CN114748629A

CN114748629A - Ccl6/15/23在诊断过敏性气道炎症中的应用

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Publication number: CN114748629A
Application number: CN202110026069.1A
Authority: CN
Inventors: 沈华浩; 应颂敏; 杜旭菲; 张超; 李飞; 邵喆婳
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2021-01-08
Filing date: 2021-01-08
Publication date: 2022-07-15

Abstract

本发明涉及医药领域，具体地涉及CCL6/15/23在诊断及治疗过敏性气道炎症中的应用。具体地，本发明提供了一种组合试剂及其用途，所述组合试剂包含：(S1)靶向CCL15的抑制剂和/或靶向CCL23的抑制剂；和(S2)靶向CCR1的抑制剂。并且所述组合试剂可以用于制备组合物或制剂，所述组合物或制剂用于(a)抑制嗜酸性粒细胞的分化、(b)抑制气道炎症、和/或(c)哮喘。

Description

CCL6/15/23在诊断过敏性气道炎症中的应用

技术领域

本发明涉及医药领域，具体地涉及CCL6/15/23在诊断过敏性气道炎症中的应用。

背景技术

哮喘是最常见的慢性疾病之一，在不同国家的人口中其发病率一直在上升，占总人口的1-18％。嗜酸性粒细胞计数高是哮喘急性发作的预测危险因素和生物标志物。嗜酸性粒细胞与HSC和在骨髓中成熟，被募集到炎症部位，并释放一系列细胞因子，趋化因子或颗粒来介导气道病理反应，粘液分泌过多，气道重塑和气道高反应性。直接靶向嗜酸性粒细胞分化过程是控制哮喘临床症状并减轻病情加重的有效治疗策略。

发明内容

本发明的目的在于提供一种靶向控制性粒细胞分化过程的组合试剂，从而帮助治疗哮喘。具体地，本发明提供了一种含有(S1)靶向CCL15的抑制剂和/或靶向CCL23的抑制剂；和(S2)靶向CCR1的抑制剂的组合试剂，所述组合试剂靶向抑制CCL6/15/23－CCR1复合物的形成，从而帮助减轻或者预防衰老。

在本发明的第一方面，提供了一种组合试剂，组合试剂包含：

(S1)靶向CCL15的抑制剂和/或靶向CCL23的抑制剂；和

(S2)靶向CCR1的抑制剂。

在本发明的第二方面，提供了一种组合试剂的用途，组合试剂包含：

(S1)靶向CCL15的抑制剂和/或靶向CCL23的抑制剂；和

(S2)靶向CCR1的抑制剂；

其中所述组合试剂用于制备组合物或制剂，所述组合物或制剂用于(a)抑制嗜酸性粒细胞的分化、(b)抑制气道炎症、和/或(c)哮喘。

在另一优选例中，所述的靶向CCL15的抑制剂包括小分子化合物、抗体、 miRNA、基因编辑试剂、或其组合。

在另一优选例中，所述的靶向CCL23的抑制剂包括小分子化合物、抗体、 miRNA、基因编辑试剂、或其组合。

在另一优选例中，所述的靶向CCR1的抑制剂包括小分子化合物、抗体、 miRNA、或其组合。

在另一优选例中，所述的靶向CCR1的抑制剂包括BX471。

在另一优选例中，所述的CCL15、CCL23和/或CCR1来源于哺乳动物，较佳地来源于人。

在另一优选例中，所述的靶向CCL15的抑制剂和/或靶向CCL23的抑制剂可抑制“CCL6/15/23－CCR1复合物”的形成。

在另一优选例中，所述的靶向CCR1的抑制剂可抑制“CCL6/15/23－CCR1 复合物”的形成。

在另一优选例中，用于所述组合试剂还用于制备治疗和/或缓解哮喘的药物。

在另一优选例中，所述试剂为口服制剂或非口服制剂。

在另一优选例中，所述的制剂包括：粉剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂、吸入剂、酊剂、口服液、片剂、含片、或滴丸。

在本发明的第三方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：

(K1)检测试剂，所述的检测试剂用于检测CCL6/15/23配体、和/或 CCL6/15/23－CCR1复合物；以及

(K2)治疗试剂，所述的治疗试剂包括：(S1)靶向CCL15的抑制剂和/或靶向CCL23的抑制剂；和(S2)靶向CCR1的抑制剂。

在另一优选例中，所述的检测试剂用于检测所述对象是否是CCL15和/或 CCL23高表达的对象。

在另一优选例中，所述的“高表达”指所述对象中，CCL15和/或CCL23的 mRNA水平M1与正常人群中CCL15和/或CCL23的mRNA水平M0之比(即M1/M0)≥ 1.5，较佳地≥2，更佳地≥4。

在另一优选例中，所述CCL15或CCL23为人源的。

在本发明的第四方面，提供了一种药物组合物，包括：

(i)第一药物组合物，所述的第一药物组合物包括：靶向CCL15的抑制剂和药学上可接受的载体；和

(ii)第二药物组合物，所述的第二药物组合物包括：靶向CCL23的抑制剂和药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的第一药物组合物和第二药物组合物是同一药物组合物。

在另一优选例中，所述的第一药物组合物和第二药物组合物是不同药物组合物。

在本发明的第五方面，提供了一种体外的抑制“CCL6/15/23－CCR1复合物” 的形成的方法，包括步骤：

(a)在靶向CCL15的抑制剂和/或靶向CCL23的抑制剂存在下，将CCL15和/ 或CCL23与CCR1接触，从而抑制“CCL6/15/23－CCR1复合物”的形成。

在另一优选例中，在步骤(a)中，所述的CCR1在细胞膜上。

在另一优选例中，所述的CCR1在嗜酸性粒细胞(Eos)的细胞膜上。

在另一优选例中，所述的嗜酸性粒细胞是活的人嗜酸性粒细胞。

在另一优选例中，所述细胞为EOS细胞。

在本发明的第六方面，提供了一种治疗和/或预防哮喘的方法，给有需要的对象施用第一方面所述的组合试剂。

在另一优选例中，所述对象为CCL15和/或CCL23高表达的对象。

在另一优选例中，所述对象为人。

在另一优选例中，所述对象为哮喘患者。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了哮喘患者中hCCL23和hCCL15的表达增加。其中，图a哮喘患者 (n＝16)与健康对照组(n＝16)的总白细胞(WBC)中hCCL23和hCCL15的相对mRNA表达。b与健康对照组(n＝30)相比，哮喘患者血浆(n＝31)中通过ELISA测定的hCCL23 浓度。a和b中的数据以中线(中线)表示，竖线长度表示不超过四分位间距的1.5 倍(方框表示第25至第75个百分位数之间的差异)。c hCCL23蛋白水平与人外周血嗜酸性粒细胞数量的相关性(n＝61，线性回归和Spearman等级相关性)。d哮喘患者外周血白细胞分离方法的示意图。e外周血总白细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的免疫荧光染色和Wright-Giemsa染色，EPX(绿色)，hCCL23(红色)，hCCL15(红色)和DAPI(蓝色)，比例尺40μm。右上角显示放大图像，比例尺 10μm。**，P<0.01。

图2显示了除了嗜酸性粒细胞外，hCCL23和hCCL15在人白细胞中没有表达。其中，图a用抗hCCL23/hCCL15(红色)，MBP(绿色)和DAPI标记(蓝色)的抗体进行免疫荧光共染，通过嗜酸性粒细胞在外周血细胞中表达hCCL23和 hCCL15，细胞用共聚焦显微镜观察并拍摄。b未发现T淋巴细胞表达hCCL23 和hCCL15。CD3(绿色)，hCCL23/hCCL15(红色)和DAPI(蓝色)，比例尺40μm。放大图像(最右侧)，比例尺10μm。

图3显示了小鼠嗜酸性粒细胞分泌hCCL23和hCCL15的同源类似物mCCL6。其中，图a mCCL6与hCCL23和hCCL15的序列比对。带阴影的字母表示在每个比对位置处与hCCL23和hCCL15特异性相同的残基，破折号表示已插入间隙以优化对齐方式。b过敏性哮喘小鼠模型的构建示意图和后续样品处理。c-e通过ELISA检测来自NS或OVA组小鼠的BALF上清液(c)，肺组织(d)和血清(e)中mCCL6的表达。每个点代表一只小鼠。每组来自4-5只小鼠的数据表示为平均值±SEM。f小鼠BALF 中mCCL6蛋白水平与嗜酸性粒细胞数量的相关性(n＝17，某些点有重叠)。g小鼠外周血中白细胞的流式细胞术圈门方法。嗜酸性粒细胞(Eos)定义为 CD45⁺SiglecF⁺Gr1^int，单核细胞(Mono)定义为CD45⁺Gr1^hiSiglecF^-CX3CR1⁺，嗜中性粒细胞(Neu)定义为CD45⁺Gr1^hiSiglecF^-CX3CR1^-。h通过g图得到NS组小鼠外周血单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞中mCCL6的表达。i小鼠外周血中T细胞 (CD45⁺CD3⁺)和B细胞(CD45⁺B220⁺)的流式细胞术圈门方法。j NS小鼠外周血中Eos、 T细胞和B细胞中mCCL6表达。**，P<0.01；***，P<0.001。

图4显示了在哮喘炎症中小鼠嗜酸性粒细胞的mCCL6分泌增加。a NS和OVA 组的eoCre/R26-tdTomato小鼠肺组织免疫荧光，mCCL6抗体(绿色)，DAPI(蓝色)，嗜酸性粒细胞(tdTomato⁺，红色)。比例尺40μm，20μm。b NS或OVA组小鼠BALF 细胞免疫荧光，mCCL6抗体(绿色)，DAPI(蓝色)，Eos(EPX⁺，红色)。比例尺40μm，20μm。c流式细胞术圈门方法，用于检测BALF细胞中的Eos。d与NS小鼠相比， OVA组的小鼠BALF中嗜酸性粒细胞mCCL6平均荧光强度升高。e用NS和OVA组的 eoCre/R26-tdTomato小鼠骨髓细胞做免疫荧光，mCCL6抗体(绿色)，DAPI(蓝色)，嗜酸性粒细胞(tdTomato⁺，红色)，比例尺40μm。f统计e中tdTomato⁺细胞中mCCL6⁺的百分比(每组n＝6，每只小鼠3张图像)。g Eos(3×10⁶/ml)经过IL-5(20ng/ml) 和/或U0126(20μM)处理6h后，ELISA法检测细胞培养上清里mCCL6的浓度。

图5显示了在嗜酸性粒细胞缺失(Eos-null)小鼠的过敏性炎症模型中几乎未观察到mCCL6表达。用mCCL6抗体(红色)和DAPI(蓝色)对NS或OVA组进行染色后，WT和Eos-null小鼠肺组织中Eos(EPX⁺，绿色)的代表性图像，比例尺40μm。三倍放大图像(最右侧的面板)，比例尺20μm。

图6显示了CCL6缺失减轻OVA引起的嗜酸性气道炎症。其中，图a使用 CRISPR/Cas9系统建立Ccl6^-/-小鼠的示意图。b CCL6敲除效率，WT和Ccl6^-/-小鼠分选并提取嗜酸性粒细胞蛋白进行Western印迹实验。c WT和Ccl6^-/-小鼠BALF细胞进行Wright-Giemsa染色后计数。OVA哮喘模型如图3b所示。来自两个独立实验的每组9-10只小鼠的组合数据表示为平均值±SEM。在最后一次OVA雾化后24 小时，H&E染色(d)，EPX染色(f)和PAS染色(h)的肺切片的代表性显微照片。比例尺，100μm。从d和h分析组织学炎症评分(e)和PAS评分(i)。g分析f中的总有核细胞中，EPX⁺细胞所占百分比(每组n＝4-5只小鼠，每只小鼠4张图像)。每组 4-5只小鼠的数据表示为平均值±SEM，每只小鼠5-7张图像。*，P<0.05；**，P <0.01；***，P<0.001；****，P<0.0001。

图7显示了OVA组WT和Ccl6^-/-小鼠的BALF细胞的免疫荧光和肺组织的定量RT-PCR。其中，a小鼠BALF细胞用EPX(红色)，mCCL6(绿色)和DAPI(蓝色) 抗体进行免疫荧光染色，然后通过共聚焦显微镜观察。比例尺40μm，20μm。 b在最后一次NS或OVA雾化后24小时，通过定量RT-PCR测定肺组织中Tslp， Epx和Muc5ac的相对mRNA水平。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001； ****，P<0.0001。

图8显示了mCCL6缺乏会减少哮喘炎症中TH2细胞的浸润。其中，图a肺组织中TH2细胞的圈门方法。b在NS和OVA组WT和Ccl6^-/-小鼠的肺组织中， TH2细胞(CD3⁺CD4⁺ICOS⁺ST2⁺)的代表性流式细胞点图。c b中TH2细胞数量的绝对值。d肺组织CD4⁺与CD8⁺T细胞的比例。e在最后一次NS或OVA雾化后 24小时，通过定量RT-PCR确定肺组织中Il-13和Il-25的相对mRNA水平。f通过ELISA测定肺组织中IL-4和IL-33的蛋白浓度。数据来自三个独立实验，每组中4-6只小鼠，平均值±SEM。n.s.，无统计学差异；*，P<0.05；***，P <0.001。

图9显示了CCL6缺乏消除了变应原诱导的气道炎症中造血干细胞稳态的损害。a小鼠嗜酸性粒细胞分化谱系。b-c NS或OVA感染的WT和Ccl6-/-小鼠外周血(b)和骨髓(c)中嗜酸性粒细胞的定量数量。d骨髓干祖细胞圈门方案。e-f LSK的代表性流式点图(e)和绝对值(f)。g-h CMP，GMP，MEP的代表性流式点图(g)和绝对值(h)。i-j EoP的代表性流式点图(i)和绝对值(j)。每组中4-6只小鼠，三次重复独立的实验，统计数据表示为平均值±SEM。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。

图10显示了mCCL6直接结合并激活CCR1及下游信号通路。a CCR1与CCL6 的GloSensor实验原理示意图。腺苷酸环化酶激活剂(Forskol in)通过激活腺苷酸环化酶(AC)人工提高cAMP水平，而CCR1被CCL6激活后会抑制AC活性，从而导致cAMP水平下降。b通过GloSensor实验检测细胞内cAMP水平的剂量反应曲线。Forskolin(1μM)处理转染了空载质粒或mCCR1的 GloSensor-HEK293T细胞，并干预所示浓度梯度的mCCL6。30分钟后记录cAMP 的下降情况。数据表示三个技术重复的平均值±SEM。中位数有效浓度(EC50) 通过非线性回归(三个参数)计算。c-d mCCL6在不同时间点干预mCCR1-293T (c)或空载对照293T(d)细胞，蛋白提取物进行p-ERK1/2，ERK1/2，p-p38， p38和GAPDH(上样对照)的Western蛋白印迹实验结果。e通过GloSensor 测定法测量的标准化细胞内cAMP信号的剂量反应曲线。用Forskolin(1μM) 处理转染了mCCR1或mCCR1-Ncut30的GloSensor-HEK293T细胞，并干预所示浓度梯度的mCCL6。30分钟后记录cAMP的下降。数据表示三个技术重复的平均值±SEM(未显示小于符号的误差线)。f在30s(箭头指示)处，用对照或 400ng/mL mCCL6处理的小鼠原代嗜酸性粒细胞(自身缺失mCCL6)，并迅速检测细胞内钙，通过流式细胞仪继续记录150s。g用对照或400ng/mL mCCL6处理2小时的小鼠原代嗜酸性粒细胞(自身缺失mCCL6)，通过流式细胞仪分析 mCCR1表面表达。

图11显示了抑制CCR1可减轻OVA诱导的嗜酸性粒细胞气道炎症。a BMDE 提取和培养示意图，及BX471干预方法。b如a中所示，在用BX471处理的 WT BMDE中，以SiglecF⁺F4/80⁺细胞为特征的嗜酸性粒细胞的数量如图所示(每独立培养物中n＝4只小鼠)。c BX471的哮喘治疗模型。d BALF细胞的分类计数。e BX471治疗后肺组织进行EPX抗体免疫组化染色。比例尺100μm。f分析e中EPX⁺细胞与有核细胞总数的比值(每组n＝4-5只小鼠，每只小鼠4张图像)。g-i ELISA检测BX471治疗模型中血清(g)、肺组织(h)和BALF上清液(i)中mCCL6的浓度。j-k通过定量RT-PCR和ELISA测定肺组织中Il-13 和Il-25的相对mRNA水平(j)以及IL-4和IL-33的蛋白质水平(k)。每组中4-5只小鼠，平均值±SEM。n.s.，无统计学差异；*，P<0.05；**，P<0.01； ***，P<0.001；****，P<0.0001。

图12显示了CCR1缺乏会抑制嗜酸性粒细胞体外分化，CCR1在过敏性炎症模型的骨髓干祖细胞中表达和激活。a WT和Ccr1^-/-小鼠BMDE培养过程中， SiglecF⁺F4/80⁺的嗜酸性粒细胞的数量(n＝3)。b定量RT-PCR检测NS和OVA 组小鼠骨髓细胞中干祖细胞的CCR1mRNA表达。c流式细胞术检测NS和OVA 组小鼠骨髓细胞中干祖细胞表面CCR1蛋白表达。数据统计为平均值±SEM，每组4只小鼠。n.s.，无统计学差异；*，P<0.05。**，P<0.01。

图13显示了CCR1缺陷小鼠全骨髓移植和竞争性骨髓移植在OVA模型中均显示出嗜酸性粒细胞分化能力减弱。a全骨髓移植后构建OVA哮喘模型的示意图，WT受体鼠在接受致死性照射后，接受WT或Ccr1基因敲除(Ccr1^-/-)供体小鼠的全骨髓移植。b-c骨髓中CMP，GMP，MEP的流式细胞计数比例(b)和绝对值(c)。d-e哮喘模型中EoP的流式细胞计数比例(d)和绝对值(e)。每组中2-5只小鼠。f竞争性骨髓移植后小鼠的过敏性哮喘模型的示意图，受体小鼠在接受致死剂量照射后接受了WT(CD45.1⁺)和Ccr1^-/-(CD45.2⁺)骨髓细胞的竞争性骨髓移植。g WT或Ccr1^-/-产生的LSK，GMP和EoP在OVA小鼠骨髓中的百分比。h-i在OVA小鼠的BALF和外周血中WT或Ccr1^-/-嗜酸性粒细胞的百分比。统计学计算数据为平均值±SEM，每组4只小鼠。n.s.，无统计学差异；*，P<0.05；**，P<0.01。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究,意外地发现抑制“CCL6/15/23－CCR1复合物”的形成，有助于治疗预防哮喘，在此基础上，完成了本发明。

具体地，本发明的实验表明，C-C趋化因子配体6(CCL6)在哮喘小鼠中增加，其人类直系同源物CCL15和CCL23在哮喘患者中高表达，且它们都主要来自嗜酸性粒细胞。使用Ccl6基因敲除小鼠的进一步研究显示，小鼠哮喘得到了缓解。此外，本发明人还在造血干细胞(HSCs)中确定了CCL6-CCR1调控轴。靶向该调控轴的特异性CCR1拮抗剂BX471可显著降低了嗜酸性粒细胞的分化和气道炎症。因此，该研究首次确定了CCL6-CCR1轴参与了变应性气道炎症发展过程中嗜酸性粒细胞与HSC之间的联系。因此，本发明也揭示了靶向G蛋白偶联受体(GPCR)的潜在治疗策略，可用于未来的哮喘临床治疗。

术语

如本文所用，“本发明的组合试剂”指的是含有S1)靶向CCL15的抑制剂和/或靶向CCL23的抑制剂；和(S2)靶向CCR1的抑制剂的组合试剂。

如本文所用，术语“CCL6/15/23”、“CCL6/15/23配体”、“CCL6/15/23 蛋白”可互换使用，指小鼠的C-C趋化因子配体6、人的C-C趋化因子配体15、人C-C趋化因子配体23、或其同系物。应理解，该术语包括野生型CCL6/15/23 蛋白和突变型的CCL6/15/23蛋白，只要该突变型保留了野生型的至少30％的配体活性，尤其是与CCR1受体形成“CCL6/15/23－CCR1复合物”的功能或活性。

如本文所用，术语“CCL6-CCR1调控轴”、“CCL6/15/23-CCR1调控轴” 可互换使用，指CCL6/15/23配体与CCR1通过形成关键的“CCL6/15/23－CCR1 复合物”，从而对下游的信号通路或功能进行调控。

CCL6/15/23配体

小鼠CC趋化因子配体6(mCCL6)文献多报道其主要由巨噬细胞产生，并吸引巨噬细胞、CD4⁺T细胞和嗜酸性粒细胞，并在多种炎症性疾病过程中起重要作用。人CC趋化因子配体15(hCCL1，也称为MPIF-1)和人CC趋化因子配体 23(hCCL23，也称为MIP-5，MIP-1δ)是mCCL6的直系同源类似物，同属于趋化因子NC6亚家族。然而，嗜酸性粒细胞分泌的mCCL6的确切功能，及其在过敏性哮喘中的致病作用尚不完全清楚；同样，hCCL23和hCCL15在哮喘患者中的作用仍有待探索。

嗜酸性粒细胞的分化、哮喘以及气道炎症

嗜酸性粒细胞是白细胞的一种，由骨髓中的造血干细胞(HSC)分化而来，经过活化的造血干细胞(Lineage^-Sca-1⁺c-Kit⁺，LSK))、共同髓系祖细胞(CMP) 和粒单核系祖细胞(GMP)、嗜酸性粒细胞祖细胞(EoP)，最终发育为成熟的嗜酸性粒细胞。这一过程受一系列转录因子(GATA-1、PU.1、C/EBP)和细胞因子(IL-5、IL-3、GM-CSF)等的调控。

哮喘是一种异质性疾病，通常以慢性气道炎症为特征，伴有可变的气流受限、气道高反应性。

慢性气道炎症是哮喘的重要病理特征，由多种炎症细胞和细胞因子参与，包括嗜酸性粒细胞、肥大细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、气道上皮细胞等，炎症介质包括组胺、白三烯、前列腺素、IL-4、IL-5、IL-13、GM-CSF等。哮喘气道炎症的病理学特征包括炎症细胞浸润、上皮细胞破坏、基底膜变化、气道粘液高分泌。

药物组合物和应用

本发明还提供了含有本发明的组合试剂的组合物或制剂或产品，所述组合物或制剂或产品可用于治疗或预防哮喘。

一种优选的组合物是药物组合物，它含有：

在另一优选例中，所述药物组合物还含有靶向CCR1的抑制剂。

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性(即抗衰老功能)的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，术语“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。

本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的活性成分每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重) 的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

典型地，当以口服方式给本发明的药物组合物时，一个60kg体重的对象 (人)，日平均剂量通常为10-500mg，较佳地20-300mg，更佳地50-250mg。所述日剂量可以分一次、二次或多次服用。

本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。

本发明的主要优点包括：

(a)首次提出了含有靶向CCL15和/或靶向CCL23的抑制剂；和靶向CCR1 的抑制剂的组合制剂，并且发现所述组合试剂能治疗哮喘。

(b)本发明的组合试剂不仅能够治疗或者预防哮喘，还能够用于制备检测哮喘或者CCL15和/或CCL23高表达患者的试剂盒。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1

哮喘患者的hCCL23和hCCL15直系同源物水平升高

为了探讨hCCL23/hCCL15和嗜酸性粒细胞计数在过敏性哮喘中的临床相关性，本发明人分析了31例急性发作的哮喘患者和30例健康对照者的血液样本。表1总结了受试者的临床特征。

表1.样本的临床特征。

平均值±SEM或数目(％)。*NA，not available。

本发明人从外周血白细胞(WBC)中提取了总mRNA，发现哮喘患者中hCCL23 和hCCL15的相对mRNA表达水平高于对照组(图1a)。此外，哮喘组的血清hCCL23 浓度高于健康对照组(图1b)，并与外周血嗜酸性粒细胞数量相关(图1c)。然后，本发明人分离了哮喘患者血液中的人嗜酸性粒细胞，单核细胞和嗜中性粒细胞，并进行了免疫荧光染色(图1d)。通过Wright-Giemsa染色和免疫荧光染色验证细胞。值得注意的是，与白细胞中其他细胞类型相比，hCCL23和hCCL15 表达主要在嗜酸性粒细胞中发现(图1e和图2a，b)。

因此，这提示，哮喘患者中hCCL23和hCCL15的上调提示该细胞因子可能与过敏性气道炎症有关。

实施例2

嗜酸性粒细胞来源的mCCL6在小鼠哮喘模型中增加

hCCL23和hCCL15是NC6亚家族的四个趋化因子中的两个，并且是mCCL6 的直系同源物(图3a)。为了研究hCCL23和hCCL15在过敏性气道炎症中的作用，本发明人建立了卵白蛋白(OVA)诱导的过敏性哮喘的小鼠模型，并首先检查了 mCCL6的浓度(图3b)。

结果表明，OVA组小鼠的支气管肺泡灌洗液(BALF)上清液(图3c)，肺组织(图3d)和血清(图3e)中的mCCL6水平均显著高于生理盐水(NS)对照组小鼠。此外，在相关分析中，mCCL6水平与BALF中的嗜酸性粒细胞计数呈正相关(图 3f)。

为了确定mCCL6的来源，本发明人分析了对照和OVA组小鼠不同部位的 mCCL6。通过流式细胞术确定外周血中不同细胞类型中的细胞内mCCL6水平(图 3g，i)。结果表明，嗜酸性粒细胞中mCCL6的平均荧光强度(MFI)明显高于单核细胞，嗜中性粒细胞和淋巴细胞(图3h和图3j)，表明嗜酸性粒细胞是体内稳态下mCCL6的主要来源。

本发明人通过将eoCre小鼠与R26-tdTomato小鼠杂交，进一步证实了 mCCL6的来源，该小鼠产生了具有嗜酸性粒细胞特异性tdTomato荧光的小鼠品系。如预期的那样，嗜酸性粒细胞是炎性肺组织中mCCL6的主要来源(图4a)。在BALF细胞中针对EPX的特异性染色证实了mCCL6和EPX的共定位(图4b)。

此外，本发明人分析了BALF嗜酸性粒细胞中的mCCL6 MFI，发现与对照组 (NS)相比，嗜酸性粒细胞中mCCL6的蓄积水平是OVA组的两倍以上(图4c和图 4d)。

骨髓细胞的免疫荧光分析表明，在OVA引起的气道炎症反应下，嗜酸性粒细胞分泌的mCCL6水平升高(图4e和图4f)，在这种情况下，IL-5可能是通过MAPK 途径促进mCCL6的释放(图4g)。在嗜酸性粒细胞缺失小鼠(Eos-null)中，在哮喘模型中几乎未观察到mCCL6以及气道炎症(图5)。

综上所述，这些结果揭示了在稳态和气道变应性炎症中，嗜酸性粒细胞是 mCCL6的主要来源，并且在过敏性气道炎症条件下嗜酸性粒细胞分泌mCCL6的水平增加。

实施例3

CCL6缺陷小鼠表现出嗜酸性气道炎症减轻和嗜酸性粒细胞分化谱系减少

为了研究体内mCCL6对哮喘的贡献，本发明人使用CRISPR/Cas9系统构建了Ccl6基因敲除(Ccl6^-/-)小鼠(图6a)。通过对野生型(WT)和Ccl6^-/-小鼠骨髓中分选的嗜酸性粒细胞的mCCL6进行蛋白质印迹分析，证实了敲除效率(图6b)。雄性和雌性Ccl6^-/-小鼠表现健康，外周血白细胞分类计数无基础缺陷(表2)。

表2.WT和Ccl6^-/-小鼠外周血白细胞分类计数

平均值±SEM。

然而，在OVA诱导的哮喘模型建立之后，本发明人发现Ccl6^-/-小鼠的BALF 中表现出嗜酸性粒细胞计数明显减少，而BALF中的其他细胞类型未观察到显著变化(图6c)。病理肺切片分析显示，OVA组的WT小鼠在支气管周围表现出明显的炎性细胞浸润，而Ccl6^-/-小鼠则炎性浸润明显减弱(图6d，e)，特别是在EPX染色上嗜酸性粒细胞浸润减少(图6f，g)。高碘酸-希夫(PAS)染色进一步显示，Ccl6^-/-小鼠对OVA诱导的过敏性气道炎症表现出轻度反应，黏液分泌减少(图6h，i)。另外，用EPX和mCCL6抗体对BALF细胞进行双重免疫荧光染色证实了OVA组的WT和Ccl6^-/-小鼠中的这些结果(图7a)。

与这些发现一致，在OVA哮喘组WT小鼠的肺组织中，炎症相关的胸腺基质淋巴细胞生成素(Tslp)、Epx和分泌的气道粘蛋白Muc5ac的mRNA表达增加，而在Ccl6^-/-小鼠中则明显缓解(图7b)。使用流式细胞术在肺组织中(图8a)分析TH2 细胞，本发明人发现在OVA哮喘组的Ccl6^-/-小鼠(图8b，c)肺组织中，TH2细胞的浸润减少了，而对CD4⁺/CD8⁺比率没有明显变化(图8d)。本发明人进一步评估了肺组织中典型的TH2细胞因子产生，发现在OVA诱导下，WT小鼠肺组织中的Il-13 和Il-25的mRNA表达上调(图8e)以及IL-4和IL-33蛋白的浓度升高，而在Ccl6^-/-小鼠中则显著缓解(图8f)。这些数据表明，OVA诱导的气道炎症在体内是CCL6 依赖性的。

嗜酸性粒细胞的分化经过造血干细胞(HSC)，共同髓系祖细胞(CMP)，粒单核系祖细胞(GMP)和嗜酸性粒细胞祖细胞(EoP)(图9a)。OVA雾化后的Ccl6^-/-小鼠外周血(图9b)和骨髓(图9c)中成熟嗜酸性粒细胞的数量没有增加，这表明mCCL6缺乏同时伴有嗜酸性粒细胞谱系分化减少。首先，我们通过流式细胞仪评估了OVA组WT和Ccl6^-/-小鼠中嗜酸性粒细胞相关干祖细胞的数量(图9d)。LSK所代表的HSC的比例在OVA组的WT小鼠中有所增加，但在Ccl6^-/-小鼠中仅略有变化(图9e，f)。通过分析与嗜酸性粒细胞生成有关的谱系，包括CMP，GMP，巨核细胞-红系祖细胞(MEP)(图9g，h)和EoP(图9i，j)，我们发现mCCL6缺乏抑制了嗜酸性粒细胞分化相关的造血干祖细胞增加。这些数据表明，mCCL6对于过敏性气道炎症中的HSC嗜酸性粒细胞分化至关重要。

实施例4

CCR1被鉴定为mCCL6受体

mCCL6的确切受体尚未精确定义。先前的一项研究报道，CCR1属于G蛋白偶联受体(GPCR)超家族，在IL-13诱导的肺部炎症和重塑模型中是mCCL6的推定受体。使用GloSensor实验(图10a)，本发明人首先发现mCCL6可以激活mCCR1，导致Gαi被激活并下调第二信使分子环状AMP(cAMP)触发下游信号级联(图10b， e)。此外，mCCL6干预用mCCR1瞬时转染的HEK293T细胞诱导了时间依赖性 p-ERK1/2和p-p38表达(图10c，d)，提供了mCCR1激活的证据。像经典GPCRs一样，CCR1在配体结合和激活后被内在化。同样，在原发性嗜酸性粒细胞中施用 CCL6后，细胞内钙快速流入并随后CCR1内化(图10f，g)。

实施例5

靶向抑制CCR1或缺失会损害嗜酸性粒细胞的持续分化并减轻气道炎症

本发明人证实了mCCL6和CCR1之间的相互作用促进了嗜酸性粒细胞增多和过敏性炎症。本发明人利用骨髓来源的嗜酸性粒细胞(BMDE)，并用BX471(一种有效的特异性CCR1拮抗剂)对其进行了处理(图11a)。在第0、4和8天或第4和8 天进行BX471给药会导致在第8、9和10天出现嗜酸性粒细胞减少(图11b)。在从 Ccr1基因敲除(Ccr1^-/-)小鼠的BMDEs的分化中也证实了类似的结果(图12a)，这表明CCR1的抑制可以减少嗜酸性粒细胞的分化。

接下来，本发明人分析了哮喘模型中来自骨髓的干祖细胞中CCR1的表达和激活。尽管在NS和OVA小鼠中没有发现CCR1表达的差异，但是在OVA组中，干祖细胞的细胞表面CCR1水平显着降低，代表了配体识别和CCR1内化(图12b，c)。本发明人通过全骨髓移植，条件性敲除小鼠造血系统的CCR1，并建立OVA哮喘模型，分析嗜酸性粒细胞的分化(图13a)。缺乏CCR1的骨髓细胞表现出嗜酸性粒细胞分化减弱(图13b-e)。此外，建立了带有WT和Ccr1^-/-骨髓细胞的嵌合模型，其中干细胞和祖细胞在由OVA激发诱导的mCCL6刺激引起的分化应激下共享相同的微环境(图13f)。与WT细胞相比，CCR1缺失的细胞从干细胞、祖细胞(包括 GMP和EoP)到成熟嗜酸性粒细胞的分化比例都明显减少(图13g-i)。

本发明人进一步探索了特异性CCR1抑制作用在体内过敏性气道炎症中的作用。在NS或OVA雾化期间，每8小时皮下注射BX471(20mg/kg)或媒介物给小鼠 (图11c)。在BALF细胞中，BX471处理可完全逆转OVA诱导的嗜酸性粒细胞增多 (图11d)。BX471处理肺组织后，支气管周围的EPX⁺嗜酸性粒细胞浸润减少到与 NS组小鼠相当的水平(图11e，f)。对mCCL6水平的分析显示，BX471治疗显着降低了肺组织和BALF中的mCCL6(图11g-i)，表明mCCL6的水平降低与嗜酸性粒细胞的变化一致。对肺组织中Il-13和Il-25的相对mRNA水平(图11j)以及IL-4和 IL-33的蛋白质水平(图11k)的分析还表明，BX471的治疗抑制了OVA引起的TH2 细胞因子的增加。这些数据表明，阻断mCCL6-CCR1信号传导可防止肺部嗜酸性粒细胞炎症。

讨论

嗜酸性粒细胞产生多种细胞介质，参与过敏性哮喘的发生和发展。例如，活性嗜酸性粒细胞产生细胞因子，例如白介素(IL-4，IL-13)，CC趋化因子配体5(CCL5)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，并调节树突状细胞和T 辅助物肺免疫反应中的2型(TH2)效应细胞。

嗜酸性粒细胞还分泌颗粒，包括嗜酸性粒细胞过氧化物酶(EPX)，嗜酸性粒细胞主要碱性蛋白，嗜酸性粒细胞阳离子蛋白和嗜酸性粒细胞衍生的神经毒素，它们直接导致哮喘病理。这些因素在变应性哮喘中形成了免疫调节网络，揭示了嗜酸性粒细胞与其他免疫细胞之间的动态相互作用。

本发明人发现，嗜酸性粒细胞主要通过嗜酸性粒细胞衍生的mCCL6，破坏 HSC维持和动员，从而破坏了HSC稳态。嗜酸性粒细胞对干细胞的影响表明，嗜酸性粒细胞可能参与哮喘病理的发生。然而，嗜酸性粒细胞和有效因子在过敏性哮喘中的复杂作用仍不完全清楚。

研究表明，mCCL6(也称为C10)主要由巨噬细胞产生，主要趋化巨噬细胞、 CD4⁺T细胞和嗜酸性粒细胞。mCCL6在炎症过程中起重要作用，包括肺纤维化、变应性支气管肺曲菌病、败血症、和实验性脱髓鞘疾病。

小鼠CCL6与人CCL23(也称为MPIF-1)和CCL15(也称为MIP-5，MIP-1δ) 并可能激活CCR1。本发明人的先前研究表明，嗜酸性粒细胞分泌的mCCL6对炎症性气道疾病中HSC损伤的潜在作用。

然而，在本发明之前，mCCL6的确切功能尚不完全清楚，其过敏性哮喘的致病作用尚不清楚；同样，hCCL23和hCCL15在哮喘患者中的作用尚不清楚。

在本发明中，本发明人探讨了嗜酸性粒细胞分泌的mCCL6在过敏性炎症病理中的作用。mCCL6与CCR1相互作用，构成哮喘加重的正反馈。在哮喘患者中， mCCL6的人类直系同源hCCL23和hCCL15表达也增加，支持了当前发现的临床相关性。

具体地，在本发明的研究中，本发明人发现哮喘患者的hCCL23和hCCL15 升高。动物研究显示出相似的结果，其中包括嗜酸性粒细胞衍生的mCCL6的表达增加，而后者负责嗜酸性粒细胞的气道炎症。使用Ccl6^-/-小鼠，本发明人发现CCL6缺乏症显著降低了OVA诱导的嗜酸性粒细胞增多，粘液分泌过多和气道TH2反应。特别地，本发明人提供直接证据表明mCCL6激活CCR1并诱导下游p-ERK1/2和p-p38表达。在体外和体内，使用特异性CCR1拮抗剂BX471的治疗均能显著缓解嗜酸性粒细胞分化和OVA诱导的嗜酸性粒细胞气道炎症。因此，本发明人得出结论，CCL6-CCR1轴是哮喘发病机制中的重要调控机制，并且是进一步治疗研究的潜在靶标。

本发明人之前和当前的研究都强调了关键趋化因子的功能，即主要来源于嗜酸性粒细胞的mCCL6，它通过直接作用于骨髓HSC来促进嗜酸性粒细胞的发育并引发过敏性气道炎症。嗜酸性粒细胞是多功能的白细胞，证据支持嗜酸性粒细胞与祖细胞之间的相互作用具有更广泛的作用，它们在过敏性炎症的引发和促进中可能起有效的效应细胞作用。在HSCs的源头阻断祖细胞或抑制HSC 在动物研究中，骨髓中的嗜酸性粒细胞分化被认为是哮喘的有效治疗策略。在这里，本发明人确定mCCL6是参与变应性炎症小鼠模型中嗜酸性粒细胞与祖细胞之间串扰的重要介体。HSC和EoP群体的增加主要取决于mCCL6表达的上调，这可能参与了过敏性炎症的发生，这表明mCCL6有助于嗜酸性粒细胞及其祖细胞在肺部病理学中的潜在反馈作用。

造血干细胞负责终生产生血细胞。此外，HSC必须响应急性或慢性需求，例如伤害或炎症。早就知道促炎细胞因子，例如IL-1，肿瘤坏死因子-α(TNF- α)和干扰素(IFN)，可以促进HSC增殖并增加骨髓细胞的细胞输出。在慢性炎症周期中，本发明人注意到与稳态相比，高水平的mCCL6导致HSC分化不平衡。因此，本发明人假设嗜酸性粒细胞不断产生mCCL6是HSC功能障碍和慢性炎症调节周期的触发因素。本发明人的研究为慢性炎症信号如何影响HSC维持气道病理反应提供了新的见解。

趋化因子是通过激活GPCR介导免疫细胞运输而充当免疫调节剂的小蛋白。趋化因子及其受体已成为广泛的免疫和炎性疾病的主要参与者和关键治疗靶点。然而，炎性趋化因子和趋化因子受体的生物学和生物化学非常复杂，部分原因是受体表现出混杂的配体结合。反之，趋化因子结合多种趋化因子受体。 mCCL6，hCCL15和hCCL23属于具有N端延伸的NC6亚科。据报道，hCCL23与细胞表面受体CCR1结合，与哮喘儿童的总IgE相关。

先前的研究表明，hCCL15结合细胞表面受体CCR1，并可能通过影响气道平滑肌细胞而导致哮喘的严重程度和气流受限。此外，本发明人提供了mCCL6 激活Gαi蛋白和相关磷酸化信号蛋白下游的CCR1的证据。激活HSC并促进HSC 分化，为CCL6-CCR1轴提供了令人信服的证据。最近在炎症性疾病中发现并研究了许多CCR1拮抗剂，这些拮抗剂已在临床试验中显示出潜在的治疗效果。这些数据表明，以CCL6-CCR1轴为靶点可能是一种有希望的预防或治疗策略。减轻过敏性炎症。本发明人的发现为趋化因子受体功能的新理论做出了贡献，并提示NC6家族趋化因子和相关受体可能是嗜酸性气道炎症的潜在生物标志物和靶标。

总之，这项研究表明，哮喘患者中hCCL23和hCCL15直向同源物的水平升高，并证明了嗜酸性粒细胞衍生的mCCL6在鼠类过敏性哮喘模型和变应原诱导的嗜酸性粒细胞中的重要作用。气道炎症由mCCL6介导，并在mCCL6缺乏症或特定 CCR1抑制后的小鼠中减轻。因此，更好地了解变应性气道炎症过程中CCL6-CCR1 相互作用在嗜酸性粒细胞分化中的新功能作用可能会导致开发新的治疗目标，用于治疗变应性哮喘。本发明人的发现也为趋化因子受体作为生物标志物功能的新理论做出了贡献，并表明以有效的中和抗体或特异性抑制剂靶向NC6家族趋化因子和相关受体可能是嗜酸性气道炎症的潜在治疗策略。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种组合试剂，其特征在于，组合试剂包含：

(S1)靶向CCL15的抑制剂和/或靶向CCL23的抑制剂；和

(S2)靶向CCR1的抑制剂。

2.一种组合试剂的用途，其特征在于，组合试剂包含：

(S1)靶向CCL15的抑制剂和/或靶向CCL23的抑制剂；和

(S2)靶向CCR1的抑制剂；

3.如权利要求2所述用途，其特征在于，用于所述组合试剂还用于制备治疗和/或缓解哮喘的药物。

4.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述试剂为口服制剂或非口服制剂。

5.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

(K1)检测试剂，所述的检测试剂用于检测CCL6/15/23配体、和/或CCL6/15/23－CCR1复合物；以及

6.一种药物组合物，其特征在于，包括：

7.一种体外的抑制“CCL6/15/23－CCR1复合物”的形成的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)在靶向CCL15的抑制剂和/或靶向CCL23的抑制剂存在下，将CCL15和/或CCL23与CCR1接触，从而抑制“CCL6/15/23－CCR1复合物”的形成。

8.一种治疗和/或预防哮喘的方法，其特征在于，给有需要的对象施用权利要求1所述的组合试剂。