CN114761422A - 白细胞介素-22的治疗性衍生物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及白细胞介素‑22(IL‑22)的新型衍生物,尤其是包含共价连接至IL‑22蛋白的脂肪酸的衍生物及其在疗法中的用途。

Description

白细胞介素-22的治疗性衍生物
发明领域
本发明涉及白细胞介素-22(IL-22)的新型衍生物,且尤其涉及包含共价连接至IL-22蛋白的脂肪酸的衍生物。本发明还涵盖了其产生方法及其在疗法中的用途,包括治疗、预防以及改善代谢、肝脏、肺部、肠道、肾脏及皮肤疾病、病症和疾患。
发明背景
IL-22是一种146个氨基酸的蛋白质,分子量为17KDa。其属于细胞因子的IL-10家族并且选择性活化异二聚受体,所述异二聚受体由广泛表达的IL-10受体B亚基(IL-10RA2)和具有上皮限制表达的IL-22受体A亚基(IL-22RA1)组成。其为独特的细胞因子,因为其虽然是从免疫细胞释放,但会选择性地靶向上皮细胞。因此,由IL-22诱导的信号传导途径可能在不同组织(靶标包括皮肤、肠、肺、肝脏、肾脏、胰腺及胸腺)中具有相关性,但IL-22以上皮特异性方式将其活化。可溶性结合蛋白IL-22BP中和IL-22并因此调节其作用。
IL-22是作为对反映化学或机械损伤的信号的响应而释放,例如响应于环境毒素或色氨酸中间物而活化芳香烃受体,以及响应于来自垂死细胞或入侵病原体的蛋白质、片段及碎片而活化模式识别受体,诸如toll样受体4。IL-22的释放受到某些细胞因子的进一步刺激,特别是IL-23和较小程度的IL-1β。因此,IL-22也作为对反映病原体感染和免疫活化的线索的响应而分泌。
IL-22的作用是多种活动/途径的协调参与的结果。IL-22在损伤时作用于上皮屏障组织和器官以保护细胞并维持屏障功能(例如通过激活抗凋亡基因程序)。其还加速修复(例如,通过诱导成熟细胞的增殖和干细胞的活化),预防纤维化(例如,通过减少上皮间质转化、拮抗NLRP3炎性体以及诱导肝星状细胞衰老),以及控制炎症(例如,通过诱导抗微生物肽和趋化性信号)。已报道IL-22能够治疗一系列医学疾患,包括通常在糖尿病或超重哺乳动物中观察到的疾患,如高血糖症(hyperglycemia)、高脂血症(hyperlipidemia)及高胰岛素血症(hyperinsulinemia)。
然而,IL-22通常通过肾脏从体内快速清除,这限制了其在临床实践中的使用。因此,用于延长循环IL-22的半衰期的已知方法力图人为地将IL-22的尺寸增加到70kDa以上,以避免肾脏清除。将IL-22连接至Fc抗体片段是目前实现这种效果的最佳解决方案;Genentech和Generon Shanghai都拥有在临床开发中的长效IL-22-Fc融合物。用聚乙二醇修饰IL-22(聚乙二醇化)是另一种已知的避免肾脏清除的方式。
然而,这些现有的解决方案并非没有缺点。现有数据表明PEG本身具有免疫原性,并且在具有聚乙二醇化生物制品的细胞中观察到含有PEG的液泡。降低的活性和异质性也是聚乙二醇化的不利方面。尽管Fc融合技术众所周知,但添加Fc抗体片段代表了IL-22结构的重大变化,这会影响其除半衰期延长之外的特性。随着Fc融合物将蛋白质的尺寸从大约17kDa增加到大约85kDa,如扩散速率、分布和受体参与动力学等特性可能会受到影响。例如,一些Fc融合物吸收缓慢和/或太大而无法通过某些途径施用。Genentech和Generon还报道了中度和可逆的皮肤反应作为IL-22-Fc融合物的剂量限制性不良作用。此外,效力可能会受到大融合配偶体引起的空间位阻的影响。
因此,本领域仍需要新的IL-22生物相容性调节剂,其与天然分子相比可提高循环半衰期并显示出优化的药代动力学和药效学特性。理想地,其应该保持天然分子的效力和其他特性,并且还应该避免已知衍生物所展示的毒性、免疫原性和任何其他不良反应。
发明内容
在第一方面,提供一种IL-22的衍生物,其包含共价连接至IL-22蛋白的脂肪酸。
在本发明的实施方案中,脂肪酸通过接头共价连接至IL-22蛋白。
脂肪酸可具有式I:
HOOC-(CH2)x-CO-*,
其中x是在10至18、任选12至18、14至16或16至18范围内的整数,并且*表示与IL-22蛋白或接头的连接点。其可以是脂肪二酸,例如C12、C14、C16、C18或C20二酸。有利地,脂肪酸是C16或C18二酸,并且最有利地是C18二酸。
IL-22蛋白可以是天然成熟的人IL-22(下文称为“hIL-22”)或其变体。该变体可以是hIL-22的取代形式,任选地在位置1、21、35、64、113和/或114处被取代。其可以包含选自由以下组成的组的hIL-22的取代:A1C、A1G、A1H、N21C、N21D、N21Q、N35C、N35D、N35H、N35Q、N64C、N64D、N64Q、N64W、Q113C、Q113R、K114C和K114R。有利地,该变体包含在hIL-22的位置1处的Cys残基。
该变体可以是hIL-22的延伸形式。其可以包含N端肽,例如N端三聚体。有利地,该变体包含N端G-P-G。
接头可以包含一个或多个氨基酸,任选地包括谷氨酸(Glu)和/或赖氨酸(Lys)。接头可以包含氧乙烯甘氨酸单元或多个连接的氧乙烯甘氨酸单元,任选地2至5个此类单元,有利地2个单元。接头可以包含一个或多个寡(乙二醇)(OEG)残基。其可以包含乙二胺(C2DA)基团和/或乙酰胺(Ac)基团。有利地,接头包含所有上述元件的组合。确切地说,接头可以是γGlu-OEG-OEG-C2DA-Ac、γGlu-γGlu-γGlu-γGlu-OEG-OEG-εLys-αAc或γGlu-OEG-OEG-εLys-αA。
接头可以是连接至hIL-22或其变体中的Cys残基的Cys反应性接头。其可以连接在hIL-22或其变体的位置-7、-5、1、6、33、113、114或153(其中位置-7、-5等如本文所定义)。例如,接头可以连接至hIL-22的位置1、6、33、113或114处取代的Cys残基。其可以连接至相对于hIL-22的-位置5、-7或153处的Cys残基。有利地,接头连接至hIL-22的位置1处取代的Cys残基。
在一个实施方案中,该衍生物包含通过接头共价连接至hIL-22变体的C14、C16、C18或C20二酸,其中该变体包含N端G-P-G和hIL-22的位置1处的Cys残基,并且接头任选地连接至所述Cys残基。本发明的示例性衍生物是在本文中鉴定为衍生物1至10的衍生物。
在第二方面,提供一种用于制备第一方面的衍生物的方法,其包括使脂肪酸共价连接至IL-22蛋白。
在第三方面,提供一种药物组合物,其包含第一方面的衍生物和药学上可接受的媒介物。
在第四方面,提供第一方面的衍生物或第三方面的药物组合物,其用于疗法中。
在第五方面,提供第一方面的衍生物或第三方面的药物组合物,其用于治疗代谢、肝脏、肺部、肠道、肾脏或皮肤疾病、病症或疾患的方法中。
代谢疾病、病症或疾患可以是肥胖、1型糖尿病、2型糖尿病、高脂血症、高血糖症或高胰岛素血症。
肝脏疾病、病症或疾患可以是非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化、酒精性肝炎、急性肝衰竭、慢性肝衰竭、慢加急性肝衰竭(ACLF)、急性肝损伤、对乙酰氨基酚诱导的肝毒性、硬化性胆管炎、胆汁性肝硬化或由手术或移植引起的病理疾患。
肺部疾病、病症或疾患可以是慢性阻塞性肺病(COPD)、囊性纤维化、支气管扩张、特发性肺纤维化、急性呼吸窘迫综合征、化学损伤、病毒感染、细菌感染或真菌感染。
肠道疾病、病症或疾患可以是炎症性肠病(IBD)、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病(Crohn’s disease)、移植物抗宿主病(GvHD)、化学损伤、病毒感染或细菌感染。
肾脏疾病、病症或疾患可以是急性肾病或慢性肾病。
皮肤疾病、病症或疾患可以是伤口、炎性疾病或GvHD。
附图简述
图1图示了(A)C18二酸、(B)C16二酸和(C)C14二酸,其各自连接至包含Cys反应性单元的接头。将脂肪酸和接头的这些组合用于在本文中鉴定为衍生物1至10的本发明的衍生物中。
图2图示了在本文中鉴定为衍生物1的本发明的衍生物的结构。
图3图示了在本文中鉴定为衍生物6的本发明的衍生物的结构。
图4图示了在本文中鉴定为衍生物10本发明的衍生物的结构。
图5图示了在糖尿病小鼠模型中进行的一项为期8天的研究中,每日给药hIL-22和仅具有骨架变异的比较性IL-22变体(在本文中鉴定为比较物3)对血糖的影响(平均值±SEM)。
图6图示了在糖尿病小鼠模型中进行的一项为期16天的研究中,与IL-22-Fc融合物(特别是人Fc与hIL-22N端融合,在下文称为“hFc-hIL-22”)相比,每日给药本发明的衍生物(在本文中鉴定为衍生物1)对(A)血糖和(B)食物摄入的影响(平均值±SEM;使用非配对t检验,*表示p<0.05)。
图7A至图7C图示了在糖尿病小鼠模型中进行的一项为期16天的研究中,每日给药衍生物1和hFc-hIL-22对三种不同的靶标参与生物标志物的影响(平均值±SEM;使用非配对t检验,***表示(A)p<0.0002,(B)p<0.0003或(C)p<0.0026)。
图8图示了在糖尿病小鼠模型中进行的一项为期13天的研究中,与衍生物1和hFc-hIL-22相比,每日给药本发明的衍生物(在本文中鉴定为衍生物6)(三种不同剂量)对血糖的剂量-反应曲线(平均值±SEM)。
图9A和图9B图示了衍生物1和6在对乙酰氨基酚(APAP)诱导的肝损伤小鼠模型中预防肝损伤的作用,这由两种不同肝酶的血浆水平所证明。使用Dunnett检验单因素线性模型,与媒介物+APAP相比,*表示p<0.05,并且**表示p<0.01。
图10图示了衍生物1和6在APAP诱导的肝损伤小鼠模型中(A)在预防细胞凋亡方面和(B)对细胞增殖的作用。NS表示不显著。
图11图示了在博来霉素(bleomycin)诱导的肺损伤大鼠模型中,衍生物6与泼尼松龙(prednisolone)相比在预防和/或减少(A)肺部炎症以及(B)和(C)肺纤维化方面的作用。
图12图示了衍生物6在葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎小鼠模型中预防结肠炎症的作用。****表示与媒介物(含有DSS)相比,p<0.0001。
图13图示了在DSS诱导的结肠炎小鼠模型中,衍生物6与hFc-hIL-22相比在预防粘膜上皮损伤方面的作用。放大4倍,比例尺=500μm。
图14图示了在DSS诱导的结肠炎小鼠模型中的血浆再生胰岛衍生蛋白3γ(Reg3g)水平,其作为靶标参与的量度(Reg3g是IL-22的靶标参与标志物)。
图15A和图15B图示了衍生物1在伴刀豆球蛋白A(Concanavalin A;ConA)诱导的肝损伤小鼠模型中在预防肝损伤方面的作用,这由两种不同肝脏酶的血清水平所证明。
图16图示了与hFc-hIL-22和已知的脂肪酸缀合的GLP-1衍生物索马鲁肽(semaglutide)相比,衍生物6对饮食诱导的肥胖小鼠体重的影响。
具体实施方式
在下文中,希腊字母由符号而不是书面名称来表示。例如,α=alpha,ε=epsilon,γ=gamma和μ=mu。氨基酸残基可以由其全名、三字母代码或一字母代码来鉴定,其全部都是完全等效的。
如本文所用,术语“IL-22的衍生物”是指具有共价连接的脂肪酸的IL-22蛋白。该术语包括其中脂肪酸直接共价连接至IL-22蛋白的衍生物和其中通过接头共价连接的那些衍生物。
脂肪酸的共价连接是一种经过验证的延长肽和蛋白质半衰期的技术,并且是一种从肽或蛋白质中对向脂肪酸的方式。这是从用于1型和2型糖尿病的上市产品中得知的,例如胰岛素
Figure BDA0003630325010000071
(地特胰岛素(detemir))和
Figure BDA0003630325010000072
(德古胰岛素(degludec)),以及胰高血糖素样肽-1(GLP-1)衍生物
Figure BDA0003630325010000073
(利拉糖肽(liraglutide))和
Figure BDA0003630325010000074
(索马鲁肽)。
脂肪酸连接使得其能够与白蛋白结合,从而防止肾脏排泄并提供一些位阻保护以防止蛋白水解。有利的是,与Fc融合或聚乙二醇化相比,其对IL-22提供了最小的修饰。在此方面,尽管Fc融合及聚乙二醇化旨在增加IL-22的尺寸超出肾脏清除的阈值,但包含共价连接至IL-22蛋白的脂肪酸的衍生物保持与IL-22蛋白的尺寸类似的小尺寸。因此,由于脂肪酸连接是最小的修饰,因此认为所得衍生物保持与天然相似的特性,包含分布、扩散速率和受体参与(结合、活化和运输),并将免疫原性风险降至最低。
如上所述,已证明脂肪酸连接在胰岛素和GLP-1衍生物中对糖尿病的治疗效果。然而,就其尺寸、序列和生物学特性来说,IL-22是一种非常不同的蛋白质。因此,对于发明人来说,脂肪酸可以共价连接至IL-22同时保持治疗效果是违反直觉的。尤其令人惊讶的是,对IL-22的这种最小修饰可能导致高效力(接近hIL-22)以及极长循环半衰期。
因此,在第一方面,本发明涉及IL-22的衍生物,其包含共价连接至IL-22蛋白的脂肪酸。脂肪酸可以直接或通过接头共价连接至IL-22蛋白,该接头本身可以设计为具有各种亚基。如本文所用,术语“IL-22蛋白”可以指天然IL-22蛋白,例如hIL-22或其变体。如本文进一步定义,“变体”可以是具有与天然蛋白质相似的氨基酸序列的蛋白质。
在自然界中,人IL-22蛋白被合成为具有33个胺基酸的信号肽以供分泌。成熟的人IL-22蛋白(即hIL-22)长146个氨基酸,并且与鼠类IL-22(后者长147个氨基酸)具有80.8%的序列同一性。hIL-22的氨基酸序列在本文中被鉴定为SEQ ID NO.1。与其他IL-10家族成员一样,IL-22结构含有六个α-螺旋(称为螺旋A至F)。
本发明的衍生物因此可以具有hIL-22的天然氨基酸序列。或者,其可以具有在天然序列内的一个或多个氨基酸序列变异。其可以额外地或替代地包含相对于天然序列(即,在天然序列外部)的一种或多种氨基酸序列变异。因此,在一个实施方案中,该衍生物包含共价连接至hIL-22或其变体的脂肪酸。
在本文中使用诸如“在……内”、“相对于”、“对应于”和“等同于”等表达,以通过参考天然蛋白质(例如hIL-22)的序列来表征在IL-22蛋白中脂肪酸的变化和/或共价连接位点。在SEQ ID NO.1中,hIL-22的第一个氨基酸残基(丙氨酸(Ala))被指定为位置1。
因此,hIL-22序列内的变异是SEQ ID NO.1中残基编号1-146中的任一个的变异。例如,在hIL-22中残基10处的Glu取代天然Asp在本文中表示为“D10E”。如果衍生物还具有在位置10处共价连接的脂肪酸,那么其在本文中称为残基“10E”处的连接。
然而,相对于hIL-22的序列的变异是SEQ ID NO.1中残基编号1-146之外的变异。例如,本文定义的衍生物2包含长度为15个氨基酸的N端肽。N端肽中的残基从与hIL-22中的残基1连接的残基开始编号为负数,即与hIL-22中的残基1连接的N端肽中的第一个残基表示为“-1”。因此,由于衍生物2在从位置-1开始的N端肽的第7残基处具有共价连接的脂肪酸,这是Cys,因此衍生物2的共价连接位点在本文中称为“-7C”。然而,根据WIPO标准ST.25,衍生物2的序列表中使用的编号自然从1开始;因此,衍生物2的序列表中的位置1实际上是如本文所指的残基-7。
可以在天然序列内进行两种、三种、四种、五种或更多种变异以形成本发明的衍生物。例如,在这方面可以进行超过10种、15种、20种、25种、50种、75种、100种或甚至超过125种变异。天然序列中的残基1-146中的任一个都可以变异。用于变异的示例性残基是hIL-22中的残基1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、24、25、26、27、29、30、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、44、45、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、58、59、61、62、63、64、65、67、68、69、70、71、72、73、74、75、77、78、79、82、83、84、86、88、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、126、127、128、129、130、132、133、134、135、137、138、139、141、143、144、145和/或146。残基1、21、35、64、113和/或114处的变异是特别有利的。
天然序列内的变异通常是氨基酸取代。如本文所用,术语“取代”可以意指天然蛋白质中的氨基酸被另一氨基酸置换。所述取代可以是保守的或非保守的替代。示例性取代是A1C、A1G、A1H、P2C、P2H、I3C、I3H、I3V、S4H、S4N、S5H、S5T、H6C、H6R、C7G、R8G、R8K、L9S、D10E、D10S、K11C、K11G、K11V、S12C、N13C、N13G、F14S、Q15C、Q15E、Q16V、P17L、Y18F、I19Q、T20V、N21C、N21D、N21Q、R22S、F24H、M25E、M25L、L26S、A27L、E29P、A30Q、L32C、L32R、A33C、A33N、D34F、N35C、N35D、N35H、N35Q、N36Q、T37C、T37I、D38L、V39Q、R40W、L41Q、I42P、E44R、K45A、F47T、H48G、H48R、G49N、V50S、S51C、M52A、M52C、M52L、M52V、S53C、S53K、S53Y、E54D、E54F、R55Q、R55V、C56Q、L58K、M59I、Q61E、V62D、L63C、N64C、N64D、N64Q、N64W、F65G、L67Q、E69D、E69L、V70S、L71C、F72D、F72L、P73C、P73L、Q74T、R77I、F78Q、Q79E、M82Y、Q83G、E84R、V86A、F88N、A90P、A90T、R91C、R91K、R91Y、L92R、S93Y、N94C、N94Q、R95K、R95Q、L96E、S97K、T98C、T98N、T98S、C99V、H100S、E102S、G103D、D104Y、D105Y、L106E、L106Q、H107L、H107N、I108L、Q109Y、R110C、R110K、N111K、V112E、Q113C、Q113R、K114C、K114R、L115V、K116Y、D117E、T118G、V119A、K120H、K121R、L122A、G123V、G126Y、E127C、I128V、K129V、G132Y、E133Q、L134P、D135M、L137D、F138R、M139L、M139R、L141Q、N143S、A144E、C145E、I146R和/或I146V。有利地,取代可选自由以下组成的组:A1C、A1G、A1H、N21C、N21D、N21Q、N35C、N35D、N35H、N35Q、N64C、N64D、N64Q、N64W、Q113C、Q113R、K114C和K114R。令人惊讶的是,本发明中使用的取代不会对IL-22活性产生不利影响。
取代的特定组合包括(i)A1G、N21D、N35D和N64D;(ii)A1G、I3V、S4N、S5T、H6R、R8K、D10E、K11V、T20V、H48R、M52A、S53K、E54D、R55Q、E69D、F72L、A90T、R91K、R95Q、T98S、E102S、L106Q、H107N、R110K、Q113R、K114R、D117E和I146V;(iii)A1G、I3V、S4N、S5T、H6R、R8K、D10E、K11V、T20V、H48R、M52A、S53K、E54D、R55Q、E69D、F72L、A90T、R91K、R95Q、T98S、E102S、L106Q、H107N、R110K、Q113R、K114R、D117E和I146V;(iv)A1G、N35Q和N64Q;(v)A1G和N64C;(vi)A1G和Q113C;(vii)A1G和K114C;(viii)A1G和M25L;(ix)A1G和M52L;(x)A1G和M139L;(xi)A1G和N36Q;(xii)A1G和D117E;(xiii)A1G和N21Q;(xiv)A1G和N35Q;(xv)A1G和N64Q;(xvi)A1G、N21Q和N35Q;(xvii)A1G、N21Q和N64Q;(xviii)A1G、N21Q、N35Q和N64Q;(xix)A1G和K11C;(xx)A1G和N13C;(xxi)N35Q和N64Q;(xxii)A1C、N35Q和N64Q;(xxiii)H6C、N35Q和N64Q;(xxiv)I3C、N35Q和N64Q;(xxv)P2C、N35Q和N64Q;(xxvi)L32C、N35Q和N64Q;(xxvii)N35Q、M52C和N64Q;(xxviii)N13C、N35Q和N64Q;(xxix)N21C、N35Q和N64Q;(xxx)N35Q、N64Q和N94C;(xxxi)N35Q、N64Q和P73C;(xxxii)N35Q、N64Q和Q113C;(xxxiii)N35Q、N64Q和R91C;(xxxiv)N35Q、N64Q和R110C;(xxxv)S12C、N35Q和N64Q;(xxxvi)N35Q、S51C和N64Q;(xxxvii)N35Q、S53C和N64Q;(xxxviii)N35Q、T37C和N64Q;(xxxix)N35Q、N64Q和T98C;(xxxx)Q15C、N35Q和N64Q;(xxxxi)N35C和N64Q;(xxxxii)H6C、N35Q和N64Q;(xxxxiii)A33C、N35Q和N64Q;和(xxxxiv)A1H、P2H、I3H、S4H、S5H、C7G、R8G、L9S、D10S、K11G、N13G、F14S、Q15E、Q16V、P17L、18F、Y19Q、N21Q、R22S、F24H、M25E、L26S、A27L、E29P、A30Q、L32R、A33N、D34F、N35H、T37I、D38L、V39Q、R40W、L41Q、I42P、E44R、K45A、F47T、H48G、G49N、V50S、M52V、S53Y、E54F、R55V、C56Q、L58K、M59I、Q61E、V62D、L63C、N64W、F65G、L67Q、E69L、V70S、L71C、F72D、P73L、Q74T、R77I、F78Q、Q79E、M82Y、Q83G、E84R、V86A、F88N、A90P、R91Y、L92R、S93Y、N94Q、R95K、L96E、S97K、T98N、C99V、H100S、G103D、D104Y、D105Y、L106E、H107L、I108L、Q109Y、R111K、V112E、L115V、K116Y、D117E、T118G、V119A、K120H、K121R、L122A、G123V、G126Y、E127C、I128V、K129V、G132Y、E133Q、L134P、D135M、L137D、F138R、M139R、L141Q、N143S、A144E、C145E和I146R。设想任何和所有的取代组合并且其构成本发明的一部分。
第一方面的衍生物通常可以包含氨基酸取代,由此任选地在以上鉴定的任何位置,例如位置1、2、3、6、11、12、13、15、21、32、33、35、37、51、52、53、63、64、71、73、91、94、98、110、113、114和/或127处,用Cys来取代天然残基。有利地,在第一方面的衍生物中所包含的IL-22蛋白在hIL-22的位置1处包含Cys残基。A1C取代与位置35和64处的两个糖基化位点的取代相组合是特别有利的,因为其会引起更快的吸收,而不会对效力或半衰期产生不利影响(参见实施例1和2中的衍生物6和10)。
或者或另外,天然序列内的变异可以是氨基酸插入。在天然序列中可插入多达5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个或甚至多达50个氨基酸。三聚体、五聚体、七聚体(septamer)、八聚体、九聚体和44聚体在这方面是特别有利的。示例性序列示出在表1中。插入可在天然序列的任何位置进行,但在螺旋A中(例如,残基30处)、环状CD中(例如,残基75处)、螺旋D中(例如,残基85处)和/或螺旋F中(例如,残基124处)的插入是优选的。
Figure BDA0003630325010000121
表1:示例性氨基酸插入序列
相对于hIL-22的氨基酸序列的如果存在的序列变异通常包括延伸,例如在N端添加肽。肽可由多达5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个或甚至多达50个氨基酸组成。单体、三聚体、八聚体、13聚体、15聚体、16聚体、21聚体、28聚体在这方面是特别有利的。示例性序列示出在表2中。合适地,第一方面的衍生物中所包含的IL-22蛋白包含N端G-P-G。在一个特别优选的实施例中,第一方面的衍生物包含在hIL-22(SEQ ID NO.1)的位置1处的Cys残基和N端G-P-G。已发现这会产生具有非常好的半衰期和效力的衍生物(参见实施例1和2中的衍生物1、3和5)。
Figure BDA0003630325010000131
表2:示例性N端肽的序列
相对于hIL-22的氨基酸序列的如果存在的序列变异可以包括在C端添加肽。肽可由多达5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个或甚至多达50个氨基酸组成。七聚体在这方面是特别有利的,其任选地具有氨基酸序列G-S-G-S-G-S-C(SEQ ID NO.15)。
除了如本文所述的天然或变体hIL-22氨基酸序列外,本发明的衍生物可以包含N端肽和C端肽。设想本文所述的N端肽和C端肽的任何组合并且其明确地包含在本发明中。
应理解,本发明扩展至IL-22的任何衍生物,其包含共价连接至hIL-22或其变体的脂肪酸。“变体”可以是与hIL-22具有至少10%序列同一性的蛋白质。在一个实施方案中,该变体与hIL-22具有至少20%或甚至至少30%的序列同一性。该变体可以“基本上”具有hIL-22的“氨基酸序列”,其可以是指与hIL-22的氨基酸序列具有至少40%序列同一性的序列。因此,在一个实施方案中,第一方面的衍生物与hIL-22具有至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或100%的氨基酸序列同一性。并入实验部分中所公开的本发明的特定衍生物中的示例性IL-22蛋白变异体示于SEQ ID NO.16-21中。
熟练的技术人员将理解如何计算两个氨基酸序列之间的同一性百分比。首先要准备两个序列的比对,然后计算序列同一性值。两个序列的同一性百分比可能取不同的值,其取决于:(i)用于比对序列的方法,例如ClustalW、BLAST、FASTA、Smith-Waterman(在不同程序中实施)或来自3D比较的结构比对;(ii)比对方法使用的参数,例如局部与全局比对、使用的对分数矩阵(例如,BLOSUM62、PAM250、Gonnet等)和空位罚分,例如函数形式和常数。
进行比对后,有许多不同的方式来计算两个序列之间的同一性百分比。例如,可以将同一性数除以:(i)最短序列长度;(ii)比对长度;(iii)序列的平均长度;(iv)非空位位置的数量;或(iv)不包括突出端的等效位置的数量。此外,将理解百分比同一性也明显依赖于长度。因此,序列对越短,可能预期偶然发生的序列同一性就越高。
因此,应理解氨基酸序列的准确比对是一个复杂的过程。流行的多重比对程序ClustalW[48,49]是根据本发明产生蛋白质多重比对的优选方式。适用于ClustalW的参数如下:对于蛋白质比对:空位开发罚分(Gap Open Penalty)=10.0,空位延伸罚分(GapExtension Penalty)=0.2,矩阵=Gonnet。对于DNA和蛋白质比对:ENDGAP=-1,且GAPDIST=4。本领域技术人员将意识到,可能需要改变这些和其他参数以进行最佳序列比对。
优选地,两个氨基酸序列之间的同一性百分比计算随后可以根据诸如(N/T)*100的比对来计算,其中N为序列共享相同残基的位置的数量,并且T为包含空位但不包括突出端的相比的位置的总数。因此,用于计算两个序列之间的同一性百分比的最优选方法包括(i)使用ClustalW程序、使用例如如上所述的合适的参数组准备序列比对;(ii)将N和T的值插入以下公式:序列同一性=(N/T)*100。
本领域技术人员将知道用于鉴定相似序列的替代方法。
适当地,第一方面的衍生物包含200个或更少的氨基酸。例如,该衍生物包含少于190个、少于180个、少于170个、少于160个或甚至少于150个氨基酸。适当地,该衍生物将包含至少146个氨基酸,然而,这是hIL-22中的氨基酸的数量。其可以包含至少150个氨基酸、至少160个氨基酸、至少170个氨基酸或甚至至少180个氨基酸。本发明的衍生物可以包含上述范围内的任何长度的蛋白质,但其长度通常为146至180个氨基酸。
无论具有天然还是变体氨基酸序列,本发明的衍生物都包含共价连接至IL-22蛋白的脂肪酸。脂肪酸通常通过接头共价连接至IL-22蛋白。脂肪酸和接头通过酰胺键适当地相互连接,并且接头共价连接至IL-22蛋白。脂肪酸和接头因此可以作为侧链存在于IL-22蛋白上。令发明人惊讶的是共价连接的脂肪酸不会不利地影响IL-22活性。尤其令人惊讶的是,脂肪酸连接与其他优势有关,例如延长半衰期。
脂肪酸可以是任何合适的脂肪酸。确切地说,脂肪酸可为式I:
HOOC-(CH2)x-CO-*,
其中x是在10至18、任选12至18、14至16或16至18范围内的整数,并且*表示与IL-22蛋白或接头的连接点。其可以是脂肪二酸,例如C12、C14、C16、C18或C20二酸。有利地,脂肪酸是C16或C18二酸,并且最有利地是C18二酸。
例如,式I中的-(CH2)x-可以是直链亚烷基,其中x为10。该脂肪酸可方便地称为C12二酸,即具有12个碳原子的脂肪二羧酸。或者,式I中的-(CH2)x-可以是直链亚烷基,其中x为12。该脂肪酸可方便地称为C14二酸,即具有14个碳原子的脂肪二羧酸。以类似的方式,式I中的-(CH2)x-可以是直链亚烷基,其中x为14(C16二酸)、16(C18二酸)或18(C20二酸)。适当地,第一方面的衍生物包含C14、C16、C18或C20二酸;更合适的是C16或C18二酸,并且甚至更合适的是C18二酸。
二酸可能能够与白蛋白形成非共价缔合,从而促进衍生物在血流中的循环。较短的二酸(例如C16二酸)具有较低的白蛋白亲和力,因此比较长的二酸(例如C18二酸)具有更短的半衰期。然而,所述较短的二酸仍然是长效衍生物,其在人体中的预期半衰期超过一天。
脂肪酸连接本身也会稳定IL-22蛋白,以防止蛋白水解降解。产生的半衰期通常与IL-22-Fc融合物的半衰期相似(即与hIL-22相比大极大地提高)。
第一方面的衍生物可以包含脂肪酸和IL-22蛋白的特定组合。例如,C14、C16、C18或C20二酸可以连接至包含在hIL-22的位置1处的Cys残基和/或N端G-P-G的IL-22蛋白。在一个实例中,第一方面的衍生物包含C18二酸,并且IL-22蛋白包含hIL-22的位置1处的Cys残基和N端G-P-G二者。
如上所述,脂肪酸适当地连接至接头,该接头连接至IL-22蛋白。接头可以包含若干接头元件,包括一个或多个氨基酸,例如一个或多个Glu和/或Lys残基。接头可以包含氧乙烯甘氨酸单元或多个连接的氧乙烯甘氨酸单元,任选地2至5个此类单元,有利地2个单元。可替代地或另外地包含一个或多个OEG残基、C2DA和/或Ac基团。接头可以包含Cys反应性单元。如本文所用,“Cys反应性单元”可以指能够与Cys的硫原子反应以产生碳-硫共价键的功能单元。Cys反应性单元可以具有若干形式中的任一种,但适当地包含连接至离去基团的碳原子,该离去基团在碳-硫键形成期间被Cys的硫原子替换。离去基团可以是卤素,任选地溴原子。该溴离去基团可以是乙酰胺官能团的α;有利地,其是溴-乙酰胺官能团。离去基团也可以是甲磺酸酯或甲苯磺酸酯形式的官能化羟基,或非官能化羟基。此外,离去基团可以是马来酰亚胺或其他官能团。示例性接头包括γGlu-OEG-OEG-C2DA-Ac、γGlu-γGlu-γGlu-γGlu-OEG-OEG-εLys-αAc和γGlu-OEG-OEG-εLys-αAc,但可以使用任何合适的接头。
脂肪酸或接头可以连接至IL-22蛋白中的任何氨基酸残基上。在这方面的示例是hIL-22氨基酸序列中或相对于hIL-22氨基酸序列的残基-7、-5、1、6、33、113、114和153。天然残基通常被Cys或Lys取代,以使脂肪酸或接头能够连接。或者,脂肪酸或接头可以连接在天然的Cys或Lys残基上。适当地,脂肪酸或接头连接至hIL-22的位置1、6、33、113或114处取代的Cys残基,或连接至相对于hIL-22的位置-5、-7或153处的Cys残基。确切地说,脂肪酸或接头可以连接至hIL-22的位置1处取代的Cys残基。
脂肪酸或接头与IL-22蛋白的连接是共价连接。例如,Cys反应性脂肪酸或接头可用于将脂肪酸或接头连接至IL-22蛋白中的Cys残基。脂肪酸或接头可以通过硫醚键共价连接至Cys残基的硫原子。或者,Lys反应性脂肪酸或接头可用于将脂肪酸或接头连接至IL-22蛋白中的Lys残基。脂肪酸或接头可替代地共价连接至IL-22蛋白的N端的游离胺(-NH2)基团(与位置1中的氨基酸无关)。连接可以像Cys连接一样进行,尽管使用了亚化学计算量的含有合适的N反应性物质的脂肪酸或接头。脂肪酸或接头可以醛(N反应性物质)的形式存在,并且使用经典已知的还原胺化共价连接至游离胺。
因此,第一方面的衍生物适当地包含通过接头连接至hIL-22变体的C14、C16、C18或C20二酸,其中该变体包含N端G-P-G和在hIL-22的位置1处的Cys残基,并且该接头任选地连接至Cys残基。
第一方面的示例性衍生物包含如在SEQ ID NO.16-21中的任一个中所示出的IL-22蛋白。特别有利的衍生物示出在表3中,在图1至图4中进行图示并在本文中举例说明。
Figure BDA0003630325010000181
表3:IL-22的示例性衍生物
图1A图示了连接至包含Cys反应性单元的接头的C18二酸。这是衍生物1、2和6至9中所使用的脂肪酸和接头(侧链)。图1B图示了连接至包含Cys反应性单元的接头的C16二酸。这是衍生物3、4和10中所使用的脂肪酸和接头(侧链)。图1C图示了连接至包含Cys反应性单元的接头的C14二酸。这是衍生物5中所使用的脂肪酸和接头(侧链)。
衍生物1、6和10分别图示于图2至图4中。
本发明的衍生物可以不同的立体异构形式存在并且本发明涉及所有这些形式。
根据本发明的第二方面,提供一种制备第一方面的衍生物的方法,其包括将脂肪酸共价连接至IL-22蛋白。
该方法可用于产生本文描述或设想的IL-22的任何不同衍生物,但其在脂肪酸共价连接至变体IL-22蛋白时是特别有利的。因此,在一个实施方案中,用于第二方面的IL-22蛋白是hIL-22的取代形式,任选在位置1、21、35、64、113和/或114被取代。示性例取代包括A1C、A1G、A1H、N21C、N21D、N21Q、N35C、N35D、N35H、N35Q、N64C、N64D、N64Q、N64W、Q113C、Q113R、K114C和/或K114R。优选地,IL-22蛋白被位置1处的Cys残基取代。
脂肪酸可以通过本领域已知的任何方式获得,包括重组方式。合适的脂肪酸是可商购获得的,或使用标准化学合成容易地衍生自可获得的起始物质。
IL-22蛋白可以通过本领域中已知的任何方式获得,包括重组方式。重组hIL-22的产生已在之前描述过并且在本领域中是众所周知的。所需的变体IL-22蛋白可以相似的方式产生。该领域有经验的研究人员将能够容易地鉴定编码所需变体IL-22蛋白的合适核酸序列。本领域技术人员因此将能够基于本领域中的现有知识容易地执行本发明的这部分。适当地,IL-22蛋白是使用标准技术在哺乳动物系统中产生,例如在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生。可以使用多组氨酸标签(His-标签)来帮助重组蛋白的亲和纯化。
在这方面,本发明中使用的IL-22蛋白可以使用表达后可裂解的His标签来制备,即N端或C端添加少于10个、优选6个的组氨酸残基,所述蛋白质可以通过对镍柱的亲和力而纯化。His标签通过接头连接至蛋白质的N端或C端,该接头可以被已知的蛋白酶消化,留下游离IL-22蛋白。可裂解的His标签可以具有氨基酸序列HHHHHHGGSSGSGSEVLFQ(SEQ IDNO.25),并且蛋白酶可裂解接头可以是烟草蚀纹病毒(tobacco etch virus;TEV)接头,其天然切割位点的共有序列为ENLYFQ\S(SEQ ID NO.26),其中‘\’表示裂解的肽键或具有EVLFQ共有裂解位点的人鼻病毒14 3C(HRV14-3C)蛋白酶可裂解接头。可以通过将大约10μg蛋白酶与2.5μg蛋白质和10mM2-巯基乙醇在室温下孵育4h来实现裂解。
为了进一步说明本发明,如下提供了蛋白质制备的代表性方法。该方法涉及制备编码IL-22蛋白的所需氨基酸序列的质粒DNA。可以将该质粒瞬时转染到细胞系(例如CHO-K1)中,使其在通过添加已知增强剂(enhancer)增加生长之前在相关培养基中生长。然后可以通过已知的离心和无菌过滤方法收获分泌的IL-22蛋白,随后在镍柱上纯化蛋白质。在浓缩和缓冲液交换之后,使用HRV14-3C蛋白酶移除His标签,随后用脂肪酸进行烷基化(下文进一步描述),并进行最终纯化和缓冲液交换。使用SDS-PAGE、尺寸排阻色谱或液相色谱和串联质谱(LC-MS-MS)对最终产物进行分析,无论是否进行去糖基化,均可用于确保最终产物的质量。
脂肪酸可以直接或使用如第一方面所述的接头共价连接至IL-22蛋白。接头可以通过本领域已知的任何方式获得。如果采用,那么制备脂肪酸和接头的代表性方法如下(以衍生物10中使用的C16二酸为例,但可以使用相似方法制备任何衍生物)。
将N-(苄氧基羰基氧基)琥珀酰亚胺(100g,401mmol)在二氯甲烷(500ml)中的溶液添加到乙二胺(189ml,2.81mol)在二氯甲烷(750ml)中的溶液中。30分钟后,将悬浮液过滤、洗涤并真空浓缩。将残余物用甲苯(750ml)稀释,洗涤并用二氯甲烷(4×200ml)萃取,经无水硫酸钠干燥,过滤,真空浓缩,并用己烷(200ml)稀释。将4M氯化氢在乙醚(100ml,400mmol)中的溶液添加到该溶液中,将所得悬浮液真空浓缩并用己烷(1l)稀释。过滤沉淀的固体,用己烷洗涤并真空干燥,得到呈白色粉末的(2-氨基乙基)氨基甲酸苄酯盐酸盐。
2-氯三苯甲基树脂100-200负载有2-[2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸(Fmoc-Ado-OH,17.5g,45.4mmol)。移除Fmoc基团并将0-6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TCTU,24.2g,68.1mmol)和N,N-二异丙基乙胺(21.4ml,123mmol)在N,N二甲基甲酰胺(140ml)中的溶液添加到该树脂中,并且将混合物摇动一个小时。过滤并洗涤树脂。如前所述,通过用20%哌啶处理来移除Fmoc基团。如前所述洗涤树脂。
将(S)-2-(芴-9-基甲氧基羰基氨基)-戊二酸1-叔丁酯(Fmoc-Glu-Ot Bu,29.0g,68.1mmol)、TCTU(24.2g,68.1mmol)和N,N-二异丙基乙胺(21.4ml,123mmol)在N,N二甲基甲酰胺(140ml)中的溶液添加到树脂中并将混合物摇动一个小时。如前所述过滤并洗涤树脂。如前所述,通过用20%哌啶处理来移除Fmoc基团。如前所述洗涤树脂。
将16-叔丁氧基)-16-氧代十六烷酸(23.3g,68.1mmol)、TCTU(24.2g,68.1mmol)和N,N二异丙基乙胺(21.4ml,123mmol)在N,N-二甲基甲酰胺/二氯甲烷混合物(4:1,200ml)中的溶液添加到树脂中。将树脂摇动一小时,过滤并用N,N-二甲基甲酰胺(3×250ml)、二氯甲烷(2×250ml)、甲醇(2×250ml)和二氯甲烷(6×250ml)洗涤。通过用2,2,2-三氟乙醇(250ml)处理18小时,从树脂中裂解出产物。滤出树脂并用二氯甲烷(2×250ml)、2-丙醇/二氯甲烷混合物(1:1,2×250ml)、2-丙醇(250ml)和二氯甲烷(3×250ml)洗涤。
合并溶液,蒸发溶剂并通过快速柱色谱法纯化粗产物。真空干燥纯的(S)-22-(叔丁氧羰基)-41,41-二甲基-10,19,24,39-四氧-3,6,12,15,40-五氧杂-9,18,23-三氮杂四十二烷酸,得到淡黄色稠黄色油状物。
随后将2-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU,11.4g,30.1mmol)和三乙胺(8.77ml,62.9mmol)添加到(S)-22-(叔丁氧羰基)-41,41-二甲基-10,19,24,39-四氧-3,6,12,15,40-五氧杂-9,18,23-三氮杂四十二烷酸(22.4g,27.4mmol)在无水二氯甲烷(110ml)中的溶液中。将三乙胺(72ml,41.0mmol)添加到(2-氨基-乙基)-氨基甲酸苄酯盐酸盐(6.94g,30.1mmol)在无水二氯甲烷(165ml)中的悬浮液中,并将所得混合物添加到上述溶液中。将混合物在室温搅拌过夜,然后蒸发至干。将残余物再溶解并洗涤;经无水硫酸钠干燥并通过柱色谱法(硅胶60,0.040至0.060mm;洗脱液:二氯甲烷/甲醇95:5)蒸发,得到呈淡黄色稠油状物的15-[(S)3-(2-{2-[(2-{2-[(2-苄氧基羰基氨基-乙基氨甲酰基)-甲氧基]-乙氧基}乙基-氨甲酰基)甲氧基]乙氧基)-乙基氨甲酰基)-1-叔丁氧基羰基丙基氨甲酰基]-十五烷酸叔丁酯。
将钯/碳(10%,1.27g,1.20mmol)添加到上述化合物(23.8g,24.0mmol)在甲醇(350ml)中的溶液中,并将所得混合物在常压下氢化四小时。滤出催化剂并将滤液蒸发至干。将残余物从二氯甲烷中蒸发数次以移除甲醇残余物并真空干燥,得到呈无色稠油状物的(S)-1-氨基-25-叔丁氧基羰基)-4,13,22,27-四氧-6,9,15,18-四氧杂-3,12,21,26-四氮杂四十二烷-42-酸叔丁酯。
在氩气下,在-30℃将N,N-二异丙基乙胺(4.98ml,28.6mmol)添加到上述胺(20.5g,23.8mmol)在无水二氯甲烷(290ml)中的溶液中。逐滴添加溴乙酰溴(2.48ml,28.6mmol),并将所得溶液在-30℃再搅拌三小时。移除冷却浴,将混合物在室温搅拌一小时,并真空移除溶剂。将残余物再溶解在乙酸乙酯(450ml)中,并用5%柠檬酸水溶液(300ml)洗涤。在一小时内分离各相。使有机层分离过夜,得到三个相。移除澄清的水层并将剩余的两相与溴化钾的饱和水溶液(100ml)一起摇动。使各相分离过夜,移除水相并用无水硫酸钠干燥有机相。真空移除溶剂并通过快速柱色谱法:二氯甲烷/甲醇95:5)纯化残余物,得到呈无色固体的(S)-1-溴-28-叔丁氧基羰基)-2,7,16,25,30-五氧-9,12,18,21-四氧杂-3,6,15,24,29-五氮杂四十五烷-45-酸叔丁酯。
将上述化合物(19.5g,19.8mmol)溶解在三氟乙酸(120ml)中,并将所得溶液在室温搅拌1.5小时。真空移除三氟乙酸并将残余物从二氯甲烷(6×200ml)中蒸发。向油状残余物中添加二乙醚(200ml),并将混合物搅拌过夜,得到悬浮液。过滤固体产物,用二乙醚和己烷洗涤并真空干燥,得到呈白色粉末的所需产物15-{(S)-1-羧基3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙酰氨基)乙基氨甲酰基]甲氧基}-乙氧基乙基-氨甲酰基]甲氧基}乙氧基-乙基氨甲酰基]丙基氨甲酰基}十五烷酸。
可以使用本领域的标准程序将脂肪酸或接头共价连接至IL-22蛋白。如果使用接头,则可以使IL-22蛋白能够共价连接至脂肪酸。作为非限制性实例,Cys反应性脂肪酸或接头可以与IL-22蛋白中的Cy s残基的硫原子反应,从而形成硫醚键。共价连接步骤的合适条件可以举例如下:将Tris水溶液添加到含IL-22蛋白(70mg)的Tris和Na Cl缓冲液(1.35mg/ml)溶液中,以将pH调节至8。添加溶解在水中的双(对磺酸根基苯基)-苯基膦二水合物二钾(BSPP)盐(12mg),并在室温轻轻搅拌四小时。添加乙醇(0.5ml)中的15-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-溴乙酰氨基)-乙基氨甲酰基]乙氧基}乙氧基)乙基氨甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨甲酰基]丙基-氨甲酰基}十五烷酸(19mg,0.022mmol),并将混合物轻轻搅拌过夜。添加MiliQ水(150ml)以将电导率降低至2.5mS/cm。然后在MonoQ 10/100GL柱上使用阴离子交换,使用结合缓冲液(20mM Tris,pH 8.0)、洗脱缓冲液(20mM Tris,500mM NaCl,pH 8.0)、经过60倍柱体积的流量为6ml和梯度为0-80%的洗脱缓冲液来纯化混合物。
本发明的衍生物可以使用本领域已知的任何合适的程序来纯化,例如色谱法、电泳法、差异溶解度法或萃取法。
如本文所述,发明人惊讶地发现脂肪酸可以共价连接至IL-22蛋白,同时保持生物活性。尤其令人惊讶的是,对IL-22的这种最小修饰可能导致高效力(接近hIL-22)以及极长循环半衰期。这种特定的特性组合可能是非常需要的。
衍生物的效力可以在体外测定中用表达人IL-22受体的全细胞来测定。例如,人IL-22受体的反应可以使用过度表达IL-22R1、IL-10R2和磷酸化STAT3(pSTAT3)响应报告基因的小仓鼠肾(BHK)细胞来测量。或者,可以使用内源性表达IL-22受体的HepG2细胞。受体的活化会导致STAT3信号传导途径的激活,其例如可以使用具有STAT3诱导的启动子的荧光素酶报告基因或通过测定pSTAT3来测量。此类测定的非限制性实例描述于实施例2中。如本领域中已知,可以在动物模型或临床试验中测定体内效力。
半数最大有效浓度(EC50)值通常用作衡量药物效力的量度。因为这代表产生最大效果的50%所需的药物浓度,EC50值越低,效力就越好。适当地,本发明的衍生物的效力(EC50值)是使用细胞中IL-22受体介导的STAT3活化来测量,其低于1.5nM、低于1.25nM、低于1nM、低于0.75nM、低于0.5nM、低于0.25nM或甚至低于0.1nM(例如如实施例2中所述测定)。适当地,本发明的衍生物的效力(EC50值)是通过测定细胞中的pSTAT3来测量,其低于15nM、低于12nM、低于10nM、低于7nM或甚至低于5nM(例如如实施例2中所述测定)。
有利地,IL-22的衍生物的效力可能高于IL-22-Fc融合物的效力。例如,Genentech报道,与hIL-22相比,其IL-22-Fc融合物UTTR1147A的体外效力降低了34倍(Stefanich等人,Biochem Pharmacol,2018,152:224-235)。相比之下,已显示脂肪酸与hIL-22的共价连接仅导致效力降低七倍(参见实施例中的衍生物1)。虽然IL-22-Fc融合物和本发明的衍生物两者在其与hIL-22相比改进的半衰期和至少在一些情况下的生物学功能方面是相当的,但本发明的衍生物可以具有额外的优点:效力损失最小。
可以通过在合适的动物模型(例如小鼠、大鼠或小型猪)中经皮下或静脉内施用衍生物来在体内测定衍生物的循环消除半衰期(T1/2)。合适的方法描述于实施例1中。作为非限制性实例,第一方面的衍生物在经皮下或静脉内施用给小鼠后具有至少一个小时、至少三个小时、至少五个小时或甚至至少八个小时的循环半衰期。衍生物在经皮下或静脉内施用给大鼠后可能具有至少三个小时、至少五个小时、至少八个小时、至少10个小时或甚至至少13个小时的循环半衰期。衍生物在经皮下或静脉内施用给小型猪之后可能具有至少25个小时、至少40个小时、至少70个小时或甚至至少100个小时的循环半衰期(全部例如如实施例1中所述测定)。
如本文所例示,发明人还发现本发明的衍生物在体内被快速吸收。有利地,衍生物的吸收可能比IL-22-Fc融合物的吸收更快。平均吸收时间是衡量摄取的准确参数,因为其与药物施用后的剂量和最大血浆浓度无关。其可以根据平均滞留时间来计算,即药物在吸收完成后在消除之前在体内度过的时间。本发明的衍生物适当地具有低于100h、低于90h、低于80h、低于70h或甚至低于60h的平均吸收时间(例如,如实施例1所述测定)。
本发明的衍生物还具有良好的生物物理特性,例如高物理稳定性和/或溶解度,这可以使用本领域的标准方法测量。
因此,根据本发明的第三方面,提供一种药物组合物,其包含第一方面的衍生物和药学上可接受的媒介物。
第三方面的药物组合物可以包含本文描述或设想的IL-22的不同衍生物中的任何一种。适当地,其包含本文中鉴定为衍生物1至10的IL-22衍生物之一。
第一方面的衍生物或第三方面的药物组合物将适当地展现出与hIL-22相比增加的循环消除半衰期。有利地,其将展现出与hIL-22相比,循环消除半衰期增加了至少50%、至少75%、至少100%或更多。
第三方面的药物组合物可以通过将治疗有效量的第一方面的衍生物与药学上可接受的媒介物组合来制备。药物活性成分与各种赋形剂的配制是本领域已知的。
第一方面的衍生物的“治疗有效量”是当施用于受试者时是治疗疾病、病症或疾患或产生期望效果所需的衍生物量的任何量。
例如,所用衍生物的治疗有效量可以为约0.001mg至约1000mg,并且优选约0.01mg至约500mg。优选的是,衍生物的量为约0.1mg至约100mg,且最优选约0.5mg至约50mg的量。作为指导,本文所述的实施例3的小鼠中使用的衍生物的剂量为0.5mg/kg(皮下施用)。
如本文所提及的“药学上可接受的媒介物”是本领域技术人员已知可用于配制药物组合物的任何已知化合物或已知化合物的组合。
在一个实施方案中,药学上可接受的媒介物可以是固体;任选地,该组合物可以呈用于再悬浮的粉末形式。固体药学上可接受的媒介物可以包括一种或多种物质,这些物质也可以用作调味剂、润滑剂、增溶剂、助悬剂、染料、填充剂、助流剂、惰性粘合剂、防腐剂或染料。媒介物也可以是封装材料。在粉末中,媒介物是与根据本发明的细微衍生物混合的细微固体。粉末优选含有高达99%的衍生物。合适的固体媒介物包含例如磷酸钙、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、糊精、淀粉、明胶、纤维素和离子交换树脂。
在另一个实施方案中,药物媒介物可以是凝胶,并且组合物可以呈乳膏等形式。
然而,药物媒介物可以是液体;任选地,药物组合物呈溶液形式。液体媒介物用于制备溶液、悬浮液、乳液、糖浆、酏剂和加压组合物。根据本发明的衍生物可以溶解或悬浮在药学上可接受的液体媒介物中,例如水、有机溶剂、两者的混合物或药学上可接受的油或脂肪。液体媒介物可以含有其他合适的药物添加剂,例如增溶剂、乳化剂、缓冲剂、防腐剂、甜味剂、调味剂、助悬剂、增稠剂、色素、粘度调节剂、稳定剂或渗透压调节剂。用于肠胃外施用的液体媒介物的合适实例包括水(部分含有上述添加剂,例如纤维素衍生物,优选羧甲基纤维素钠溶液)、醇(包括一元醇和多元醇,例如二醇)及其衍生物,以及油(例如,分馏椰子油和花生油)。对于肠胃外施用,媒介物也可以是油性酯,例如油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯。无菌液体媒介物可用于供肠胃外施用的无菌液体形式组合物中。用于加压组合物的液体媒介物可以是卤代烃或其他药学上可接受的推进剂。
因此,用于制备本发明的药物组合物的方法可以包括本领域中标准的常用步骤。
因此,根据本发明的第四方面,提供第一方面的衍生物或第三方面的药物组合物,其用于疗法中。还提供了一种用本发明的衍生物或包含该衍生物的药物组合物治疗受试者的方法。本文描述或设想的IL-22的不同衍生物中的任何一种都明确地包含在本发明的这些方面中。
如本文所用,诸如“治疗”和“疗法”的术语明确包含治疗、改善或预防疾病、病症或疾患。
IL-22的衍生物或包括该衍生物的药物组合物可以直接施用于待治疗的受试者。衍生物或药物组合物可以通过任何方式施用,包括通过吸入、通过注射、局部或眼部施用。当通过吸入施用时,可以通过鼻或嘴施用。优选地,衍生物或药物组合物通过注射施用,通常是经皮下或静脉内施用。因此,由于其较小的尺寸和较高的效力,衍生物在施用灵活性(例如通过注射、通过吸入、局部应用或眼部递送)方面具有优于Fc融合物的明显优势。应当理解,与hIL-22相比,将本发明的衍生物施用于待治疗的受试者将导致循环时间增加,并且这将有助于治疗疾病、病症或疾患。如上所述,“治疗”还包括改善和预防疾病、病症或疾患。
液体药物组合物是无菌溶液或悬浮液,可通过例如肌肉内、鞘内、硬膜外、腹膜内和特别是皮下或静脉内注射来使用。衍生物可以制备成可在使用无菌水、盐水或其他适当的无菌可注射介质进行施用时溶解或悬浮的无菌固体组合物。
可用于吸入的形式包含无菌溶液、乳液和悬浮液。或者,衍生物可以通过
Figure BDA0003630325010000281
Figure BDA0003630325010000282
以细粉或气溶胶的形式施用。鼻腔吸入剂可以适当地采用细粉或气溶胶鼻喷雾剂或改进的
Figure BDA0003630325010000283
Figure BDA0003630325010000284
的形式。
局部制剂包括溶液、乳膏、泡沫、凝胶、洗剂、软膏、糊剂、酊剂和粉末。其可以是表皮制剂,即直接施用于皮肤,或施用于粘膜。
用于眼部施用的制剂通常是用于局部施用的溶液、悬浮液和软膏,例如呈滴眼剂形式。或者,可以通过眼内注射使用无菌溶液或悬浮液。衍生物可以制备成可在使用无菌水、盐水或其他适当的无菌可注射介质进行施用时溶解或悬浮的无菌固体组合物。该制剂可用于结膜下、玻璃体内、眼球后或前房内注射。
本发明的衍生物或药物组合物可以施用于任何有需要的受试者。如本文所用,“受试者”可以是脊椎动物、哺乳动物或家养动物。因此,根据本发明的衍生物和组合物可用于治疗任何哺乳动物,例如家畜(例如马)、宠物,或可用于其他兽医应用。最优选地,受试者是人类。衍生物和组合物不仅需要施用于那些已经显示出疾病、病症或疾患迹象的受试者。而且,其可以作为一种纯粹的预防性措施施用于表面上健康的受试者,以防止将来发生这种疾病、病症或疾患的可能性。
应当理解,根据本发明的IL-22的衍生物和组合物可以用于单一疗法中(即,该衍生物或组合物的唯一用途),其用于治疗疾病、病症或疾患。或者,根据本发明的衍生物和组合物可以用作用于治疗疾病、病症或疾患的已知疗法的助剂或与已知疗法组合使用。
应了理解,所需的IL-22的衍生物的量是由其生物活性、半衰期及生物利用度决定,这又取决于施用模式、衍生物和组合物的生理化学特性及其是用作单一疗法还是用于联合疗法。施用频率也将受到衍生物在所治疗受试者体内的半衰期的影响。待施用的最佳剂量可由本领域技术人员确定,并且将随使用的特定衍生物、药物组合物的强度、施用方式以及疾病、病症或疾患的进展而变化。取决于所治疗的特定受试者的其他因素将导致需要调整剂量,所述因素包括受试者年龄、体重、性别、饮食和施用时间。
通常,根据本发明的IL-22的衍生物的0.001μg/kg体重和10mg/kg体重之间的日剂量可用于治疗疾病、病症或疾患,这取决于使用哪种衍生物或组合物。更优选地,日剂量在0.01μg/kg体重和1mg/kg体重之间,更优选在0.1μg/kg和500μg/kg体重之间,并且最优选在大约0.1μg/kg和100μg/kg体重之间。
IL-22衍生物或组合物可以在疾病、病症或疾患发作之前、期间或之后施用。日剂量可以作为单次施用(例如,单次每日注射)给予。或者,衍生物或组合物可能需要在一天内施用两次或更多次。例如,衍生物可以0.07μg至700mg(即假设体重为70kg)之间的两个日剂量(或更多个日剂量,取决于所治疗的疾病、病症或疾患的严重程度)施用。接受治疗的患者可在醒来时服用第一剂,然后在晚上服用第二剂(如果采用两剂方案)或此后每隔3或4小时服用一次。或者可以每周一次、每两周一次或每月一次,或更频繁地(例如每周两次或三次)给予剂量。已知程序,例如制药工业常用的程序(例如,体内实验、临床试验等),可用于形成根据本发明的衍生物和组合物的特定制剂和精确的治疗方案(例如剂的日剂量和施用频率)。
许多研究已经证明IL-22在多种上皮损伤模型中的关键作用,尤其是在肺、肝、肠、肾脏、皮肤、胰腺和胸腺中的关键作用。在机制上,多个研究人员已在研究中充分证明了例如抗细胞凋亡、增殖、先天免疫、抗氧化应激、抗纤维化和干细胞/祖细胞募集内的几种途径可以调节IL-22的作用。关键机制调查结果已在体外使用人细胞系或在人离体模型(例如原代人肠道类器官)中得到进一步证实。因此,IL-22在预防细胞死亡、确保再生和控制上皮损伤炎症方面的强大作用已得到充分证实。
许多研究是通过分析受到损伤的遗传模型(IL-22敲除或转基因过表达)来进行的。在这些研究中,IL-22的缺乏或IL-22的过表达将在损伤时出现。在其他研究中,IL-22在损伤时被抗体中和,并且在一些情况下,IL-22在急性损伤阶段之后(例如亚急性或完全进入再生阶段)被中和。其他研究通过观察外源性施用的IL-22的效果更接近治疗场景。需要注意的是,在全面查看现有文献时,不同的模型,无论是敲除、过表达、损伤前后的IL-22中和或外源性蛋白质给药,都描绘了IL-22保护受损器官并驱动再生的相同画面。这表明IL-22治疗潜力的广泛应用和广泛的时间窗口,并且也显示了需要比hIL-22更长效的IL-22蛋白的原因。
因此,根据本发明的第五方面,提供第一方面的衍生物或第三方面的药物组合物,其用于治疗代谢、肝脏、肺部、肠道、肾脏或皮肤疾病、病症或疾患的方法中。本文描述或设想的IL-22的的不同衍生物中的任何一种都明确地包含在本发明的这个方面中。
代谢疾病、病症或疾患可以是肥胖、1型糖尿病、2型糖尿病、高脂血症、高血糖症或高胰岛素血症。
肝脏疾病、病症或疾患可以是NAFLD、NASH、肝硬化、酒精性肝炎、急性肝衰竭、慢性肝衰竭、ACLF、对乙酰氨基酚诱导的肝毒性、急性肝损伤、硬化性胆管炎、胆汁性肝硬化或由手术或移植引起的病理疾患。
肺部疾病、病症或疾患可以是COPD、囊性纤维化、支气管扩张、特发性肺纤维化、急性呼吸窘迫综合征、化学损伤、病毒感染、细菌感染或真菌感染。
肠道疾病、病症或疾患可以是IBD、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、GvHD、化学损伤、病毒感染或细菌感染。
肾脏疾病、病症或疾患可以是急性肾病或慢性肾病。
皮肤疾病、病症或疾患可以是伤口、炎性疾病或GvHD。
还提供了一种用IL-22的衍生物或包含该衍生物的药物组合物治疗患有对IL-22治疗有反应的疾患(例如一种或多种上述疾病、病症或疾患)的受试者的方法。
IL-22的衍生物具有本发明的第一方面指定的所有特征。该药物组合物具有本发明的第三方面指定的所有特征。治疗患有对IL-22治疗有反应的疾患(例如一种或多种上述疾病、病症或疾患)的受试者的方法具有本发明的第四方面指定的所有特征。
对于应向哪个患者施用如本文所述的IL-22的哪种衍生物或组合物没有限制。相反,旨在将本文所述的任何衍生物和组合物施用于如本文所述的任何患者。
本文(包括任何随附权利要求书、摘要和附图)所述的所有特征和/或如此公开的任何方法或过程的所有步骤都可以与任何上述方面以任何组合形式进行组合,但其中至少一些此类特征和/或步骤互斥的组合除外。
为了更好地理解本发明,并且为了展示本发明的实施方案如何实施,现在将参考实施例,这些实施例不旨在以任何方式限制本发明。
实施例
除非另有说明,否则实施例中描述的研究中使用的材料和方法如下。
衍生物
表4提供对数据集中表示的IL-22的衍生物和比较物的概述。
IL-22的衍生物具有各种骨架、脂肪酸类型和共价连接位点,因此代表了本发明所涵盖的衍生物的多样性。在所有情况下使用的接头是γGlu-OEG-OEG-C2DA-Ac。在所有情况下,接头都连接至残基1C,但衍生物2(-7C)、4(-7C)、8(6C)和9(33C)除外。虽然衍生物7举例说明在1C处的共价连接,但其缺乏所有具有在1C处共价连接的脂肪酸的其他衍生物中所存在的G-P-G N端肽。
比较物是hIL-22、hFc-hIL-22(一种重组融合蛋白)和hIL-22变体(即仅具有一个或多个骨架变异的hIL-22)。
Figure BDA0003630325010000321
Figure BDA0003630325010000331
表4:数据集中表示的关键衍生物和比较物的概述
针对实施例产生的衍生物的质量控制分析如下进行。
通过在室温下将20μl的1mg/ml样本添加到2μl N-糖苷酶F中持续48h,测定去糖基化后样本中蛋白质的完整质量。然后将样本用pH 7.4的PBS稀释至0.2mg/ml,并使用连接至Waters Synapt G2的Synapt G2和Waters MassLynx 4.1进行分析。10-90柱Acquity UPLC蛋白质BEH C4 1.7μm 1×100mm与以下流动相一起使用:A:0.1%甲酸水溶液;和B:乙腈,0.09%甲酸。流速为120μl/min,UV 214nm(20pts/s),并且梯度如表5中所示。
时间(min) 流速(ml/min) A%
初始 0.12 90
1 0.12 90
17 0.12 10
18 0.12 0
19 0.12 0
20 0.12 90
25 0.12 90
表5:用于IL-22衍生物的质量控制的梯度(%和min)结果显示于表6中。
Figure BDA0003630325010000341
表6:实测的IL-22的关键衍生物的质量和保留时间
因此,质量控制数据证实确实已经产生了预期的衍生物。
以下是示例性方案,仅旨在说明要求保护的发明。如本领域技术人员所知,研究中使用的动物的确切数量和时间进程可以变化。
实施例1-药代动力学研究
方法
在小鼠(n=27)、大鼠(n=4-8)和小型猪(n=2-5)中对选定的衍生物进行药代动力学研究。将IL-22的衍生物与hIL-22、hFc-hIL-22和/或作为比较物的hIL-22变体一起进行测试。
(i)小鼠和大鼠
从Taconic Biosciences获得30只8周龄C57Bl/6雄性小鼠和5只Sprague Dawley雄性大鼠。将小鼠以10只为一组进行圈养。在实验前使动物适应一周。在给药前测量体重,这对于药代动力学计算很重要。在整个实验过程中,动物都是清醒的,可以得到食物和水。
所有衍生物和比较物均制备为pH 7.4的PBS中的0.3mg/ml溶液以便用于小鼠,并且制备为0.5mg/ml溶液以便用于大鼠。在小鼠中测试2.0mg/kg的剂量。在大鼠中测试1mg/kg的剂量。
将衍生物和比较物皮下施用于动物。在给药后的特定时间点采集血样。
对小鼠使用稀疏取样;因此,对27只小鼠给药IL-22衍生物或比较物,并在以下每个时间点从三只不同的小鼠采集血样:5min、15min、30min、45min、60min、75min、90min、105min、120min、150min、3h、4h、6h、8h、16h、24h、32h和48h。因此,对每只小鼠在研究过程中只采集了两个样本。在取最后一个样本后,通过颈椎脱臼对小鼠实施安乐死。
对五只大鼠给药IL-22的衍生物或比较物,并在以下每个时间点采集三个血样:5min、15min、30min、45min、60min、75min、90min、105min、120min、150min、3h、4h、6h、8h和24h。在研究过程中,对每只大鼠采集了17个样本。在取最后一个样本后,用二氧化碳对大鼠实施安乐死。
通过舌血从小鼠和大鼠中采集血样(100μl),并转移到EDTA管(
Figure BDA0003630325010000351
VetMed 200K3E,Sarstedt nr 09.1293.100)。将血液在抽取后20分钟内以8000G、4℃离心五分钟。将血浆样本(40至50μl)转移到半micronic管中。
(ii)小型猪
从Ellegaard
Figure BDA0003630325010000352
Minipigs A/S获得体重大约15kg的9月龄的雌性
Figure BDA0003630325010000361
小型猪。手术(插入导管)前允许有大约18天的适应期,在此期间,使小型猪合群并接受皮下给药和导管采血的训练。手术前三至五天,将小型猪单独圈养。在给药前六天,所有小型猪都插入了两个中心静脉导管(Cook Medical,C-TPNS-6.5-90-REDO,硅,法国尺寸6.5号,106cm长的TPN型),这使得手术后的恢复时间为研究开始(给药)前至少五天。
将所有衍生物和比较物均制备为pH 7.4的PBS中的溶液。使用的剂量为0.1mg/kg(静脉内施用)或0.2mg/kg(皮下施用)。
在给药期间用丙泊酚(Propofol)轻轻麻醉小型猪。通过长中心导管对小型猪施用静脉内注射。施用后,用10ml无菌盐水冲洗导管。使用25G针头以5mm深度进行皮下注射。注射后将针头在皮肤中保持10s以避免回流。
在静脉给药后的以下时间点从小型猪身上采集血样:1.5h、2h、3h、4h、6h、8h、10h、12h、24h、28h、48h、72h、96h、144h、168h、192h、216h、240h、264h、312h、336h、360h、384h、408h、432h和480h。在皮下给药后的以下时间点采集血样:1.5h、2h、3h、4h、5h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h、26h、28h、46h、52h、72h、96h、144h、168h、192h、216h、240h、264h、312h、336h、360h、384h、408h、432h和480h。
将来自小型猪的血样(1ml)收集在EDTA管(1.3ml管,其含有K3EDTA,产生1.6mgK3EDTA/ml血液(Sarstedt,Germany))。将样本在湿冰上最多保存30min,直到离心(10mim,4℃,2000G)。将200μl血浆转移到Micronic管中,用于测量IL-22的衍生物或比较物,并存储在-20℃下直至分析。
(iii)样本处理
IL-22衍生物或比较物的血浆水平使用如前所述的内部开发的发光氧通道
Figure BDA0003630325010000371
测定来测量(Poulsen等人J Biomol Screen,2007,12(2):240-7)。在测定过程中,产生了一种浓度依赖性的珠粒-分析物-免疫复合物,产生光输出,将其在Perkin ElmerEnvision读取器上进行测量。如前所述进行抗体与珠粒的偶联、抗体的生物素化和LOCI测定程序(Petersen等人,J Pharmaceut Biomed,2010,51(1):217-24)。校准物和质量控制(QC)样本在与研究样本相同的基质中产生。对所有测试样本的测定精密度(%CV)进行了评估并显示低于20%。
该测定使用抗人IL-22单克隆抗体(R&D Systems MAB7822)缀合的受体珠粒以及生物素化单克隆抗体(R&D Systems BAM7821;针对人IL-22产生)和通用链霉亲和素包被的供体珠粒。大鼠血浆中人IL-22的定量下限(LLOQ)为4pM。然而,每个衍生物或比较物都是针对同一衍生物的校准物行进行测量的。测量每种衍生物或比较物对hIL-22的交叉反应性,并用于调整测定灵敏度。
使用Phoenix WinNonlin Professional 6.4(Pharsight Inc)中的非隔室分析(NCA)测量小型猪的血浆浓度-时间曲线。使用单个浓度、加权1/(Y*Y)和使用线性对数梯形进行计算。使用静脉给药是因为循环消除半衰期(T1/2)是主要筛选参数。清除率和分布体积是次要的所关注参数,因此是研究第1天频繁采集血样的原因。
为评估小鼠和大鼠的药代动力学而测量的唯一参数是循环消除半衰期(T1/2)。在小型猪中,测量的其他参数是施用药物后的最大(峰值)血浆浓度(Cmax)、达到Cmax的时间(Tmax)、针对药物剂量标准化的血浆药物浓度-时间曲线下面积(AUC;其反映施用一定剂量的药物之后身体对药物的实际暴露量)(AUC/D),平均滞留时间(MRT;即药物在吸收完成后在消除之前在体内度过的时间)、所施用剂量的平均吸收时间(MAT)和全身利用度(即生物利用度;F)。将MAT计算为皮下施用后的MRT(MRTSC)减去静脉内施用后的MRT(MRTIV)。
结果
表7显示了在小鼠中获得的结果,表8显示了在大鼠中获得的结果,并且表9和表10显示了在小型猪中获得的结果。ND=未确定。IV=静脉内施用。SC=皮下施用。
Figure BDA0003630325010000381
表7:在小鼠中获得的药代动力学数据
如表7中所示,仅具有骨架变异的hIL-22变体(比较物1和3)具有短循环半衰期,无论施用途径如何。用Fc融合物(hFc-hIL-22)进行的延伸显著增加了半衰期。脂肪酸(C18二酸;衍生物1和6)的共价连接导致小鼠体内的中等循环半衰期。与静脉内施用相比,在皮下施用时,IL-22的衍生物在小鼠体内的循环时间更长。
Figure BDA0003630325010000382
表8:在大鼠中获得的药代动力学数据
如表8中所示,仅具有骨架变异的hIL-22变体(比较物1)具有短循环半衰期。脂肪酸的共价(衍生物1、3和6)连接导致在大鼠中的循环半衰期增加,而与采用的脂肪酸(C16与C18二酸)和施用途径无关。与静脉内施用相比,在皮下施用时,IL-22衍生物的循环时间通常更长。
Figure BDA0003630325010000391
表9:在小型猪中获得的药代动力学数据
如表9中所示,仅具有骨架变异的hIL-22变体(比较物1和2)具有短循环半衰期,与hIL-22相当。比较物Fc融合物(hFc-hIL-22)和IL-22的所有衍生物(衍生物1、6和10)具有显著增加的循环半衰期。当静脉内施用时,IL-22的衍生物在小型猪中的循环半衰期超过50小时,这与比较物IL-22-Fc融合物相当。
Figure BDA0003630325010000392
表10:在小型猪中获得的药代动力学数据
如表10中所示,与比较物Fc融合物(hFc-IL-22)相比,IL-22的衍生物(衍生物6)证明了更快的MAT。MAT比简单地比较Tmax更精确地衡量药物摄取,因为其还考虑了Cmax的差异(Tmax受剂量和Cmax的影响)。这项研究使用小型猪而不是小鼠或大鼠,因为其与人相似。
结论
已知的脂肪酸烷基化GLP-1衍生物索马鲁肽在小型猪中的半衰期为46小时(Lau等人,J Med Chem,2015,58(18):7370-80),并且在人中的半衰期为160小时,对应于峰谷比为2的每周一次给药曲线。Fc融合物GLP-1衍生物度拉糖肽(dulaglutide)的半衰期相似。
所证明的IL-22的衍生物在小型猪中的半衰期在皮下施用时为至少40小时并且在静脉内施用时超过50小时,因此假设其对应于在人中峰谷比为2的每周一次的给药曲线。
因此,数据显示本发明的衍生物提高了IL-22的循环半衰期并展现出优化的药代动力学和药效学特性,因此为各种适应症提供了新的和改进的治疗,所述适应症包括代谢、肝脏、肺部、肠道、肾脏、眼睛、胸腺、胰腺和皮肤疾病、病症和疾患。
实施例2-体外效力研究
方法
采用两种体外测定来研究效力。
第一个是BHK细胞中的报告基因测定,所述细胞已经IL-22Ra、IL-10Rb和具有STAT3诱导的启动子的荧光素酶三重转染。这是一种高度灵敏、高通量的测定,其可测量IL-22受体介导的STAT3活化。
使用以下质粒产生稳定的报告BHK细胞系:(i)pcDNA3,1hygro(+)中的hIL-10Rb、(ii)pcDNA3,1(Zeocin)中的IL22R和(iii)pGL4.20中的2xKZdel2。因此,该细胞系在pSTAT3驱动的启动子的控制下表达人IL-10Rb、人IL-22Ra和荧光素酶报告蛋白。
在测定方案的第0天,在96孔板(Corning#3842,黑色,透明底部)中以15,000至20,000个细胞/孔将细胞接种在基础培养基(500ml:DMEM+Glutamax(Gibco,目录号:31966-021)、10%(w/v)胎牛血清(FCS;含有白蛋白)(50ml)和1%(w/v)青霉素-链霉素(P/S)(5ml))中。第1天,通过翻转板移除培养基。以每孔50μl添加新鲜的基础培养基,并且培养细胞60分钟。
将IL-22的衍生物与hIL-22和作为比较物的仅具有骨架变异的hIL-22变体一起进行测试。用于测试每种衍生物或比较物的动物数量‘n‘在1至36的范围内。
因此,将50μl稀释的衍生物或比较物(在基础培养基中稀释)添加到每个孔中,并将板静置四小时。因此,衍生物和比较物经2倍稀释,因为其被稀释到孔中已有的50μl培养基中。四小时后通过添加100μl Steadylite plus试剂(Perkin Elmer目录号6066759)终止刺激。用TopSeal A密封板,以450rpm摇动15分钟,然后不迟于12小时后使用Mithras或类似系统读取。
使用Graphpad Prism进行数据分析。评估每种衍生物或比较物的半数最大有效浓度(EC50)作为衡量其效力的量度。EC50是使用对数(化合物)与反应-可变斜率(4p)确定。作为标准,将Hill斜率被限制为1。
第二个体外效力测定测量了HepG2细胞中的pSTAT3,所述细胞是内源性表达IL-22Ra和IL-10Rb的人肝源性细胞系。
第1天,以25,000至30,000个细胞/孔将HepG2细胞接种在96孔板(Biocoat#35-4407Becton Dickinson)中。用于接种和传代的细胞培养基是DMEM(1x)+25mM(4.5g/l)葡萄糖、-丙酮酸(Gibco,目录号61965-026)+10%(w/v)FCS+1%(w/v)P/S。在第2天,细胞已准备好进行测定。用DMEM(Gibco,目录号61965-026)中的0.1%(w/v)FCS(即极低的白蛋白浓度)使细胞饥饿—将50μl添加到每个孔中并静置60分钟。
使用技术重复以每种衍生物或比较物的七种浓度作为标准(0.001、0.01、0.1、1、10、100、1000nM)进行测试。因此,将50μl经稀释的衍生物或比较物(稀释于DMEM中的0.1%(w/v)FCS中)添加到各孔中且将板静置15分钟。因此,衍生物和比较物经2倍稀释,因为其被稀释到孔中已有的50μl培养基中。为了使细胞裂解,从细胞中移除培养基,并向每个孔中添加50μl新鲜制备的1×裂解缓冲液(试剂盒中的SureFire裂解缓冲液)。将板在室温下以350rpm搅拌10分钟。
遵循
Figure BDA0003630325010000421
STAT3(p-Tyr705)测定方案(Perkin Elmer目录号TGRS3S(500-10K-50K))来测量IL-22诱导的STAT3磷酸化。在这方面,将4μl裂解物转移到384孔proxiplate中进行测定(添加4μl阳性和阴性对照)。在即将使用之前制备接受体混合物(通过在反应缓冲液中将活化缓冲液稀释5倍并在稀释的缓冲液中将受体珠粒稀释50倍)。将5μl接受体混合物添加到每个孔中,将板用Topseal A粘合膜密封并在室温下孵育两小时。在即将使用之前制备供体混合物(通过在稀释缓冲液中将供体珠粒稀释20倍)。在弱光下将2μl供体混合物添加到孔中。将板再次用Topseal A粘合膜密封并在室温下孵育两小时。在与Alpha Technology兼容的板式读取器上读取该板。
使用Graphpad Prism进行数据分析。首先,在Prism中使用对数(化合物)与反应–可变斜率(4p)分析进行非线性回归。Hill斜率被限制为1。然后将来自对照化合物(His标记的hIL-22或hIL-22)的Y=top用于Prism中的标准化。0%被设置为每个数据集中的最小值,并且100%被设置为上述非线性回归(用于对照)的Y=top。如上所述重复非线性回归,并且测试衍生物的活性/重量百分比和EC50分别在顶部和EC50下的结果中读取。
结果
表11显示了在BHK细胞报告基因测定中测量的关键衍生物和比较物的EC50,其用于IL-22受体介导的STAT3活化。
ID EC<sub>50</sub>(nM)
hIL-22 0.07
比较物1 0.06
比较物5 0.19
比较物14 0.09
衍生物1 0.48
衍生物3 0.30
衍生物4 0.18
衍生物6 0.61
衍生物7 0.09
衍生物8 1.24
衍生物9 0.28
衍生物10 0.37
表11:BH细胞测定中关键衍生物和比较物的EC50
由于BHK细胞测定含有大量白蛋白,因此在测试衍生物时,测得的EC50结合了白蛋白结合的影响。
比较物4,一种仅具有骨架变异的IL-22变体,显示为与hIL-22等效。衍生物3与比较物4具有相同的骨架,但共价连接至中等亲和力白蛋白结合剂(C16二酸),其表现出与hIL-22相比效力降低四倍。同样具有相同骨架但共价连接至高亲和力白蛋白结合剂(C18二酸)的衍生物1仅表现出与hIL-22相比效力降低七倍。
通过比较衍生物6至9的结果,在35Q、64Q背景(即三个IL-22糖基化位点中的两个发生突变)中进行了烷基化位置和骨架变异的扫描。这些衍生物中的共价连接位点是基于对IL-22结构的分析选择的,该结构鉴定了预期暴露于表面且不参与受体结合的位置。用这些衍生物获得的结果表明,Cys取代和脂肪酸共价连接在若干(选择)位置是可以容忍的,这对发明人来说是出人意料的。
表12显示了在pSTAT3的HepG2细胞测定中测量的关键衍生物和比较物的EC50
ID EC<sub>50</sub>(nM)
hIL-22 3.88
比较物1 4.73
比较物4 12.11
衍生物1 10.13
衍生物2 6.98
衍生物6 14.86
表12:HepG2细胞测定中关键衍生物和比较物的EC50
在具有内源性受体表达水平、信号放大很少且没有白蛋白的HepG2细胞测定中,与hIL-22相比,衍生物1的效力降低了2.5倍(类似于比较物4,一种与衍生物1具有相同骨架但不含脂肪酸的hIL-22变体)。
表13整理了BHK和HepG2细胞测定的结果,以评估N端延伸中的脂肪酸共价连接和糖基化位点的突变。ND=未确定。
Figure BDA0003630325010000441
表13:BHK和HepG2细胞测定中关键衍生物和hIL-22的EC50
衍生物6与衍生物1的不同之处在于额外的N35Q和N64Q取代(三个糖基化位点中有两个发生突变),但其是等效的(倾向于衍生物6的效力略低)。
虽然衍生物2和4具有15聚体N端延伸,在延伸中具有用于脂肪酸连接的Cys残基(-7C),但令人惊讶的是,其显示出良好的耐受性。
结论
在本发明的测试衍生物中通过脂肪酸共价连接观察到的效力降低主要是由白蛋白结合驱动的,而骨架取代几乎没有贡献。比较物4和hIL-22惊人的等效性证明了这一点。相比之下,并且如前所述,Genentech报道了其IL-22的Fc融合物的体外效力降低了34倍。
在白蛋白水平极低的HepG2细胞测定中,与hIL-22相比,衍生物1(IL-22的衍生物,其在BHK测定(与白蛋白结合)中显示效力降低七倍)仅显示效力降低2.5倍。
衍生物1和6的等效性(表13)显示出35Q和64Q突变具有出人意料的耐受性而不影响效力。
因此,IL-22的衍生物在存在白蛋白的情况下保持高效力,并且在不存在白蛋白的情况下与hIL-22几乎等效。Cys取代和脂肪酸共价连接在若干位置是可以耐受的。
因此,数据显示本发明的衍生物展现出良好的生物利用度和效力,因此为各种适应症提供新的和改进的治疗,所述适应症包括代谢、肝脏、肺部、肠道、肾脏和皮肤疾病、病症和疾患。
实施例3–糖尿病方面的体内功效研究
该研究旨在探究在糖尿病小鼠模型中每天一次给药本发明的衍生物持续8至16天的效果。该研究是在治疗(而非预防)模式下进行的,这意味着在开始给药之前就已经发展了糖尿病病理学。由于小鼠模型具有脂肪肝(瘦素受体敲除),因此其也可用作肝脏疾病的代谢模型。
方法
从Charles River实验室(第-10天)获得7至8周龄的雄性C57BKS db/db小鼠,并在实验开始前使所述小鼠适应至少一周。到达后一周(第-3天),将小鼠随机分组并以10只为一组圈养(或单独圈养以进行食物摄入研究)。在研究的第-3天和第1至16天的每一天,测量血糖和食物摄入。
将IL-22的衍生物(衍生物1)与作为比较物的IL-22的Fc融合物(hFc-hIL-22)和仅作为阴性对照的媒介物一起进行测试。在糖尿病db/db小鼠(每组中n=6至10)中,在第1至16天的每一天以0.1、0.25、0.5或1.0mg/kg的每日一次剂量皮下施用每种剂。衍生物/比较物/对照给药后,食物摄入减少。
在研究持续期间每天测量血糖。终止时在麻醉小鼠中采集眼部血样。将500μl血液收集到EDTA管中。将样本保存在冰上并在20分钟内在4℃下以6000G离心五分钟。将血浆分离到0.75ml micronic管中并立即冷冻以供以后测量组分浓度。
除了测量衍生物或比较物浓度外,还在研究结束时测量了靶标参与生物标志物(肝源性急性期蛋白、触珠蛋白和血清淀粉样蛋白P组分(SAP)以及肠道源性肽YY(PYY))的血浆水平。根据制造商说明书,使用商业试剂盒在COBAS仪器(Roche Diagnostics)上测量触珠蛋白。根据制造商说明书,用识别小鼠和大鼠PYY的商业ELISA测定(ALPCO)测量PYY。根据制造商说明书,使用识别小鼠Pentraxin2/SAP的商业ELISA测定(R&D Systems)测量SAP。
结果
整个研究期间的血糖水平示出于图5和图6A中。
从图5可以看出,与媒介物对照相比,hIL-22和仅具有骨架变异的hIL-22变体(比较物3)在研究过程中未能降低血糖。
从图6A可以看出,尽管hFc-hIL-22的靶标参与更高,反映了特定研究中较高的稳态暴露水平,但在研究的最后几天,衍生物1和hFc-hIL-22以相当的方式均降低血糖至正常水平,其中衍生物1的功效略高。与媒介物对照相比,在治疗过的动物中观察到食物摄入减少(参见图6B)。因此,所测试的衍生物以与hFc-hIL-22相似的方式使db/db模型中的血糖标准化;如上所述,使用hIL-22或比较物3未观察到这种效果。
在研究结束时测量的靶标参与生物标志物触珠蛋白、SAP和PYY的水平分别示出在图7A至图7C中。从图中可以看出,所有三个靶标参与生物标志物都由所测试的衍生物和hFc-hIL-22上调,hFc-hIL-22上调的尤其比衍生物1多。
图8显示了衍生物6(本发明的另一种衍生物,其与衍生物1相同,但在两个糖基化位点有另外的取代)的剂量反应数据。所测试的所有三种剂量(0.1、0.25和0.5m/kg)随着时间的推移在降低血糖方面都是有效的,并且随着浓度的增加而逐渐显示尤其如此。
结论
测试的衍生物和hFc-hIL-22均使db/db模型中的血糖标准化,从而证明了体内治疗效果。重要的是,在hIL-22给药时没有观察到这种效果,这表明用长效衍生物和Fc融合物获得的慢性暴露对于治疗效果是必要的。虽然抗糖尿病效果的作用方式尚未完全阐明,但认为IL-22对肝脏的作用(肝糖异生和脂肪生成)是主要贡献。
用本发明的衍生物治疗也显示食物摄入减少,因此证明了作为肥胖治疗的功效。
还观察到靶标参与生物标志物被衍生物和hFc-hIL-22上调。已知在db/db小鼠中测量的特定生物标志物可以转化为人。
需要注意的是,皮下施用的hFc-hIL-22的循环半衰期(T1/2)高于衍生物1,特别是在小鼠中(T1/2分别为20和8小时;参见表7)。因此,hFc-hIL-22在稳态时的暴露较高。观察结果进一步证实了这一点,即hFc-hIL-22组中的靶标参与生物标志物(触珠蛋白、SAP和PYY)高于衍生物1组(图7),这表明在所示实验中靶标参与本身更高。因此,尽管暴露和靶标参与更高,但在为期16天的给药研究的最后三天中,与本发明的衍生物(衍生物1)相比,Fc融合物(hFc-hIL-22)的功效较差。
因此,数据显示,本发明的衍生物在糖尿病和肝病小鼠模型中表现出良好的治疗功效。由于已知在db/db小鼠中测量的特定生物标志物可以转化为人,因此可以合理地预测这种治疗功效也会转化。
实施例4-肝损伤方面的体内功效研究(i)
该研究旨在探究给药本发明的衍生物在肝损伤小鼠模型中的效果。该研究是在预防模式下进行的,这意味着只有在开始给药后才会诱导肝损伤。
方法
获得10周龄的C57Bl/6Rj小鼠并在研究开始前适应一周。用单次腹膜内剂量(300mg/kg、20ml/kg)的APAP诱导肝损伤。将IL-22的测试衍生物(衍生物1和6)在APAP给药前2小时以1.5mg/kg的剂量与媒介物对照一起皮下给药(n=5至10)。该研究在APAP给药后24小时终止。为测量血浆丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)采集末梢血。
将血样收集在肝素化试管中,分离血浆并存储在-80℃直至分析。根据制造商说明书,在COBAS c501自动分析仪上使用商业试剂盒(Roche Diagnostics)测量ALT和AST。
对肝脏进行福尔马林固定和石蜡包埋以进行组织学分析。
通过ki67免疫组织化学(IHC)染色测量增殖。使用VIS软件(Visiopharm,Denmark)通过图像分析对IHC阳性染色进行量化。
在末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)测定中测量细胞凋亡。简单来说,将具有石蜡包埋切片的载玻片在二甲苯中脱石蜡并在一系列分级乙醇中再水化。用蛋白酶K预处理载玻片,并且用过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性。将TUNEL混合物(原位细胞死亡检测试剂盒,POD,Roche)添加到载玻片上,然后用辣根过氧化物酶(HRP)进行扩增,并通过二氨基联苯胺(DAB)(Chromogen)进行可视化。最后,将载玻片在苏木精中复染并盖上盖玻片。
结果
研究结束时的血浆ALT和AST水平分别示出在图9A和图9B中。与媒介物/APAP对照相比,在肝损伤前用衍生物1或6治疗的小鼠中显示出ALT和AST的量显著降低。
研究结束时,TUNEL和ki67阳性细胞的数量分别示出在图10A和图6B中。与媒介物/APAP对照相比,在肝损伤前用衍生物1或6治疗的小鼠中TUNEL阳性细胞的量(显著)减少。在APAP处理组中,ki67阳性细胞的量相当。
结论
ALT和AST是用作肝损伤指标的肝酶。因此,显示衍生物1和6可保护肝脏免受APAP诱导的损伤。
TUNEL测定的结果显示,与媒介物/APAP对照相比,衍生物1和6防止肝损伤引起的细胞凋亡。然而,细胞增殖不受IL-22的这些衍生物的影响。由于增殖在生理上作为对损伤的响应而被上调(如在对照中所见),结果表明衍生物1和6的增殖作用,因为损伤减少后增殖未减少(增殖与损伤的比率增加)。
因此,数据显示,本发明的衍生物在小鼠模型中展现了在保护免受肝损伤方面的良好功效。已知在小鼠中测量的特定生物标志物可以转化为人,因此可以合理地预测观察到的保护作用也会转化。
实施例5-肺损伤方面的体内功效研究
该研究旨在探究给药本发明的衍生物在肺损伤大鼠模型中的效果。该研究是在预防和治疗模式下进行的,这意味着在诱导肺损伤之前开始给药,然后继续给药。
方法
为了诱导肺损伤,在第1天通过口咽抽吸将100μl博莱霉素作为单剂量施用于雄性Sprague Dawley大鼠的肺(第2至第6组)。盐水作为阴性对照施用(第1组)。
从第-1天到第3天,每天一次(通过皮下注射)分别以0.5、1.5或4.5mg/kg向第3、4和5组的动物给药衍生物6。从第-1天到第3天,每天一次(通过口服管饲法)以10mg/kg向第6组的动物给药泼尼松龙。
为了测量来自大鼠的支气管肺泡灌洗液(BALF)中的可溶性胶原蛋白,用无菌PBS(不含钙和镁)(包含添加的蛋白酶抑制剂混合物)对肺进行灌洗(3×4ml),并将每只动物的灌洗液放入一个管中。使用可溶性胶原蛋白测定Sircol S1000(Biocolor)(Charles RiverLaboratories)测量在BALF上清液中的可溶性胶原蛋白。
在第4天(终末安乐死)提交所有动物进行尸检。收集所有动物的右肺进行组织病理学检查,并用10%中性缓冲福尔马林(NBF)充气固定,然后浸入固定在NBF中。从右尾肺叶修剪三个平行的纵向切片并固定在盒01中。右肺顶叶、中肺叶和副肺叶也被纵向切开并固定在盒02中。
由每个盒制作两个载玻片;一个载玻片用苏木精和伊红(eosin)(H&E)染色,而另一个载玻片用苏木精和苦天狼星红(picrosirius red)(H&PSR)染色。
然后使用随机数生成器为每个载玻片分配一个随机数。识别密钥记录在Microsoft Excel电子表格中,并在载玻片评估后向研究病理学家提供一份副本。因此,每个肺的六个切片是盲读的。
然后兽医病理学家对每个H&E染色载玻片上的每个切片的炎症严重程度进行评分(其中0=不存在,1=极小,2=轻度,3=中度和4=严重)。计算每组的平均评分和中值评分。病理学家还对每个H&PSR染色载玻片上的每个切片的纤维化严重程度进行评分(使用修改后的Ashcroft评分,从0=低到8=高)。计算每组的平均评分和中值评分,并对其进行非参数ANOVA、Kruskal-Wallis后测分析。
结果
表14中显示了显微镜检查结果的总结,其揭示了每组的炎症和纤维化的平均和中值评分。
Figure BDA0003630325010000511
Figure BDA0003630325010000521
表14:肺损伤大鼠模型中的显微镜检查结果总结
如通过比较表14中的第1组和第2组所证明的,博来霉素在大鼠模型中诱导了肺部炎症和纤维化。在第3至5组中,即用本发明的衍生物(衍生物6)处理的大鼠中,平均和中位评分较低。这些较低的评分与在用泼尼松龙处理的大鼠(第6组)中观察到的评分相当。
研究中每只动物的中位炎症和纤维化评分也分别示出在图11A和图11B中。
如图11A中所示,与阴性对照(第1组)相比,博来霉素/媒介物对照(第2组)的组中值炎症评分增加。与博来霉素/媒介物对照相比,用衍生物6和泼尼松龙(第6组)处理的大鼠中,组中值炎症评分降低(并且在高剂量组5中显著降低)。
如图11B中所示,与阴性对照(第1组)相比,博来霉素/媒介物对照(第2组)的组中值纤维化评分增加。然而,与博来霉素/媒介物对照相比但不与对照泼尼松龙相比,用衍生物6处理的大鼠的组中值纤维化评分降低(并且在高剂量第5组中显著降低)。
如图11C中所示,与阴性对照(第1组)相比,博来霉素/媒介物对照(第2组)中在博莱霉素诱导的肺损伤后BALF中的可溶性胶原蛋白的量增加,而其并未通过用泼尼松龙处理而减少(第6组)。然而,与博来霉素/媒介物对照相比,在用衍生物6(在所有测试剂量中)处理的大鼠的BALF中观察到可溶性胶原蛋白的量显著减少。由于BALF中的可溶性胶原蛋白是纤维化的读出(read-out),因此这些结果证实了上面刚刚报道的组织学数据。
结论
显微镜研究的结果表明,本发明的衍生物能够预防和/或减少大鼠模型中博来霉素诱导的肺部炎症和纤维化。在炎症方面观察到的效果与用泼尼松龙(一种已知用于治疗肺部炎症的皮质类固醇)观察到的效果相当。然而,本发明的衍生物对纤维化具有独特的作用,这是泼尼松龙所没有的。
实施例6-结肠炎方面的体内功效研究
此研究旨在探究在结肠炎小鼠模型中给药本发明衍生物的效果。该研究是在预防和治疗两种模式下进行的,这意味着在诱导结肠炎症的同一天开始给药,然后继续给药。
方法
根据体重将喂食的雌性C57Bl/6JRj小鼠随机分为五组(每组n=8)。DSS用于在五组中的四组中诱导结肠炎。从研究的第0天到第6天,这些小鼠在其饮用水中接受DSS达7天。在第五组中,动物接受没有DSS的水,因此用作健康对照。从研究第0天开始,将DSS小鼠用媒介物、IL-22的测试衍生物(衍生物6;以0.35mg/kg或1mg/kg腹膜内给药)或作为比较物的IL-22-Fc融合物(hFc-hIL-22;以0.5mg/kg腹膜内给药)处理,每天一次,持续10天。每天监测体重、食物和水的摄入。
在研究第10天,将小鼠的血样收集在EDTA管中,并且分离血浆,并存储在-80℃直至分析。根据制造商说明书,使用ELISA试剂盒(Cloud-Clone Corp)一式两份测量再生胰岛衍生蛋白3γ(Reg3g)。Reg3g是IL-22的靶标参与标志物。
终止时,取出肠进行体视学分析。因此,在取样前用冰冷的盐水冲洗肠道并轻轻移除其内容物。
使肠在福尔马林中渗透过夜(Tissue-Tek VIP),随后包埋进石蜡块中。然后使用系统均匀随机取样(SURS)原则,从近端到远端方向对福尔马林固定的肠进行取样,得到总共四个切块并放置在多用包埋盒(multi-cassette)中。所有组织切块都以这样的方式放置,以便在稍后阶段可以鉴别单个切块。修整石蜡块,切下5μm的顶部切片并固定在Superfrost+物镜上。对于大肠,在距离顶部部分500μm的地方切下另一切片,由此从每只动物得到总共八个结肠切片。
以立体学方式(即使用结肠二维横断面的三维解释)测量结肠炎症体积。使用newCAST系统(Visiopharm)在扫描的H&E染色载玻片上进行体视学体积估计。总肠道体积、粘膜体积、粘膜下层和肌层的体积以及发炎组织的体积通过使用适当尺寸的网格系统的点计数来估计,其中所有击中所关注结构的点都被计数。根据以下数学关系将击中所关注结构的点的数量转换为体积:
Volref=∑p·A(p)·t
其中A(p)是每个点的面积,p是击中所关注结构的点的总数,并且t是各部分之间的距离。计算每组的平均炎症体积并进行统计分析。
在终止时还通过查看H&E染色载玻片评估结肠形态。
结果
结肠炎症体积显示于图12中。与媒介物对照(也含有DSS)相比,用任一剂量的衍生物6处理的小鼠都显示出炎症得到预防。值得注意的是,在用衍生物6处理的组中,炎症保持在正常水平,处理组的结肠炎症体积与健康对照组(不含DSS的媒介物)相同就证明了这一点。对于用hFc-hIL-22处理的组也是如此。
终止时结肠形态的代表性H&E染色图像显示于图13中。在DSS处理后,可以在媒介物处理的动物中发现粘膜上皮损伤(用黑色箭头标记),但没有在用任何剂量的衍生物6或hFc-hIL-22处理的动物中发现。这证明了对上皮组织的保护作用。
血浆Reg3g水平显示于图14中。DSS处理诱导了基础Reg3g水平的增加(将媒介物与不含DSS的媒介物进行比较)。在低剂量(0.35mg/kg)衍生物6组中未检测到进一步增加,但在较高剂量(1mg/kg)衍生物6组和hFc-hIL-22组中发现了进一步增加。与衍生物6(1mg/kg)组相比,hFc-hIL-22(0.5mg/kg)组中较高的Reg3g水平表明,尽管剂量较低,但靶标参与较高,这可能与hFc-hIL-22在小鼠中的半衰期较长有关(hFc-hIL-22的T1/2为30个小时,而衍生物6的T1/2为9.1个小时)。
结论
因此,数据显示,本发明的衍生物在小鼠模型中证明了在保护免受结肠炎及粘膜上皮受伤方面的良好功效。这表明已经发现了一种新的和改进的肠道疾病、病症和疾患的治疗。特别是,这些发现证明了治疗以粘膜上皮损伤为特征的疾病(例如炎症性肠病)的潜力。
实施例7-肝损伤方面的体内功效研究(ii)
此研究旨在探究在第二种肝损伤小鼠模型(第一种在上文实施例4中描述)中给药本发明衍生物的效果。该研究是在预防模式下进行的,这意味着只有在开始给药后才会诱导肝损伤。
方法
将C57Bl6/6j雄性小鼠分为五组(每组n=8)。相对于ConA处理,在-26小时和-2小时,在五个组中的两个组中以1mg/kg腹膜内给药IL-22的测试衍生物(衍生物1)。另外两组仅在这些时间点接受媒介物。ConA以15mg/kg的剂量在30秒时段内以静脉推注的形式给予所有四组,以诱导肝损伤。作为健康对照,第五组未接受ConA(如上仅接受媒介物)。
ConA注射后8或24小时,将小鼠置于异氟醚麻醉下,并且通过心脏穿刺采集最大体积的血液(使用含有凝块活化剂的聚丙烯血清凝胶管)。在8小时的时间点处死未接受处理的小鼠(第5组)。通过将管倒置数次,将每支管中的血液与的凝血活化剂混合。将管在室温下保持15分钟,然后在4℃以2000g离心10分钟。根据制造商说明书,使用自动化系统(Konelab 20)测量血清样本中的ALT和AST。
结果
研究结束时的ALT及AST血浆水平分别显示于图15A和图15B中。在测试的两个时间点,与媒介物/ConA对照相比,在肝损伤之前用衍生物1处理的小鼠中的ALT和AST的量显示出减少。
结论
ALT和AST是用作肝损伤指标的肝酶。因此,显示衍生物1会保护肝脏免于ConA诱导的损伤,正如其在实施例4中针对APAP诱导的损伤的作用一样。已知在小鼠中测量的特定生物标志物可以转化为人,因此可以合理地预测观察到的保护作用也会转化。
实施例8-肥胖和NASH方面的体内功效研究
此研究旨在探究在肥胖和NASH小鼠模型中给药本发明衍生物的效果。该研究是在治疗(非预防)模式下进行的,这意味着在开始给药之前就发展了肥胖及NASH病理学。
方法
饮食诱导的肥胖小鼠模型是基于雄性C57BL/6JRj小鼠,在实验前至少30周向其喂食了高脂肪饮食。该饮食富含脂肪(40%)、果糖(22%)和胆固醇(2%)(Research DietsD09100310)。这导致了肥胖、NAFLD,并最终导致NASH。
在第一剂测试衍生物(或其他)前六天将动物单独圈养,并在整个实验过程中每天监测体重。将小鼠分为六组(每组n=12)。在研究第0天开始给药(在图16中用虚线指示),并按下列剂量每天一次皮下施用。
索马鲁肽是一种长效GLP-1受体激动剂,在第一组中用作阳性对照,并在第二组中与IL-22的测试衍生物(衍生物6)组合进行了研究。索马鲁肽的剂量按照以下时间表逐步滴定:第0天0.6nmol/kg-第1天1.2nmol/kg-第2天2.4nmol/kg-第3天4.8nmol/kg-第4天12nmol/kg-第5天30nmol/kg。在组合组中,在索马鲁肽处理组中体重减轻达到平台期后,在第0天开始给药索马鲁肽,并在第12天开始给药衍生物6(在图16中用虚线指示)。
第三个“高剂量”组中的衍生物6的剂量按照以下时间表逐步滴定:第0天0.05mg/kg-第1天0.1mg/kg-第2天0.15mg/kg-第3天0.2mg/kg-第4天0.25mg/kg。在第14天,剂量从0.25mg/kg切换到0.1mg/kg(在图16中用虚线表示)。在第四个“低剂量”组中,衍生物6的剂量从0.05mg/kg开始,无需进一步滴定。
在第五组中,作为比较物的IL-22-Fc融合物(hFc-hIL-22)的剂量按照以下时间表逐步滴定:第0天0.02mg/kg-第1天0.04mg/kg-第2天0.06mg/kg-第3天0.08mg/kg-第4天0.1mg/kg。基于与实施例6中所见的衍生物6相比更长的半衰期和相应更高的靶标参与(参见图14),选择hFc-hIL-22的剂量以匹配0.25mg/kg衍生物6组的靶标参与。
仅对第六组给药媒介物而作为阴性对照。
在给药开始后的基线(第-2天)、第2周(第14天)和第4周(第28天)测量血浆甘油三酯(TG)水平。具体来说,通过将体积等于或低于200μl的尾血压入用适当抗凝剂处理的开放Microvette(100μl或200μl)管中,收集尾血样本用于分析。将血液置于4℃直至以3000g离心10分钟。将血浆上清液转移到新管中并立即在干冰上冷冻并存储在-80℃。根据制造商说明书,在
Figure BDA0003630325010000571
c 501自动分析仪上使用商业试剂盒(Roche Diagnostics)测量TG水平。
结果
实验过程中的体重示于图16中。
该研究证明了衍生物6在降低肥胖小鼠模型的体重方面的剂量依赖性高功效。此外,其还展现出与GLP-1受体激动剂(索马鲁肽)的累加性,该药物正在肥胖治疗的后期临床试验中进行研究。数据表明,与hFc-hIL-22相比,衍生物6在诱导体重减轻方面具有优势。重要的是,hFc-hIL-22在小鼠中的半衰期比衍生物6长,并且即使以衍生物6的一半剂量给药时也展现出更高的靶标参与。因此,本研究中使用的0.1mg/kg hFc-hIL-22的剂量被选择用于与0.25mg/kg衍生物6组相似的靶标参与。
此处在饮食诱导的肥胖小鼠中观察到对由衍生物6诱导的体重减轻的敏感性,但并未在瘦小鼠中观察到该敏感性。例如,在每天一次给药的为期10天的DSS诱导的结肠炎研究(实施例6)中,DSS/媒介物组和DSS/衍生物6(0.35mg/kg)组在研究开始时的体重均为19.0g。在研究结束时,DSS/媒介物组中的体重为17.6克,而DSS/衍生物6(0.35mg/kg)组中的体重为17.4克,两者没有差异(在未配对学生t检验(students t-test)中,p=0.82)。相比之下,在本研究的第10天,媒介物组和衍生物6(0.25mg/kg)组中的小鼠体重分别为43.5g和35.2g。因此,与媒介物组相比,在衍生物6组中观察到显著的体重减轻(在第10天的未配对学生t检验中,p<0.0001)。在研究开始时,媒介物组中的体重与衍生物6组相似(分别为44.3g和44.1g)。
在开始给药后的基线(第-2天)、第2周(第14天)及第4周(第28天)测量的血浆TG水平显示于表15中。
Figure BDA0003630325010000591
表15:肥胖和NASH小鼠模型中的血浆TG水平(nmol/l)
Δ是指指定处理及时间点的TG水平(nmol/l)相对于基线的变化。如从表15可以看出,媒介物组的水平变化为正(增加),但所有其他组的水平变化为负(降低)。
衍生物6在降低TG水平方面比索马鲁肽具有更高的功效,在低剂量时也是如此,这导致比索马鲁肽更少的体重减轻(例如,索马鲁肽的第4周ΔTG水平(nmol/l)为-0.14±0.066,衍生物6(0.05mg/kg)的第4周ΔTG水平为-0.30±0.034,并且衍生物6(0.25/0.1mg/kg)的第4周ΔTG水平为-0.35±0.052)。结果表明,衍生物6在TG降低方面具有高功效,其部分与体重减轻效果无关。此外,衍生物6效果与索马鲁肽有完全累加性。在第4周,以ΔTG计算的TG水平(nmol/l)降低:对于衍生物6(0.05mg/kg)为-0.30±0.034,对于索马鲁肽为-0.14±0.066,并且对于索马鲁肽+衍生物6(0.05mg/kg)为-0.53±0.042。尽管媒介物组中的TG水平在研究过程中增加,但与基线(ΔTG)相比,TG降低。
结论
研究表明,本发明的衍生物(衍生物6)可以以剂量依赖性方式诱导肥胖小鼠的体重减轻,至少达到与使用索马鲁肽(一种用作阳性对照的长效GLP-1受体激动剂)观测到的相当的水平。此外,使用索马鲁肽和衍生物6的组合对体重减轻有累加效果。衍生物6在诱导体重减轻方面的功效高于在经选择以提供相似水平的靶标参与的剂量下使用hFc-IL-h22观察到的功效。在DSS处理的瘦小鼠中未观察到在饮食诱导的肥胖小鼠中衍生物6诱导的体重减轻,表明肥胖小鼠对衍生物6诱导的体重减轻更敏感。由于在饮食诱导的肥胖小鼠中观察到的体重减轻与在人中使用的读出相同,因此可以合理地预测观察到的体重减轻也会转化。
衍生物6还显示了在降低TG水平方面的高功效。衍生物6在测试的两种剂量下均显示出比索马鲁肽更高的功效,并且观察到组合给药的功效的完全累加性。鉴于0.05mg/kg剂量的衍生物6具有比索马鲁肽更高的功效,尽管体重减轻较少,仍可以得出结论:衍生物6的TG降低效果至少部分与体重减轻无关。此外,在两种测试剂量下,衍生物6均优于hFc-hIL-22比较物。由于在饮食诱导的肥胖小鼠中观察到的TG降低与在人中使用的读出相同,因此可以合理地预测观察到的效果也会转化。因此,结果表明已经发现了一种新的用于以高TG水平为特征的病症和疾患的治疗。
尽管本文已经说明和描述了本发明的某些特征,但是本领域普通技术人员将想到许多修改和等效物。因此,应当理解,权利要求旨在涵盖所有落入本发明真正精神内的修改和等效物。
Figure IDA0003630325060000011
Figure IDA0003630325060000021
Figure IDA0003630325060000031
Figure IDA0003630325060000041
Figure IDA0003630325060000051
Figure IDA0003630325060000061
Figure IDA0003630325060000071
Figure IDA0003630325060000081
Figure IDA0003630325060000091

Claims (15)

1.一种IL-22的衍生物,其包含共价连接至IL-22蛋白的脂肪酸。
2.如权利要求1所述的衍生物,其中所述脂肪酸通过接头共价连接至所述IL-22蛋白。
3.如权利要求1或权利要求2所述的衍生物,其中所述脂肪酸为:
(i)式I:
HOOC-(CH2)x-CO-*,
其中x是在10至18、任选12至18、14至16或16至18范围内的整数,并且*表示与所述IL-22蛋白或接头的连接点;
(ii)脂肪二酸;
(iii)C12、C14、C16、C18或C20二酸;
(iv)C16或C18二酸;和/或
(v)C18二酸。
4.如前述权利要求中任一项所述的衍生物,其中所述IL-22蛋白是天然成熟的人IL-22(hIL-22;SEQ ID NO.1)或其变体。
5.如权利要求4所述的衍生物,其中所述变体:
(i)为hIL-22的取代形式;
(ii)在hIL-22的位置1、21、35、64、113和/或114处被取代;
(iii)包含选自由以下组成的组的hIL-22的取代:A1C、A1G、A1H、N21C、N21D、N21Q、N35C、N35D、N35H、N35Q、N64C、N64D、N64Q、N64W、Q113C、Q113R、K114C和K114R;和/或
(iv)包含hIL-22的位置1处的Cys残基。
6.如权利要求4或权利要求5所述的衍生物,其中所述变体:
(i)为hIL-22的延伸形式;
(ii)包含N端肽;
(iii)包含N端三聚体;和/或
(iv)包含N端G-P-G。
7.如权利要求2至6中任一项所述的衍生物,其中所述接头包含:
(i)一个或多个氨基酸,任选地包括Glu和/或Lys;
(ii)氧乙烯甘氨酸单元或多个连接的氧乙烯甘氨酸单元,任选地2至5个此类单元;
(iii)一个或多个寡(乙二醇)(OEG)残基;
(iv)乙二胺(C2DA)基团;
(v)乙酰胺(Ac)基团;
(vi)γGlu-OEG-OEG-C2DA-Ac;
(vii)γGlu-γGlu-γGlu-γGlu-OEG-OEG-εLys-αAc;和/或
(viii)γGlu-OEG-OEG-εLys-αAc。
8.如权利要求2至6中任一项所述的衍生物,其中所述接头是:
(i)连接至所述hIL-22或其变体中的Cys残基的Cys反应性接头;
(ii)连接在所述hIL-22或其变体的位置-7、-5、1、6、33、113、114或153;
(iii)连接至hIL-22的位置1、6、33、113或114处取代的Cys残基;
(iv)连接至相对于hIL-22的位置-5、-7或153处的Cys残基;和/或
(v)连接至hIL-22的位置1处取代的Cys残基。
9.如前述权利要求中任一项所述的衍生物,其中所述衍生物包含通过接头共价连接至hIL-22的变体的C14、C16、C18或C20二酸,其中所述变体包含N端G-P-G和hIL-22的位置1处的Cys残基,并且所述接头任选连接至所述Cys残基。
10.如前述权利要求中任一项所述的衍生物,其中所述衍生物是如本文中所鉴定的衍生物1至10。
11.一种用于制备前述权利要求中任一项所述的衍生物的方法,其包括使脂肪酸共价连接至IL-22蛋白。
12.一种药物组合物,其包含权利要求1至10中任一项所述的衍生物和药学上可接受的媒介物。
13.如权利要求1至10中任一项所述的衍生物或如权利要求12所述的药物组合物,其用于疗法中。
14.如权利要求1至10中任一项所述的衍生物或如权利要求12所述的药物组合物,其用于治疗代谢、肝脏、肺部、肠道、肾脏或皮肤疾病、病症或疾患的方法中。
15.如权利要求14所述的衍生物或药物组合物,其中:
(i)所述代谢疾病、病症或疾患是肥胖、1型糖尿病、2型糖尿病、高脂血症、高血糖症或高胰岛素血症;
(ii)所述肝脏疾病、病症或疾患是非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化、酒精性肝炎、急性肝衰竭、慢性肝衰竭、慢加急性肝衰竭(ACLF)、对乙酰氨基酚诱导的肝毒性、急性肝损伤、硬化性胆管炎、胆汁性肝硬化或由手术或移植引起的病理疾患;
(iii)所述肺部疾病、病症或疾患是慢性阻塞性肺病(COPD)、囊性纤维化、支气管扩张、特发性肺纤维化、急性呼吸窘迫综合征、化学损伤、病毒感染、细菌感染或真菌感染;
(iv)所述肠道疾病、病症或疾患是炎症性肠病(IBD)、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、移植物抗宿主病(GvHD)、化学损伤、病毒感染或细菌感染;
(v)所述肾脏疾病、病症或疾患是急性肾病或慢性肾病;或
(vi)所述皮肤疾病、病症或疾患是伤口、炎性疾病或GvHD。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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IL297187A (en) * 2020-04-17 2022-12-01 Univ Leland Stanford Junior Transgenic interleukin-22 polypeptides and uses thereof

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR106F (zh) 1964-12-21
WO2011154349A2 (en) 2010-06-08 2011-12-15 Novo Nordisk A/S Fgf21 analogues and derivatives
MX345608B (es) 2010-12-22 2017-02-07 Baxalta Inc Materiales y metodos para conjugar un derivado de acido graso soluble en agua a una proteina.
MX368005B (es) 2013-03-15 2019-09-13 Genentech Inc Polipéptidos de il-22 y proteínas de fusion de il-22 fc y métodos de uso.
EP3043824B1 (en) 2013-09-13 2022-07-06 The Scripps Research Institute Modified therapeutic agents and compositions thereof
MA41794A (fr) 2015-03-18 2018-01-23 The California Institute For Biomedical Res Agents thérapeutiques modifiés et compositions associées
MX2018000542A (es) * 2015-07-15 2018-06-27 Protagonist Therapeutics Inc Inhibidores peptidicos del receptor de interleucina 23 y su uso para tratar enfermedades inflamatorias.
EP3661955A4 (en) * 2017-08-03 2021-05-26 Synthorx, Inc. CYTOKINE CONJUGATES FOR THE TREATMENT OF AUTOIMMUNE DISEASES
EP3819307A1 (en) 2019-11-07 2021-05-12 CytoKi Pharma ApS Therapeutic derivatives of interleukin-22

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