CN114788523B - 一种增强柑橘对木虱抗性的免疫诱导剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种增强柑橘对木虱抗性的免疫诱导剂及其应用。免疫诱导剂，其氨基酸序列为：SWCSDHSLIFLDVIGRGNGGQNN。本发明使用柑橘Pep小肽作为免疫诱导剂，仅通过叶面喷施的方式就能快速诱导柑橘的免疫降低柑橘木虱虫口密度。柑橘Pep小肽诱导免疫的功能依赖于其受体CsPEPR1，因此柑橘Pep小肽仅作用于柑橘类植物。综上所述，本发明提供了一种特异性诱导柑橘免疫增强柑橘对木虱抗性的新方法，同时该方法具有无毒、安全、绿色、环保的特点。

Description

一种增强柑橘对木虱抗性的免疫诱导剂及其应用

技术领域

本发明属于害虫防治领域，具体涉及一种增强柑橘对木虱抗性的免疫诱导剂及其应用。

背景技术

柑橘黄龙病(Huanglongbing,HLB)是柑橘类作物最具毁灭性的细菌性病害，给全球柑橘产业造成巨大的威胁。感染黄龙病的柑橘植株会出现叶片斑驳黄化、嫩梢枯萎、果实产量和品质下降等病状，最终会发展成根系腐烂、整株病死。柑橘黄龙病已经蔓延至中国、美国、巴西、墨西哥和西班牙等世界最主要的柑橘生产国，尤以美国佛罗里达和中国的广东、广西等地病害发生最为严重。2021年全国柑橘黄龙病发病面积达到220万亩，给我国的柑橘产业造成了无法估量的经济损失。由于黄龙病具有潜伏期长、传播快、无特效农药等特点，使得黄龙病成为了难以根治的柑橘“癌症”。目前尚未发现抗黄龙病的柑橘种质资源，同时由于黄龙病菌Citrus Liberibacter无法离体培养，导致柑橘黄龙病抗病机制的研究很难获得突破性的进展。黄龙病已经成为制约全球柑橘产业可持续发展的瓶颈问题。

柑橘木虱(Diaphorina citri)是黄龙病最主要的昆虫媒介，属于韧皮部刺吸式取食昆虫。由于柑橘黄龙病难以根治，因此防治木虱阻断传播链成为了治理柑橘黄龙病的关键环节。目前防治柑橘木虱的主要手段是利用化学农药如除虫菊酯类、阿维菌素类等进行灭杀，但是长期的农药滥用导致木虱出现了不同程度的耐药性，同时水果中农药的残留容易引发消费者对食品安全的担忧，降低了柑橘类水果的市场竞争力。因此开发绿色安全无毒的防治木虱的新方法对于遏制黄龙病的蔓延和保护食品安全具有重要的意义。柑橘园区引入捕食性天敌如蜘蛛、龟纹瓢虫等及寄生性天敌如亮腹釉小蜂等常规的生物防治手段虽然能在一定程度上降低木虱的虫口密度，但是在田间的推广应用上还存在许多问题如天敌难以规模化养殖、存在潜在的生态风险等。另一种被广泛应用于防治黄龙病的绿色防治手段是利用抗菌肽如攻击素A蛋白、天蚕抗菌肽B、SAMP等直接粘附黄龙病菌表面抑制细菌的生长发育。但由于黄龙病菌深处柑橘植株韧皮部，表面喷施抗菌肽难以在韧皮部形成有效浓度杀灭细菌，而采用注射的方式则需耗费大量人力，不适宜产业化推广。

近年来越来越多的研究开始关注如何利用诱抗剂激活植物自身的天生免疫系统，从而增强对病虫害的抗性。例如美国佛罗利达大学的王年教授报道了柑橘园区喷施β-氨基丁酸能够上调防御蛋白PR-2的基因表达，激活柑橘系统性免疫降低木虱单株的产卵量，使得黄龙病的发病率降低15％-30％。但由于β-氨基丁酸的氨基处于β位，人工合成成本高，价格高昂难以推广应用^[5]。此外许多小分子化合物如水杨酸、油菜素内酯、异噻菌胺、维生素K等被报道能够诱导植物免疫，一定程度上降低黄龙病菌对柑橘的危害^[5]。但这些小分子化合物的作用机理尚未明确且实际应用效果还有待验证。

植物Pep小肽是一类响应病原菌及昆虫等生物胁迫的内源性多肽，能够激活并放大植物的天生免疫，诱导防御反应增强植物对病虫害的抗性。Pep小肽广泛存在于十字花科、茄科、蔷薇科、禾本科等多个科属的植物中。本专利的申请人前期的研究解析了Pep小肽的前体加工机制，发现病原菌能够促进Pep小肽前体的表达和加工。被加工释放出来的Pep小肽被运输到细胞膜外与其受体PEPR(Plant elicitor peptides receptor)结合，激活该受体。之后被激活的受体通过类受体胞质激酶(Receptor-like cytoplasmic kinase，RLCK)如BIK1和PBL1等将磷酸化信号转导至下游免疫通路，进而诱导植物产生防御反应。这些防御反应包括：MAPK和CDPK信号通路的激活、活性氧爆发、防御激素和次生代谢物的合成等。外施高浓度Pep小肽被证实能够增强植物对多种细菌、真菌及昆虫的抗性。

本专利申请之前，尚未有文献报道柑橘Pep小肽诱导植物免疫的功能。

发明内容

本发明提供一种增强柑橘对木虱抗性的免疫诱导剂及其应用。

本发明的第一个目的是提供一种免疫诱导剂，其氨基酸序列为：SWCSDHSLIFLDVIGRGNGGQNN(具体如SEQ ID NO.1所示)。

本发明还提供了编码上述免疫诱导剂的基因。

本发明的第二个目的是提供上述免疫诱导剂在制备增强柑橘对柑橘木虱抗性的药剂中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种增强柑橘对柑橘木虱抗性的药剂，其含有上述免疫诱导剂作为活性成分。

本发明的第四个目的是提供一种增强柑橘对柑橘木虱抗性的方法，其是将上述免疫诱导剂喷洒在柑橘叶片上。

优选，所述的免疫诱导剂的浓度为1μM。

本专利通过分析植物Pep小肽序列特征，从柑橘基因组中明确了柑橘Pep小肽的前体基因，通过化学合成法人工合成了CsPep1小肽，并开发了CsPep1高效处理柑橘的方法，成功诱导了柑橘的免疫从而增强了柑橘对木虱的抗性。

本发明使用柑橘Pep小肽作为免疫诱导剂，仅通过叶面喷施的方式就能快速诱导柑橘的免疫降低柑橘木虱虫口密度。柑橘Pep小肽诱导免疫的功能依赖于其受体CsPEPR1，因此柑橘Pep小肽仅作用于柑橘类植物。综上所述，本发明提供了一种特异性诱导柑橘免疫增强柑橘对木虱抗性的新方法，同时该方法具有无毒、安全、绿色、环保的特点。

附图说明：

图1中A是柑橘CsPep1小肽具有与AtPep1及ZmPep1小肽等同源的C末端。黑体加粗的氨基酸残基表示同源的残基；B是CsPep1小肽处理可以诱导柑橘叶片活性氧爆发。1μMCsPep1处理柑橘幼叶30分钟后，采用化学发光法检测活性氧的含量。**表示P值小于0.05，student’st Test.生物学重复n＝12。

图2中A是CsPep1小肽降低了取食柑橘实生苗的木虱数量。1μM CsPep1处理柑橘实生苗24小时后接种木虱成虫。图片展示接种1天后取食柑橘实生苗的木虱数量对比。ScaleBar＝0.5cm；B是对图A每株柑橘实生苗上的木虱数量进行统计。统计每个寄主选择实验中取食对照组(Mock)、处理组(CsPep1)的木虱数量及未取食任何植株(None)的木虱数量，计算各组木虱数量占总数的百分比。木虱接种后的天数DPI:days post infestation。15个生物学重复的P值(student’s t test)。

图3中A是CsPep1小肽降低了取食柑橘嫁接成年植株幼叶的木虱数量。1μM CsPep1处理柑橘幼叶24小时后接种木虱成虫。图片展示接种1天后取食柑橘幼叶的木虱数量对比。Scale Bar＝0.5cm；B是对图A每株柑橘幼叶上的木虱数量进行统计。统计每个寄主选择实验中取食对照组(Mock)、处理组(CsPep1)的木虱数量及未取食任何植株(None)的木虱数量，计算各组木虱数量占总数的百分比。木虱接种后的天数DPI:days post infestation。15个生物学重复的P值(student’s t test)。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1

1比对柑橘基因组找出柑橘Pep小肽

由于尚未有文献报道柑橘类植物存在Pep小肽，因此本发明通过氨基酸序列同源比对的方法分析柑橘的基因组找出柑橘CsPep小肽。首先利用柑橘基因组数据库网站CPBD(http://citrus.hzau.edu.cn/index.php)的BLAST工具，以拟南芥AtPep1小肽和玉米ZmPep1小肽的氨基酸序列对甜橙基因组Citrus sinensis v1.0 protein进行BLAST比对。结果发现CsPROPEP1基因(基因号XP_015388657.1)编码的氨基酸序列中存在与AtPep1、ZmPep1较高相似性的CsPep1小肽(附图1A)。根据AtPep1小肽与受体AtPEPR1结合的蛋白晶体结构模型可以推测C末端同源的CsPep1具有结合其受体CsPEPR1并诱导免疫的能力。

2验证柑橘Pep1小肽诱导免疫功能

委托商业公司(武汉星皓生物有限公司)利用固相多肽化学合成法合成CsPep1小肽(氨基酸序列为：SWCSDHSLIFLDVIGRGNGGQNN)。本发明以埃及甜橙(Citrus sinensisOsbeck)作为实验材料，验证CsPep1小肽的免疫活性。实验流程为：将45天大的埃及甜橙实生苗叶片均匀打孔0.25cm²小叶片后，浸泡在去离子水中静置4个小时。然后去除上清后加入反应液(反应液配方为：200μM Luminol[货号:120-04891,Wako公司],0.01μg/μLhorseradish peroxidase[货号:p6782,Sigma公司])，之后分别加入终浓度1μM CsPep1小肽的水溶液或去离子水(负对照)处理30分钟后用化学发光仪Varioskan Lux(Thermo)检测埃及甜橙叶片产生的活性氧ROS的含量。实验结果显示CsPep1小肽处理埃及甜橙叶片30分钟后显著提高了活性氧的含量(附图1B)，这说明CsPep1小肽具有诱导柑橘免疫的功能。

3开发高效诱导柑橘抗虫免疫的方法和结果

本发明利用叶面喷施CsPep1小肽的方式来快速诱导柑橘植株的抗虫免疫，实验流程为：配制1μM的CsPep1小肽的水溶液，加入0.05％浓度(v/v)的Silwet-L77以增加CsPep1溶液叶面附着力。将温室里培养45天大的埃及甜橙实生苗(幼苗)或2年大的嫁接苗(砧木：香橙Citrusjunos Sieb.ex Tanaka；接穗：埃及甜橙)黑暗处理(关闭灯光过夜)，次日早上光照处理并浇水以促进叶片气孔打开。1～2小时后将CsPep1小肽的水溶液(以不加CsPep1小肽的0.05％Silwet-L77[货号：S9430，Solarbio公司]水溶液为负对照)采用叶面喷施的方式对埃及甜橙实生苗全株或嫁接苗的嫩梢进行喷施，喷施至叶面挂滴。

CsPep1小肽处理埃及甜橙24小时后，开展柑橘木虱成虫寄主选择实验以检测CsPep1小肽处理是否增强柑橘对木虱的抗性。实验流程为：将一定数量的柑橘木虱雌雄成虫(柑橘木虱为广东省农业科学院张瑞敏副研究员所赠)接种于2年大的九里香(Murrayaexotica)培养数月以繁殖木虱。对于埃及甜橙实生苗的木虱寄主选择实验，CsPep1和负对照处理后的埃及甜橙实生苗各一株置于透明方形盒子(长宽高：38cm、26cm、21cm)中，以每个盒子40头木虱成虫的比例接种木虱，每隔24小时观察并统计一次埃及甜橙实生苗上木虱的数目同时喷施一次CsPep1或负对照水溶液。对于埃及甜橙嫩梢的寄主选择实验，将CsPep1和负对照处理后的埃及甜橙嫩梢幼叶剪下来置于含有0.6％琼脂糖的无菌培养盒(长宽高：20cm、12cm、10cm)中，在超净工作台中以每片幼叶20头的比例接种木虱成虫，每隔24小时观察并统计一次埃及甜橙嫩梢幼叶上木虱的数目。

A、喷施CsPep1小肽增强柑橘实生苗对木虱的抗性

实验结果显示1μM CsPep1处理诱导了埃及甜橙实生苗抗虫免疫，促进抗虫次生代谢物的合成，导致处理组的埃及甜橙实生苗上木虱数量连续3天明显低于对照组。具体而言：在第1天、第2天、第3天分别有29.5％、36.8％、55.2％的木虱选择取食对照组的埃及甜橙；但分别只有11.3％、12.5％、12.7％的木虱选择取食处理组的埃及甜橙；剩余的木虱在观察时刻未取食任何植株(附图2)。以上实验结果说明喷施CsPep1可以有效地增强埃及甜橙幼苗对木虱的抗性。

B、喷施CsPep1小肽增强柑橘成年植株嫩梢对木虱的抗性

在柑橘园区木虱偏爱取食柑橘嫩梢及幼叶，因此本发明检测了CsPep1小肽处理对柑橘嫩梢幼叶抗木虱的影响。实验结果显示1μM CsPep1处理同样显著降低了柑橘幼叶上木虱的虫口密度。具体而言：在第1天、第2天、第3天分别有22.3％、23.8％、30.8％的木虱选择取食对照组的埃及甜橙；但分别只有9.3％、10.2％、10％的木虱选择取食处理组的埃及甜橙；剩余的木虱在观察时刻未取食任何叶片(附图3)。以上实验结果说明喷施CsPep1可以有效地增强埃及甜橙成年植株对木虱的抗性。

序列表

<110> 广东省农业科学院果树研究所

<120> 一种增强柑橘对木虱抗性的免疫诱导剂及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> PRT

<213> 柑橘(Citrus reticulata)

<400> 1

Ser Trp Cys Ser Asp His Ser Leu Ile Phe Leu Asp Val Ile Gly Arg

1 5 10 15

Gly Asn Gly Gly Gln Asn Asn

20

Claims (6)

1.一种降低柑橘植株上柑橘木虱虫口密度的制剂，其氨基酸序列为：SWCSDHSLIFLDVIGRGNGGQNN。

2.编码权利要求1所述的制剂的基因。

3.权利要求1所述的制剂在制备降低柑橘植株上柑橘木虱虫口密度的药剂中的应用。

4.一种降低柑橘植株上柑橘木虱虫口密度的药剂，其特征在于，含有权利要求1所述的制剂作为活性成分。

5.一种降低柑橘植株上柑橘木虱虫口密度的方法，其特征在于，是将权利要求1所述的制剂喷洒在柑橘叶片上。

6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的制剂的浓度为1 μM。

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