CN114813457A - 一种用于悬浮细胞培养的实时监测系统及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于悬浮细胞培养的实时监测系统及方法，用于实时监测生物反应器中悬浮细胞培养体系中的生化指标和/或细胞变化，包括数据采集装置和数据处理模块；数据采集装置包括探头式拉曼光谱仪和/或图像采集装置；所述数据处理模块用于对数据采集装置采集的拉曼光谱和/或图像进行数据分析；拉曼光谱的数据分析包括通过相应生化指标的定量校正模型对实时采集的拉曼光谱数据实时计算生化指标的定量结果；图像数据分析包括对实时采集的图像通过多尺度小波分析法获得细胞的密度和直径分布结果。本发明的监测系统及方法能实时监测悬浮细胞培养体系中的生物量、生化指标浓度，具有实时在线、快速、准确、可靠及灵敏度高的特点。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程检测领域，尤其涉及一种用于悬浮细胞培养的实时监测系统、及用于悬浮细胞培养的实时监测方法。
背景技术
随着近几十年生物技术的迅猛发展，生物发酵已经广泛应用于制药、食品、能源等诸多领域中，各种发酵产品(如酸奶、抗生素、单克隆抗体等)层出不穷，生物发酵已与人们的生活息息相关。在发酵过程中，通过活体细胞代谢将底物转化为产物是生物反应过程中的关键。由于细胞培养环境及培养策略直接影响细胞培养生产状况，因此为保证细胞正常生长、提高产量及保证产品质量，必须对细胞培养过程中的生化指标(葡萄糖、谷氨酸和乳酸等)和生物量进行准确的检测。目前，针对细胞培养过程中的生化指标和生物量的检测主要采用离线取样分析的方式：采用细胞计数仪离线统计总细胞密度及直径分布，采用生化分析仪离线分析葡萄糖、乳酸、谷氨酸等指标浓度。这些方法存在取样时间间隔较长、分析繁琐、结果滞后等问题，难以满足过程控制的要求。同时，频繁的取样过程会使得发酵罐中的培养体系发生改变，增加染菌的风险(Rathore AS,Bhambure R,Ghare V.Processanalytical technology(PAT)for biopharmaceutical products.Anal Bioanal Chem,2010,398(1):137–154.)。在线近红外、拉曼光谱仪等过程分析技术已应用于生物发酵过程中主要生化指标浓度的在线检测，但建立的预测模型均误差较大(Vann L,Sheppard J.Useof near-infrared spectroscopy(NIRs)in the biopharmaceutical industry forreal-time determination of critical process parameters and integration ofadvanced feedback control strategies using MIDUS control.J Ind MicrobiolBiotechnol,2017,44(12):1589–1603；Assawajaruwan S,Reinalter J,HitzmannB.Comparison of methods for wavelength combination selection from multi-wavelength fluorescence spectra for on-line monitoring of yeastcultivations.Anal Bioanal Chem,2017,409(3):707–717)，难以满足细胞培养体系分析和控制的应用。特别是对体系生物量(总细胞密度、活细胞密度和细胞直径分布)的准确实时在线检测一直是一个难题。由于细胞培养体系的复杂性，准确在线获取细胞图像信息，通常需要对细胞进行染色，目前还未见能够实时处理细胞图像获得细胞直径分布的检测技术(王远山,郝文辉,吴哲明,等.原位显微镜在细胞生物量在线监测中的发展与应用.生物工程学报,2019,35(09):1607-1618.)。
因此，针对上述工业现状：生化指标浓度在线检测方法不准确和细胞图像信息不能实时在线处理的问题，亟需开发细胞培养过程中主要生化指标(主要是葡萄糖、乳酸、谷氨酸和谷氨酰胺4个指标)浓度和生物量(细胞密度和形态)，特别是细胞直径分布的实时在线准确的检测方法及系统。
发明内容
技术问题
有鉴于此，本发明提供一种用于悬浮细胞培养的实时监测系统、及用于悬浮细胞培养的实时监测方法。
本发明的监测系统可以实时、准确检测培养体系中的生化指标浓度、细胞直径分布和生物量。
解决方案
为解决以上技术问题，本发明提供如下技术方案：
本发明提供一种用于悬浮细胞培养的实时监测系统，用于实时监测生物反应器中悬浮细胞培养体系中的生化指标和/或细胞变化，包括数据采集装置和数据处理模块；
所述数据采集装置包括探头式拉曼光谱仪和/或图像采集装置；所述图像采集装置用于采集培养体系内细胞的图像；所述探头式拉曼光谱仪的探头用于安装在生物反应器中，所述探头式拉曼光谱仪用于实时采集培养体系中生化指标的拉曼光谱，所述生化指标包括葡萄糖、乳酸、谷氨酸和谷氨酰胺中的至少一种；
所述数据处理模块用于对数据采集装置采集的拉曼光谱和/或图像进行数据分析；拉曼光谱的数据分析包括通过相应生化指标的定量校正模型对实时采集的拉曼光谱数据实时计算生化指标的定量结果；图像数据分析包括对实时采集的图像通过多尺度小波分析法获得细胞的密度和直径分布结果。
进一步地，所述相应生化指标的定量校正模型的构建方法包括：
将反应过程中不同时间节点采集的拉曼光谱数据采用SPXY自动分组的方法分为训练集和验证集；
对训练集的拉曼光谱数据进行预处理；采用变窗口宽度遗传算法优化的偏最小二乘法将预处理后的训练集拉曼光谱数据与生化指标的离线检测结果进行关联，建立拉曼光谱数据与生化指标实时浓度的定量模型；
采用验证集光谱数据对定量模型进行验证，确定最佳的定量校正模型。
进一步地，生化指标的离线检测的方法为：采用生化分析仪离线分析生化指标的浓度。
进一步地，对训练集的拉曼光谱数据进行预处理方法包括：采用趋势消除技术和多元散射校正组合的方法进行预处理。
进一步地，建立拉曼光谱数据与生化指标实时浓度的定量模型中进行多元校正，包括：采用变窗口宽度遗传算法对某生化指标的光谱波段进行选择，再采用偏最小二乘法进行多元校正以关联某生化指标的离线检测结果；可选地，遗传算法的窗口宽度选择为1–50，可选地窗口宽度选择为1–10。
进一步地，定量模型的验证方法包括：以校正均方根误差、校正相关系数RC 2、交叉验证均方根误差、交叉验证相关系数RCV 2、验证集预测均方根误差和预测相关系数RP 2评价模型的拟合能力，选择模型交叉验证相关系数RCV 2和校正相关系数RC 2越接近于1，RMSEC、RMSECV和RMSEP越小的模型。
进一步地，多元校正方法包括：
采用变窗口宽度的遗传算法智能选择PLS模型的某生化指标的输入波段：
约束条件下随机产生多个初始波段种群，并对每个个体进行编码，得到他们的染色体信息；将PLS模型的预测值与实验值的误差函数作为适应度函数计算个体的适应度；以种群中最优的一个子种群作为后代的父代群体，通过杂交产生后代，再通过变异作用每一个后代产生新的后代集，并计算新后代集的适应度；如此反复操作，直到筛选出最佳的波段范围和校正模型；其中，PLS模型为偏最小二乘法分析模型。
进一步地，所述探头式拉曼光谱仪的探头为浸入式光纤探头，可选地，探头式拉曼光谱仪的激光波长为532nm、785nm和1064nm，激光线宽小于0.1nm，光谱范围200-4000cm-1，分辨率4cm-1，积分时间8ms-60min，激光输出功率0-500mW，探头工作距离1-5mm。
进一步地，还包括用于安装在生物反应器的适配器，用于安装探头式拉曼光谱仪的探头和/或图像采集装置。
进一步地，图像数据分析包括：对采集的图像进行预处理，通过多尺度小波分析法分离细胞图像与背景，通过统计像素点获得细胞的密度和直径分布。
进一步地，多尺度小波分析法包括：采用小波函数对图像中的细胞边缘进行识别，对每一个细胞边缘执行闭合和填充操作，通过统计像素点获得细胞填充面积，保留填充面积介于阈值范围内的细胞图像作为处理后的细胞图像，用于获得细胞的密度和直径分布。
进一步地，多尺度小波分析法的小波函数如下：
其中，k表示平移次数；f(x,y)是由细胞图像内某个位置坐标(x,y)构成的小波基函数；u，v分别表示某个位置坐标(x,y)在水平和垂直方向上平移幅度；j为小波函数索引。
进一步地，阈值范围为1～104。
进一步地，细胞的当量直径d采用公式
计算，其中A为细胞的填充面积，通过统计像素点得到。
进一步地，统计细胞的直径分布和计算细胞密度采用公式ρ＝A′/A′0计算，其中，A’为图片面积内细胞的填充面积总和，A’0为图片总面积，可选地，以每组样品的平均值作为最终结果。
进一步地，图像数据分析包括：先对采集的图像采用灰度调整法提高图像对比度，再采用多尺度小波分析法的小波函数分析法分析。
进一步地，所述图像采集装置采用2D Vision Probe工艺过程成像仪，可选地，所述2D Vision Probe工艺过程成像仪的拍摄频率为15～40帧/秒，可选地，像素为2000×1500(pixel像素)或以上。
进一步地，悬浮细胞培养包括直径范围在1-30μm的悬浮细胞，可选地包括中国仓鼠卵巢细胞、考克斯班尼犬肾脏细胞、非洲绿猴肾细胞、干细胞或sf9昆虫细胞。
另一方面，提供一种利用所述的实时监测系统的实时监测方法，包括：
实时采集生物反应器的培养体系中生化指标的拉曼光谱数据，采用相应生化指标的定量校正模型，实时计算生化指标的浓度；所述生化指标包括葡萄糖、乳酸、谷氨酸和谷氨酰胺中的至少一种；
同时实时采集生物反应器的培养体系中图像，通过多尺度小波分析法获得细胞的密度和直径分布结果。
有益效果
(1)本发明的监测系统及方法能实时监测悬浮细胞培养体系中的生物量、生化指标浓度，具有实时在线、快速、准确、可靠及灵敏度高的特点，不需要对样品进行预处理、无需稀释及备样、对样品无污染，避免取样过程中的染菌风险。
(2)本发明的拉曼光谱数据与生化指标实时浓度的定量模型建立中通过变窗口宽度遗传算法对相应生化指标的光谱波段进行选择，并通过多元校正可以更准确的获得拉曼光谱数据的相应生化指标的光谱数据，使模型建立更加准确。
(3)本发明采用小波函数对图像进行分析，可以准确的计算和检测细胞数量、密度及直径分布。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定，附图中具有相同参考数字标号的元件表示为类似的元件，除非有特别申明，附图中的图不构成比例限制。
图1是本发明的用于悬浮细胞培养的实时监测系统的连接示意图；
图2是本发明的生物反应器(发酵罐)的适配器结构图，其中a为俯视图，b为a图的B-B剖面图，c为立体图；1-适配器。
图3是本发明实施例1的PLS模型输出的葡萄糖浓度预测值与样品实际测量值的对比图；
图4是本发明实施例2的PLS模型输出的乳酸浓度预测值与样品实际测量值的对比图；
图5是本发明实施例3的CHO细胞培养第20组的体系原始图像(a)及预处理后图像(b)；
图6是本发明实施例3的CHO细胞培养第40组的体系原始图像(a)及预处理后图像(b)；
图7是本发明实施例3的CHO细胞培养第20组的细胞直径分布统计；
图8是本发明实施例3的为CHO细胞培养第40组的细胞直径分布统计。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
除非另有其他明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其他元件或其他组成部分。
本发明提供的实时检测细胞培养过程中主要生化指标浓度及生物量的技术和定量模型的建立，实现了对细胞培养工艺过程的快速在线检测。实施例描述的各示例的单元及步骤，能够以电子硬件、计算机软件或者二者的结合来实现。这些功能究竟以硬件还是软件方式来执行，取决于技术方案的特定应用和设计约束条件。专业技术人员可以对每个特定的应用来使用不同方法来实现所描述的功能，但是这种实现不应认为超出本发明的范围。
本发明提供一种用于悬浮细胞培养的实时监测系统，如图1所示，用于实时监测生物反应器中悬浮细胞培养体系中的生化指标和/或细胞变化，包括数据采集装置和数据处理模块；数据采集装置包括探头式拉曼光谱仪和/或图像采集装置；图像采集装置用于采集培养体系内细胞的图像；探头式拉曼光谱仪的探头用于安装在生物反应器中，探头式拉曼光谱仪用于实时采集培养体系中生化指标的拉曼光谱，生化指标包括葡萄糖、乳酸、谷氨酸和谷氨酰胺中的至少一种；数据处理模块用于对数据采集装置采集的拉曼光谱和/或图像进行数据分析；拉曼光谱的数据分析包括通过相应生化指标的定量校正模型对实时采集的拉曼光谱数据实时计算生化指标的定量结果；图像数据分析包括对实时采集的图像通过多尺度小波分析法获得细胞的密度和直径分布结果。
本发明在使用时，将探头式拉曼光谱仪的探头和/或图像采集装置的探头安装在生物反应器的适配器上，在细胞培养过程中实时在线采集体系中拉曼光谱和/或图像，并通过数据处理模块实时处理拉曼光谱和/或图像数据，实时获得生化指标的定性和/或定量结果、及细胞的密度和直径分布结果。
本发明的监测系统及方法能实时监测悬浮细胞培养体系中的生物量、生化指标浓度，具有实时在线、快速、准确、可靠及灵敏度高的特点，不需要对样品进行预处理、无需稀释及备样、对样品无污染，避免取样过程中的染菌风险。
进一步地，相应生化指标的定量校正模型的构建方法包括：
将反应过程中不同时间节点采集的拉曼光谱数据采用SPXY自动分组的方法分为训练集和验证集；
对训练集的拉曼光谱数据进行预处理，采用变窗口宽度遗传算法优化的偏最小二乘法将预处理后的训练集拉曼光谱数据与生化指标的离线检测结果进行关联，建立拉曼光谱数据与生化指标实时浓度的定量模型；
采用验证集光谱数据对定量模型进行验证，确定最佳的定量校正模型。
在某一时间节点采集的拉曼光谱数据包括该时间节点所有生化指标的信息，通过对某生化指标的波段选择可以使光谱图上某生化指标的定量信息与离线检测结果相关联，关联过程中进行多元校正，从而保证定量模型的准确性。
进一步地，生化指标的离线检测的方法为：采用生化分析仪离线分析生化指标的浓度。
进一步地，对训练集的拉曼光谱数据进行预处理方法包括：采用趋势消除技术和多元散射校正组合的方法进行预处理。
进一步地，建立拉曼光谱数据与生化指标实时浓度的定量模型中进行多元校正，包括：采用变窗口宽度遗传算法对某生化指标的光谱波段进行选择，再采用偏最小二乘法进行多元校正以关联某生化指标的离线检测结果；可选地，遗传算法的窗口宽度选择为1–50，可选地窗口宽度选择为1–10。通过变窗口宽度遗传算法对相应生化指标的光谱波段进行选择，并通过多元校正可以更准确的获得拉曼光谱数据的相应生化指标的光谱数据，使模型建立更加准确。
进一步地，定量模型的验证方法包括：以校正均方根误差、校正相关系数RC 2、交叉验证均方根误差、交叉验证相关系数RCV 2、验证集预测均方根误差和预测相关系数RP 2评价模型的拟合能力，选择模型交叉验证相关系数RCV 2和校正相关系数RC 2越接近于1，RMSEC、RMSECV和RMSEP越小的模型。
进一步地，多元校正方法包括：
采用变窗口宽度的遗传算法智能选择PLS模型的某生化指标的输入波段：
约束条件下随机产生多个初始波段种群，并对每个个体进行编码，得到他们的染色体信息；将PLS模型的预测值与实验值的误差函数作为适应度函数计算个体的适应度；以种群中最优的一个子种群作为后代的父代群体，通过杂交产生后代，再通过变异作用每一个后代产生新的后代集，并计算新后代集的适应度；如此反复操作，直到筛选出最佳的波段范围和校正模型；其中，PLS模型为偏最小二乘法分析模型。
进一步地，探头式拉曼光谱仪的探头为浸入式光纤探头，可选地，探头式拉曼光谱仪的激光波长为532nm、785nm和1064nm，激光线宽小于0.1nm，光谱范围200-4000cm-1，分辨率4cm-1，积分时间8ms-60min，激光输出功率0-500mW，探头工作距离1-5mm。
进一步地，图像采集装置采用2D Vision Probe工艺过程成像仪，可选地，2DVision Probe工艺过程成像仪的拍摄频率为15～40帧/秒，可选地，像素为2000×1500(pixel像素)或以上。
进一步地，还包括用于安装在生物反应器的适配器，用于安装探头式拉曼光谱仪的探头和/或图像采集装置。
2D Vision Probe工艺过程成像仪一般包括二维成像探头(2D Vision Probe)、光源控制器和数据交换机三个部分，显微镜探头与光源控制器和数据交换机连接，数据交换机与数据处理模块连接，显微镜探头安装在发酵罐适配器1上。适配器1结构如图2所示，一般要求安装显微镜探头的适配器开口直径可以为20mm、材料为316不锈钢、表面光洁度Ra为0.6，并装有抱紧螺丝和双层密封垫圈。安装适配器后使发酵罐保持密封。
拉曼光谱仪的探头通过光纤连接光谱仪主机，光谱仪主机与数据处理模块连接，并将拉曼探头安装在发酵罐的适配器(结构可以如图2所示的适配器)上，一般要求安装拉曼探头的适配器开口直径可以为16mm；材料为316不锈钢；表面光洁度Ra为0.6，并装有抱紧螺丝和双层密封垫圈。安装适配器后使发酵罐保持密封。
进一步地，图像数据分析包括：对采集的图像进行预处理，通过多尺度小波分析法分离细胞图像与背景，通过统计像素点获得细胞的密度和直径分布。
进一步地，多尺度小波分析法包括：采用小波函数对图像中的细胞边缘进行识别，对每一个细胞边缘执行闭合和填充操作，通过统计像素点获得细胞填充面积，保留填充面积介于阈值范围内的细胞图像作为处理后的细胞图像，用于获得细胞的密度和直径分布。
进一步地，多尺度小波分析法的小波函数如下：
其中，k表示平移次数；f(x,y)是由细胞图像内某个位置坐标(x,y)构成的小波基函数；u，v分别表示某个位置坐标(x,y)在水平和垂直方向上平移幅度；j为小波函数索引。
进一步地，阈值范围为1～104。
进一步地，细胞的当量直径d采用公式
计算，其中A为细胞的填充面积，通过统计像素点得到。
进一步地，统计细胞的直径分布和计算细胞密度采用公式ρ＝A′/A′0计算，其中，A’为图片面积内细胞的填充面积总和，A’0为图片总面积，可选地，以每组样品的平均值作为最终结果。
进一步地，图像数据分析包括：先对采集的图像采用灰度调整法提高图像对比度，再采用多尺度小波分析法的小波函数分析法分析。
进一步地，悬浮细胞培养包括直径范围在1-30μm的悬浮细胞，可选地包括中国仓鼠卵巢细胞、考克斯班尼犬肾脏细胞、非洲绿猴肾细胞、干细胞或sf9昆虫细胞。
另一方面，提供一种利用上述的实时监测系统的实时监测方法，包括：
实时采集生物反应器的培养体系中生化指标的拉曼光谱数据，采用相应生化指标的定量校正模型，实时计算生化指标的浓度；生化指标包括葡萄糖、乳酸、谷氨酸和谷氨酰胺中的至少一种；
同时实时采集生物反应器的培养体系中图像，通过多尺度小波分析法获得细胞的密度和直径分布结果。
本发明的监测系统的数据采集方法如下：
在细胞培养过程中实时在线采集体系拉曼光谱，根据实验批次特点设定采集频次，每次采样重复扫描3次，取3次数据的平均值作为实验数据点。采集拉曼光谱所用的激光波长为785nm、532nm或1064nm。积分时间为1-30s，平滑宽度为0-10，平均次数为1-10。在采集拉曼光谱时的同时采集体系图像数据，2D Vision Probe工艺过程成像仪亮度为0-1000％，电流为0.1-0.6A，灯的脉冲宽度0.01-0.08ms，每组样品采集10-100张照片。
定量模型的建立中，需要在采集拉曼光谱时的同时还采用生化分析仪对体系进行离线取样分析葡萄糖、乳酸、谷氨酸和谷氨酰胺浓度，作为建模参比。
生化指标浓度定量校正模型的建立及评价包括：
将采集得到的拉曼光谱数据采用SPXY自动分组的方法分为训练集和验证集。对训练集数据采用趋势消除技术和多元散射校正组合(MSC-Detrend)进行预处理。对预处理后的拉曼数据采用变窗口宽度遗传算法优化的偏最小二乘法进行多元校正，建立葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺、谷氨酸4生化指标浓度的定量模型。以校正均方根误差、校正相关系数RC 2、交叉验证均方根误差、交叉验证相关系数RCV 2、验证集预测均方根误差和预测相关系数RP 2评价模型的拟合能力。选择模型交叉验证相关系数RCV 2和校正相关系数RC 2越接近于1，RMSEC、RMSECV和RMSEP越小的模型，作为最佳的定量校正模型。
细胞图像处理和细胞直径分布统计具体可以如下：
对采集的细胞培养体系图像采用灰度调整进行处理，提高图像对比度。再采用多尺度小波分析法对图像中细胞边缘进行识别，对每一个细胞边缘执行闭合和填充操作，通过统计像素点获得细胞填充面积，只保留填充面积介于1-104之间的细胞图像作为处理后的细胞图像。计算细胞的当量直径d(
A为填充面积)，并统计细胞的直径分布和计算总细胞密度(ρ＝A′/A′0计算，A’为图片面积内细胞的填充面积总和，A’0为图片总面积)，将每组照片的平均值作为细胞直径分布的最终结果。
本发明以5L发酵罐(广州齐志生物科技有限公司)培养中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary,CHO)细胞，实时在线检测葡萄糖、乳酸浓度和细胞直径分布为例，具体实施例如下：
实施例1
CHO-K1细胞经过解冻复苏、传代培养后，将细胞接种于发酵罐中，接种密度为2.16×105cell/mL。打开控制柜操作界面，将溶氧(DO)设定为50％；pH设定值为7.2；液位设定为5L；温度设定为37℃；搅拌速度控制为100r/min进行培养，培养时间约为11天。
在细胞接种后的前三天，每隔大约12小时进行一次拉曼光谱和2DVision Probe工艺过程成像仪图像采集；在细胞接种后第四天到第八天，每隔大约6小时采集一次培养基的拉曼光谱和2D Vision Probe工艺过程成像仪成像图片；在细胞接种后第八天到本培养批次结束，每隔大约4小时采集一次培养基的拉曼光谱和2D Vision Probe工艺过程成像仪图像照片；共采得细胞培养过程的40组样本。对于拉曼光谱采集每次采样重复扫描3次，将三次数据取平均值作为建模数据。采样时拉曼光谱的激光波长为785nm，拉曼位移范围是20cm-1。积分时间为2.8s，平滑宽度为3，平均次数为3。在采集拉曼数据的同时，采用M-100生物传感器分析仪对CHO细胞培养体系进行葡萄糖浓度的离线分析。从取样瓶中取出2mL的培养基，离心后取出20μL的上清液，进行1比10稀释后放入生化分析仪的检测池中，检测得到葡萄糖的浓度。
将采集到的40组拉曼光谱数据和对应的葡萄糖浓度数据，用SPXY自动分组的方法，将40组数据分为32组训练集，8组验证集。训练集数据采用MCS和Detrend组合方法(MCS-Detrend)进行预处理。多元校正之前，采用遗传算法对光谱波段进行选择，算法窗口宽度设为3和6(分别记为GA-3和GA-6)，再采用PLS进行多元校正，建立定量模型，葡萄糖浓度定量校正模型计算值与实验值对比和模型评价结果分别见图3和表1。
根据表1和图3的结果可知，定量校正模型的计算值与样品的实验值偏差较小，GA-3模型的相关性达0.999。模型的主元个数为4个，RMSEC为0.051g/L，RMSECV为0.109g/L，RMSEP为0.085g/L。校正相关系数RC 2为0.999、交叉验证相关系数RCV 2为0.994、预测相关系数RP 2为0.999。预测相对误差为0.95％。模型的主元数较少，且三个误差指标较小，相关系数接近于1。证明模型拟合能力较好，对未知样品的预测能力也有好的结果。
表1波段选择及葡萄糖浓度校正模型的评价结果
实施例2
如实施例1中培养CHO细胞并采用体系拉曼光谱图，同时采用采用M-100生物传感器分析仪对体系乳酸浓度进行离线分析。将采集到的40组拉曼光谱数据和对应的葡乳酸浓度数据，用SPXY自动分组的方法，将40组数据分为32组训练集，8组验证集。训练集数据采用MCS和Detrend组合方法(MCS-Detrend)进行预处理，波段选择采用遗传算法，算法窗口宽度设为3(记为GA-3)，再采用PLS进行多元校正，建立定量模型，葡萄糖定量校正模型计算值与实验值对比和模型评价结果分别见图4和表2。
表2乳酸浓度定量校正模型评价结果
根据图4和表2可知，乳酸浓度定量校正模型的计算值与样品的实验值偏差较小，模型的验证相关性达0.966。
由模型建立结果可以得到，模型的主元个数为5个，RMSEC为0.023g/L，RMSECV为0.056g/L，RMSEP为0.070g/L。校正相关系数RC 2为0.996、交叉验证相关系数RCV 2为0.980、预测相关系数RP 2为0.966。预测相对误差为0.28％。模型的主元数较少，且三个误差指标较小，相关系数接近于1，证明模型拟合能力较好，对未知样品的预测能力好。
实施例3
如实施例1中培养CHO细胞，并按采集拉曼光谱时间采集2D Vision Probe工艺过程成像仪图像数据(40组)，采样时2D Vision Probe工艺过程成像仪亮度设为200％，电流选择0.6A，灯的脉冲宽度0.02ms。每张照片拍摄的时间间隔为0.18s，每组照片拍摄时长为18s(共100张图片)。每张照片采用灰度调整法提高照片对比度，再采用多尺度小波分析法识别细胞边缘，对每一个细胞边缘执行闭合和填充操作，只保留填充面积介于预设高低阈值(高阈值为104，低阈值为1)之间的细胞，计算细胞当量直径，统计细胞直径分布，将100组照片的平均值作为最终结果(图7和图8)。
图5(a)和图6(a)分别为CHO细胞培养第20组和第40组2D Vision Probe工艺过程成像仪采集的细胞图像，从图中可以看出CHO细胞大多程圆形或椭圆形，随着培养时间的增长，细胞的粒径缓慢增长。预处理后的图像背景噪音明显降低(图5(b)和图6(b))，细胞轮廓明显清晰，大小和形态保持不变。图7和图8对比了第20组和第40组原位显微镜(2DVisionProbe工艺过程成像仪)与细胞计数器统计的细胞直径分布结果，从图中可以看出原位显微镜结果与细胞计数器结果吻合度较高，完全可以代替细胞计数器的使用。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。针对上述示例性实施方案所做的任何简单修改、等同变化与修饰，都应落入本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种用于悬浮细胞培养的实时监测系统，用于实时监测生物反应器中悬浮细胞培养体系中的生化指标和/或细胞变化，其特征在于，包括数据采集装置和数据处理模块；
所述数据采集装置包括探头式拉曼光谱仪和/或图像采集装置；所述图像采集装置用于采集培养体系内细胞的图像；所述探头式拉曼光谱仪的探头用于安装在生物反应器中，所述探头式拉曼光谱仪用于实时采集培养体系中生化指标的拉曼光谱，所述生化指标包括葡萄糖、乳酸、谷氨酸和谷氨酰胺中的至少一种；
所述数据处理模块用于对数据采集装置采集的拉曼光谱和/或图像进行数据分析；拉曼光谱的数据分析包括通过相应生化指标的定量校正模型对实时采集的拉曼光谱数据实时计算生化指标的定量结果；图像数据分析包括对实时采集的图像通过多尺度小波分析法获得细胞的密度和直径分布结果。
2.根据权利要求1所述的实时监测系统，其特征在于，所述相应生化指标的定量校正模型的构建方法包括：
将反应过程中不同时间节点采集的拉曼光谱数据采用SPXY自动分组的方法分为训练集和验证集；
对训练集的拉曼光谱数据进行预处理，采用变窗口宽度遗传算法优化的偏最小二乘法将预处理后的训练集拉曼光谱数据与生化指标的离线检测结果进行关联，建立拉曼光谱数据与生化指标实时浓度的定量模型；
采用验证集光谱数据对定量模型进行验证，确定最佳的定量校正模型。
3.根据权利要求2所述的实时监测系统，其特征在于，生化指标的离线检测的方法为：采用生化分析仪离线分析生化指标的浓度；
和/或，对训练集的拉曼光谱数据进行预处理方法包括：采用趋势消除技术和多元散射校正组合的方法进行预处理；
和/或，建立拉曼光谱数据与生化指标实时浓度的定量模型中进行多元校正，包括：采用变窗口宽度遗传算法对某生化指标的光谱波段进行选择，再采用偏最小二乘法进行多元校正以关联某生化指标的离线检测结果，可选地，遗传算法的窗口宽度选择为1–50，可选地窗口宽度选择为1–10；
和/或，定量模型的验证方法包括：以校正均方根误差、校正相关系数RC 2、交叉验证均方根误差、交叉验证相关系数RCV 2、验证集预测均方根误差和预测相关系数RP 2评价模型的拟合能力，选择模型交叉验证相关系数RCV 2和校正相关系数RC 2越接近于1，RMSEC、RMSECV和RMSEP越小的模型。
4.根据权利要求2或3所述的实时监测系统，其特征在于，多元校正方法包括：
采用变窗口宽度的遗传算法智能选择PLS模型的某生化指标的输入波段：
约束条件下随机产生多个初始波段种群，并对每个个体进行编码，得到他们的染色体信息；将PLS模型的预测值与实验值的误差函数作为适应度函数计算个体的适应度；以种群中最优的一个子种群作为后代的父代群体，通过杂交产生后代，再通过变异作用每一个后代产生新的后代集，并计算新后代集的适应度；如此反复操作，直到筛选出最佳的波段范围和校正模型；其中，PLS模型为偏最小二乘法分析模型。
5.根据权利要求1至4任一所述的实时监测系统，其特征在于，所述探头式拉曼光谱仪的探头为浸入式光纤探头，可选地，探头式拉曼光谱仪的激光波长为532nm、785nm和1064nm，激光线宽小于0.1nm，光谱范围200-4000cm-1，分辨率4cm-1，积分时间8ms-60min，激光输出功率0-500mW，探头工作距离1-5mm；
可选地，还包括用于安装在生物反应器的适配器，用于安装探头式拉曼光谱仪的探头和/或图像采集装置。
6.根据权利要求1至5任一所述的实时监测系统，其特征在于，图像数据分析包括：对采集的图像进行预处理，通过多尺度小波分析法分离细胞图像与背景，通过统计像素点获得细胞的密度和直径分布；
可选地，多尺度小波分析法包括：采用小波函数对图像中的细胞边缘进行识别，对每一个细胞边缘执行闭合和填充操作，通过统计像素点获得细胞填充面积，保留填充面积介于阈值范围内的细胞图像作为处理后的细胞图像，用于获得细胞的密度和直径分布。
7.根据权利要求6所述的实时监测系统，其特征在于，多尺度小波分析法的小波函数如下：
其中，k表示平移次数；f(x,y)是由细胞图像内某个位置坐标(x,y)构成的小波基函数；u，v分别表示某个位置坐标(x,y)在水平和垂直方向上平移幅度；j为小波函数索引；
可选地，阈值范围为1～104；
可选地，细胞的当量直径d采用公式
计算，其中A为细胞的填充面积，通过统计像素点得到；
可选地，统计细胞的直径分布和计算细胞密度采用公式ρ＝A′/A′0计算，其中，A’为图片面积内细胞的填充面积总和，A’0为图片总面积，可选地，以每组样品的平均值作为最终结果。
8.根据权利要求1至7任一所述的实时监测系统，其特征在于，图像数据分析包括：先对采集的图像采用灰度调整法提高图像对比度，再采用多尺度小波分析法的小波函数分析法分析；
和/或，所述图像采集装置采用2D Vision Probe工艺过程成像仪，可选地，所述2DVision Probe工艺过程成像仪的拍摄频率为15～40帧/秒，可选地，像素为2000×1500或以上。
9.根据权利要求1至7任一所述的实时监测系统，其特征在于，悬浮细胞培养包括直径范围在1-30μm的悬浮细胞，可选地包括中国仓鼠卵巢细胞、考克斯班尼犬肾脏细胞、非洲绿猴肾细胞、干细胞或sf9昆虫细胞。
10.一种利用权利要求1至9任一所述的实时监测系统的实时监测方法，其特征在于，包括：
实时采集生物反应器的培养体系中生化指标的拉曼光谱数据，采用相应生化指标的定量校正模型，实时计算生化指标的浓度；所述生化指标包括葡萄糖、乳酸、谷氨酸和谷氨酰胺中的至少一种；
同时实时采集生物反应器的培养体系中图像，通过多尺度小波分析法获得细胞的密度和直径分布结果。
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