CN114773250A - 具有抗耐药性的抗菌脒类低聚物及其制作方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有抗耐药性的抗菌脒类低聚物及其制作方法、用途、抗菌机理以及在胞内感染模型和偶发分枝杆菌感染的斑马鱼模型中杀菌的应用，脒类低聚物的抗菌种类包括大肠杆菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、耻垢分枝杆菌、偶发分枝杆菌等。本发明公开的结构具有破坏细菌细胞膜和结合其染色体DNA的双重抗菌机制、具有快速杀菌和抗耐药性的特征，并且呈现出抗菌广谱性。此外，该结构对血细胞有较低的毒性，在血液中有较高的安全性。同时该结构能够应用于耻垢分枝杆菌和偶发分枝杆菌感染的Raw264.7细胞模型中，该结构对MRSA和偶发分枝杆菌感染的斑马鱼模型也有较好的治疗效果。
Description
技术领域
本发明涉及医药化工材料领域，更具体地说涉及一种具有抗耐药性的抗菌脒类低聚物及其制作方法和用途。
背景技术
在抗菌领域中抗生素的滥用加速了耐药菌株、多药耐药菌株的出现，细菌耐药性已经成为一个普遍和严重危害人类健康的问题。因此，开发出可以快速杀灭耐药菌且不引起细菌耐药性产生的新型抗菌剂已迫在眉睫。近来，确立了抗耐药性抗菌剂这一概念，旨在通过设计一种具有双重抗菌机理的阳离子型脒类抗菌低聚物来解决细菌的耐药性问题。
具有双重抗菌机理的脒类抗耐药性抗菌剂应具有以下特征：1)对包括多药耐药性病原体在内的多种病原菌有良好的杀灭效果，具有较好的抗菌广谱性。2)在使用过程中能有效杀灭耐药菌，并且细菌对其产生抗药性的速率较低。3)对哺乳动物细胞的毒性较低，并且可以应用在细菌感染的活体模型治疗中。众所周知，抗生素耐药性产生的根本原因是其靶标发生突变，从而使各种不同作用机理的药物失效。因此，如果一种药物可以靶向于多个靶标，或者其靶标涉及复杂的生物过程，那么产生耐药性的概率将大大降低。抗菌聚合物这个类型的化合物符合抗耐药性这一概念，但传统的高分子量抗菌聚合物具有毒性较大的缺点。通过缩聚的方式进行聚合，可以有效地控制聚合物的分子量，得到分子量较低的抗菌剂，可以有效地降低对哺乳动物细胞的毒性。同时，在分子主链中引入可以结合细菌DNA的模块，获得第二重的抗菌机理，即通过结合细菌的染色体DNA，阻断其复制和翻译等重要的生命过程来达到抗菌的目的。
发明内容
为解决传统高分子量抗菌聚合物毒性较大的问题，本发明公开了一种具有抗耐药性的抗菌脒类低聚物及其制作方法和用途。
一种具有抗耐药性的抗菌脒类低聚物、用途及其制作方法，所述脒类低聚物的分子式如下所示：
其中，5≤n≤8，R1分子式为式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(V)、式(VI)、式(VII)、式(Ⅷ)、式(IX)中的一种或任意几种：
其中，R2分子式为式(a)、式(b)、式(c)、式(d)、式(e)、式(f)、式(g)、式(h)、式(i)中的一种或任意几种：
本发明公开的结构具有破坏细菌细胞膜和结合其染色体DNA的双重抗菌机制，具有快速杀菌和抗耐药性的特征，呈现出广谱的抗菌活性。同时该结构对血细胞的毒性很低，有较高的治疗指数。除此之外，该结构可以有效地杀灭哺乳动物细胞胞内感染的细菌以及斑马鱼体内感染的病原菌。
附图说明
图1A、图1B为本发明的反应示意图；
图2为流式实验，证明P2具有较强的破膜能力；
图3为SEM图像，表明P2处理过的耻垢分枝杆菌细胞膜表面出现了不同程度的皱缩；
图4为P2具有结合细菌基因组DNA能力的动态光散射实验结果图；
图5为P2可以结合细菌的DNA并发出荧光的Confocal结果图；
图6为P2对常见的用于临床治疗结核分枝杆菌感染的抗生素利福平的敏化作用；
图7为分别用利福平和P2的次最小抑菌浓度处理耻垢分枝杆菌210代之后，比较其耐药性产生的速率图；
图8为耻垢分枝杆菌感染的Raw264.7细胞的Confocal图；
图9为P2在耻垢分枝杆菌感染的Raw264.7细胞模型中的杀菌效果Confocal图；
图10a、10b分别为P2在耻垢分枝杆菌和偶发分枝杆菌感染的Raw264.7细胞模型中的胞内杀菌效果图；
图11为P2提高MRSA感染的斑马鱼的存活率的实验结果图；
图12为P2提高偶发分枝杆菌感染斑马鱼的存活率的实验结果图；
图13-1至图13-36为实验例1至实验例9中有关化合物的核磁谱图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式并且结合附图对本发明的技术方案作具体说明，下述实施例中的部件或设备如无特别说明，均为通用标准件或本领域技术人员知晓的部件，其结构和原理都为本技术人员均可通过技术手册得知或通过常规实验方法获知。
说明：在本发明以下各个实施例中，R1表示分子式为式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(V)、式(VI)、式(VII)、式(Ⅷ)、式(IX)中的任意一种的化合物：
R2表示分子式为式(a)、式(b)、式(c)、式(d)、式(e)、式(f)、式(g)、式(h)、式(i)中的任意一种的化合物：
实施例一
经试验，一种具有广谱抗菌性的抗菌脒类低聚物，其化学式如下所示：
其中，5≤n≤8，R1与R2具有上述说明中的结构。从以上结构式可以看出，其中通过R1与R2的不同组合可以得到81种化合物，为了便于对这些化合物进行分析与说明，在下表1中对其中的60种化合物进行了标号，需要说明的是，对本领域技术人员而言，未进行标号的化合物也是可以合成的，这些未标号的化合物的性能与合成方式与已标号的60种化合物相近，因此在本发明中未对其做进一步的分析说明。
60种化合物的结构式及其抗菌活性以及生物相容性列表如表1和表2所示，从表2可以看出，相对于其它化合物，P1、P2、P3、P4、P6、P7的治疗指数(IC50/MIC)均大于200，具有较好的治疗效果，特别是P2，其治疗指数为354.2，具有最好的治疗效果。
表1 P1-60的结构式列表
表2 P1-P60抗菌活性以及生物相容性列表
aGram posmve bacteriabGram negtive bacteria.cSelectivity index＝IC50/MIC(M.s).IC50：P1-P20，cell line is HEK293T cell；P21-P60，cell line is NIH 3T3cell.S.a，Staphylococcus aureus；K.p，Klebsiella pneumomae，E.c，Escherichia coli，A.b，Acinetobacter baumannii，E.fa，Enterococcus faecalis.
实施例二
如图1所示，本发明还公开了一种合成具有抗耐药性的抗菌脒类低聚物的制作方法，包括如下步骤：
S1：制备具有如下分子式的化合物单体：
S2：将所述化合物单体与H2N-R2-NH2、无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)以及N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)反应，得到所述脒类低聚物，R1与R2具有上述说明中的结构。
其中，上述步骤S1中包括如下步骤：
S11：称取5-氰基吲哚或者6-氰基吲哚和二碳酸二叔丁酯，然后加入二氯甲烷混合均匀，加入催化量的4-二甲氨基吡啶(DMAP)在2-6℃下搅拌半个小时之后恢复至20-25℃的室温搅拌过夜，将混合物过滤洗涤后用旋转蒸发仪进行旋干，得到固体产物，然后用硅胶柱对产物进行纯化，得到白色的固体；
S12：称取S11得到的化合物，加入四氢呋喃混合均匀，在N2保护下加入2M LDA溶液。在-20℃下搅拌一段时间之后，加入三甲基氯化锡固体，继续在室温下搅拌过夜，将混合物在旋转蒸发仪上进行旋干，之后用饱和食盐水对混合物进行洗涤，干燥后，通过柱层析法对所得的粗产品进行纯化，最后得到白色的固体产物；
S13：称取上述S12步骤中得到的有机锡化合物和4-溴苯甲氰类化合物，加入无水二氧六环混合均匀，然后在氮气保护下加入四三苯基膦钯催化剂，在105-115℃搅拌12h得到混合物，将混合物洗涤萃取后进行旋干，然后用柱层析法进行纯化，最终得到白色或者黄色的所述化合物单体。
上述步骤S2中包括如下步骤：
S21：将所述化合物单体与H2N-R2-NH2和无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)混合均匀，加入N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)，在惰性气体保护下45℃-55℃搅拌96-144h得到混合物；
S22：将S21得到的混合物的pH调节至1-2，然后截留得到分子量为＞1KDa的物质，冷冻干燥后得到白色的固体即所述脒类低聚物。
实验例1
该实验例以P2化合物进行详细说明：
材料和方法：所有试剂均由TCI(美国)，Sigma-Aldrich，麦克林，阿达玛斯等有机试剂公司和碧云天生物科技公司提供，均直接使用不须进一步纯化(除其它注明外)。实验用超纯水来自于Milli-Q纯化仪器。惰性气体为氮气。
P2的合成合成步骤如图1所示。先进行4’，6-二亚氨酸酯基-2-苯基吲哚盐酸盐单体的合成。称取6-氰基吲哚(10g，70.3mmol)和二碳酸二叔丁酯(BOC)(35.36g，162mmol)，然后加入100mL二氯甲烷混合均匀，之后加入催化量的4-二甲氨基吡啶(DMAP)(0.86g，7.03mmol)，在室温下搅拌12-24h得到混合物，将混合物萃取、旋干后得到固体混合物，对固体混合物进行柱层析分离得到白色的固体产物13.6g，产率为80％。称取上一步得到的BOC保护的6-氰基吲哚化合物(0.3g，1.238mmol)和三甲基氯化锡(0.32g，1.606mmol)，加入20mL干燥的四氢呋喃溶液混合均匀。使反应混合物的温度保持在-20℃，然后在氮气保护的条件下加入2M LDA。在-20℃条件下搅拌30min后，将反应混合物移至室温继续反应6h之后加入30mL水淬灭反应。在旋转蒸发仪上将四氢呋喃溶剂除去之后，用乙酸乙酯进行萃取，对旋干后所得的产物进行柱层析纯化，得到白色的固体产物(0.6g，50％)。称取上一步的反应产物(3g，7.406mmol)和4-溴苯甲氰(1.754g，9.628mmol)加入20mL干燥的二氧六环中，在氮气保护的条件下将反应体系加热到110℃，在回流的条件下搅拌12-24h。在旋转蒸发仪上将混合物旋干，将混合产物进行柱层析纯化得到最终产物1.5g，产率为50％。在一个20mL的小瓶子里加入干燥的无水乙醇，然后缓慢地滴入乙酰氯。在室温条件下搅拌30min。称取上一步的反应产物100mg溶解在无水乙醇中，然后滴加到乙酰氯的乙醇溶液中。盖紧瓶盖，在室温下保持剧烈地搅拌4天，用无水乙醚对产物进行沉淀洗涤。之后在旋转蒸发仪上对产物进行旋干。得到黄色的固体粉末100mg，产率为50％。
称取4’，6-二亚氨酸酯基-2-苯基吲哚盐酸盐单体(46mg，0.14mmol)和1，6-己二胺(13.132mg，0.14mmol)加入到含有1.5mL干燥DMF的7mL玻璃瓶中。然后加入75μL的DIPEA，盖紧瓶盖。然后在50℃加热的条件下搅拌4天。反应完成后向混合物中加入2mL 3M HCl。用截留分子量为1kDa的透析袋对上述混合物进行透析24-48h，然后进行冷冻干燥得到黄色固体12mg。
P2具有广谱的抗菌活性对化合物P2测试了其对多种细菌的抗菌活性(表2)。P2均表现出良好的抗菌活性，所有测试的最小抑菌浓度均在较低的范围内(0.0625-8μg/mL)。P2对耻垢分枝杆菌有较好的抗菌活性与选择性，最小抑菌浓度在个位数以下，比其它菌株的数值要低两个数量级。抗菌活性数据说明P2不仅具有很好的抗菌广谱性，同时对以耻垢分枝杆菌为代表的分枝杆菌类病原微生物具有良好的潜在抗菌活性。
P2具有较低溶血毒性表2可以看出这一系列的抗菌低聚物的溶血毒性较低，其中P2的半数溶血浓度为1062.9μg/mL，表现出较低的溶血毒性。P2在有效杀灭各种病原菌和耐药病原菌的同时保持较低的溶血毒性，对血细胞的破坏很小，说明P2的生物相容性较高。
靶向细菌细胞膜抗菌机理的验证用流式实验评估P2的破膜能力。在流式实验中，碘化丙啶(PI)作为一种评估细菌细胞膜完整性的荧光染料。培养过夜的耻垢分枝杆菌离心之后，弃去培基，用PBS洗三次，之后用含有50μM PI的PBS重新悬浮为OD600nm＝0.1，加入指定浓度的P2在37℃下培养4h后，运用BDAccuri C6 Plus流式细胞仪对样品进行分析。如图2所示，用P2处理过的耻垢分枝杆菌有更多的PI积累，从而发出更强的荧光。未经处理的耻垢分枝杆菌则表现出极低的荧光。
还进一步运用扫描电子显微镜来证明P2的破膜能力。如图3所示，相对于未经处理的耻垢分枝杆菌对照组，用P2处理过的细菌都表现出了明显的膜破损和皱缩。
结合细菌DNA抗菌机理的验证该低聚物的设计主要是基于膜靶向和DNA靶向的双重抗菌机理。除了对P2破坏细菌细胞膜能力的证明，还证明了该低聚物具有结合细菌DNA的能力。动态光散射(DLS)研究表明P2可以促进耻垢分枝杆菌基因组DNA的聚集。如图4所示，P2结合DNA形成的低聚物-DNA复合物的粒径远远大于P2的粒径以及DNA的粒径，证明了P2和DNA之间具有较强的亲和力能够结合细菌的DNA。
在确定了P2在体外具有与DNA结合能力后，用罗丹明标记了P2化合物，并将其与细菌进行共孵育，观察其对细菌DNA的结合情况。图5为P2对耻垢分枝杆菌的染色情况，P2与细菌DNA结合之后发出荧光的“P2-DNA complex”通道和罗丹明通道可以很好地重合在一起，表明P2能够结合细菌的DNA，进一步证明了P2可以结合细菌DNA的机理。
P2对结核分枝杆菌感染临床常见抗生素的敏化作用如上所述，P2不仅能靶向细菌的细胞膜同时也能引起细菌细胞膜的破裂。将P2与小分子抗生素联用，应能对抗生素进入细菌内部起到促进作用，增加抗生素在细菌内的积累量，从而提高其抗菌活性，降低其最小抑菌浓度的数值。为了验证P2对小分子抗生素的敏化作用，用次最小抑菌浓度的P2对抗生素乙胺丁醇(EMB)、链霉素(STR)、卡那霉素(KAN)、异烟肼(INH)、利福平(RIF)进行敏化。如图6所示，加入P2会显著降低利福平的最小抑菌浓度(降低8倍)。
P2抗耐药性产生速率的测定引入双重抗菌机理可以降低细菌对化合物产生耐药性的速度。细胞膜靶向型抗菌聚合物的靶标是细胞膜，由于细胞膜的生物合成非常复杂，只有当多种随机突变同时发生并且导致膜结构发生变化，才会产生耐药性。因此细胞膜靶向型的聚合物被认为是一类低耐药的抗菌化合物。作为一种细胞膜靶向型的聚合物，P2也同样具有低耐药性的特点。除此以外，P2还将细菌的DNA作为第二靶标，因此细菌需要同时发生膜结构的突变以及DNA结构的突变，才能产生对P2的耐药性。通过实验测定了P2产生耐药性的速率，如图7所示，耻垢分枝杆菌被次最小抑菌浓度的标准抗生素利福平重复处理后，菌株产生了耐药性突变，表现为对利福平的最小抑菌浓度不断上升，细菌复制210代后其最小抑菌浓度增加了32倍。与之相反的是，P2在相同的情况下几乎没有产生耐药性。上述结果说明，相对于传统抗生素P2难以产生细菌耐药性。由于P2具有破坏细菌细胞膜不易引起其耐药性的问题，将P2和利福平组合使用，可以有效地降低利福平耐药性的产生，图7可以看出，即使在用这一组合药物处理了耻垢分枝杆菌210代之后，也几乎没有引起耻垢分枝杆菌对其产生耐药性。
实验例2
称取5-氰基吲哚或者6-氰基吲哚(10g，70.3mmol)和二碳酸二叔丁酯(35.36g，162mmol)加入到400mL无水二氯甲烷中。之后加入4-二甲氨基吡啶(0.86g，7.03mmol)。将上述混合物放到冰水浴中进行搅拌2h，反应完成后用冰水淬灭反应。用二氯甲烷对有机相进行萃取，将萃取之后的有机相进行合并，然后用旋转蒸发仪进行旋干。得到的粗产物通过柱层析的方法进行提纯。得到白色的固体产物，BOC保护的5-氰基吲哚和BOC保护的6-氰基吲哚产率分别为37％和47％。
N-BOC-5-氰基吲哚1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.27(d，J＝8.6Hz，1H)，7.92(s，1H)，7.73(d，J＝2.9Hz，1H)，7.57(d，J＝8.6Hz，1H)，6.64(d，J＝2.9Hz，1H)，1.71(s，9H).13C NMR(101MHz，CDCl3)：δ149.0，137.1，130.5，128.1，127.3，125.8，119.8，116.0，106.9，106.1，84.9，28.1.。
N-BOC-6-氰基吲哚1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.53(s，1H)，7.79(d，J＝3.6Hz，1H)，7.66(d，J＝8.1Hz，1H)，7.51(d，J＝8.1，1H)，6.66(d，J＝3.6Hz，1H)，1.71(s，9H).13C NMR(101MHz，CDCl3)：δ149.0，134.2，133.8，129.3，125.8，121.7，120.0，119.8，107.2，107.1，85.0，28.1.。
实验例3
称取BOC保护的氰基吲哚衍生物(0.17g，1.24mmol)和三甲基氯化锡0.32g加入到含有5mL干燥的四氢呋喃溶液的两颈烧瓶中，将烧瓶的一个颈与真空线连接。把上述混合体系放进-20℃进行冷却。对溶液进行换气使反应瓶中充满N2的保护氛围。在冷却的条件下，用针管小心地吸取0.81mL二异丙基氨基锂(2M LDA的正庚烷-四氢呋喃-乙醚的溶液)，在N2的保护下慢慢地打入反应烧瓶中。在低温下保持反应一段时间之后，将烧瓶移至20-25℃继续反应过夜。在溶液中加入30mL水将反应终止，然后将溶液中的四氢呋喃用旋转蒸发仪旋蒸掉。用乙酸乙酯将粗产品溶解，之后用饱和食盐水洗涤有机相。将有机相进行收集，并用无水硫酸镁进行干燥。将乙酸乙酯旋蒸完之后得到固体混合物，用柱层析法进行纯化，所用洗脱剂为PE∶DCM＝1∶1。
N-BOC-1-三甲基甲锡基-5-氰基吲哚：1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.03(d，J＝8.6Hz，1H)，7.86(s，1H)，7.50(d，J＝8.6Hz，1H)，6.77(s，1H，coupling with 117Sn/119Sn couldbe observed)，1.74(s，9H)，0.36(s，9H，coupling with117Sn/119Sn could be observed).13C NMR(101MHz，CDCl3)：δ151.5，146.6，139.2，132.2，126.5，124.8，120.0，117.6，115.9，105.5，85.3，28.1，-7.2。
N-BOC-1-三甲基甲锡基-6-氰基吲哚：1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.27(s，1H)，7.59(d，J＝8.1Hz，1H)，7.45(d，J＝8.1Hz，1H)，6.80(s，1H，coupling with 117Sn/119Sn couldbe observed)，1.73(s，9H)，0.34(s，9H，coupling with 117Sn/119Sn could be observed).13C NMR(101MHz，CDCl3)：δ151.4，148.6，136.4，135.3，125.5，120.8，120.5，119.6，117.8，106.0，85.5，28.1，-7.2。
实验例4
化合物3系列化合物的合成步骤比较相似，下面以其中一种化合物的合成举例。称取N-BOC-1-三甲基锡基-6-氰基吲哚(3.0g，7.4mmol)和4-溴苯甲氰化合物(9.63mmol)加入到含有20mL干燥的二氧六环的两颈烧瓶中，之后将反应烧瓶连接到真空线上，对二氧六环溶剂在真空条件下进行脱气并用N2进行置换以使反应体系中充满N2。称取四(三苯基膦)钯催化剂(0.86g，0.74mmol)快速加入含有1mL的无水二氧六环溶剂中。之后，在氮气保护下用注射器将上述溶液滴加到反应体系中。将上述反应液在油浴的条件下加热到110℃，并在此温度下保持反应24h。反应结束后，将二氧六环溶剂通过旋转蒸发的方法除去。之后用200mL乙酸乙酯将旋干后所得的固体溶解，然后加入5mL浓氨水将钯的配合物破坏掉。并用去离子水对有机相进行洗涤，之后将有机相进行合并，旋干。用柱层析法对粗产物进行分离纯化。所用的洗脱液为正己烷∶乙酸乙酯＝4∶1。得到产物为白色或者黄色的固体粉末。
R1＝H：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ12.35(s，1H)，8.15(s，1H)，8.10(d，J＝8.3Hz，2H)，7.97(d，J＝8.3Hz，2H)，7.60(d，J＝8.5Hz，1H)，7.51(d，J＝8.5Hz，1H)，7.30(s，1H).13CNMR(101MHz，DMSO-d6)：δ139.7，138.7，136.0，133.5，128.5，126.8，126.4，125.7，120.9，119.3，113.3，110.6，102.5，102.4。
RI＝H：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ12.37(s，1H)，8.12(d，J＝8.0Hz，2H)，7.99(d，J＝8.0Hz，2H)，7.90(s，1H)，7.77(d，J＝8.2Hz，1H)，7.38(d，J＝8.2Hz，1H)，7.31(s，1H).13CNMR(101MHz，DMSO-d6)δ140.1，136.8，135.8，133.5，131.9，126.6，122.9，122.2，120.9，119.2，116.8，110.9，104.2，102.5。
R1＝CH3：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ12.08(s，1H)，7.89(s，2H)，7.86-7.74(m，3H)，7.39(d，J＝8.2Hz，1H)，6.94(s，1H)，2.54(s，3H).13C NMR(101MHz，DMSO-d6)：δ140.0，137.8，136.5，135.9，135.0，131.7，130.4，130.3，122.6，122.0，120.9，119.2，116.7，111.1，104.7，103.8，21.1。
R1＝OCH3：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.92(s，1H)，8.03(d，J＝8.0Hz，1H)，7.91(s，1H)，7.76(d，J＝8.2Hz，1H)，7.69(s，1H)，7.58(d，J＝8.0Hz，1H)，7.36(d，J＝8.2Hz，1H)，7.27(s，1H)，4.04(s，3H).13C NMR(101MHz，DMSO-d6)：δ156.6，137.3，136.0，131.4，129.3，125.3，124.7，122.5，122.0，121.0，119.1，116.8，116.2，111.8，104.8，103.8，56.9。
实验例5
化合物4的合成方法是相同的，具体如下：将6mL干燥的乙酰氯溶液缓慢地滴加到含有10mL无水乙醇的瓶子中。将瓶盖拧紧，在室温条件下保持剧烈搅拌30min。称取100mg上一步骤中所得的产物超声溶解在无水乙醇中。之后快速地滴加到反应体系中。迅速将瓶盖拧紧，用封口膜将瓶口封闭好。保持反应体系在常温下搅拌4天，用TLC的方法监测，反应完成后，向反应体系中加入无水乙醚。之后将反应混合物转移到50mL离心管中进行离心，弃去上清液。对反应产物进行三次洗涤之后，将其放入真空干燥箱干燥过夜。得到黄色固体粉末，产率均在60％左右。
4a：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ12.95(s，1H)，8.55(s，1H)，8.25(s，4H)，7.93(d，J＝8.5，1H)，7.68(d，J＝8.5Hz，1H)，7.44(s，1H)，4.67(m，4H)，1.52(m，6H)。13C NMR(101MHz，DMSO-d6)：δ171.5，170.2，141.4，138.6，137.4，130.0，128.0，125.7，124.8，124.0，122.8，117.2，112.4，103.3，69.7，69.3，13.7，13.6。
4b：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ12.97(s，1H)，8.25-8.33(m，5H)，7.81(s，2H)，7.38(s，1H)，4.67(m，4H)，1.52(m，6H)。13C NMR(101MHz，DMSO-d6)：δ171.9，170.6，141.4，137.6，137.1，133.8，130.4，126.5，125.7，121.5，120.1，119.2，114.5，102.8，70.1，69.7，14.1，14.0。
4c：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ12.60(s，1H)，8.33(s，1H)，8.21(s，1H)，8.12(d，J＝8.1Hz，1H)，7.91(d，J＝8.1Hz，1H)，7.82(m，2H)，6.99(s，1H)，4.68(m，4H)，2.62(s，3H)，1.52(d，6H)。13C NMR(101MHz，DMSO-d6)：δ171.9，170.7，141.4，138.0，137.3，136.2，133.6，132.1，130.2，127.2，125.8，121.3，119.9，118.7，114.4，105.0，70.2，69.8，21.6，14.1。
4d：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ12.38(s，1H)，8.34(s，1H)，8.22(d，J＝8.3Hz，1H)，8.10(s，1H)，7.77-7.87(m，3H)，7.35(s，1H)，4.68(m，4H)，4.12(s，3H)，1.52(m，6H)。13CNMR(101MHz，DMSO-d6)：δ171.9，170.3，156.7，138.6，136.3，133.3，129.1，126.7，126.0，122.2，121.3，119.8，118.8，114.7，113.3，105.2，70.2，69.7，57.1，14.1。
实验例6
以P2的合成为例，包括如下步骤：称取4′，6-二亚氨酸酯基-2-苯基吲哚盐酸盐单体(46mg，0.113mmol)和1，6-己二胺(13.132mg，0.113mmol)加入到含有1.5mL干燥DMF的7mL玻璃瓶中。然后加入75μL的DIPEA，盖紧瓶盖。之后在50℃加热的条件下搅拌4天。反应完成后向混合物中加入2mL 3M HCl。用截留分子量为1kDa的透析袋对上述混合物进行透析24-48h，然后进行冷冻干燥得到黄色固体12mg。
实验例7
以P16的合成为例，包括如下步骤：称取4′，6-二亚氨酸酯基-2-(2-甲氧基)-苯基吲哚盐酸盐单体(46mg，0.105mmol)和N，N-双(3-氨丙基)甲胺(15.25mg，0.105mmol)加入到含有1.5mL干燥DMF的7mL玻璃瓶中。然后加入75μL的DIPEA，盖紧瓶盖。然后在50℃加热的条件下搅拌4天。反应完成后向混合物中加入2mL 3M HCl。用截留分子量为1kDa的透析袋对上述混合物进行透析24-48h，然后进行冷冻干燥得到黄色固体25mg。
实验例8
以P17的合成为例，包括如下步骤：称取4′，5-二亚氨酸酯基-2-苯基吲哚盐酸盐单体(46mg，0.113mmol)和2，2′-氧代双乙胺(11.77mg，0.113mmol)加入到含有1.5mL干燥DMF的7mL玻璃瓶中。然后加入75μL的DIPEA，盖紧瓶盖。然后在50℃加热的条件下搅拌4天。反应完成后向混合物中加入2mL 3M HCl。用截留分子量为1kDa的透析袋对上述混合物进行透析24-48h，然后进行冷冻干燥得到黄色固体25mg。
实验例9
一、单体的合成
将化合物1(10.00g，1.9eq)，化合物2(10.25g，1.0eq)和碳酸钾(12.21g，2.0eq)转移至250mL圆底烧瓶中，乙腈做溶剂，110℃回流过夜。然后将混合物冷却，旋干后加入少量乙酸乙酯成悬浮液。向获得的悬浮液中加入1M NaOH溶液，并将混合物于室温下搅拌10分钟。然后将悬浮液过滤并用水和乙酸乙酯反复洗涤除去杂质。将得到的固体于60℃烘干后得到化合物1-2(9.50g，69.75％)。
1-2：1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.57(d，J＝8.2Hz，4H)，6.95(d，J＝8.3Hz，4H)，4.20-4.18(t，4H)，3.95-3.93(t，4H).
将化合物1(10.00g，1.9eq)，化合物5(10.16g，1.0eq)和碳酸钾(12.21g，2.0eq)转移至250mL圆底烧瓶中，乙腈做溶剂，110℃回流过夜。然后将混合物冷却，旋干后加入少量乙酸乙酯成悬浮液。向获得的悬浮液中加入1M NaOH溶液，并将混合物于室温下搅拌10分钟。然后将悬浮液过滤并用水和乙酸乙酯反复洗涤除去杂质。将得到的固体于60℃烘干后得到化合物1-5(9.60g，70.90％)。
1-5：1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.57(d，J＝8.4Hz，4H)，6.93(d，J＝8.4Hz，4H)，4.03(t，J＝6.2Hz，4H)，1.88(m，J＝14.1，6.8Hz，4H)，1.67(m，J＝7.1Hz，2H)。
将化合物2(10.00g，1.9eq)，化合物8(11.66g，1.0eq)和碳酸钾(12.21g，2.0eq)转移至250mL圆底烧瓶中，乙腈做溶剂，110℃回流过夜。然后将混合物冷却，旋干后加入少量乙酸乙酯成悬浮液。向获得的悬浮液中加入1MNaOH溶液，并将混合物于室温下搅拌10分钟。然后将悬浮液过滤并用水和乙酸乙酯反复洗涤除去杂质。将得到的固体于60℃烘干后得到化合物2-8(10.24g，68.09％)。
2-8：1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.46(s，4H)，7.38(q，J＝8.0Hz，2H)，7.27(s，2H)，7.21(d，J＝7.2Hz，4H)，5.10(s，4H)。
称取化合物1-2(5.00g)于500mL两颈烧瓶中，并加入120mL无水乙醇和50mL无水氯仿的混合物，不断往烧瓶中通入经无水氯化钙干燥过的氯化氢气体，室温反应4-5天，直到反应完成(通过TLC监测)。反应结束后用无水乙醚洗涤产物，将得到的产物真空干燥后得到白色固体1-2-S(5.23g，80.59％)。
1-2-S：1H NMR(400MHz，DMSO)δ8.14(d，J＝7.6Hz，4H)，7.18(d，J＝7.5Hz，4H)，4.60(t，J＝5.9Hz，4H)，4.27(t，4H)，3.86(t，4H)，1.47(q，6H)。
称取化合物1-5(5.00g)于500mL两颈烧瓶中，并加入120mL无水乙醇和50mL无水氯仿的混合物，不断往烧瓶中通入经无水氯化钙干燥过的氯化氢气体，室温反应4-5天，直到反应完成(通过TLC监测)。反应结束后用无水乙醚洗涤产物，将得到的产物真空干燥后得到白色固体1-5-S(5.56g，85.67％)。
1-5-S：1H NMR(400MHz，DMSO)δ11.77(s，2H)，11.01(s，2H)，8.14(d，J＝8.6Hz，4H)，7.15(d，J＝8.6Hz，4H)，4.60(t，J＝6.8Hz，4H)，4.15(q，J＝6.1Hz，4H)，1.851.81(m，4H)，1.60(m，J＝6.9Hz，2H)，1.48(t，J＝6.9Hz，6H)。
称取化合物2-8(5.00g)于500mL两颈烧瓶中，并加入120mL无水乙醇和50mL无水氯仿的混合物，不断往烧瓶中通入经无水氯化钙干燥过的氯化氢气体，室温反应4-5天，直到反应完成(通过TCL监测)。反应结束后用无水乙醚洗涤产物，将得到的产物真空干燥后得到白色固体2-8-S(5.05g，79.53％)。
2-8-S：1H NMR(400MHz，DMSO)δ7.89(s，2H)，7.71(d，J＝7.6Hz，2H)，7.707.58(q，2H)，7.55(s，J＝18.2Hz，4H)，7.52-7.43(d，2H)，5.26(s，4H)，4.65(q，4H)，1.48(t，6H)。
二、聚合
将两种单体1-2-S(0.4mmol，1eq)和2，2′-氧代双乙胺(0.4mmol，1eq)加入20mL玻璃瓶中，并加入4mL无水DMF作溶剂，随后加入N，N-二异丙基乙胺(264.5μL，1.6mmol，4eq)，密封后在50℃下反应4天。反应结束后加盐酸(3.0M，2mL)调节至酸性条件，将溶液用水(MWCO＝1kDa)透析24小时。之后将纯化的溶液冻干，得到淡黄色絮状固体P24。
将两种单体1-5-S(0.4mmol，1eq)和1，4-丁二胺(0.4mmol，1eq)加入20mL玻璃瓶中，并加入4mL无水DMF作溶剂，随后加入N，N-二异丙基乙胺(264.5μL，1.6mmol，4eq)，密封后在50℃下反应4天。反应结束后加盐酸(3.0M，2mL)调节至酸性条件，将溶液用水(MWCO＝1kDa)透析24小时。之后将纯化的溶液冻干，得到白色絮状固体P46。
将两种单体2-8-S(0.4mmol，1eq)和1，4-丁二胺(0.4mmol，1eq)加入20mL玻璃瓶中，并加入4mL无水DMF作溶剂，随后加入N，N-二异丙基乙胺(264.5μL，1.6mmol，4eq)，密封后在50℃下反应4天。反应结束后加盐酸(3.0M，2mL)调节至酸性条件，将溶液用水(MWCO＝1kDa)透析24小时。之后将纯化的溶液冻干，得到白色絮状固体P54。
实施例三
为了扩展抗菌脒类低聚物在胞内杀菌模型中的应用，以低聚物P2为例，用P2处理耻垢分枝杆菌和偶发分枝杆菌感染的Raw264.7细胞，以测试其杀灭胞内感染的细菌的能力。具体方法如下。
胞内感染模型的构建用5μg/mL的4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)对耻垢分枝杆菌进行染核5min。然后用染色的耻垢分枝杆菌来感染Raw264.7细胞，感染比例(MOI)为10，在37℃细胞培养箱中培养4h之后，用PBS洗三次，将胞外的耻垢分枝杆菌清洗干净。然后加入PBS，用激光共聚焦显微镜对细胞进行成像研究。如图8所示(图中标尺为20μm)，染色后的耻垢分枝杆菌均分布在Raw264.7细胞的细胞基质中。
胞内杀菌的Confocal表征实验为了观察P2胞内杀菌的效果，进行了胞内杀菌的Confocal实验。首先，如上所述，先构建耻垢分枝杆菌的胞内杀菌模型，然后用P2和感染后的细胞进行共孵育，同时设置对照实验组：用标准抗生素利福平处理的阳性对照组和不用药物处理的对照组。如图9所示，不用药物处理的对照组在24小时之后，胞内的细菌繁殖较快，会将完整的细胞膜撑破，裸露出细胞核。利福平处理的对照组，Raw264.7细胞内仍有较多的细菌，影响细胞的形态。而用P2处理的实验组可以有效地杀掉胞内的耻垢分枝杆菌，从而使细胞维持较好的细胞形态，达到拯救哺乳动物细胞的目的。
P2胞内杀菌能力的评估为了测试P2胞内杀菌的最小浓度，在96孔板中进行胞内杀菌的实验。分别用耻垢分枝杆菌和偶发分枝杆菌，按上述的感染比例(MOI＝10)对Raw264.7进行感染，感染4小时后，用庆大霉素将胞外的细菌清除掉。然后分别加入不同浓度的P2和作为对照的标准抗生素利福平与细胞共孵育24h。之后将细胞裂解掉，然后用PBS稀释100倍之后进行涂板，在37℃培养48h后对琼脂板上的菌落进行计数。如图10a，10b所示，P2分别在8μg/mL和16μg/mL时就几乎可以完全杀灭细胞内的耻垢分枝杆菌和偶发分枝杆菌。
P2在MRSA以及偶发感染的斑马鱼模型中的应用为了评估P2活体内的杀菌性能，分别构建了MRSA和偶发分枝杆菌感染的斑马鱼模型。
P2在MRSA感染的斑马鱼模型中的应用将67尾斑马鱼分为4组：PBS组(18尾)；P2组(18尾)；红霉素(ERY)组(18尾)；甲氧西林(MET)组13尾。通过腹腔注射的方式将MRSA注射到斑马鱼的腹腔中进行感染，然后注射P2和各个对照组。对上述斑马鱼的存活情况进行观察记录。持续观察72小时之后，对各个组的斑马鱼的存活情况进行统计分析。如图11所示，注射P2的实验组相对于其它对照组有较高的存活率。证明P2对斑马鱼体内感染的MRSA有较好的杀伤作用，对MRSA感染的斑马鱼有拯救作用。
P2在偶发分枝杆菌感染的斑马鱼模型中的应用30尾斑马鱼被分为3组：PBS组(10尾)；P2组(10尾)；乙胺丁醇(EMB)组(10尾)。通过腹腔注射的方式进行斑马鱼感染。然后通过腹腔注射的方式分别注射PBS，P2和乙胺丁醇(EMB)。开始观察各个组的存活情况。持续观察大概140小时之后发现，感染完偶发分枝杆菌的斑马鱼腹部会逐渐地出现肉芽肿的现象。随着时间增长肉芽肿会越来越大，直至斑马鱼的肚子破裂而死亡。如图12所示，注射完P2的实验组斑马鱼的存活率明显高于PBS组和标准抗生素EMB组。
综上所述，该低聚物可同时靶向细菌的细胞膜和染色体DNA。得益于其双重抗菌机理，该低聚物保留了传统抗菌聚合物的所有抗菌优势，具有抗菌广谱性和较快的杀菌动力学，并且能够杀灭耐药性病原菌。该低聚物可以有效地杀灭胞内感染的耻垢分枝杆菌和偶发分枝杆菌，并且在MRSA和偶发分枝杆菌感染的斑马鱼模型中也有较好的杀菌活性，从而显著地提高斑马鱼的存活率。
Claims (9)
1.一种具有抗耐药性的抗菌脒类低聚物，其特征在于，所述脒类低聚物的分子式如下所示：
其中，5≤n≤8，R1分子式为式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(V)、式(VI)、式(VII)、式(Ⅷ)、式(IX)中的一种或任意几种：
其中，R2分子式为式(a)、式(b)、式(c)、式(d)、式(e)、式(f)、式(g)、式(h)、式(i)中的一种或任意几种：
2.根据权利要求1所述的低聚物，其特征在于，其中R1为式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)中的任意一种，R2为式(a)。
3.根据权利要求2所述的低聚物，其特征在于，其中R1为式(II)，R2为式(a)。
4.根据权利要求1所述的低聚物，其特征在于，其中R1为式(II)、式(III)中的任意一种，R2为式(b)。
5.一种合成具有抗耐药性的抗菌脒类低聚物的制作方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：制备具有如下分子式的化合物单体：
S2：将所述化合物单体与H2N-R2-NH2、无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)以及N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)反应，得到所述脒类低聚物；
其中的R1分子式包括式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(V)、式(VI)、式(VII)、式(Ⅷ)、式(IX)中的一种或任意几种：
其中R2分子式包括式(a)、式(b)、式(c)、式(d)、式(e)、式(f)、式(g)、式(h)、式(i)中的一种或任意几种：
6.根据权利要求5所述的制作方法，其特征在于，所述步骤S1中包括如下步骤：
S11：称取5-氰基吲哚或者6-氰基吲哚和二碳酸二叔丁酯，然后加入二氯甲烷混合均匀，加入催化量的4-二甲氨基吡啶(DMAP)在2-6℃下搅拌半个小时之后恢复至20-25℃的室温搅拌过夜，将混合物过滤洗涤后用旋转蒸发仪进行旋干，得到固体产物，然后用硅胶柱对产物进行纯化，得到白色固体；
S12：称取S11得到的化合物，加入四氢呋喃混合均匀，在N2保护下加入2M LDA溶液。在-20℃下搅拌一段时间之后，加入三甲基氯化锡固体，继续在室温下搅拌过夜，将混合物在旋转蒸发仪上进行旋干，之后用饱和食盐水对混合物进行洗涤，干燥后，通过柱层析的方法对所得的粗产品进行纯化，最后得到白色的固体产物；
S13：称取上述S12步骤中得到的有机锡化合物和4-溴苯甲氰类化合物，加入无水二氧六环混合均匀，然后在氮气保护下加入四三苯基膦钯催化剂，在105-115℃条件下搅拌12h得到混合物，将混合物洗涤萃取后旋干，然后用柱层析法进行纯化，最终得到白色或者黄色的所述化合物单体。
7.根据权利要求5所述的制作方法，其特征在于，所述步骤S2中包括如下步骤：
S21：将所述化合物单体与H2N-R2-NH2和无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)混合均匀，加入N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)，在惰性气体保护下，温度为45℃-55℃的条件下搅拌96-144h得到混合物；
S22：将S21得到的混合物的pH调节至1-2，然后截留得到分子量为>1KDa的物质，冷冻干燥后得到白色的固体即所述脒类低聚物。
8.一种如权利要求1所述低聚物的用途，其特征在于，所述脒类低聚物用于作为抗菌剂。
9.根据权利要求8所述的具有抗耐药性的抗菌脒类低聚物的用途，其特征在于，所述脒类低聚物用于抗菌，所述脒类低聚物的抗菌种类包括大肠杆菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、耻垢分枝杆菌、偶发分枝杆菌等。
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