CN114832872B - 基于声表面波排列的单细胞包裹微液滴生成装置及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种基于声表面波排列的单细胞包裹微液滴生成装置，包括叉指换能器，在叉指换能器上部键合有微流道系统，微流道系统上设置有鞘流入口接头、细胞悬液入口接头、连续相入口接头、收集出口接头、鞘流第一出口接头、鞘流第二出口接头，叉指换能器上设置有两个弧形电极，这两个弧形电极分别对称设置在细胞悬液入口接头与鞘流第一出口接头及鞘流第二出口接头之间的微流道系统两侧。本发明采用一对弧形叉指换能器产生的驻波声表面波将团聚的粒子有效的进行分散和单排排列，有效的提升单细胞包裹的微液滴的效率，且声表面波具有非接触，对生物样本实验具有良好的生物兼容性。适用于单细胞包裹微液滴的生成及包裹单个微球、微粒的微液滴的生成。

Description

基于声表面波排列的单细胞包裹微液滴生成装置及方法

技术领域

本发明涉及液滴微流控技术领域，特别涉及一种基于声表面波排列的单细胞包裹微液滴生成装置及方法。

背景技术

在生化医疗研究当中，单细胞分析技术允许以单个细胞为单位，实现对各种细胞独特生物学特性的研究，对于在细胞层面开展深入研究探索至关重要。随着微流控技术的发展，液滴微流控技术可以实现在容积为几纳升的独立隔室中进行生化反应，使成千上万的反应可以同时彼此独立地发生。其中，将单个细胞封装于微液滴中，可以避免多细胞之间的相互干扰，保证细胞研究所需要的液态环境，避免外界污染；通过最小的样品稀释、更高的灵敏度、更短的时间来表征单细胞分析。液滴微流控单细胞封装技术为实现包括蛋白质和基因的单细胞分析提供了快速、准确的新方法。

基于液滴微流控的单细胞封装方法主要包括被动封装和主动封装两类方法。被动封装方法可以在简单的微流控装置中利用压力驱动连续相和分散相流体来制备微液滴，获得封装单个细的微液滴。但是该类方法中微液滴中封装细胞的数量主要取决于细胞悬液的浓度，封装过程通常遵循泊松统计，虽然该方法较为简单，但单细胞封装的效率较低。

主动封装方法主要借助声场、光场、电场等外力场将细胞主动包裹在液滴中，例如光捕获（M.Y. He, J.S. Edgar, G.D.M. Jeffries, et al., Selective encapsulationof single cells and subcellularorganelles into picoliter- and femtoliter-volume droplets, Anal. Chem. 77 (2005 1539–1544.）、声场力（U. Demirci, G.Montesano, Single cellepitaxy by acoustic picolitre droplets, Lab Chip. 7(2007 1139–1145.）、气动阀（Y. Zeng, R. Novak, J. Shuga, et al., High-performance single cell genetic analysis using microfluidic emulsiongenerator arrays,Anal. Chem. 82 (2010 3183–3190.）和通过锥形毛细管的吸力（S.Q.Gu, Y.X. Zhang, Y. Zhu, et al., Multifunctional picoliter dropletmanipulation platformand its application in single cell analysis, Anal. Chem.83 (20117570–7576.）。该类方法的特点是可以通过对细胞的驱动操控，使细胞更容易被微液滴封装。相比被动封装方法，可以获得更高的单细胞封装效率，但封装效率仍然在50%以下，不能满足生物医学领域对大批量单细胞封装液滴的需求，因此，高封装效率的方法需要进一步发展。

发明内容

为提升单细胞封装的效率，本发明提供一种基于声表面波排列的单细胞包裹微液滴生成装置及方法，通过弧形叉指换能器的两个弧形电极产生的驻波声表面波对微通道中的单细胞进行单列排序，然后生成包裹单细胞的微液滴；结合鞘流结构，采用一对弧形叉指换能器产生的驻波声表面波可以将团聚的粒子有效的进行分散和单排排列，从而有效的提升单细胞包裹的微液滴的效率，且声表面波具有非接触，对生物样本实验具有良好的生物兼容性；不仅适用于单细胞包裹微液滴的生成，还适用于包裹单个微球、微粒的微液滴的生成。

本发明的目的是以下述方式实现的：

一种基于声表面波排列的单细胞包裹微液滴生成装置，包括叉指换能器，在叉指换能器上部键合有微流道系统，所述微流道系统上设置有鞘流入口接头、细胞悬液入口接头、连续相入口接头、收集出口接头、鞘流第一出口接头、鞘流第二出口接头，叉指换能器上设置有两个弧形电极，这两个弧形电极分别对称设置在细胞悬液入口接头与鞘流第一出口接头及鞘流第二出口接头之间的微流道系统两侧。

上述基于声表面波排列的单细胞包裹微液滴生成装置，所述微流道系统包括鞘流通道、细胞悬液通道，鞘流通道的入口端为鞘流入口，鞘流入口接头设置在鞘流入口上，鞘流通道的出口端与细胞悬液通道的末端连接贯通，鞘流通道是以细胞悬液通道为中心的对称结构，细胞悬液通道的入口端为细胞悬液入口，细胞悬液入口接头设置在细胞悬液入口上，细胞悬液通道的出口端与鞘流通道的出口端、层流通道的入口端连接贯通，层流通道的出口端与鞘流第一运输通道的入口端、鞘流第二运输通道的入口端、第三运输通道的入口端连接贯通，鞘流第一运输通道的出口端为鞘流第一出口，鞘流第一出口接头设置在鞘流第一出口上，鞘流第二运输通道的出口端为鞘流第二出口，鞘流第二出口接头设置在鞘流第二出口上，第三运输通道的出口端与连续相流道的出口端、第四运输通道的入口端连接贯通，连续相流道的入口端为连续相入口，连续相入口接头设置在连续相入口上，连续相流道是以第四运输通道为中心的对称结构，第四运输通道的出口端为收集出口，收集出口接头设置在收集出口上，叉指换能器的两个电极分别设置在鞘流通道与鞘流第一运输通道以及鞘流第二运输通道之间的层流通道之间的层流通道的两侧。

上述基于声表面波排列的单细胞包裹微液滴生成装置，所述叉指换能器为弧形叉指换能器。

上述基于声表面波排列的单细胞包裹微液滴生成装置，所述叉指换能器包括压电基片，压电基片上设置有第一圆弧叉指电极，第二圆弧叉指电极，均包括若干对扇形叉指，且扇形叉指交错平行排列；所述第一圆弧叉指电极、第二圆弧叉指电极分别有两个信号输入端，第一圆弧叉指电极和第二圆弧叉指电极对称设置在层流通道的两侧。

上述基于声表面波排列的单细胞包裹微液滴生成装置，所述压电基片的材质为双面抛光的128°Y铌酸锂或石英单晶。

上述基于声表面波排列的单细胞包裹微液滴生成装置，所述第一圆弧叉指电极、第二圆弧叉指电极采用60纳米底层的铬、300纳米中间层的金、20纳米上层的二氧化硅的三层结构。

上述基于声表面波排列的单细胞包裹微液滴生成装置，所述微流道系统的流道高度均为70微米，鞘流入口、细胞悬液入口、鞘流第一出口、鞘流第二出口、连续相入口、收集出口均为通孔。

上述基于声表面波排列的单细胞包裹微液滴生成装置，所述微流道系统的材质为聚二甲基硅氧烷。

一种基于声表面波排列的单细胞包裹微液滴生成方法，包括以下步骤：

1）首先将基于声表面波排列的单细胞包裹微液滴生成装置固定在安装有高速相机的显微镜载物台上，通过物镜观察并调节载物台位置，确保层流通道处于显微镜视场内并且无倾斜；

2）将鞘流入口接头、细胞悬液入口接头、连续相入口接头、收集出口接头通过超细PEEK管分别与氮气压力注射泵上的鞘流试剂储液瓶、细胞悬液储液瓶、连续相溶液储液瓶连接，鞘流第一出口接头、鞘流第二出口接头通过特氟龙软管连接废液瓶，收集出口接头通过特氟龙软管连接液滴储存瓶进行液滴收集，其中连续相溶液采用电子氟化油，鞘流试剂、细胞悬液均为水溶液；

3）开启并调节氮气压力注射泵，将鞘流试剂、细胞悬液、分别通过鞘流入口接头、细胞悬液入口接头分别压入鞘流通道和细胞悬液通道，并使鞘流试剂、细胞悬液在层流通道处形成并行层流，细胞悬液中的细胞在鞘流试剂的挤压下移动到层流通道中间；

4）将经过功率放大器放大后的信号发生器的正负两极分别与第一圆弧叉指电极、第二圆弧叉指电极的两极相连接，调节信号发生器的输出信号为正弦交流电压；

5）按下信号发生器“输出”按钮，并设定相应的正弦交流电压输出值，第一圆弧叉指电极、第二圆弧叉指电极激发出两列声表面波，两列声表面波在层流通道的中形成驻波场，在声表面波驻波的声辐射力作用下，层流通道中间团聚的细胞分散开来，最终形成单排排列细胞，然后单排排列细胞随细胞悬液流入第三运输通道；

6）调节氮气压力注射泵，将连续相通过连续相入口接头、连续相入口压入并充满连续相流道和第四运输通道，第三运输通道中的单排排列细胞随细胞悬液被连续相的流体剪切力连续剪切成单细胞包裹的微液滴；

7）单细胞包裹的微液滴随流体经过第四运输通道后，经收集出口、收集出口接头流出而被收集。

相对于现有技术，本发明具有以下技术效果：

（1）本发明集成流道结构和对称设置的叉指换能器的两个弧形电极，利用驻波声表面波可以将团聚的细胞有效的进行分散和单排排列，从而有效的提升单细胞包裹的微液滴的效率。

（2）本发明的微流道系统整体为对称结构，更有利于细胞在流体中的聚焦和单细胞包裹液滴的生成。

（3）本发明采用的微流控装置体积小，结构紧凑，使用简单方便，可以很好的与其他技术进行集成使用，且引入的声表面波具有很好的生物兼容性，不会伤害生物样本的活性。

附图说明

图1是本发明结构示意图。

图2是本发明微流通道结构示意图。

图3是本发明微流通道后视图。

图4是本发明叉指换能器的结构示意图。

图5是本发明叉指换能器的后视图。

图6是基于声表面波排列的单细胞包裹微液滴生成原理图。

具体实施方式

如附图1所示的一种基于声表面波排列的单细胞包裹微液滴生成装置，包括叉指换能器700，叉指换能器为常规圆弧叉指换能器，叉指换能器700为聚焦声表面激发器件，用以产生聚焦声表面波。叉指换能器700上制作有两个聚焦式弧形电极，叉指换能器700上部键合有微流道系统100，常规圆弧叉指电极与微流道系统100配合；所述微流道系统100上设置有鞘流入口接头600、细胞悬液入口接头500、连续相入口接头200、收集出口接头300、鞘流第一出口接头400、鞘流第二出口接头800，这两个弧形电极分别对称设置在细胞悬液入口接头500与鞘流第一出口接头400及鞘流第二出口接头800之间的微流道系统两侧，微流道系统100与叉指换能器700键合后形成封闭的微通道，用于容纳和输送微流体。

所述基于声表面波排列的单细胞包裹微液滴生成装置，如附图1、图2和图3所示，所述微流道系统100包括鞘流通道102、细胞悬液通道104，鞘流通道102的入口端为鞘流入口101，鞘流入口接头600设置在鞘流入口101上，鞘流通道102的出口端与细胞悬液通道104的末端连接贯通，鞘流通道102是以细胞悬液通道104为中心的对称结构，细胞悬液通道104的入口端为细胞悬液入口103，细胞悬液入口接头500设置在细胞悬液入口103上，细胞悬液通道104的出口端与鞘流通道102的出口端、层流通道105的入口端连接贯通，层流通道105的出口端与鞘流第一运输通道113的入口端、鞘流第二运输通道107的入口端、第三运输通道108的入口端连接贯通，鞘流第一运输通道113的出口端为鞘流第一出口114，鞘流第一出口接头400设置在鞘流第一出口114上，鞘流第二运输通道107的出口端为鞘流第二出口106，鞘流第二出口接头800设置在鞘流第二出口106上，第三运输通道108的出口端与连续相流道111的出口端、第四运输通道112的入口端连接贯通，连续相流道111的入口端为连续相入口110，连续相入口接头200设置在连续相入口上，连续相流道111是以第四运输通道112为中心的对称结构，第四运输通道112的出口端为收集出口109，收集出口接头300设置在收集出口109上，叉指换能器的两个电极分别设置在鞘流通过102与鞘流第一运输通道113以及鞘流第二运输通道107之间的层流通道105之间的层流通道105的两侧。

所述基于声表面波排列的单细胞包裹微液滴生成装置，如图4和图5所示，所述叉指换能器700，包括压电基片701，压电基片701上设置有第一圆弧叉指电极702，第二圆弧叉指电极703，均包括若干对扇形叉指，且扇形叉指交错平行排列；所述第一圆弧叉指电极702、第二圆弧叉指电极703分别有两个信号输入端，第一圆弧叉指电极702和第二圆弧叉指电极703对称设置在层流通道105的两侧。

本发明基于声表面波排列的单细胞包裹微液滴生成装置，所述压电基片701的材质为双面抛光的128°Y铌酸锂或石英单晶。所述第一圆弧叉指电极702、第二圆弧叉指电极703采用60纳米底层的铬、300纳米中间层的金、20纳米上层的二氧化硅的三层结构。

所述基于声表面波排列的单细胞包裹微液滴生成装置，所述微流道系统100的流道高度均为70微米，鞘流入口101、细胞悬液入口103、鞘流第一出口114、鞘流第二出口106、连续相入口110、收集出口109均为通孔。所述微流道系统100的材质为聚二甲基硅氧烷。

本发明所述微流道系统100、叉指换能器700、鞘流入口接头600、细胞悬液入口接头500、连续相入口接头200、收集出口接头300、鞘流第一出口接头400、鞘流第二出口接头800之间的相对位置关系：微流道系统100有流道的下表面键合在叉指换能器700有叉指电极的上表面；鞘流入口接头600与鞘流入口101同轴配合并连接贯通；细胞悬液入口接头500与细胞悬液入口103同轴配合并连接贯通；鞘流第一出口接头400与鞘流第一出口114；鞘流第二出口接头800与鞘流第二出口106同轴配合并连接贯通；收集出口接头300与收集出口109同轴配合并连接贯通；连续相入口接头200与连续相入口110同轴配合并连接贯通；第一圆弧叉指电极702、第二圆弧叉指电极703对称分布于层流通道105的两侧。

一种基于声表面波排列的单细胞包裹微液滴生成方法，包括以下步骤：

1）首先将基于声表面波排列的单细胞包裹微液滴生成装置固定在安装有高速相机的显微镜载物台上，通过物镜观察并调节载物台位置，确保层流通道105处于显微镜视场内并且无倾斜；

2）将鞘流入口接头600、细胞悬液入口接头500、连续相入口接头200、收集出口接头300通过超细PEEK管分别与氮气压力注射泵上的鞘流试剂储液瓶、细胞悬液储液瓶、连续相溶液储液瓶连接，鞘流第一出口接头400、鞘流第二出口接头800通过特氟龙软管连接废液瓶，收集出口接头300通过特氟龙软管连接液滴储存瓶进行液滴收集，其中连续相溶液采用电子氟化油，鞘流试剂、细胞悬液均为水溶液；

3 开启并调节氮气压力注射泵，将鞘流试剂、细胞悬液、分别通过鞘流入口接头600、细胞悬液入口接头500分别压入鞘流通道102和细胞悬液通道104，并使鞘流试剂、细胞悬液在层流通道105处形成并行层流，细胞悬液中的细胞在鞘流试剂的挤压下移动到层流通道105中间；

4）将经过功率放大器放大后的信号发生器的正负两极分别与第一圆弧叉指电极702、第二圆弧叉指电极703的两极相连接，调节信号发生器的输出信号为正弦交流电压；

5）按下信号发生器“输出”按钮，并设定相应的正弦交流电压输出值，第一圆弧叉指电极702、第二圆弧叉指电极703激发出两列声表面波，两列声表面波在层流通道105的中形成驻波场，在声表面波驻波的声辐射力作用下，层流通道105中间团聚的细胞分散开来，最终形成单排排列细胞，然后单排排列细胞随细胞悬液流入第三运输通道108；

6）调节氮气压力注射泵，将连续相通过连续相入口接头200、连续相入口110压入并充满连续相流道111和第四运输通道112，第三运输通道108中的单排排列细胞随细胞悬液被连续相的流体剪切力连续剪切成单细胞包裹的微液滴；

7）单细胞包裹的微液滴随流体经过第四运输通道112后，经收集出口109、收集出口接头300流出而被收集。

如图1、图2、图3、图4、图5和图6所示，基于声表面波排列的单细胞包裹微液滴生成的过程为：在氮气压力注射泵的驱动下，鞘流试剂溶液通过鞘流入口接头600、鞘流入口101，鞘流试剂溶液充满鞘流通道102，细胞悬液通过细胞悬液入口接头500、细胞悬液入口103，细胞悬液充满细胞悬液通道104，通过氮气压力注射泵调节鞘流入口接头600、细胞悬液入口接头500的输入压力，使鞘流试剂、细胞悬液在层流通道105处形成并行层流，鞘流试剂将细胞悬液挤压在流道中间；将经过功率放大器放大后的信号发生器的输出信号的正负两极分别与第一圆弧叉指电极702、第二圆弧叉指电极703的两极相连接，调节信号发生器的输出信号为正弦连续输出；按下信号发生器“输出”按钮，并设定相应的正弦交流电压输出值，第一圆弧叉指电极702、第二圆弧叉指电极703激发出两列声表面波，两列声表面波在层流通道105的中相遇并形成驻波场，在声表面波驻波场的声辐射力的作用下，团聚细胞在超声振动下被分散开来，最终形成单排排列细胞，然后单排排列细胞随细胞悬液流入第三运输通道108；调节氮气压力注射泵，将连续相通过连续相入口接头200、连续相入口110压入并充满连续相流道111和第四运输通道112，第三运输通道108中的单排排列细胞随细胞悬液被连续相的流体剪切力连续剪切成包裹单细胞的微液滴；单细胞包裹的微液滴经过第四运输通道112后，经收集出口109、收集出口接头300流出而被收集。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明整体构思前提下，还可以作出若干改变和改进，这些也应该视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种基于声表面波排列的单细胞包裹微液滴生成装置，包括叉指换能器（700），其特征在于，在叉指换能器上部键合有微流道系统（100），所述微流道系统（100）上设置有鞘流入口接头（600）、细胞悬液入口接头（500）、连续相入口接头（200）、收集出口接头（300）、鞘流第一出口接头（400）、鞘流第二出口接头（800），所述叉指换能器为弧形叉指换能器，叉指换能器（700）上设置有两个弧形电极，这两个弧形电极分别对称设置在细胞悬液入口接头（500）与鞘流第一出口接头（400）及鞘流第二出口接头（800）之间的微流道系统两侧，所述微流道系统（100）包括鞘流通道（102）、细胞悬液通道（104），鞘流通道（102）的入口端为鞘流入口（101），鞘流入口接头（600）设置在鞘流入口（101）上，鞘流通道（102）的出口端与细胞悬液通道（104）的末端连接贯通，鞘流通道（102）是以细胞悬液通道（104）为中心的对称结构，细胞悬液通道（104）的入口端为细胞悬液入口（103），细胞悬液入口接头（500）设置在细胞悬液入口（103）上，细胞悬液通道（104）的出口端与鞘流通道（102）的出口端、层流通道（105）的入口端连接贯通，层流通道（105）的出口端与鞘流第一运输通道（113）的入口端、鞘流第二运输通道（107）的入口端、第三运输通道（108）的入口端连接贯通，鞘流第一运输通道（113）的出口端为鞘流第一出口（114），鞘流第一出口接头（400）设置在鞘流第一出口（114）上，鞘流第二运输通道（107）的出口端为鞘流第二出口（106），鞘流第二出口接头（800）设置在鞘流第二出口（106）上，第三运输通道（108）的出口端与连续相流道（111）的出口端、第四运输通道（112）的入口端连接贯通，连续相流道（111）的入口端为连续相入口（110），连续相入口接头（200）设置在连续相入口上，连续相流道（111）是以第四运输通道（112）为中心的对称结构，第四运输通道（112）的出口端为收集出口（109），收集出口接头（300）设置在收集出口（109）上，叉指换能器的两个电极分别设置在鞘流通道（102）与鞘流第一运输通道（113）以及鞘流第二运输通道（107）之间的层流通道（105）之间的层流通道（105）的两侧。

2.根据权利要求1所述基于声表面波排列的单细胞包裹微液滴生成装置，其特征在于，所述叉指换能器（700），包括压电基片（701），压电基片（701）上设置有第一圆弧叉指电极（702），第二圆弧叉指电极（703），均包括若干对扇形叉指，且扇形叉指交错平行排列；所述第一圆弧叉指电极（702）、第二圆弧叉指电极（703）分别有两个信号输入端，第一圆弧叉指电极（702）和第二圆弧叉指电极（703）对称设置在层流通道（105）的两侧。

3.根据权利要求2所述基于声表面波排列的单细胞包裹微液滴生成装置，其特征在于，所述压电基片（701）的材质为双面抛光的128°Y铌酸锂或石英单晶。

4.根据权利要求2所述基于声表面波排列的单细胞包裹微液滴生成装置，其特征在于，所述第一圆弧叉指电极（702）、第二圆弧叉指电极（703）采用60纳米底层的铬、300纳米中间层的金、20纳米上层的二氧化硅的三层结构。

5.根据权利要求2所述基于声表面波排列的单细胞包裹微液滴生成装置，其特征在于，所述微流道系统（100）的流道高度均为70微米，鞘流入口（101）、细胞悬液入口（103）、鞘流第一出口（114）、鞘流第二出口（106）、连续相入口（110）、收集出口（109）均为通孔。

6.根据权利要求1所述基于声表面波排列的单细胞包裹微液滴生成装置，其特征在于，所述微流道系统（100）的材质为聚二甲基硅氧烷。

7.一种基于声表面波排列的单细胞包裹微液滴生成方法，其特征在于，应用上述权利要求1-6所述的基于声表面波排列的单细胞包裹微液滴生成装置进行单细胞包裹微液滴的生成，包括以下步骤：

1）首先将基于声表面波排列的单细胞包裹微液滴生成装置固定在安装有高速相机的显微镜载物台上，通过物镜观察并调节载物台位置，确保层流通道（105）处于显微镜视场内并且无倾斜；

2）将鞘流入口接头（600）、细胞悬液入口接头（500）、连续相入口接头（200）、收集出口接头（300）通过超细PEEK管分别与氮气压力注射泵上的鞘流试剂储液瓶、细胞悬液储液瓶、连续相溶液储液瓶连接，鞘流第一出口接头（400）、鞘流第二出口接头（800）通过特氟龙软管连接废液瓶，收集出口接头（300）通过特氟龙软管连接液滴储存瓶进行液滴收集，其中连续相溶液采用电子氟化油，鞘流试剂、细胞悬液均为水溶液；

3）开启并调节氮气压力注射泵，将鞘流试剂、细胞悬液、分别通过鞘流入口接头（600）、细胞悬液入口接头（500）分别压入鞘流通道（102）和细胞悬液通道（104），并使鞘流试剂、细胞悬液在层流通道（105）处形成并行层流，细胞悬液中的细胞在鞘流试剂的挤压下移动到层流通道（105）中间；

4）将经过功率放大器放大后的信号发生器的正负两极分别与第一圆弧叉指电极（702）、第二圆弧叉指电极（703）的两极相连接，调节信号发生器的输出信号为正弦交流电压；

5）按下信号发生器“输出”按钮，并设定相应的正弦交流电压输出值，第一圆弧叉指电极（702）、第二圆弧叉指电极（703）激发出两列声表面波，两列声表面波在层流通道（105）的中形成驻波场，在声表面波驻波的声辐射力作用下，层流通道（105）中间团聚的细胞分散开来，最终形成单排排列细胞，然后单排排列细胞随细胞悬液流入第三运输通道（108）；

6）调节氮气压力注射泵，将连续相通过连续相入口接头（200）、连续相入口（110）压入并充满连续相流道（111）和第四运输通道（112），第三运输通道（108）中的单排排列细胞随细胞悬液被连续相的流体剪切力连续剪切成单细胞包裹的微液滴；

7）单细胞包裹的微液滴随流体经过第四运输通道（112）后，经收集出口（109）、收集出口接头（300）流出而被收集。