CN114761413B

CN114761413B - 碳青霉烯水解D类β-内酰胺酶抑制剂及其制备方法

Info

Publication number: CN114761413B
Application number: CN202080077689.1A
Authority: CN
Inventors: 李相喜; 李净薰; 全廷浩
Original assignee: Industry Academy Cooperation Foundation of Myongji University
Current assignee: Industry Academy Cooperation Foundation of Myongji University
Priority date: 2019-11-08
Filing date: 2020-08-28
Publication date: 2024-04-12
Anticipated expiration: 2040-08-28
Also published as: WO2021091059A1; KR102457867B1; US20210137954A1; US11058695B2; CN114761413A; KR20210056892A

Abstract

本发明涉及碳青霉烯类水解D类β‑内酰胺酶抑制剂及其制备方法，尤其涉及[3‑(2‑苯基乙氧基)苯基]硼酸或其药学上可接受的盐及其制备方法。根据本发明的[3‑(2‑苯基乙氧基)苯基]硼酸或其药学上可接受的盐包含所有6个临床上重要的CHDL亚组(碳青霉烯水解D类β‑内酰胺酶)并抑制4个新出现的CHDL亚组。因此，本发明的化合物在大范围内抑制各种CHDL，与β‑内酰胺类抗生素并用时，对由各种CHDL引起的对抗生素产生耐药性的细菌的感染和治疗是有效的。

Description

碳青霉烯水解D类β-内酰胺酶抑制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及新型碳青霉烯水解D类β-内酰胺酶(carbapenem-hydrolyzing classDbeta-lactamases；以下称为“CHDL”)抑制剂以及包含该抑制剂的抗生素组合物。

本发明涉及对所述CHDL表现出抑制活性的抑制剂的制备方法。

本发明涉及利用所述CHDL抑制剂预防和治疗微生物感染的方法。

背景技术

β-内酰胺酶(Beta-lactamases)是一种将β-内酰胺类抗生素等β-内酰胺结构水解而失活的细菌酶。由于此类β-内酰胺酶的存在，常用于治疗重症或高危病原菌感染的β-内酰胺类抗生素如青霉素类(penicillins)、头孢菌素类(cephalosporins)、单环内酰胺类(monobactams)以及碳青霉烯类(carbapenems)的β-内酰胺结构被破坏，使其无法充当抗生素的作用，因此使病原微生物对β-内酰胺类抗生素产生耐药性。

当基于碱基序列的同源性分类时，β-内酰胺酶分为A、B、C和D四种类型(Bush等人，Antimicrob.Agents Chemother.(抗菌物和化学疗法),2010,54(3)，第969-976页；Galleni等人,Antimicrob.Agents Chemother.(抗菌物和化学疗法),2001,45(3),第660-663页)。β-内酰胺酶的A、C和D类是形成共价酰基酶中间体的丝氨酸酶。

碳青霉烯酶(carbapenemase)是水解碳青霉烯(carbapenem)和其他β-内酰胺类抗生素的最通用的β-内酰胺酶家族(Queenan等人,Clin.Microbiol.Rev.(临床微生物评论),2007,20(3),第440-458页)。碳青霉烯酶根据酶的活性是否需要2价阳离子，分为非金属碳青霉烯酶(不依赖锌，A、C和D类)和金属碳青霉烯酶(依赖锌，B类)(Lee等人,Res.J.Microbiol.(微生物研究),2006,1(1),第1-22页)。

碳青霉烯(亚胺培南(imipenem)、美罗培南(meropenem)、比阿培南(biapenem)、厄他培南(ertapenem)和多利培南(doripenem))具有类似青霉素的五角环，但五角环中C-1的硫被碳原子取代，C-2和C-3之间形成双键(Moellering等人,J.Antimicrob.Chemother.(抗菌化学疗法杂志),1989,24(增刊A),第1-7页)。

碳青霉烯类在所有β-内酰胺类中具有最广谱的抗菌活性，主要用于治疗好氧革兰氏阴性菌引起的感染。

由碳青霉烯酶引起的获得性碳青霉烯类耐药微生物的出现和传播是重大的公共卫生问题，被认为是全球前哨事件(sentinel event；对患者造成严重损害的意外事件)(Richet等人，Emerg.Infect.Dis.(新发传染病)，2001,7(2),第319-322页)。D类β-内酰胺酶，也称为OXA型酶(OXA代表苯唑西林酶(oxacillinase))，据报道存在具有遗传差异的850多种。D类碳青霉烯酶也称为CHDL。根据氨基酸序列的同源性，CHDL分为几个亚组(OXA-23、OXA-24/40、OXA-48、OXA-51、OXA-55、OXA-58、OXA-60、OXA-62、OXA-134、OXA-143、OXA-211、OXA-213、OXA-214、OXA-229、OXA-235和OXA-372)(Antonelli等人,J.Antimicrob.Chemother.(抗菌化学疗法杂志),2015,70(1),2749-2756；Evans等人,Clin.Microbiol.Rev.,2014,27(2),241-263)。它们主要在鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)中发现(Evans et al.,Clin.Microbiol.Rev.(临床微生物评论),2014,27(2),241-263)。属于OXA-23、OXA-24/40、OXA-48、OXA-51、OXA-58和OXA-143亚组的六种CHDL具有临床重要性，因为它们广泛传播到细菌病原体中(Antunes等人，Antimicrob.Agents Chemother.(抗菌物和化学疗法),2014,58(4),2119-2125)。CHDL是临床上最成问题的，因为它会对最后使用的碳青霉烯类抗生素产生耐药性，严重限制了治疗选择。

Rettig及其同事报道了苯硼酸(Phenylboronic acid:PBA)(Rettig等人,Can.J.Chem.(加拿大化学杂志),1977,55,3071-3075)。Beesley及其同事已经报道了十二种含有2-甲酰基苯硼酸酯(2-formylphenylboronate；2FORMB)、4-甲酰基苯硼酸酯(4-formyl phenylboronate；4FORMB)和4-甲基苯硼酸酯(4-methylphenylboronate；4MEPB)的被取代的苯硼酸(Beesley等人，Biochem.J.(生物化学杂志),1983,209(1),229-233)。Amicosante及其同事已经报道了硼酸(Boric acid)、苯硼酸(PBA)、间氨基苯硼酸酯(m-aminophenyboronate；MAPB)和四苯基硼酸(Amicosante等人,J.Chemotherapy(化学疗法杂志),1989,1(6),394-398)。

特别地，据报道间-(丹磺酰氨基苯基)-硼酸(m-(dansylamidophenyl)-boronicacid；NSULFB)是从阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)P99分离的β-内酰胺酶的亚微摩尔抑制剂(Dryjanski等人，Biochemistry(生物化学),1995,34(11),3561-3568)。

为设计对TEM-1酶具有高亲和力(affinity)的新型烷基硼酸抑制剂(1R)-1-乙酰氨基-2-(3-羟苯基)乙硼酸((1R)-1-acetamido-2-(3-carboxyphenyl)ethane boronicacid)，使用突变的TEM-1酶-青霉素G复合物的晶体结构(Strynadka等人,Nat.Struct.Biol.(自然结构生物学),1996,3,688-695)。这些苯基硼酸衍生物在可逆地抑制A类和C类β-内酰胺酶方面具有出色的功效。阿维巴坦(Avibactam，原名NXL104)和二氮杂双环辛烷(diazabicyclooctane,DBO，非内酰胺)衍生物抗生素在可逆抑制包括A类[主要是超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)和肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(Klebsiella pneumoniacarbapenemases，KPCs)]、C类和部分D类(包括OXA-1、OXA-10和OXA-48亚组)的丝氨酸β-内酰胺酶方面具有优异的功效。

然而，迄今为止尚未报道已知的化合物抑制所有6个主要的临床上重要的CHDL亚组(OXA-23、OXA-24/40、OXA-51、OXA-58、OXA-143、OXA-148亚组)和新出现的CHDL亚组。

因此，需要开发能够抑制所有6个临床上重要的CHDL亚组和新出现的CHDL亚组的广谱功能的新型CHDL抑制剂。

本申请的发明人发现了具有广谱抑制作用的新型CHDL抑制剂，从而完成了本发明。

发明内容

技术问题

本发明的目的是提供新型CHDL抑制剂。

本发明的另一目的是提供CHDL抑制剂的制备方法。

本发明的另一个目的是提供利用所述CHDL抑制剂预防和治疗微生物感染的方法。

解决问题的手段

为了上述目的，本发明的第一方面提供由以下化学式1表示的CHDL(碳青霉烯水解D类β-内酰胺酶)抑制剂。所述抑制剂是抑制CHDL的非β-内酰胺抑制剂。

[化学式1]

上述记载的化学式1的化合物抑制CHDL中的6个临床上重要的亚组和新出现的CHDL亚组。这里，CHDL可以选自6个临床上重要的亚组，即OXA-23亚组、OXA-24/40亚组、OXA-48亚组、OXA-51亚组和OXA-58亚组。更具体地，所述CHDL可以选自OXA-23、OXA-24/40、OXA-48、OXA-51、OXA-109、OXA-97和OXA-143。所述CHDL可以选自4个新出现的CHDL组(OXA-211亚组、OXA-229亚组、OXA-210亚组和OXA-240亚组)。更具体地，所述CHDL是OXA-23、OXA-24/40、OXA-48、OXA-51、OXA-109、OXA-97、OXA-143、OXA-211、OXA-229、OXA-418、OXA-210、OXA-240。

本发明的第二方面涉及所述化学式1的CHDL抑制剂的合成方法，包括以下步骤；(a)使用3-溴苯酚(3-Bromophenol)和苯乙醇(Phenethyl alcohol)制备1-溴代-3-(2-苯基乙氧基)苯(1-bromo-3-(2-phenylethoxy)benzene)；以及(b)使用上述1-溴代-3-(2-苯基乙氧基)苯制备[3-(2-苯基乙氧基)苯基]硼酸([3-(2-Phenylethoxy)phenyl]boronicacid)。

更具体地，步骤(a)中，包括以下步骤：将3-溴苯酚、苯乙醇和三苯基膦溶于无水四氢呋喃中制备溶液；在所述溶液中加入偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD)来制备混合物；并通过对所述混合物进行色谱法纯化1-溴代-3-(2-苯基乙氧基)苯。

步骤(b)中，包括以下步骤：(b1)将所述1-溴代-3-(2-苯基乙氧基)苯与无水四氢呋喃-甲苯混合物混合；(b2)在所述步骤(b1)的混合物中加入包含正丁基锂的己烷溶液；(b3)在所述(b2)的添加物中加入硼酸三异丙酯(triisopropyl borate)；以及(b4)在所述(b3)的添加物中加入HCl。

本发明的第三方面涉及化学式1的CHDL抑制剂及其药学上可接受的盐。所述抑制剂还可包括药学上可接受的赋形剂。

本发明的第四方面是提供包含化学式1的CHDL抑制剂和抗生素的抗生素组合物。所述抗生素可以是β-内酰胺类抗生素。β-内酰胺类抗生素是在其分子结构中含有β-内酰胺环的抗生素。β-内酰胺类抗生素包括但不限于青霉素类、头孢烯类(cephem)、碳青霉烯类(carbapenem)、青霉烯类(penem)和单环内酰胺类(monobactam)。根据本发明的一个实施方案，β-内酰胺类抗生素可以是选自青霉素类、头孢菌素类(cephalosporin)、头霉素类(cephamycin)、单环内酰胺类和碳青霉烯类中的任一种或它们的组合。包含所述化学式1的化合物的组合物可以口服给药或肠胃外给药，在肠胃外给药的情况下，可以通过皮肤局部给药、静脉内注射、皮下注射、肌肉注射、腹膜内注射或透皮给药。

该组合物以药学有效量给药。如本文所用，“药学有效量”表示足以治疗适用于医学治疗的细菌感染的量。有效剂量水平将取决于包括感染的类型或重症程度、药剂的活性、对药剂的敏感性、给药时间、给药途径、排泄率、治疗时间、联合使用的药剂的因素，以及医学领域中众所周知的其他因素。该组合物可以在施用β-内酰胺类抗生素之前、同时或之后施用于受试者。该组合物可以作为单独的治疗剂施用或可以与其他治疗剂组合使用。可以与常规治疗剂一起或同时施用。可以作为单剂量或多剂量给药。重要的是给予能够以最小剂量获得最大效果的量，同时考虑到所有上述没有副作用的成分，并且剂量可由本领域普通技术人员容易地确定。

根据本发明的实施方案的组合物，还可以包括药学上可接受的载体。载体包括但不限于通常用于制备制剂的乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油。根据本发明的实施方案的组合物，还可以包括润滑剂、润湿剂、甜味剂、矫味剂、乳化剂、混悬剂和防腐剂。

本发明实施例的组合物可以制备成各种剂型，包括口服剂型和非肠道剂型。当制备制剂时，使用通常用于制备制剂的稀释剂或媒介物来制备，例如填充剂、增量剂、粘合剂、保湿剂、崩解剂或表面活性剂。用于口服给药的固体制剂包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，这些固体制剂是通过将一种或多种化合物与一种或多种媒介物(淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖或明胶)混合来制备的。此外，除了简单的媒介物外，还使用硬脂酸镁或滑石粉等润滑剂。用于口服给药的液体制剂的实例包括混悬剂、内服溶液制剂、乳剂、糖浆制剂等。除了作为常规使用的简单稀释剂的水或液体石蜡之外，还可以包括各种媒介物，例如保湿剂、甜味剂、芳香剂或防腐剂。用于肠胃外给药的制剂的实例包括无菌水溶液、不溶性试剂、混悬剂、乳剂、冷冻干燥剂和栓剂。作为非水溶剂或混悬剂，可以使用植物油如丙二醇、聚乙二醇或植物油如橄榄油，以及注射用酯如乙醇盐(ethylolate)。作为栓剂的基质，可以使用合成脂肪酸酯(witepsol)、聚乙二醇(macrogol)、吐温61、可可脂、月桂脂、甘油凝胶(glycerogeltin)等。

本发明的第五方面提供了利用化学式1的化合物预防和治疗细菌感染的方法。预防和治疗细菌感染的方法，其特征在于，制备化学式1的组合物或其药学上可接受的盐的步骤，以及向患有或处于细菌感染风险中的受试者施用有效量的化学式1的化合物或其药学上可接受的盐。所述组合物还可包括β-内酰胺类抗生素。更具体地，抗生素可以选自青霉素类、头孢烯类、碳青霉烯类、青霉烯类和单环内酰胺类。更具体地，所述抗生素可以是选自青霉素类、头孢菌素类、头霉素类、单环内酰胺类和碳青霉烯类中的任一种或它们的组合。所述给药方法还可包括在向受试者施用组合物之前、同时或之后向受试者施用β-内酰胺类抗生素。所述组合物还可包括药学上可接受的载体。所述细菌感染是由对β-内酰胺有耐药性的病原菌引起的。更具体地说，所述细菌感染对CHDL(碳青霉烯水解D类β-内酰胺酶)具有耐药性。这里，CHDL可以选自6个临床上重要的组中，即OXA-23亚组、OXA-24/40亚组、OXA-48亚组、OXA-51亚组、OXA-58亚组和OXA-143亚组。所述CHDL可以选自4个新出现的CHDL亚组(OXA-211亚组、OXA-229亚组、OXA-210亚组和OXA-240亚组)。更具体地，所述CHDL是OXA-23、OXA-24/40、OXA-48、OXA-51、OXA-109、OXA-97、OXA-143、OXA-211、OXA-229、OXA-418、OXA-210、OXA-240。

技术效果

根据本发明的化学式1的化合物，抑制所有6个临床上重要的CHDL亚组(碳青霉烯水解D类β-内酰胺酶)和4个新出现的CHDL亚组。因此，本发明的化合物在大范围内抑制各种CHDL，对由各种CHDL抗生素耐药性引起的细菌感染和治疗有效。

附图简要说明

图1示出了[3-(2-苯基乙氧基)苯基]硼酸的¹H-NMR谱。

图2示出了[3-(2-苯基乙氧基)苯基]硼酸的¹³C-NMR谱。

具体实施方式

在下文中，将参照附图详细描述本发明的实施例。

根据本发明的一个或多个实施方案，包含化学式1的化合物的组合物可用作CHDL(碳青霉烯水解D类β-内酰胺酶)的抑制剂。先前报道的化合物并未报道抑制所有6个主要的临床上重要的CHDL亚组(OXA-23、OXA-24/40、OXA-48、OXA-51、OXA-58和OXA-143亚组)。根据本发明的化学式1的化合物不仅在6个主要的临床上重要的CHDL亚组中有效，而且在4个新出现的CHDL亚组中也有效。因此，本发明的CHDL抑制剂是广谱的CHDL抑制剂。

与现有的CHDL抑制剂相比，化学式1的化合物对CHDL的抑制范围更广，可用于细菌感染的预防和治疗。

特别地，通过施用化学式1的化合物，可以灭活对β-内酰胺类抗生素具有耐药性的病原菌的β-内酰胺酶，因此在用抗生素治疗时可以更有效地治疗和预防细菌感染。

β-内酰胺类抗生素是在其分子结构中含有β-内酰胺环的抗生素。β-内酰胺类抗生素包括但不限于青霉素类、头孢烯类、碳青霉烯类、青霉烯类和单环内酰胺类。更具体地，β-内酰胺类抗生素是青霉素类、头孢菌素类、头霉素类、单环内酰胺类和/或碳青霉烯类。

包含所述化学式1的化合物的组合物可以口服给药或肠胃外给药，在肠胃外给药的情况下，可以通过皮肤局部给药、静脉内注射、皮下注射、肌肉注射、腹膜内注射或透皮给药。

该组合物以药学有效量给药。如本文所用，“药物有效量”表示足以治疗适用于医学治疗的细菌感染的量。有效剂量水平将取决于包括感染的类型或重症程度、药剂的活性、对药剂的敏感性、给药时间、给药途径、排泄率、治疗时间、联合使用的药剂的因素，以及医学领域中众所周知的其他因素。该组合物可以在施用β-内酰胺类抗生素之前、同时或之后施用于受试者。该组合物可以作为单独的治疗剂施用或可以与其他治疗剂组合使用。可以与常规治疗剂一起或同时施用。可以作为单剂量或多剂量给药。重要的是给予能够以最小剂量获得最大效果的量，同时考虑到所有上述没有副作用的成分，并且剂量可由本领域普通技术人员容易地确定。

本发明实施例的组合物可以制备成各种剂型，包括口服剂型和非肠道剂型。当制备制剂时，使用通常用于制备制剂的稀释剂或媒介物来制备，例如填充剂、增量剂、粘合剂、保湿剂、崩解剂或表面活性剂。用于口服给药的固体制剂包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，这些固体制剂是通过将一种或多种化合物与一种或多种媒介物(淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖或明胶)混合来制备的。此外，除了简单的媒介物外，还使用硬脂酸镁或滑石粉等润滑剂。用于口服给药的液体制剂的实例包括混悬剂、内服溶液制剂、乳剂、糖浆制剂等。除了作为常规使用的简单稀释剂的水或液体石蜡之外，还可以包括各种媒介物，例如保湿剂、甜味剂、芳香剂或防腐剂。用于肠胃外给药的制剂的实例包括无菌水溶液、不溶性试剂、混悬剂、乳剂、冷冻干燥剂和栓剂。作为非水溶剂或混悬剂，可以使用如丙二醇、聚乙二醇或植物油如橄榄油，以及注射用酯如乙醇盐。作为栓剂的基质，可以使用合成脂肪酸(witepsol)、聚乙二醇、吐温61、可可脂、月桂脂、甘油凝胶等。

发明的实施方式

在下文中，将通过实施例更详细地描述本发明。然而，提供以下实施例仅用于对本发明进行具体说明，对于本领域普通技术人员显而易见的是，本发明的范围不限于此。

使用ICM-VLS软件的基于结构的虚拟筛选用于发现抑制碳青霉烯水解D类β-内酰胺酶的新型化合物(参见以下的实施例1)。从细菌菌株中纯化的碳青霉烯水解D类β-内酰胺酶用于该筛选。筛选的化合物抑制碳青霉烯类水解D类β-内酰胺酶活性的能力(IC₅₀值)使用标准酶抑制方法测定(参见以下的实施例4；Page,Biochem.J.(生物化学杂志),1993,295,第295-304页)。已经发现了新型碳青霉烯水解D类β-内酰胺酶抑制剂(化学式(I))。

实施例1

虚拟图书馆筛选(Virtual library screening)

为了找到抑制OXA-48(临床上最重要的碳青霉烯类水解D类β-内酰胺酶)的新型化合物，使用ICM-VLS软件进行了基于结构的虚拟筛选。使用ICM(Internal CoordinateMechanics(内部坐标力学)软件程序(Molsoft,LLC)中提供的PocketFinder算法分析OXA-48的晶体结构(PDB ID,4S2P)。

蛋白质结构通过三维(3D)质子化、水分子的缺失和能量最小化来制备，使用ICM力场和距离依赖遗传电位，均方根(root mean square,RMS)梯度为

配体结合位点被定义为活性位点缝隙周围的子配套(set)区域，并使用ICM-VLS软件(Molsoft,LLC)被选为虚拟文库筛选VLS(virtual library screening)的目标位点。ICM-VLS使用具有偏差概率(biased probability)的蒙特卡洛(Monte Carlo)立体构造搜索，使用全局最优化，将配体的完全灵活的全原子配体模型与从蛋白质受体的原子坐标计算的网格电位图集(set)快速对接。然后通过评分函数评估每个配体对接构象。ICM评分函数整合了范德华能量、静电、氢键、结构熵损失和溶剂化静电能量变化(Abagyan等人，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志),1994,235(3),第983-1002页)。在使用ICM-VLS的三个3.0GHz Intel Xeon处理器上，使用基本ICM-对接参数对MolCart化合物和构建块数据库(Molsoft,LLC)中整个1,720,909种化合物集进行了对接。经过三次对接运行后，对接得分为＜-55的所得化合物进一步过滤，以选择具有广泛氢键和范德华接触的化合物，然后在各种支架上进行层次聚类，鉴定了55种化合物在结构和化学上与靶标OXA-48的配体结合位点相容的化学物。选择具有最佳分子对接分数的七种化合物，并从Enamine(http://www.enamine.net/)购买。

7种化合物的IC₅₀值如下测定。将筛选出的7种化合物(10mM)溶解在100％DMSO中。根据需要制备更稀释的原液。OXA-48活性由Shimazu UV-1650PC分光光度计使用硝基噻吩(nitrocefin)(Oxoid，Hampshire，UK)的特征分子吸光系数(De₄₈₂＝15,900M^-1cm^-1)，在482nm处监测吸光度变化，从而决定。最大5％的DMSO不影响碳青霉烯水解D类β-内酰胺酶的酶活性。该测定在含有酶(103pM)、50mM NaHCO₃和20μg/mL牛血清白蛋白的10mM MES(pH6.8)中进行。在30℃下将纯化的酶和抑制剂预孵育5分钟后，加入硝基噻吩(100μM)以引发酶促反应。5分钟后测量保留率。每个反应的前120秒用于确定初始速率。使用MicrosoftExcel评估数据。OXA-48的浓度依赖性抑制，以从2倍稀释系列产生的不同浓度，对7种化合物为对象进行测定。在7种化合物的所有浓度下，反应进程测定三次。IC₅₀值使用Excel(www.idbs.com)的XL Fit拟合曲线拟合软件使用4参数对数拟合计算，使用以下等式：

其中，y是残留酶活性(％)，x是相应的浓度。拟合的IC₅₀参数定义为提供曲线的拟合上端(B)和下端(A)之间的一半值的浓度。在7种化合物中，只有化合物I显示出IC₅₀值(154.8μM)(表1)。

表1.筛选化合物OXA-48 I的IC₅₀值。

[表1]

化合物	IC₅₀(μM)
		1	154.8
2	NI^a
		3	NI
4	NI
		5	NI
6	NI
		7	NI

^aNI，无抑制。

实施例2

化合物I的合成与表征

使用无水溶剂在烘箱干燥的玻璃器皿上和氩气上进行有机金属反应。无水四氢呋喃(THF)和二乙醚通过标准方法获得，并在使用前在氩气氛围下从苯甲酮羰基钠(natriumbenzophenone ketyl)中新蒸馏。所有起始化学品和试剂都是可商购的。使用硅胶(粒度0.05-0.20mm)进行化合物的色谱纯化。OptiMelt自动熔点系统(MMPA100，StanfordResearch Systems，Sunnyvale，California)用于定义熔点。在氘代二甲基亚砜(DMSO-d₆)溶液中使用Bruker Avance 500(¹H为500MHz，¹³C为125MHz)光谱仪记录¹H-NMR和¹³C-NMR光谱。化学位移(δ)从作为内标的单一四甲基硅烷(TMS)以ppm向下场测量(s：单峰，d：双峰，t：三峰，m：多峰，br s：宽信号)。所得化合物的纯度在Agilent 1100仪器中通过LC/MS确认。所有测试化合物的纯度至少为95％以上。

[3-(2-苯基乙氧基)苯基]硼酸([3-(2-Phenylethoxy)phenyl]boronic acid)的合成(PLPBA：化合物1)

化学式1的化合物的示例性合成如下：

反应式1：PLPBA的合成。

步骤1：

将3-溴苯酚(0.013mol)、苯乙醇(0.013mol)和三苯基膦(0.016mol)溶解在50mL无水四氢呋喃中。在持续搅拌下，在0℃下向该溶液中滴加偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD，0.016mol)。添加完成后，将混合物升温至室温并搅拌过夜。蒸发溶剂并将残余物加入到乙醚(100mL)中，依次用氢氧化钠溶液和水洗涤，并干燥(硫酸镁)。真空除去乙醚并通过快速色谱法(硅胶，己烷/乙酸乙酯＝4∶1)纯化残余物。

步骤2：

将溴化物[1-溴代-3-(2-苯基乙氧基)苯，0.009mol]在100mL无水四氢呋喃-甲苯混合物(1:1v/v)中的搅拌溶液冷却至-80℃，将包含在己烷(2.5M)中的正丁基锂(0.010mol)滴加到反应混合物中，同时保持温度低于-70℃。当添加完成时，将反应混合物在-80℃搅拌15分钟，然后立即添加硼酸三异丙酯(0.011mol)。将反应混合物缓慢升温至环境温度并搅拌过夜。向混合物中加入冰水(150mL)和浓盐酸(10mL)，分离有机层。真空蒸发，将残余物溶解在5％氢氧化钠水溶液(100mL)中并用甲苯(30mL×2)洗涤。用浓盐酸将水相酸化至pH 2，过滤形成的沉淀物并干燥，得到目标化合物，为白色粉末。Mp＝130-133℃.LC/MS:MH+243.¹H-NMR(500MHz,DMSO):3.09(t,2H,CH2),4.16(t,2H,CH2),6.97(d,1H,4-H),7.20-7.40(m,8H,Ph+2,5,6-H),8.08(s,2H,OH)。(图1)¹³C-NMR(125MHz,DMSO):35.6(CH2),68.5(CH2),116.8(4-C),120.1(5-C),125.7(Ph),126.0(2-C),128.8(Ph),129.1(1-C),129.4(Ph),139.0(Ph),158.3(3-C)(图2)。

实施例3

蛋白质产生和纯化

由IDT(Integrated DNA Technologies，Coralville，IA，USA)合成了九个编码大肠杆菌的优化bla_OXA-23基因(GenBank ID:AJ132105)、bla_OXA-24/40基因(GenBank ID:AJ239129)、bla_OXA-48基因(GenBank ID:AY236073)、bla_OXA-51基因(GenBank ID:AJ309734)、bla_OXA-97基因(GenBank ID：EF102240)、bla_OXA-109基因(GenBank ID：EF650035)、bla_OXA-143基因(GenBank ID：GQ861437)、bla_OXA-211基因(GenBank ID：JN861779)和bla_OXA-229基因(GenBank ID：JQ422052)的模板。使用合适的引物对通过PCR扩增DNA模板(表2)。使用引物对从铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)PAE0831中分离的bla_OXA-210基因(GenBank ID:JF795487)、从铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)WK28中分离的bla_OXA-240基因(GenBank ID:JX089628)以及从鲍曼不动杆菌(A.baumannii)ABA031中分离的bla_OXA-418基因(GenBankID：KJ997966)进行PCR扩增后(表2)，然后进行序列分析。将扩增的DNA和pET-28a(+)或pET-30a(+)载体(Novagen,Madison,Wisconsin,USA)用NdeI(或NcoI)和XhoI双切，然后使用处理过的DNA并与双切载体结合。确认DNA序列后，质粒(pET-30a(+)/His₆-bla_OXA-23、pET-30a(+)/His₆-bla_OXA-24/40、pET-30a(+)/His₆-bla_OXA-51、pET-30a(+)/His₆-bla_OXA-97、pET-30a(+)/His₆-bla_OXA-109、pET-30a(+)/His₆-bla_OXA-143、pET-30a(+)/His₆-bla_OXA-210、pET-28a(+)/His₆-bla_OXA-211、pET-30a(+)/His₆-bla_OXA-229、pET-28a(+)/His₆-bla_OXA-240和pET-30a(+)/His₆-bla_OXA-418被单独转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中。组氨酸标签蛋白(OXA-23、OXA-24/40、OXA-48、OXA-51、OXA-97、OXA-109、OXA-143、OXA-210、OXA-211、OXA-229、OXA -240和OXA-418)均按照先前报道的方法制备(Park等人,J.Glob.Antimicrob.Resist.(全球抗微生物杂志),2018,14,第302-305页)。

表2.用于PCR扩增以表达编码碳青霉烯类水解D类β-内酰胺酶的12个基因的寡核苷酸的核苷酸序列。

[表2]

/>

^aF，转录(正向)引物；R，抗转录(反向)引物。

^b限制酶位点为斜体字，带下划线的碱基为六组氨酸标签位点，加粗的碱基为肠激酶识别位点。

实施例4

测定碳青霉烯水解D类β-内酰胺酶的新型抑制剂(PLPBA)的IC₅₀值

为了研究对于6个临床上重要的碳青霉烯水解D类β-内酰胺酶亚组(OXA-23亚组成员：OXA-23；OXA-24/40亚组成员：OXA-24/40；OXA-48亚组成员：OXA-48；OXA-51亚组成员：OXA-51和OXA-109；OXA-58亚组成员：OXA-97；OXA-143亚组成员：OXA-143)和属于4个新型碳青霉烯水解D类β-内酰胺酶亚组的5种碳青霉烯水解D类β-内酰胺酶(OXA-211亚组成员：OXA-211；OXA-229亚组成员：OXA-229和OXA-418；OXA-210亚组成员：OXA-210；OXA-240亚组成员：OXA-240)的新型抑制剂(PLPBA)的抑制效果，测定IC₅₀值，(表3)。将新型抑制剂(PLPBA)以10mM的浓度溶解在100％DMSO中。通过监测482nm处吸光度的变化来确定碳青霉烯类水解D类β-内酰胺酶的活性。最大5％的DMSO不影响碳青霉烯水解D类β-内酰胺酶的酶活性。每种酶(OXA-23，418pM；OXA-24/40，134pM；OXA-48，103pM；OXA-51，184nM；OXA-97，178pM；OXA-109，168nM；OXA-143，96pM；OXA-210，179pM；OXA-211，701pM；OXA-229，142pM；OXA-240，383pM；OXA-418，158pM)与新型抑制剂(PLPBA)反应5分钟后，与硝基噻吩(100μM)混合。使用每个反应的前120秒确定初始速率。使用Microsoft Excel评估数据。在所有PLPBA浓度下，测量3次反应进程。表3显示了PLPBA对碳青霉烯水解D类β-内酰胺酶的抑制结果。PLPBA对临床上重要的新型碳青霉烯水解D类β-内酰胺酶亚组中的12个成员，显示IC₅₀范围为91.79±0.01μM至864.59±0.01μM。特别是，PLPBA对临床上重要的碳青霉烯水解D类β-内酰胺酶亚组的7个成员，显示IC₅₀值在91.79±0.01μM至594.73±0.01μM范围内。

表3.使用硝基噻吩作为底物测定临床上重要和新型碳青霉烯水解D类β-内酰胺酶亚群的新型抑制剂的IC50值。

[表3]

酶(CHDL^a)	IC₅₀(μM)	酶(CHDL)	IC₅₀(μM)
				OXA-23	275.54±0.02	OXA-143	91.79±0.01
OXA-24/40	384.73±0.02	OXA-210	218.79±0.02
				OXA-48	154.84±0.02	OXA-211	238.51±0.01
OXA-51	594.73±0.01	OXA-229	171.93±0.01
				OXA-97	189.02±0.01	OXA-240	218.59±0.03
OXA-109	864.59±0.02	OXA-418	209.51±0.02

^aCHDL，碳青霉烯水解D类β-内酰胺酶

因此，化学式1的化合物在抑制所有6个临床上重要的碳青霉烯水解D类β-内酰胺酶亚群和新型碳青霉烯水解D类β-内酰胺酶亚群方面表现出广谱功能。

<110> 明知大学校产学协力团

<120> 碳青霉烯水解D类β-内酰胺酶抑制剂

<130> Q21619YG01

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Primer

<400> 1

atacatatgc accatcatca tcatcatgac gacgacgaca agcagattgt tcaaggacat 60

aatcag 66

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Primer

<400> 2

gagctcgagt taaataatat tcagctgttt taatgatttc 40

<210> 3

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Primer

<400> 3

atacatatgc accatcatca tcatcatgac gacgacgaca agcatatttc ttctcagcaa 60

catgaaaaag ctat 74

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> Primer

<400> 4

gagctcgagt taaatgattc caagattttc tagcgactta t 41

<210> 5

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> Primer

<400> 5

atacatatgc accatcatca tcatcatgac gacgacgaca aggaatggca agaaaacaaa 60

agttggaatg c 71

<210> 6

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Primer

<400> 6

gagctcgagc tagggaataa ttttttcctg tttgagcact tc 42

<210> 7

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Primer

<400> 7

atacatatgc accatcatca tcatcatgac gacgacgaca agaatccaaa tcacagcgct 60

tcaaaat 67

<210> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> Primer

<400> 8

gagctcgagc tataaaatac ctaattgttc taaactttta taag 44

<210> 9

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> Primer

<400> 9

gatatacata tgcaccatca tcatcatcat gacgacgacg acaagcatag tatgagtcga 60

gcaa 64

<210> 10

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> Primer

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caggagctcg agttataaat aatgaaaaac acc 33

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<211> 67

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<213> 人工序列

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<223> Primer

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atacatatgc accatcatca tcatcatgac gacgacgaca agaatccaaa tcacagcgct 60

tcaaaat 67

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<213> 人工序列

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<223> Primer

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gagctcgagc tataaaatac ctaattgttc taagctttta taa 43

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<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> Primer

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atacatatgc accatcatca tcatcatgac gacgacgaca agaatcagca acatgaaaaa 60

gccatta 67

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<213> 人工序列

<220>

<223> Primer

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gagctcgagt tatataatcc ctaaattctc taatgattta taag 44

<210> 15

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<213> 人工序列

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<223> Primer

<400> 15

gatatacata tgcaccatca tcatcatcat gacgacgacg acaaggcgca agaaggcacg 60

ctag 64

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<213> 人工序列

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<223> Primer

<400> 16

caggagctcg agttatcgcg cagcgtccga g 31

<210> 17

<211> 70

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<213> 人工序列

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<223> Primer

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ataccatggg ccaccatcat catcatcatg acgacgacga caagaaaaat caccagcaac 60

aaagtgctca 70

<210> 18

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Primer

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gagctcgagt taaattatcc ccagtgctgt cagactt 37

<210> 19

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Primer

<400> 19

atacatatgc accatcatca tcatcatgac gacgacgaca agcgagaaac tgagattcct 60

ttattatt 68

<210> 20

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Primer

<400> 20

gagctcgagt tatcttaaat aaaaaaatag acccaatttg t 41

<210> 21

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Primer

<400> 21

catataccat gggccaccat catcatcatc atgacgacga cgacaagggt tcaattacag 60

aaaatacgtc 70

<210> 22

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Primer

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caggagctcg agttagccac caatgatgcc caca 34

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> Primer

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atacatatgc accatcatca tcatcatgac gacgacgaca agggttgtgt ttatgattca 60

aaactacaa 69

<210> 24

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Primer

<400> 24

gtgctcgagt tatcttaaat aaaaaaatag acccaatttg 40

Claims

1.包含有效量的化学式1的化合物或其药学上可接受的盐和抗生素的组合物在制备用于治疗细菌感染的药物中的用途：

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述化合物为用于抑制碳青霉烯水解D类β-内酰胺酶(CHDL)的[3-(2-苯基乙氧基)苯基]硼酸或其药学上可接受的盐。

3.根据权利要求2所述的用途，其中所述化合物为权利要求2所述的[3-(2-苯基乙氧基)苯基]硼酸或其药学上可接受的盐，其中，所述碳青霉烯水解D类β-内酰胺酶(CHDL)选自OXA-23、OXA-24/40、OXA-48、OXA-51、OXA-109、OXA-97、OXA-143、OXA-211、OXA-229、OXA-418、OXA-210和OXA-240。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中，所述组合物还包含药学上可接受的载体。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中，所述抗生素为β-内酰胺类抗生素。

6.根据权利要求5所述的用途，其中，所述β-内酰胺类抗生素选自青霉素类、头孢烯类、碳青霉烯类、青霉烯类和单环内酰胺类。