CN114807371A - 检测样本中htr6的试剂在制备低级别胶质瘤的预后产品中的应用 - Google Patents

检测样本中htr6的试剂在制备低级别胶质瘤的预后产品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了检测样本中HTR6的试剂在制备低级别胶质瘤的预后产品中的应用。本发明的第一方面，提供检测样本中生物标志物的试剂在制备低级别胶质瘤的预后产品中的应用，生物标志物包括HTR6。根据本申请实施例的应用，至少具有如下有益效果：本发明通过一系列生物信息学分析方法来筛选低级别胶质瘤与正常组织中差异表达的基因或其蛋白质，首次提出HTR6基因或者HTR6蛋白作为低级别胶质瘤预后进行判断的生物标志物，弥补了现有低级别胶质瘤预后指标的不足，具有良好的临床价值。

Description

检测样本中HTR6的试剂在制备低级别胶质瘤的预后产品中的 应用
技术领域
本申请涉及胶质瘤诊断技术领域，尤其是涉及检测样本中HTR6的试剂在制备低级别胶质瘤的预后产品中的应用。
背景技术
胶质瘤是目前最常见的原发性中枢神经系统恶性肿瘤之一，约占所有中枢神经系统恶性肿瘤的80％。根据WHO描述的相关标准，胶质瘤可以分为I～IV级，其中，I、Ⅱ级为低级别，Ⅲ、IV级为高级别。I级胶质瘤为良性肿瘤，多发于儿童，治疗方法以手为主；III～IV级胶质瘤为恶性肿瘤，多发于中老年，治疗时需要结合手术、放疗及化疗等多种手段；相比之下，II级胶质瘤为低级别胶质瘤(low grade glioma，LGG)，其介于良性与恶性之间，多发于中青年。低级别胶质瘤有去分化和转化为高级别胶质瘤的倾向，术后容易复发且升高级别，临床上存在较高的致残率和病死率。因此，有必要提供一种能够对低级别胶质瘤进行有效预后评估的产品。
发明内容
本申请旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本申请提出一种具有良好的预后价值的低级别胶质瘤标志物。
本申请的第一方面，提供检测样本中生物标志物的试剂在制备低级别胶质瘤的预后产品中的应用，生物标志物包括HTR6。
根据本申请实施例的应用，至少具有如下有益效果：
本申请通过一系列生物信息学分析方法来筛选低级别胶质瘤与癌旁组织和正常组织中差异表达的基因或其蛋白质，首次提出HTR6基因或者HTR6蛋白作为低级别胶质瘤预后判断的生物标志物，弥补了现有低级别胶质瘤相关指标的不足，具有良好的临床价值。
其中，HTR6(5-Hydroxytryptamine Receptor 6)是5-羟色胺受体6，HTR6基因编码一种属于七重跨膜G蛋白偶联受体蛋白质家族的蛋白质。编码蛋白与Gsα亚单位偶联，刺激腺苷酸环化酶激活环腺苷酸依赖性信号通路，参与调节大脑中胆碱能神经元的传递。
在本申请的一些实施方式中，试剂采用测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术、蛋白免疫技术中的至少一种检测生物标志物，具体包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、等温扩增反应(如环介导等温扩增LAMP、重组酶聚合酶扩增RPA等)、探针杂交技术、RNA印迹等方法。在蛋白水平上定量检测HTR6蛋白的试剂通过以下方法进行，包括但不限于酶联免疫反应(ELISA)、放射免疫反应(IRA)、免疫组化染色、蛋白质印迹、电泳、液相色谱-质谱/质谱(LC-MS/MS)等。
在本申请的一些实施方式中，试剂为特异性识别生物标志物的探针、特异性扩增生物标志物的引物、特异性结合生物标志物的抗体中的至少一种。
其中，在基因水平上定量检测HTR6的试剂包括但不限于引物、探针和基因芯片。其中，引物是指能够特异性扩增HTR6基因的引物，例如一定长度的多核苷酸，如约35个核苷酸或者更长的引物，其能够与模板序列的至少部分进行杂交并用作合成引物延伸产品的起始位点。探针是指能够特异性识别HTR6基因或者该基因转录本的探针，其是一种能够结合另一个分子的特定序列或子序列或其他部分的分子，通常是指通过互补碱基配对结合另一个核酸(即作为靶核苷酸的HTR6的特异性序列)的核酸探针。而基因芯片是指在基底材料(具体包括但不限于聚合物如尼龙膜、硝酸纤维素膜以及玻璃等)上固定有前述的探针的阵列所形成的复合结构。
在蛋白水平上定量检测HTR6的试剂包括特异性抗体。其中，特异性抗体是指能够特异性识别HTR6编码蛋白的抗体，具体包括但不限于单克隆抗体(例如全长或完整的单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如具有预期的生物学活性的双特异性抗体)或者包括某些抗体片段中的至少一种。可以理解的是，抗体可以是人、人源化和/或亲和力成熟的抗体。
在本申请的一些实施方式中，样本选自组织、血清、血浆、全血中的任一种。
在本申请的一些实施方式中，预后判断包括预测受试者的生存率。其中，生存率是特定时间节点下受试者存活的概率。例如一年生存率、两年生存率、三年生存率、五年生存率、十年生存率等。一般而言，生存率可以分为总体生存率、中位生存率、无进展生存率、无疾病生存率、无转移生存率、无复发生存率等。在本申请的实施例中，申请人发现，低级别胶质瘤患者的HTR6表达情况与其生存率密切相关，因而可以根据HTR6的表达水平来预测受试者的生存率。可以理解的是，除了生存率之外的其它预后指标也可以作为预后判断的一个参数或指标。
在本申请的一些实施方式中，生存率为总体生存率、无复发生存率、无进展生存率中的至少一种。总体生存率(overall survival，OA)是指从确认患有低级别胶质瘤开始到因为任何原因引起死亡的时间。无复发生存率(recurrence-free survival，RFS)是指初次手术到最早出现复发证据的时间。无进展生存率(progression-free survival，PFS)是指由随机至第一次发生疾病进展或任何原因死亡的时间，其中，疾病进展是指肿瘤增长、肿瘤原发病灶转移、发现新病灶等。
在本申请的实施例中，申请人发现受试者的HTR6的水平与受试者的总体生存率等存在显著相关性，因而可以通过HTR6的水平来预测受试者的生存率。进一步HTR6的水平差异显示，其在肿瘤组织中表达显著降低，而且HTR6表达较低的组中，患者的总体生存率降低。因此，可以根据HTR6的表达水平对低级别胶质瘤患者的预后做出较为准确的预测。具体而言，可以给出一个HTR6表达水平的设定值，该设定值可以根据正常人和/或非低级别胶质瘤患者的正常样本的HTR6的表达水平而确定，例如，选择合适样本数量的正常样本的HTR6的表达水平的平均值，或基于该平均值设定一个合理的倍数，如0.9倍、0.8倍、0.7倍、0.6倍、0.5倍等，当受试者的HTR6的表达水平低于该设定值时，判断为低级别胶质瘤的预后较差。可以理解的是，基于平均值，或平均值的倍数所确定的设定值的需要具有良好的分类意义，可以通过基于该设定值的分类对已知样本采用常用的统计学检验方法进行检验，当结果具有统计学意义时，表明该设定值可以作为判断标准使用。可以理解的是，也可以将特定的一个或多个低级别胶质瘤患者数据库或实际的低级别胶质瘤诊断病例中HTR6的表达水平进行排序，得到相应的中位值，以该中位值，或基于该平均值设定一个合理的倍数，如0.9倍、0.8倍、0.7倍、0.6倍、0.5倍等作为设定值，当受试者的HTR6的表达水平低于该设定值时，判断为低级别胶质瘤的预后较差。进一步，设定值可以根据不同的预后水平而设定多个以形成相应的梯度，当HTR6的表达水平落入其中一个梯度范围内，判断为预后的一种情况。
其中，HTR6的水平是指针对受试者的这一生物标志物通过直接测量或根据直接测量进一步间接推导出的值，其通常至少部分来源于受试者的样品中的生物标志物的丰度或浓度。其中，间接推导出的值的方式包括通过将函数应用于这一生物标志物的测量值而推导得到的。直接测量值包括但不限于通过测序、杂交、质谱、免疫测定、免疫荧光、流式细胞术等其中至少一种方式确定的生物标志物的值。
本申请实施例提供HTR6作为低级别胶质瘤预后的标志物，因为在数据库分析中发现其在低级别胶质瘤的肿瘤组织中表达显著降低；同时，Kaplan-Meier Plotter分析mRNA的表达同样发现随着HTR6的表达降低，患者的总体生存率降低；而且多因素回归分析也表明，HTR6可以作为低级别胶质瘤的预后因子。
本申请的第二方面，还提供一种低级别胶质瘤的预后产品，该预后产品包括检测生物标志物的试剂，生物标志物包括HTR6。
可以理解的是，为了进一步增强对低级别胶质瘤的预后效果，试剂所检测的生物标志物还可以是其它本领域技术人员所熟知的具有预后作用的核酸片段、蛋白质、代谢物等可以作为标志物使用的生物材料，通过这种方式实现多种生物标志物的组合使用，相互之间进行配合达成更好对低级别胶质瘤患者的预后效果，从而达成更有效的预后评估。
在本申请的一些实施方式中，试剂包括特异性扩增HTR6的引物、特异性识别HTR6的探针、特异性识别HTR6蛋白的抗体中的至少一种。
在本申请的一些实施方式中，预后产品还包括阳性对照品、阴性对照品、缓冲液中的至少一种。其中，阳性对照品和阴性对照品是检验实验有效性的控制品，并作为判断结果的对照。缓冲液可以是本领域所公知的任何能够在检测过程中提供适当的缓冲条件的溶液。
本申请的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本申请的实践了解到。
附图说明
图1是本申请的实施例1中低级别胶质瘤患者与正常人的HTR6的差异表达结果。
图2是本申请的实施例1中不同HTR6表达水平的低级别胶质瘤患者的生存曲线。
图3是本申请的实施例1中多因素cox回归模型分析低级别胶质瘤患者的总生存率的森林图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本申请的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本申请的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本申请的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本申请的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本申请保护的范围。
下面详细描述本申请的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本申请，而不能理解为对本申请的限制。
在本申请的描述中，若干的含义是一个以上，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。
本申请的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
实施例1
在TCGA库中搜索低级别胶质瘤和癌旁组织以及正常组织中HTR6的mRNA差异表达数据并进行分析，结果如图1所示，是低级别胶质瘤患者(T组，n＝518)与对照组(N组，n＝207)的对比结果，图中左侧为低级别胶质瘤患者，右侧为对照组，纵坐标为TranscriptsPer Million(TPM)均一化(+0.001)和取对数后的值。从图中可以看出，相较于正常组织，HTR6在低级别胶质瘤患者中表达显著下降(p<0.05)。
通过TCGA数据库中低级别胶质瘤的mRNA表达数据进一步研究HTR6表达水平高低对患者总体生存率的影响，生存曲线采用Kaplan-Meier法绘制，logrank检验统计学意义。其中，按照不同患者的HTR6的TPM从高到低排序，以排序后的中位数为界限，高于中位数的作为高表达组，低于(或等于)中位数的作为低表达组，从而将505例低级别胶质瘤患者进行分组，结果如图2所示，曲线的横坐标为月数，纵坐标为总体生存率，上方曲线为高表达组，下方曲线为低表达组。从图中可以看出，不同表达水平分组的患者的生存时间存在显著差异(logrank p＝0.00024)。HTR6的表达量越低，低级别胶质瘤患者的总体生存率越低。
从TCGA数据库中确认低级别胶质瘤患者的HTR6的mRNA差异表达数据以及其它临床信息，通过多因素回归模型分析了低级别胶质瘤患者的年龄、性别、分期以及HTR6表达情况等不同变量与总体生存率之间的关系，结果如图3所示，是总体生存率的多因素cox回归分析的森林图。从图中可以看出，HTR6的表达水平与低级别胶质瘤患者的总体生存率显著相关(p＝0.00233)，因此可以作为独立的预后因素。
综合上述结果可以看出，HTR6能够作为低级别胶质瘤患者的独立的预后因素，具有良好的预后判断的价值。
实施例2
本实施例提供一种ELISA试剂盒以及该试剂盒在制备低级别胶质瘤预后产品中的应用，该试剂盒包括预涂层的96孔板、缓冲液、终止液、一抗、酶标二抗等，其中一抗包括HTR6的特异性抗体。利用该试剂盒可以完成对受试者样本中HTR6蛋白含量的定量检测，将其通过经过大批量低级别胶质瘤患者预后不良和预后较好(或者生存期较长与生存期较短)的患者表达量所设定出的截断值(设定值)进行比较，从而判断受试者是否预后不良。
实施例3
本实施例提供一种试剂盒在制备低级别胶质瘤预后产品中的应用，与实施例2的区别在于，该试剂盒中包括特异性结合HTR6的mRNA的荧光探针，通过该试剂盒可以完成对受试者样本中HTR6的水平的定量检测，以此与截断值进行比较，评估受试者的生存期或生存率。
上面结合实施例对本申请作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.检测样本中生物标志物的试剂在制备低级别胶质瘤的预后产品中的应用，其特征在于，所述生物标志物包括HTR6。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂试剂采用测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术、蛋白免疫技术中的至少一种检测所述生物标志物。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂为特异性识别所述生物标志物的探针、特异性扩增所述生物标志物的引物、特异性结合所述生物标志物的抗体中的至少一种。
4.根据权利要求1至3任一项所述的应用，其特征在于，所述样本选自组织、血清、血浆、全血中的任一种。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述预后产品用于预测受试者的生存率。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述生存率为总体生存率、无进展生存率、无疾病生存率、无转移生存率、无复发生存率中的任一种。
7.根据权利要求1至3任一项所述的应用，其特征在于，当所述生物标志物的水平低于设定值时，判断为预后较差。
8.低级别胶质瘤的预后产品，其特征在于，包括检测样本中生物标志物的试剂，所述生物标志物包括HTR6。
9.根据权利要求8所述的预后产品，其特征在于，所述试剂包括特异性扩增所述生物标志物的引物、特异性识别所述生物标志物的探针、特异性识别所述生物标志物的抗体中的至少一种。
10.根据权利要求8所述的预后产品，其特征在于，所述预后产品还包括阳性对照品、阴性对照品、缓冲液中的至少一种。
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