CN114740075A - 一种基于hs-ptr-tof-ms快速确定酱油发酵阶段及特征香气的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种基于HS‑PTR‑TOF‑MS快速确定酱油发酵阶段及特征香气的方法,为了检测到尽可能多的挥发性成分,通过优化顶空样品量,温度,时间,气体吹扫流速,盐离子含量等多种指标来增加顶空上层的挥发性气体浓度;HS‑PTR‑TOF‑MS快速采集得到不同发酵阶段酱油样品的统计分析质谱数据,并构建不同酱油发酵阶段质谱数据库;利用PCA,PLS‑DA,SVM,ANN,RNN,随机森林等多种数学模型,构建分类和预测模型,同时并确定不同发酵阶段的差异质谱数据。与现有技术对比,本发明建立了一种新型,准确,快速实现对不同发酵过程的酱油样本采集和预测,较好的消除了人员干扰和长时间的仪器分析的带来的时间成分。
Description
技术领域
本发明涉及食品风味生产控制领域,具体为一种基于HS-PTR-TOF-MS快 速确定酱油发酵阶段及特征香气的方法。
背景技术
酱油是一种传统的发酵调味品,主要是以大豆、豆粕等植物蛋白为主要 原料,辅以面粉、小麦等淀粉质原料,利用微生物(如曲霉、酵母菌、乳酸 菌等)的发酵作用,水解生成多种氨基酸、肽、有机酸及糖类,并以这些物 质为基础,经过复杂的生物化学变化,形成具有特殊色泽、香气、滋味和状 态的调味液。酱油的生产历史悠久,起源于我国周朝时期(公元前1059年– 前221年),我国是酱油的主要生产和消费大国。现如今酱油更是传入世界各地,不仅东亚、东南亚等传统酱油消费国,欧美等国家的酱油消费量也逐 年增加,酱油在食品加工、烹调或佐餐时赋予食品良好的色、香、味,引发 人的食欲,已经成为世界性的大宗调味品。此外许多研究表明,酿造酱油中 不仅含有丰富的营养物质,而且含有多种具有生理活性的物质,如呋喃酮、 异黄酮、类黑精等,具有抗氧化、抗癌、抗菌、抗凝血、降血压、提高免疫 等保健功能。
研究食品的风味,首先要了解风味物质的成分及组成,即对风味物质进 行成分分析。因此,风味分析前处理的首要任务是将挥发性化合物从食品复 杂体系中提取分离出来。一项有效的香气提取技术必须满足以下4点要求: (1)能提取到对香气有贡献的关键风味物质;(2)不改变或破坏香气物质 的结构;(3)不产生新的香气化合物或其他干扰物质;(4)消除不挥发性 物质对GC分离系统的影响。然而风味物质组成复杂,并且在食品中含量低, 常为ppm或ppb,甚至ppt级别,通常具有一定的挥发性和热不稳定性,对 酸碱比较敏感,在酶的作用下,风味物质也都有被破坏的可能。所以,选择 有效、合适的提取手段是样品预处理的关键。
目前常用的香气物质检测技术有气相色谱法、液相色谱法,气相色谱-质 谱联用法,气相色谱嗅闻技术和电子鼻检测技术等。传统上酱油发酵过程的 评价需要依靠感官成员的“感官”完成,不但审评周期较长,而且容易受到 各种主观和外界因素的干扰,数据的“一致性”和“量化性”都不足,难以 客观且稳定地表征其实际品质,因此有必要寻找一种标准化且易操作的手段 实现监控酱油发酵过程变化的方法。
PTR-TOF-MS是一种痕量挥发性有机物在线检测技术。PTR-TOF-MS通常采 用H3O+作为初始反应离子,通过与有机物分子M的质子转移反应生成准分子 离子MH+,并采用质谱检测产物离子的强度来定量确定有机物M的绝对浓度。 常规的VOCs检测方法主要采用气相色谱或色谱-质谱联用技术。在分析前需 要对样品进行预处理,因此费时、费力且容易引起样品的交叉污染,致使分 析难度加大;而PTR-MS技术无需对样品进行预处理,可直接测定挥发性有机 物的绝对浓度,并具有高灵敏度、快响应速度、低裂解度以及不受空气中常 规组分干扰等优点,已发展成为痕量气体在线监测的潜在有效手段。
发明内容
基于此,本发明旨在建立一种基于HS-PTR-TOF-MS快速确定酱油发酵阶 段及特征香气的方法,用于代替传统的人工感官评价,实现对不同发酵时期 酱油的快速判别。
本发明方案主要可以归纳为以下步骤:S1:样品前处理的优化,为了检测 到尽可能多的挥发性成分,通过优化顶空样品量,温度,时间,气体吹扫流 速,盐离子含量等多种指标来增加顶空上层的挥发性气体浓度;S2:确定方 法的稳定和重现性,保证实验的准确度;S3:利用HS-PTR-TOF-MS快速采集 得到不同发酵阶段酱油样品的统计分析质谱数据,并构建不同酱油发酵阶段 质谱数据库;S4:利用PCA,PLS-DA,SVM,ANN,KNN,随机森林等多种数学 模型模拟构建分类和预测模型,确定最佳构建模型及相关参数,同时并确定 不同发酵阶段的差异质谱数据;S5:靶向验证其差异的特征分子量成分,结 合GC-MS或文献可确定其差异成分;根据不同发酵阶段相应的特征指标和差 异成分来确定酱油发酵的阶段。
本发明具体采用以下的技术方案
优化前处理方案:以测定物质的数量和响应值为指标来判断前处理的条 件,样品量1g、2g、5g、7g、10g;
温度30℃、40℃、50℃、60℃、70℃;
气体吹扫流速0.1ml/min、0.2ml/min、0.4ml/min、0.6ml/min、0.8ml/min;
盐离子的含量;
检测时间的长短:观察30min内数据的稳定性;
确定方法的稳定和重现性(n=6),保证实验的准确度;
基于上述稳定的方法采集发酵过程中酱油的挥发性风味成分质谱数据, 并建立酱油发酵过程中的挥发性风味成分数据库,并采用PCA,PLS-DA,SVM, ANN,KNN,随机森林等多种数学模型模拟构建分类和预测模型。
针对分析不同发酵过程中的差异代谢产物质谱分子量,进一步结合GC-MS 分析判断其具体的成分,确定其发酵过程中的挥发性风味成分的含量和物质 的变化。
优选前期的实验方法,所述酱油样品通过以下步骤进行分析和制备:
样品前处理:5g酱油样品,加入2g盐,在50℃温度下预热7min,测定 3min;吹扫气体为氮气,流速为0.1L/min:漂移管电压640V,漂移管温度80 ℃,漂移管压力225pa,电场强度102Td,漂移管中气体流量45pa.m3/s,扫描 m/z范围30-350,取测定条件下60个循环的稳定数据进行分析;
在相同的工作条件下,HS-PTR-TOF-MS对不同发酵阶段酱油样品进行多次 扫描,统计整理得到酱油挥发性成分PTR-TOF-MS质谱数据库;
基于挥发性成分质谱数据库,首先采用PLS-DA和OPLS-DA无监督的判别 方式确定不同发酵阶段酱油的挥发性成分差异代谢产物,建立不同发酵阶段 的挥发性香气标准,后采用K-邻近算法等有监督的机器学习方式进行预测, 通过调整相应的模型参数,能够得到最佳的预测结果;
靶向验证其差异的特征分子量成分,结合GC-MS或文献可确定其差异成 分;根据不同发酵阶段相应的特征指标和差异成分来确定酱油发酵的阶段。
综上所述,本发明主要具有以下有益效果:
1,本发明建立的成熟稳定的HS-PTR-TOF-MS检测不同发酵阶段酱油的方 法,能够针对酱油样品做到良好的重现性和稳定性。
2,相比传统的GC-MS检测方式,检测全过程方便快捷,消耗时间短,制 备好的样品完成判别的全过程小于3min,仪器方便操作和使用。
3,KNN模型分析结果表明该模型具有良好的稳定性,与实际结果的一致 性也高于90%,因此该判别结果具有很好的实用价值,能够很好地实现对不同 发酵过程中酱油的调控。
附图说明
图1是本发明实施例不同发酵阶段酱油最小判别二乘法PLS-DA得分图;
图2是本发明实施例KNN判别函数的预测得分图。
具体实施方式
为让本专利的特征和优点能更明显易懂,下文特举实施例,并配合附图, 作详细说明如下:本实施例利用HS-PTR-TOF-MS对不同发酵天数的酱油进行 质谱分析并检测,
具体分析和建立过程如下:
(1)样品前处理:称取5g酱油样品,加入2g盐,在50℃温度下预热 7min,测定3min;吹扫气体为氮气,流速为0.1L/min;PTR-TOF-MS测试条件: 漂移管电压640V,漂移管温度80℃,漂移管压力225pa,电场强度102Td, 漂移管中气体流量45pa.m3/s,扫描m/z范围30-350。每个样品以每秒一张 全谱图的采集速率测量60秒,测量顺序随机。
(2)数据分析:将获得的不同发酵过程酱油样品挥发性物质的 HS-PTR-TOF-MS检测图谱,经PTR-TOF-MS自带软件计算得到m/z(质荷比) 整数值。以m/z整数值为自变量,质量峰的信号强度为因变量,对所采集到 的9个时间段不同发酵过程酱油样品的顶空挥发性化合物进行分析。
(3)确定对不同发酵阶段酱油的差异代谢产物的质荷比。运用正交偏最 小二乘判别分析(PLS-DA和OPLS-DA)确定贡献度最大(VIP值大于1)以及 P value小于0.05的质荷比m/z,确定不同发酵阶段潜在的差异代谢产物有: 45,43,55,56,57,91,103,44,57,91,60,124,137,128,83等。 单一的PCA或PLS-DA还不能准确的预测不同发酵阶段下酱油差异,部分天数 差异不明显,仍然会重合在一起,通过KNN机器学习模型构建训练集和预测 数据集,训练集构建相应的KNN模型,通过调整相应的参数K值,可提高预 测的准确性,更好的提供分类的方式,当K值为10,准确度可达到90以上。
(4)采用GC-MS对酱油差异代谢产物进行进一步分析发现,3-羟基-4,5- 二甲基-2(5H)-呋喃酮,4-羟基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮,4-羟基-5-乙基 -2-甲基-3(2H)-
呋喃酮或4-羟基-2-乙基-5-甲基-3(2H)-呋喃酮等特征性的差异代谢产 物。
(5)通过以上实施例对一种基于HS-PTR-TOF-MS快速确定酱油发酵阶段 及特征香气的方法的详细介绍,我们发现不同发酵阶段的酱油挥发性风味成 分具有显著性差异,尤其是酱油的特征挥发性风味物质。其由多种微量成分 组合而成,包括醇、酯、酸、醛、酮以及各种杂环类化合物等,其中酮类化 合物香气相近,对酱油风味贡献巨大,并构成了酱油特有的香气骨架,而酯 类化合物成分复杂,一部分在美拉德反应过程中产生,另一部分则需要微生 物的发酵来不断产生。醛、酮等含量较少,对风味有较大影响。因此,该方 法对于快速区分不同酱油发酵阶段具有较好的性能,对产品的控制和品质的 评价都有很好的效果。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例,但本具体实施例仅仅是对本发 明的解释,其并不是对发明的限制,描述的具体特征、结构、材料或者特点 可以在任何一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合,本领域技术人员 在阅读完本说明书后可在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下,可以根据需 要对实施例做出没有创造性贡献的修改、替换和变型等,但只要在本发明的 权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (6)
1.一种基于HS-PTR-TOF-MS快速确定酱油发酵阶段及特征香气的方法,其特征在于:包括以下步骤:
S1:样品前处理的优化,为了检测到尽可能多的挥发性成分,通过优化顶空样品量,温度,时间,气体吹扫流速,盐离子含量等多种指标来增加顶空上层的挥发性气体浓度;
S2:确定方法的稳定和重现性,保证实验的准确度;
S3:利用HS-PTR-TOF-MS快速采集得到不同发酵阶段酱油样品的统计分析质谱数据,并构建不同酱油发酵阶段质谱数据库;
S4:利用PCA,PLS-DA,SVM,ANN,KNN,随机森林等多种数学模型模拟构建分类和预测模型,确定最佳构建模型及相关参数,同时并确定不同发酵阶段的差异质谱数据;
S5:靶向验证其差异的特征分子量成分,结合GC-MS或文献可确定其差异成分;根据不同发酵阶段相应的特征指标和差异成分来确定酱油发酵的阶段。
2.根据权利要求1所述的一种基于HS-PTR-TOF-MS快速确定酱油发酵阶段及特征香气的方法,其特征在于:在上述S1中,以测定物质的数量和响应值为指标来判断前处理的条件,样品量1g、2g、5g、7g、10g;
温度30℃、40℃、50℃、60℃、70℃;
气体吹扫流速0.1ml/min、0.2ml/min、0.4ml/min、0.6ml/min、0.8ml/min;
盐离子的含量;
检测时间的长短:观察30min内数据的稳定性。
3.根据权利要求1所述的一种基于HS-PTR-TOF-MS快速确定酱油发酵阶段及特征香气的方法,其特征在于:在上述S2中,确定方法的稳定和重现性(n=6),保证实验的准确度。
4.根据权利要求1所述的一种基于HS-PTR-TOF-MS快速确定酱油发酵阶段及特征香气的方法,其特征在于:在上述S3中,基于上述稳定的方法采集发酵过程中酱油的挥发性风味成分质谱数据,并建立酱油发酵过程中的挥发性风味成分数据库,并采用PCA,PLS-DA,SVM,ANN,KNN,随机森林等多种数学模型模拟构建分类和预测模型。
5.根据权利要求1所述的一种基于HS-PTR-TOF-MS快速确定酱油发酵阶段及特征香气的方法,其特征在于:在上述S5中,针对分析不同发酵过程中的差异代谢产物质谱分子量,进一步结合GC-MS分析判断其具体的成分,确定其发酵过程中的挥发性风味成分的含量和物质的变化。
6.根据权利要求1所述的一种基于HS-PTR-TOF-MS快速确定酱油发酵阶段及特征香气的方法,其特征在于:酱油样品通过以下步骤进行分析和制备:
S11,样品前处理:5g酱油样品,加入2g盐,在50℃温度下预热7min,测定3min;吹扫气体为氮气,流速为0.1L/min:漂移管电压640V,漂移管温度80℃,漂移管压力225pa,电场强度102Td,漂移管中气体流量45pa.m3/s,扫描m/z范围30-350,取测定条件下60个循环的稳定数据进行分析;
S12,在相同的工作条件下,HS-PTR-TOF-MS对不同发酵阶段酱油样品进行多次扫描,统计整理得到酱油挥发性成分PTR-TOF-MS质谱数据库;
S13,基于挥发性成分质谱数据库,首先采用PLS-DA和OPLS-DA无监督的判别方式确定不同发酵阶段酱油的挥发性成分差异代谢产物,建立不同发酵阶段的挥发性香气标准,后采用K-邻近算法等有监督的机器学习方式进行预测,通过调整相应的模型参数,能够得到最佳的预测结果;
S14,靶向验证其差异的特征分子量成分,结合GC-MS或文献可确定其差异成分;根据不同发酵阶段相应的特征指标和差异成分来确定酱油发酵的阶段。
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