CN114763563A - 一种提高慢病毒感染效率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种慢病毒感染T细胞的方法。所述方法包括在感染体系中加入促感染试剂后培养；所述促感染试剂为dm PGE2；所述促感染试剂在所述感染体系中的终浓度为10μM～20μM。本发明筛选出一种安全有效的慢病毒促感染试剂及其最适浓度用于提高TCR的表达效率，dm PGE2(10～20μM)可以用于促进慢病毒感染CD8+T细胞，与常用的促感染试剂polybrene相比，可以显著提高慢病毒载体基因转导效率，增强T细胞的杀伤功能，而对于T细胞的分化表型没有影响。
Description
技术领域
本发明涉及免疫治疗领域，具体涉及一种提高慢病毒感染效率的方法，尤其涉及一种慢病毒感染T细胞的方法。
背景技术
过继性细胞免疫治疗(adoptive cellular immuno-therapy，AC)属于肿瘤的免疫治疗，在过继性T细胞免疫治疗中，根据回输的T细胞类型分为嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy)和T细胞受体基因工程化T细胞疗法(T cell receptor-gene engineered T cells Immunotherapy)。过继性T细胞疗法是指向肿瘤患者输注具有抗肿瘤活性的特异性T细胞，通过直接杀伤肿瘤或激发机体免疫反应来杀伤肿瘤细胞，最终达到清除肿瘤的目的一种治疗方式。回输的T淋巴细胞包括肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocytes,TIL)、T细胞受体基因工程化T细胞(T cellreceptor-gene engineered T cells,TCR-T)和嵌合抗原受体T细胞(Chimeric antigenreceptor T cells,CAR-T)。
然而，TCR-T细胞临床免疫治疗也面临一些挑战。构建TCR-T细胞的效率由于原代T细胞的外源基因表达效率限制处于较低的水平，无法满足大量的回输治疗。特别是在应用慢病毒载体系统进行基因转导时，外源基因表达效率在原代细胞和细胞系之间和不同状态的T细胞(静息的T细胞无法被慢病毒感染)之间差异较大(Shearer and Saunders)，除了病毒感染复数(MOI)和感染时间等的限制条件外，促感染试剂也是重要的影响因素之一。
大多数的TCR基因转导使用的是逆转录病毒载体，包括γ-逆转录病毒载体和慢病毒载体。逆转录病毒载体在宿主细胞的基因组中稳定地插入整合需要在转导过程中T细胞的完全激活和增殖，并且影响归巢相关分子(CD62L)或者共激活分子(CD28)的表达。因此，慢病毒载体以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展为另一个基于T细胞进行肿瘤免疫治疗的有效基因转导工具。研究证明，慢病毒载体比γ-逆转录病毒载体具有更高的转导效率，可以插入更长的基因，并且可以感染生长较慢的细胞如肿瘤浸润淋巴细胞(tumorinfiltrating lymphocytes,TILs)。之后，有研究证实慢病毒载体可以有效转导抗肿瘤活性的毒性T淋巴细胞(CTLs)和最低程度激活的外周血淋巴细胞(PBLs)。
慢病毒载体在临床上也有着广泛的应用。2003年，VIR*SYS开始第一个应用慢病毒载体的临床试验，从HIV-1病人获得的CD4+ T细胞转导入一个慢病毒载体，包括了一段针对HIV-1包膜的反义序列。2013年，64个病人治疗后其病毒载量降低，并且没有引起各种不良反应。其他的疾病的临床试验也获得了良好的效果，包括镰状细胞性贫血和β-地中海贫血。
第二代慢病毒载体系统包含了三种质粒，包装质粒(packaging plasmid)，包膜质粒(envelope plasmid)和转导质粒(transfer plasmid)。包装质粒携带突变的HIV-1前病毒，但是因为一些缺失的蛋白不能包装成病毒。包膜质粒包含了一个病毒包膜来决定趋向性，即病毒能够感染哪一种细胞，因为来自HIV-1的病毒包膜只能感染CD4+ T细胞，所以将其替换成来自VSV-G的病毒包膜，使其具有更广的感染性。转导质粒编码HIV-1长终止重复(LTRs)中间插入所需要转导的目的基因。
第三代慢病毒包装系统被分成了两个质粒，一个编码Rev基因，另外一个编码Gag和Pol基因，提高了产生一个复制型病毒所需要的重组概率，增加了安全性。本发明采用的是第二代慢病毒包装系统。
应用于提高慢病毒基因转导效率的试剂大部分通过对病毒进行电荷吸附或者其他方式吸附，浓缩病毒并将其大量富集到细胞表面，增加病毒和细胞的接触，部分试剂通过调节mTOR的活性提高慢病毒的感染效率(环孢素A，雷帕霉素等)，还有其他试剂通过减少早期依赖capsid的转导障碍提高基因转导效率。
常用的鱼精蛋白(protamine)和聚凝胺(polybrene)都是多聚阳离子复合物，可以通过普通的静电效应(比如降低病毒粒子和细胞膜表面的静电排斥)促进慢病毒感染靶细胞完成基因转导。鱼精蛋白是存在于各类鱼精巢组织中的一种碱性多聚阳离子肽，它更多地应用于逆转录病毒基因治疗的临床实验，并且在腺病毒基因转导也被人熟知。聚凝胺在1960年就被发现可以用于提高逆转录病毒的感染效率，在慢病毒的基因转导中也有应用。一项研究中显示，在CD8+ T细胞中，与没有促感染试剂的慢病毒基因转导后的表达目的基因细胞数相比，硫酸鱼精蛋白展示出了40％的提高(A Nontoxic Transduction EnhancerEnables Highly Efficient Lentiviral Transduction of Primary Murine T Cellsand Hematopoietic Stem Cells)。而在另一项研究中，在感染慢病毒进行基因转导时加入5μg/ml的polybrene使得表达目的基因的T细胞数目相比没有促感染试剂增加了大约2倍(Gene transfer into stimulated and unstimulated T lymphocytes by HIV-1-derived lentiviral vectors)。
Poloxamer 407是一种亲水性非离子表面活性剂，它一种三嵌段共聚物，由聚丙二醇的中心疏水性嵌段与两个聚乙二醇(PEG)亲水性嵌段相接组成。它最初被证明可以提高腺病毒介导的基因转导效率。其在CD34+人细胞中可以显著提高慢病毒的基因转导效率，还有研究表明，在原代人内皮细胞(endothelial cells,ECs)和原代人平滑肌细胞(smoothmuscle cells,SMCs)中，低剂量慢病毒的基因转导水平随着表面活性剂poloxamer407的加入而进一步增强，但是并未有CD8+ T细胞中基因转导效率提高的相关报道。
Retronectin试剂是一种由三个功能结构域组成的重组人纤维蛋白片段(rFN-CH-296)，三个结构域分别是细胞连接结构域(C-domain,CBD),肝素连接结构域(H-domain)以及CS-1序列。retronectin的肝素连接结构域与病毒粒子相互作用结合，试剂表面的细胞连接结构域和CS-1序列则通过细胞表面整联蛋白受体VLA-5和VLA-4与靶细胞相互作用而结合。这种试剂已经证实可以显著提高慢病毒介导的基因转导，特别是在表达VLA-4或VLA-5的细胞中。我们构建的TCR-T细胞来源于CD8+的T细胞，细胞表面表达VLA-4(Very LateAntigen-4)整合素的α4β1片段。并且已经有研究报道retronectin同时可以显著促进CD8+T细胞的增殖，retronectin比起polybrene和鱼精蛋白低毒，所以这种试剂也有希望可以提高慢病毒载体构建TCR-T细胞的效率。
临床前科研级慢病毒制备中没有去除包装错误、没有活性的慢病毒颗粒，因此用于直接感染原代细胞效率较低，受细胞状态影响较大，批次差异大(感染细胞系效率可达到80％～100％，原代细胞效率为5～30％)，目前常用的促感染试剂如Polybrene,protamine促进慢病毒感染原代T细胞效果不明显。因此有必要筛选新的有效的促感染试剂，用于慢病毒改造的T细胞治疗的临床前研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中常用的促感染试剂如Polybrene,protamine,促进慢病毒感染原代T细胞效果不明显的缺陷，提供一种慢病毒感染T细胞的方法以及dm PGE2作为促感染试剂在慢病毒感染T细胞中的应用。本发明所述的方法能显著提高慢病毒感染原代T细胞的效率以及慢病毒载体基因的转导效率，与不加促感染试剂或常规促感染试剂相比，使用本申请的方法感染效率可提高3～4倍。且在保证对T细胞的分化表型没有影响的情况下增强了T细胞的杀伤功能。
本发明第一方面提供一种慢病毒感染T细胞的方法，所述方法包括在感染体系中加入促感染试剂后培养；所述促感染试剂为dm PGE2；所述促感染试剂在所述感染体系中的终浓度为10μM～20μM。
所述T细胞较佳为CD8+ T细胞。
所述培养较佳地包括以下步骤：在37℃、5％CO2的培养箱中培养10～15h；然后弃去上清液，加入所述上清液的体积的2倍的培养基培养10～15h，所述培养基为含有2％FBS、10ng/mL IL-2、IL-7以及IL-15的淋巴细胞培养基，如T009培养基。
进一步地，在本发明一较佳实施例中，所述慢病毒的制备方法包括如下步骤：
(1)在500μl的Opti-MEM溶液中按照4:3:2的质量比例加入包装质粒、包膜质粒和转导质粒，另取500μl Opti-MEM溶液并加入所述包膜质粒9倍质量的聚乙烯亚胺；
(2)将步骤(1)中两种Opti-MEM溶液混匀后在室温孵育20～30min，然后加入含有293T细胞的培养基，所述培养基为含有10％FBS的DMEM培养基；
(3)培养48h后离心收集慢病毒液。
更佳地，所述包装质粒为psPAX2，所述包膜质粒为pMD2.G；
所述转导质粒的制备包括将TCR基因克隆到pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE慢病毒转导质粒。
本发明第二方面提供dm PGE2作为促感染试剂在慢病毒感染T细胞中的应用。
本发明中所述dm PGE2在感染体系中的终浓度较佳地为10μM～20μM。
所述T细胞较佳地为CD8+ T细胞。
本发明第三方面提供dm PGE2在制备用于慢病毒感染T细胞的促感染剂中的应用。
本发明的积极进步效果在于：
筛选出一种安全有效的慢病毒促感染试剂及其最适浓度用于提高TCR的表达效率，dm PGE2(10～20μM)可以用于促进慢病毒感染CD8+ T细胞，与常用的促感染试剂polybrene相比，可以显著提高慢病毒载体基因转导效率，增强T细胞的杀伤功能，而对于T细胞的分化表型没有影响。
附图说明
图1为不同浓度的促感染试剂作用下GFP表达效率比较的示意图。
图2为不同浓度的促感染试剂作用下活细胞数比较的示意图。
图3为不同浓度的促感染试剂作用下GFP阳性细胞数比较的示意图。
图4为不同的促感染试剂作用下5T-4 TCR表达的示意图。
图5为不同的促感染试剂作用下5T-4 TCR-T的表型检测的示意图。
图6为不同的促感染试剂作用下5T-4 TCR-T的表型统计(健康志愿者1)。
图7为不同的促感染试剂作用下5T-4 TCR-T的表型统计(健康志愿者2)
图8为不同的促感染试剂作用下5T-4 TCR-T的杀伤功能检测的示意图。
图9为不同的促感染试剂作用下5T-4 TCR-T的杀伤比例统计。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1：TCR过表达慢病毒的包装与收集
本发明将TCR基因(其α可变区和β可变区的序列分别如SEQ ID NO:1和2所示)克隆到pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE慢病毒转导质粒载体(购自Addgene)的BamHI,EcoRI酶切位点之间，用TCR基因替换载体中的EGFP基因，此慢病毒转导质粒载体命名为5T-4 PGK。慢病毒包装采用293T细胞系(来自ATCC)。转染前一天传代，第二天汇合度达到约70％时进行转染。首先更换293T细胞的培养基，小心地吸去旧培养基，再加入适量新鲜预热的含10％FBS的DMEM(Gibco)培养基。然后在离心管中按照4:3:2的质量比例在500μl的Opti-MEM溶液中加入三种质粒：5T-4 PGK转导质粒，PsPAX2和pMD2.G(购自Addgene)，其中pMD2.G为表达慢病毒的膜蛋白质粒，psPAX2为表达慢病毒外壳的质粒。另取一个离心管加500μl Opti-MEM溶液，并在其中加入质量为质粒3倍的聚乙烯亚胺(Polyethylenimine，PEI)，将两种Opti-MEM溶液充分混匀，室温孵育20min。轻柔加入含10％FBS的DMEM培养基中，左右摇匀。
48小时收集第一批病毒，取培养基上清2000RPM，10min离心后通过0.45μM滤膜，64小时收集的病毒液同样处理，将过滤后的病毒上清使用Beckman超速离心机离心、Type 45Ti转子、35000RPM、4℃离心90min。
离心后去除上清，200μl无血清T009培养基重悬，混匀分装，-80℃保存。
将5T-4 PGK转导质粒替换为原始的pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE转导质粒，用同样的方法包装GFP病毒。由于GFP病毒包装效率较高，可以省去超速离心浓缩的步骤。
实施例2：不同促感染试剂促进慢病毒感染CD8+ T细胞的最适浓度
收集10ml HLA-A*0201分型的健康人外周血(来自于HLA-A*0201分型的健康志愿者)，用Ficoll密度梯度离心方法，得到外周血单个核细胞(peripheral bloodmononuclear cell,PBMC)。从分离得到的PBMC中，使用抗CD8抗体包被的磁珠(Miltenyi)分选得到CD8+ T细胞。磁珠分选的CD8+ T细胞在2％FBS的HIPP-T009培养基(上海倍谙基)中静息2天，换成含2％FBS、10ng/mL IL-2，IL-7及IL-15的T009培养基后每1×106个细胞加入10μl Transact试剂(Miltenyi)激活48小时。
提前一天准备96孔平底板(tissue culture treated)，按照实验测试条件的组数，每组三孔重复，每孔加入100μl GFP慢病毒液后再加入100μl 1×106个/ml CD8+ T细胞。在不同实验孔中分别加入不同终浓度的促感染试剂，测试的促感染试剂终度及种类包括：4、8、16、32μg/ml protamine(Sigma)；10μM和20μM dm PGE2(Sigma)；50、100、200、400μg/mlpoloxamer 407(Sigma)；3、6、12μg/ml polybrene(Sigma)；5、10、20、40μM PGE2(Sigma)。另外设置不加促感染试剂的对照组。将促感染试剂，细胞，病毒液在孔中，混匀后800g离心30min，离心后再次将细胞和培养基混匀，放置于二氧化碳培养箱，37℃、5％CO2过夜培养。第二天弃去120μl上清液，加入上清体积两倍的含2％FBS、10ng/mL IL-2，IL-7及IL-15的T009培养基，第三天将细胞转到48孔板中培养。感染后第5天对各组细胞计数，并用流式细胞仪检测GFP表达比例。
图3中GFP阳性细胞数目为图1中GFP阳性比例乘以图2中活细胞数目。结果如图1-3所示，poloxamer 407随着药物浓度的增加，虽然GFP阳性率有一定的提升，但是细胞增殖毒性大大增加，结合促感染效率和细胞毒性，最适浓度为50ug/mL；polybrene的趋势和poloxamer 407类似，低浓度获得的阳性细胞数相反最多，结合促感染效率和细胞毒性，最适浓度为3-6ug/mL。protamine也有着类似的趋势，但是前三个浓度梯度阳性细胞数的递减幅度小于poloxamer 407和polybrene，在32μg/ml的浓度下显示出显著的细胞增殖毒性(活率平均值为76％，细胞毒性不显著)，结合促感染效率和细胞毒性，最适浓度为4～8ug/mL。PGE2和dmPGE2的浓度从低到高对于感染效率影响不大，并且在高浓度下没有表现出细胞毒性，反而有一定的促进细胞增殖的作用。PGE2组感染效率没有明显的提升，但是dmPGE2组阳性细胞数与对照组相比有显著的增加。
综上所述，10～20μM的dm PGE2是最佳的慢病毒感染CD8+ T细胞促感染试剂，可以最大程度上提高慢病毒基因转导效率，4～8μg/ml的protamine，3～6μg/mLμl的polybrene可以作为选择和dm PGE2进行药物组合。
实施例3：不同促感染试剂促进TCR慢病毒载体感染CD8+ T细胞的效果比较
磁珠分选的CD8+ T细胞在2％FBS的HIPP-T009培养基(上海倍谙基)中静息2天，换成含2％FBS、10ng/mL IL-2，IL-7及IL-15的T009培养基后每1×106个细胞加入10μlTransact试剂(Miltenyi)激活48小时。取96孔平底板(tissue culture treated)，按照实验测试条件的组数，每组三孔重复，每孔加入30μl实施例1中制备的5T-4 PGK慢病毒液后再加入100μl 1×106个/ml的CD8+ T细胞。不同实验孔中分别加入8μg/ml protamine；10μM dmPGE2；100μg/ml poloxamer 407；6μg/ml polybrene；10μM PGE2。另外设置不加促感染试剂的对照组。将促感染试剂、细胞、病毒液在孔中混匀后800g离心30min，离心后再次混匀，放置于二氧化碳培养箱，37℃、5％CO2过夜培养，第二天弃去120μl上清液，加入上清液体积2倍的含2％FBS、10ng/mL IL-2、IL-7及IL-15的T009培养基，第三天转孔到48孔板中培养，第五天进行MART-1四聚体染色及流式检测。
四聚体的合成步骤为稀释Mart-1多肽储存溶液(金斯瑞)到400μM，每个反应为20μl稀释的多肽和20μM单体(Flex-TTM monomer，BioLegend,200μg/ml)，将两者加入到96孔U底板后混匀。孵育板子，3300g 2min 4℃离心，去除密封后置于冰上紫外线(365nm)照射30min，且紫外灯管距离样品2-5cm。再次密封板子，37℃温箱黑暗中孵育30min。将反应后的置换肽单体取出到一个新的1.5ml离心管中，每10μl加入1.1μl APC/PE荧光偶联的共轭链霉亲和素(荧光偶联的链霉亲和素(BioLegend)，对于其他品牌荧光偶联的链霉亲和素，需确保单体与链霉亲和素的摩尔比为6:1)，离心管上下颠倒混匀或用移液枪吹打混匀，冰上黑暗孵育30min，将终止液(1.6μl50mM的D-Biotin和6μl的10％(w/v)NaN3加到192.4μl的PBS中)按每10μl加入0.8μl加入，上下颠倒或用移液枪吹打混匀停止反应。密封板子，冰上黑暗孵育30min即得到Mart-1tetramer抗体。
取出用于流式检测的细胞数5×105/管，加入制备的MART-1四聚体(0.5μl/5×105细胞)，混匀并4℃反应30min；反应时间结束后，加入3ml PBSA(含0.5％FBS的PBS)重悬，400g、5min离心，小心弃去上清，200μl PBSA重悬，置于冰上用于流式检测。
结果如图4所示，在携带TCR序列的慢病毒感染CD8+ T细胞时，10μM的dm PGE2相比其他促感染试剂能够有效提高慢病毒感染效率和基因转导效率。
实施例4：促感染试剂dmPGE2对于T细胞分化表型没有影响
T细胞的分化阶段与T细胞的功能状态密切相关。根据细胞表面特征分子的表达，可以表征T细胞的分化表型，主要包括原初T细胞(CCR7+CD45RO-)，终末分化的效应T细胞(CCR7-CD45RO-)及记忆T细胞。记忆T细胞又包括三类，中枢性记忆T细胞(CCR7+CD45RO+)，效应性记忆T细胞型(CCR7-CD45RO+)及组织特异性T细胞(存在于特定组织中)。还有一类具有干细胞特征的T细胞，干细胞记忆性T细胞(CCR7+CD45RO-CD95+)在外周血T细胞中占比约2-3％，具有类似干细胞的很强的自我更新能力，被认为是在合适刺激条件下分化为其它T细胞表型的储备力量。在细胞治疗中，有较高的记忆性T细胞比例，有助于T细胞在体内持久发挥作用。因此，我们检测了在用dmPGE2或Polybrene促感染试剂制备的TCR-T的分化表型，并与不使用促感染试剂做比较。
首先用实施例3中的流程得到使用不同促感染试剂(20μM dmPGE2或6μg/mLPolybrene)及不使用促感染试剂制备的TCR-T细胞。感染4-6天后用荧光偶联的抗CCR7、CD45RO抗体染色，流式检测。
如图5所示，用表面特征分子染色可以区分T细胞不同的分化表型，将四种表型进行统计，如图6中数据显示，两种促感染试剂制备的TCR-T细胞表型类似，并且与不加促感染试剂的TCR-T细胞也类似。其中，TEFF代表终末分化的效应T细胞，TEM代表效应性记忆T细胞，TCM代表中枢性记忆T细胞，TN代表原初T细胞。
图7为用另一名健康志愿者PBMC来源的T细胞制备的TCR-T，在两种促感染试剂作用下的表型统计。同样数据显示，两种促感染试剂或不用促感染试剂制备的TCR-T细胞表型基本一致。结果表明，虽然不同志愿者来源的T细胞制备的TCR-T表型组成有区别，但是我们测试的促感染试剂对于制备的TCR-T细胞表型没有影响。
实施例5促感染试剂dmPGE2制备的TCR-T杀伤功能较强
T细胞对于肿瘤细胞的杀伤能力是细胞治疗中最重要的一个功能指标。为了检测促感染试剂是否对于TCR-T的杀伤功能产生影响，我们检测了两种促感染试剂制备的TCR-T细胞对于过表达MART-1抗原的靶细胞(Mel526-MART-1-GFP，北纳创科)的细胞毒性。
具体实验流程为：
靶细胞(Mel526-MART-1-GFP)计数，用2％牛血清T009培养基(倍谙基)重悬调整浓度至2×105/mL浓度。取分别用两种促感染试剂制备的TCR-T效应细胞及未感染的T细胞对照，同样调整浓度至4×106/mL。将效应细胞50μl/孔加到96孔板中后，加入靶细胞悬液50μl/孔，充分混匀。同时设置不加效应细胞的单独靶细胞组，每组三孔重复。将孔板放入37℃、5％的CO2孵箱孵育6h。
流式分析：孵育结束后，将上清吸出，再用适量胰酶消化板底贴壁的靶细胞，用含血清的培养基中和后置于冰上。流式上样前按1:20稀释比例加入1mg/mL PI染料，充分吹散混匀后立即进行流式上样分析，在FITC及PE-TexasRed通道中收集荧光信号。
流式细胞仪分析检测结果如图8所示，FITC阳性PI阴性的群体(Q3)为剩余的活的靶细胞。以未感染T细胞与靶细胞共孵育组为基准，对dmPGE2TCR-T组及polybrene TCR-T组的杀伤比例进行了统计及比较：
如图9所示，dmPGE2制备的TCR-T细胞对于靶细胞的杀伤效率显著高于polybrene组。综上结果显示dmPGE2是一种有效安全的慢病毒促感染试剂，能够显著提高慢病毒感染原代T细胞的效率，增强T细胞的杀伤功能，而对于T细胞的分化表型没有影响。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳华大临床检验中心
<120> 一种提高慢病毒感染效率的方法
<130> P20016140C
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 393
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TCR-β可变区
<400> 1
atgagaatca ggctcctgtg ctgtgtggcc ttttctctcc tgtgggcagg tccagtgatt 60
gctgggatca cccaggcacc aacatctcag atcctggcag caggacggcg catgacactg 120
agatgtaccc aggatatgag acataatgcc atgtactggt atagacaaga tctaggactg 180
gggctaaggc tcatccatta ttcaaatact gcaggtacca ctggcaaagg agaagtccct 240
gatggttata gtgtctccag agcaaacaca gatgatttcc ccctcacgtt ggcgtctgct 300
gtaccctctc agacatctgt gtacttctgt gccagcagcc taagtttcgg cactgaagct 360
ttctttggac aaggcaccag actcacagtt gta 393
<210> 2
<211> 399
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TCR-α可变区
<400> 2
atgatgaaat ccttgagagt tttactagtg atcctgtggc ttcagttgag ctgggtttgg 60
agccaacaga aggaggtgga gcagaattct ggacccctca gtgttccaga gggagccatt 120
gcctctctca actgcactta cagtgaccga ggttcccagt ccttcttctg gtacagacaa 180
tattctggga aaagccctga gttgataatg ttcatatact ccaatggtga caaagaagat 240
ggaaggttta cagcacagct caataaagcc agccagtatg tttctctgct catcagagac 300
tcccagccca gtgattcagc cacctacctc tgtgccgtga acttcggagg aggaaagctt 360
atcttcggac agggaacgga gttatctgtg aaacccaat 399
Claims (9)
1.一种慢病毒感染T细胞的方法，其特征在于，所述方法包括在感染体系中加入促感染试剂后培养；所述促感染试剂为dm PGE2；所述促感染试剂在所述感染体系中的终浓度为10μM～20μM。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述T细胞为CD8+T细胞。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养包括以下步骤：在37℃、5％CO2的培养箱中培养10～15h；然后弃去上清液，加入所述上清液的体积的2倍的培养基培养10～15h，所述培养基为含有2％FBS、10ng/mL IL-2、IL-7以及IL-15的淋巴细胞培养基。
4.如权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述慢病毒的制备方法包括如下步骤：
(1)在500μl的Opti-MEM溶液中按照4:3:2的质量比例加入包装质粒、包膜质粒和转导质粒，另取500μl Opti-MEM溶液并加入所述包膜质粒9倍质量的聚乙烯亚胺；
(2)将步骤(1)中两种Opti-MEM溶液混匀后在室温孵育20～30min，然后加入含有293T细胞的培养基，所述培养基为含有10％FBS的DMEM培养基；
(3)培养48h后离心收集慢病毒液。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述包装质粒为psPAX2，所述包膜质粒为pMD2.G；
所述转导质粒的制备包括将TCR基因克隆到pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE慢病毒转导质粒。
6.dm PGE2作为促感染试剂在慢病毒感染T细胞中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述dm PGE2在感染体系中的终浓度为10μM～20μM。
8.如权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述T细胞为CD8+T细胞。
9.dm PGE2在制备用于慢病毒感染T细胞的促感染剂中的应用。
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2021
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