝PEKK相比，接枝PEKK的光谱在1190cm-1 和1068cm-1处显示出特征峰，这是由polyNaSS分子链中O＝S＝O结构的对称振 动引起的。此外，PEKK的强度随着单体浓度的增加而增加。这些结果证实，PEKK 被polyNaSS成功地进行了表面改性。
2材料表面的亲水性
为了评估材料表面的亲水性，本发明测量了静态水接触角(CA)。如图2B 和2C所示，未接枝PEKK的CA为109.05±3.58，而接枝PEKK的CA为12.08±5.27 (SK0.25)、8.03±1.92(SK0.5)和7.6±3.42(SK1.0)。表明随着接枝量的增加， 样品表面的亲水性增加。由于polyNaSS是一种亲水性聚合物，这些结果表明材 料的表面得到了成功的改性。在单体浓度为0.25mmol/L和0.5mmol/L时，接枝 PEKK的亲水性显著高于接枝PEEK。
3蛋白质吸附能力
为了确定样品是否能为蛋白质结合提供有利的环境，进行了蛋白质吸附试 验。将样品浸入0.5g/L牛血清白蛋白(BSA)溶液中60min。如图2D所示， BSA均匀吸附在所有样品表面上。接枝PEKK对BSA的吸附量明显高于未接枝 PEKK。在所有样品中，SK1.0样品的蛋白质吸附量最高。CLSM图像定量分析 (图2E)表明，当NaSS单体浓度为1.0mol/L时，PEKK的BSA吸附容量最高。 上述结果表明SK1.0具有最高的蛋白质吸附容量。
4细胞粘附
采用CLSM法观察材料对培养1d的hWJ-MSCs粘附和增殖的影响。代表性 图像显示在图3A中。罗丹明-鬼笔环肽/DAPI染色结果表明，随着接枝程度的增 加，粘附细胞的数量增加。此外，与未接枝组相比，接枝后的材料上的细胞具有 更多的伪足和更大的细胞铺展面积。CLSM图像定量分析(图3B)表明，当NaSS 单体浓度为1.0mol/L时，SK1.0比SE1.0更利于细胞铺展。
5细胞活力测定
MTT法用于检测在样品上生长的hWJ-MSCss的活性(图3C和3D)。在培 养的第一天，与在未接枝PEKK上生长的细胞相比，在所有接枝PEKK(SK0.25、 SK0.5、SK1.0)上生长的细胞的活力更高(图3C)，相比之下，在SE0.25表面 的细胞活力与未接枝组无显著差异接枝。SE1.0和SK1.0样本最有利于细胞活力， 并且在两个样本上生长的细胞活力没有显著差异，但是在培养的第三天，SK1.0 样品上生长的细胞活力显著高于SE1.0组(图3D)。
6细胞粘附相关基因的表达
为了进一步揭示样本对细胞粘附的影响，我们评估了与细胞粘附相关的基因 表达水平(图4)。在PEKK中，在SK1.0样本上生长的细胞中FAK、VCL、PXN、 ITGβ1、ITGβ3和ITGα5基因的表达显著高于在其他组。尽管在PEKK上生长的 细胞中VCL、PXN、ITGβ1和ITGα5基因的表达低于在PEEK上生长的细胞， 但SK1.0组细胞的基因表达，尤其是FAK的表达在所有样品中最高。SK1.0组 的FAK基因表达量是SE1.0组的2.2倍。
7成骨相关蛋白的表达与矿化
为了研究样本是否会影响hWJ-MSC的成骨分化，将细胞与成骨诱导液孵育 7d，然后进行Runx2和COL1荧光染色以及ALP检测。如图5A-5C所示，在SK1.0 样本上生长的细胞中ALP、Runx2和COL1的表达高于在纯PEKK上生长的细 胞中的表达。如图5B所示，PEKK和PEEK的ALP活力区别不显著，但SK1.0 具有最高的ALP活性，显著高于SE1.0。表明polyNaSS表面接枝PEKK可显著 提高PEKK的早期骨诱导能力。
茜素红染色(ARS)用于观察在成骨培养基中培养21天的hWJ-MSCs中矿 化基质的累积情况(图5D)。宏观和微观图像均显示，在SK1.0样品上生长的细 胞胞外钙沉积较PEKK显著增加，在SK1.0样品上生长的细胞胞外钙沉积显著 高于SE1.0。这些结果表明，polyNaSS表面接枝PEKK有利于骨诱导和矿化。
8成骨相关基因的表达
为了进一步检测SK1.0样本的成骨能力，通过qRT-PCR测定不同样本上培 养的hWJ-MSCs中成骨细胞标记物的转录谱。在接枝材料上培养的hWJ-MSCs 中，RUNX-2、ALP、COL1、OCN和OPN基因的表达在培养的14天内稳步增 加。与在SE1.0样品上生长的细胞相比，在SK1.0样品上生长的细胞在第7天观 察到COL1和OCN基因表达显著上调。在第14天，在ALP、COL1、OCN和 OPN基因中也观察到相同的趋势。在SK1.0样本上生长的细胞中OCN的表达水 平在第7天是在SE1.0样本上生长的细胞的2.3倍(图6A)，在第14天增加到 4.3倍(图6B)，这表明SK1.0显著增强了晚期成骨。这些结果证实，紫外线诱 导的polyNaSS接枝可增强PEKK的成骨活性。
9抗菌性能
本发明还检测了polyNaSS接枝PEKK对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和牙龈 假单胞菌的抗菌性能。在接枝材料上生长1d的细菌的生长明显低于在对照组上 生长的细菌的生长(图7A)。这表明polyNaSS的接枝有助于防止细菌粘附在 PEKK表面。
我们使用活/死细菌活力试剂盒进一步测定了polyNaSS对细菌活力的影响。 膜完整的活细菌细胞被染成绿色，而死亡或受伤的细胞被染成红色(图7B)。结 果表明，在接枝材料上生长的绿色细胞数量大大减少，并且在三种细菌中观察到 相同的趋势。虽然细菌数量减少，但红细胞比例没有显著增加。
由以上实验可知，本申请的表面接枝polyNaSS的PEKK在14天内均没有 细胞毒性(图3-6)。
在本研究中，我们评估了细胞在材料上的初始粘附。培养第1天后，粘附的 细胞数量和铺展面积随着接枝率的增加而增加(图3A和3B)。此外，在接枝后 的材料上生长的hWJ-MSCs中，ITGα5、ITGβ1、ITGβ5、VCL、FAX和PXN(图 4)的mRNA水平显著增加。这些基因的上调有助于整合素和粘着斑的形成。粘 着斑成熟后，细胞内会形成肌动蛋白束，使其收缩和扩散，如接枝组材料上生长 的细胞伪足所示(图3A)。细胞粘附的差异可能与材料亲水性的变化有关。在polyNaSS接枝后，由于polyNaSS中存在亲水性磺酸基团，PEKK的亲水性显著 增强(图1和图2)。亲水表面通常认为可以增强蛋白质吸附。蛋白质吸附是生 物材料植入体内后的第一步反应。介导细胞粘附的蛋白通过细胞粘附受体向细胞 提供信号。在我们的实验中，我们发现polyNaSS接枝PEKK的BSA吸附能力 显著提高。
良好的骨传导和骨诱导是确保植入材料骨整合的关键因素。成骨相关基因， 包括ALP、OPN、OCN、Col1和RUNX-2，可以调节成骨蛋白的表达和矿化。 在本研究中，在接枝组材料上生长7天和14天的hWJ-MSCs中，成骨相关基因 和蛋白质的表达显著上调(图5-6)。此外，在接枝材料上生长21天的细胞中形 成的矿化结节数量高于未接枝组(图5D)。这些结果证实，PEKK通过polyNaSS 接枝可促进hWJ骨髓间充质干细胞的成骨分化。体外研究表明，钛和聚对苯二 甲酸乙二醇酯植入物表面的磺酸基团可以增强成骨细胞的分化。这可能是由于以 下原因。首先，如上所述，polyNaSS接枝可以促进hWJ-MSCs的粘附并提高其 生存能力，这是成骨分化的基础。其次，polyNaSS中的磺酸基可作为生物活性 剂，通过使成骨细胞积极参与骨再生和促进体内骨整合来增强细胞功能。另外， polyNaSS功能化水凝胶可与骨形态发生蛋白-2(BMP-2)有效结合。BMP-2由 细胞内前体蛋白BMP消化形成，并分泌到细胞外。分泌的BMP-2倾向于与材料 表面的polyNaSS结合。当BMP-2与hWJ-MSCs细胞膜上的I型和II型丝氨酸/ 苏氨酸激酶受体结合后，BMP-2/Smads/Runx2/osterix信号通路被激活，导致成骨 相关基因表达上调，包括Runx2、ALP、OCN和Col I(图5和6)。
抑制材料表面的初始细菌粘附对于预防种植体周围炎至关重要。因此，我们 评估了复合材料的抗菌性能。种植体周围炎的主要致病菌——牙龈卟啉单胞菌、 常见的革兰氏阳性菌——金黄色葡萄球菌和常见的革兰氏阴性菌——大肠杆菌 被用作细菌模型。我们的结果表明，粘附在接枝材料上的三种细菌数量明显低于 未接枝组(图7A)。细菌的粘附与材料表面的亲水性密切相关。过去的研究表明， 亲水表面不利于细菌粘附和定植。在与polyNaSS接枝后，PEKK具有更高的亲 水性(图2B和2C)，因此接枝后的复合材料可以抑制细菌粘附。同时polyNaSS 的Ze-TA电位为负，大多数细菌的表面带负电；因此，它们之间存在静电排斥 力，这会削弱细菌的粘附力。此外，分布在Ti和PMMA聚合物表面的SO3-可 以改变纤维蛋白结合蛋白(FN)的构象。纤维蛋白结合蛋白是一种与细菌粘附 相关的蛋白质，因此磺酸集团改变它的构象将会导致细菌粘附减少。我们进一步 评估了材料对细菌生存能力的影响。结果表明，各组材料上生长的活菌和死菌比 例差异不显著，表明本研究中开发的polyNaSS接枝PEKK的抗菌性能的机制更 可能是由于抑制细菌粘附而非杀死细菌(图7B)。
作为PAEK的新衍生物，以上结果表明表面polyNaSS接枝的PEKK有可能 发展成为一种理想的口腔种植体材料。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围 下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的 权利要求为保护范围。

Claims (10)

1.一种提高PEKK生物活性的方法，其特征在于，通过紫外线诱导自由基聚合，将polyNaSS接枝到PEKK表面，即可。
2.根据权利要求1所述的一种提高PEKK生物活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将PEKK材料表面打磨后，清洗干净；
将步骤（1）的样品浸入0.1~5mol/L的polyNaSS水溶液中，惰性气体氛围下紫外线处理30~120min；
将步骤（2）的样品清洗干净后，干燥即得。
3.根据权利要求2所述的一种提高PEKK生物活性的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，使用丙酮和双蒸水对材料进行清洗；优选的，清洗时采用超声辅助清洗。
4.根据权利要求3所述的一种提高PEKK生物活性的方法，其特征在于，所述步骤（2）中polyNaSS浓度为0.25~1mol/L；优选的，polyNaSS浓度选自0.25、0.5或1mol/L；更优选的，polyNaSS浓度为1mol/L。
5.根据权利要求2所述的一种提高PEKK生物活性的方法，其特征在于，所述步骤（2）中紫外处理时间为50~80min，优选为60min。
6.根据权利要求2所述的一种提高PEKK生物活性的方法，其特征在于，所述紫外线处理采用高压汞灯来来完成；优选的，所述高压汞灯的功率为500W。
7.根据权利要求2所述的一种提高PEKK生物活性的方法，其特征在于，所述作为本申请的优选技术方案，所述步骤（2）中，惰性气体为稀有气体或氮气；其中，所述稀有气体选自氦气、氖气、氩气、氪气或氙气。
8.根据权利要求2所述的一种提高PEKK生物活性的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，干燥采用冷冻干燥方式；优选的，干燥时间为12h。
9.权利要求1-8所述的一种提高PEKK生物活性的方法得到的表面接枝polyNaSS的PEKK。
10.权利要求9所述的表面接枝polyNaSS的PEKK作为口腔种植体材料的应用。
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