CN114736810B - 高抗紫外辐射球孢白僵菌菌株及其定向诱变方法和用途 - Google Patents

高抗紫外辐射球孢白僵菌菌株及其定向诱变方法和用途 Download PDF

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Abstract

本申请涉及生物技术领域，具体涉及高抗紫外辐射球孢白僵菌菌株及其定向诱变方法和用途。本申请的高抗紫外辐射球孢白僵菌菌株，保藏编号：CGMCC No.22466，保藏日期：2021年07月05日。该菌株以球孢白僵菌野生株CGMCC No.13566为出发菌株，经模拟阳光UVB亚致死量辐射的多轮反复胁迫和定向筛选而得，具有高抗紫外辐射的性状，采用该菌株制得的真菌杀虫剂能较好地全天候应用于害虫绿色防控。

Description

高抗紫外辐射球孢白僵菌菌株及其定向诱变方法和用途
技术领域
本申请涉及生物技术领域，具体涉及高抗紫外辐射球孢白僵菌菌株及其定向诱变方法和用途。
背景技术
球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是广谱性昆虫病原真菌，主要进行无性繁殖，产生分生孢子。目前，将球孢白僵菌分生孢子制成剂型化的真菌杀虫剂，在世界范围被用于害虫生物防治，其中我国使用球孢白僵菌防治马尾松毛虫和玉米螟是国际上最大的害虫防治项目，取得良好的害虫持续控制效果。
但是，剂型化的球孢白僵菌在田间应用中常遭受阳光紫外辐射的损伤而影响害虫防治效果的稳定性和持效性，突出表现在害虫种群经常暴发和阳光辐射尤其强烈的夏季，故阳光紫外辐射限制了真菌杀虫剂对害虫绿色防控的全天候应用。其中，阳光紫外辐射包含UVB(290-320nm)和UVA(320-400nm)两种有害射线成分，所幸最短最有害的UVC射线(<290nm)在阳光抵达地球表面之前被大气臭氧层全部过滤去除。因此，太阳光中以UVB紫外辐射对剂型化真菌细胞的损伤最大，而较大波长UVA的影响则相当有限。
球孢白僵菌有1-2个光裂合酶。通常真核细胞修复紫外辐射所致DNA损伤的机制主要靠定位于细胞核的光裂合酶的光修复作用，利用该光裂合酶在可见光下快速修复辐射所致DNA损伤，可使大部分受损细胞恢复活力。因此，光裂合酶基因的表达水平在很大程度上决定了真菌细胞对DNA损伤的光修复能力。
目前，提高光裂合酶基因在真菌细胞中表达水平的途径有两条。一是利用外源抗性分子标记筛选高表达目标基因的途径，由此选育的抗紫外菌株不可避免地携带外源抗性基因，属于转基因菌株，因而存在生态安全性隐患。二是不用任何外源抗性分子标记的定向诱变和筛选途径，选育高抗紫外辐射菌株的途径，但目前选育的球孢白僵菌对紫外辐射的抗性有限，难以较好地全天候应用于害虫绿色防控。
发明内容
为了解决现有真菌杀虫剂抗紫外辐射性能差的问题，本申请选育出一株能高效表达光裂合基因的球孢白僵菌，该菌株具有较强的抗紫外辐射效果，采用该菌株制得的真菌杀虫剂能较好地全天候应用于害虫绿色防控。
第一方面，本申请提供一种高抗紫外辐射球孢白僵菌菌株，保藏编号：CGMCCNo.22466，保藏日期：2021年07月05日。
本申请的高抗紫外辐射球孢白僵菌菌株，其分生孢子对UVB辐射的抗性较出发菌株提高53％，其修复DNA损伤的关键光裂合酶基因的表达水平上调98倍，其余生物防治潜能相关性状与出发菌株完全一致，不含任何具潜在生态安全隐患的外源抗性分子标记，因而可作为高抗紫外辐射真菌杀虫剂的生产菌株，具有重要的应用价值。
优选的，所述高抗紫外辐射球孢白僵菌菌株经体壁穿透感染第六天的校正死亡率≥50％，经体壁穿透感染第七天的校正死亡率≥60％。
优选的，所述高抗紫外辐射球孢白僵菌菌株的虫体附着率为92.5-110.3％。
第二方面，本申请提供一种高抗紫外辐射球孢白僵菌菌株的定向诱变方法，所述高抗紫外辐射球孢白僵菌菌株以球孢白僵菌野生株CGMCC No.13566为出发菌株，经模拟阳光UVB亚致死量辐射的多轮反复胁迫和定向筛选而得。
优选的，所述定向诱变方法包括以下步骤：
①以球孢白僵菌野生株CGMCC No.13566为出发菌株，配制其分生孢子的孢子悬液；
②将孢子悬液均匀涂布于培养基平板上，在阳光模拟辐射箱中以UVB的亚致死剂量对平板进行辐射；
③培养经辐射的存活孢子至长出菌落，挑选生长势旺盛的菌落转移至产孢培养平板上，培养直至充分产孢，所获分生孢子用于UVB抗性测定，筛选出在前一轮最佳菌落基础上UVB抗性进一步显著增强的菌落，并同时测定生长产孢和毒力性状有无显著变化；
④反复重复①、②和③的诱变与筛选步骤，直到前一轮最优目标菌落的UVB抗性在后一轮重复诱变中不再显著增强为止，选择最后一轮诱变筛选中UVB抗性表现理想的菌株即为高抗紫外辐射球孢白僵菌菌株。
本申请以球孢白僵菌野生株为出发菌株，材料获取来源广泛，其采用模拟阳光UVB亚致死剂量辐射的多轮反复胁迫和定向筛选，相对于基因操作或编辑手段操作更为简便，由此筛选的菌株是无任何外源基因的分子定向改良菌株，应视为非转基因菌株，其制剂产品无需通过额外苛刻繁琐且昂贵的环境安全性评价。
优选的，步骤①中分生孢子使用含0.01-0.06％吐温-80的无菌水分散为孢子悬液。
通过采用上述技术方案，吐温-80为亲水性表面活性剂，具有较强的破坏细胞膜的作用而引起应激性，在本申请中使用低剂量的吐温-80能增加分生孢子膜的通透性，促使孢子发生定向诱变，在一定程度上可加快球孢白僵菌的选育效率。
优选的，步骤②中培养基为萨氏培养基。
通过采用上述技术方案，萨氏培养基的配方主要为酵母浸出粉、葡糖糖、蛋白胨和琼脂，是常规用于真菌分离培养的培养基，本申请使用萨氏培养基足以为球孢白僵菌的生长提供基础的营养成分，这是基于本申请需要筛选环境耐受性强的菌株而做出的优选，其无需额外配制专属培养基，能在一定程度上降低菌株的选育成本，同时有效筛选出性能优异的突变株。
优选的，步骤②中UVB的亚致死剂量为0.35-0.40J/cm2。
通过采用上述技术方案，上述亚致死剂量能导致95％左右的分生孢子死亡，少数存活下来的分生孢子则具有较强的抗紫外辐射性能，有效提高球孢白僵菌选育效率。
优选的，步骤③中经辐射后的培养基置于温度为22-28℃、光周期为(10-14):(10-14)的条件下进行培养。
辐射温度和光周期是影响菌株变异的关键因素，采用上述温度和光周期培养的诱变菌株有助于筛选出本申请所述的高抗紫外辐射球孢白僵菌菌株适应田间应用环境。
优选的，本申请在上述定向诱变方法的基础上，收获步骤④中挑选的菌落的分生孢子，将所获分生孢子浸泡于海藻糖-乙醇水溶液中，将孢子悬液均匀涂布于培养基平板上，在阳光模拟辐射箱中以UVB的亚致死剂量对平板进行辐射，培养经辐射的存活孢子长出菌落，挑选生长势旺盛的菌落转移至产孢培养平板上，培养直至充分产孢，所获分生孢子用于UVB抗性测定，筛选出在前一轮最佳菌落基础上UVB抗性进一步显著增强的菌落，并同时测定生长产孢和毒力性状有无显著变化，选择最后一轮诱变筛选中UVB抗性表现理想的菌株即为高抗紫外辐射球孢白僵菌菌株。
通过采用上述技术方案，本申请将步骤④挑选的菌株对应产出的孢子用海藻糖-乙醇水溶液浸泡，其中的海藻糖虽然用于胞外，但其不但能有效提高经浸泡后的孢子的抗紫外辐射性能，促使该孢子在UVB的亚致死量下快速萌发并稳定生长，还能促使生长的菌株具有更高的修复DNA损伤的关键光裂合酶基因的表达水平，这可能是由于海藻糖附着在菌株胞外起到良好的防护作用，使光裂合酶基因在胞内稳定表达，而其中的乙醇能在一定程度上增加孢子的细胞壁和细胞膜的通透性，使培养基中的营养物质能快速进入胞内为光裂合酶基因表达提供充足的养分。
第三方面，本申请提供一种高抗紫外辐射球孢白僵菌菌株在制备真菌杀虫剂中的应用，其制得的真菌杀虫剂克服了现有真菌杀虫剂田间稳定性不足这一共性关键技术瓶颈，具有良好的田间稳定性、持效性和害虫防治效果。
附图说明
图1是本申请抗紫外辐射诱变菌株的菌落形态及显微特征。
图2是本申请球孢白僵菌出发野生菌株与抗紫外辐射诱变菌株的UVB抗性比较示图；其中，(A)为分生孢子随UVB辐射剂量变化的存活趋势，(B)为基于辐射剂量-孢子存活指数拟合曲线计算孢子失活50％所需的UVB辐射剂量LD50，(C)为光裂合酶基因phr2在诱变株中相对于野生株的表达水平；误差线：三次重复实验平均值的标准差(SD)。
图3是球孢白僵出发野生菌株与抗紫外辐射诱变菌株的毒力与产孢性状比较示图；其中，(A)为大蜡螟五龄幼虫在孢子悬液(107个孢子/mL)经体壁穿透侵染(NCI)和单头血腔注射侵染(CBI)500个孢子之后的校正死亡率趋势及死亡50％所需时间LT50。(B)为启动NCI所需分生孢子在蝗虫后翅体壁上的附着率比较。(C)为CDB-BSA培养物中生物量与NCI成功穿透昆虫体壁所需的胞外酶(ECEs)和Pr1家族蛋白酶等体壁降解酶在培养物上清液中的总酶活比较。(D)在萨氏培养基(SDAY)平板上用孢子悬液涂板接种后正常培养期间的分生孢子产量比较。(D)为大蜡螟幼虫病死新鲜虫尸与死后10天体表长出物比较，显示诱变株与野生株在虫尸上的生长产孢水平完全一致；误差线：三次重复实验平均值的标准差(SD)，注意诱变株与野生株的所有考查性状均无显著差异。
具体实施方式
以下结合附图、实施例和对比例对本申请作进一步详细说明。
原料来源
本申请的原料均购自市售产品，具体参见下表一。
表一本申请的原料来源
Figure GDA0003889497290000041
实施例1
一种高抗紫外辐射球孢白僵菌菌株的定向诱变方法，包括以下步骤：
①以球孢白僵菌野生菌株CGMCC No.13566(简称野生菌株)为出发菌株，将其在萨氏培养基(SDAY)平板上正常培养所产的分生孢子悬浮于含0.02％吐温-80(允许在0.01-0.06％的范围内波动)的无菌水中，配制成107个孢子/mL的悬液；
②在无菌条件下，用上述孢子悬液60μL等量均匀涂布SDAY平板。空气干燥数分钟后(使涂布的孢子悬液干燥)，将平板置于阳光紫外辐射模拟箱Bio-Sun++UV Chamber(Vilber Lourmat,Marne-la-Vallée,France)的样品台(12cm×16cm)上，按亚致死剂量0.38J/cm2(允许在0.35-0.4J/cm2范围内波动)进行UVB辐射，导致95％左右的孢子死亡；
③涂有孢子的平板经辐射后即刻加盖，在温度为25℃、光周期为12:12(允许在22-28℃、(10-14):(10-14)的范围内波动)的条件下培养，直到少数存活孢子长出菌落，挑选生长势旺盛的菌落转移至新的SDAY平板培养直到充分产孢，所获孢子用于UVB抗性测定，筛选出在上一轮最佳菌落基础上UVB抗性进一步显著增强的菌落，并同时测定生长产孢和毒力性状有无显著变化；
④反得重复①、②和③的诱变与筛选步骤，直到前一轮最优目标菌落的UVB抗性在后一轮重复诱变中不再显著增强为止，选择最后一轮诱变筛选中UVB抗性表现理想的诱变株即为高抗紫外辐射球孢白僵菌菌株。
诱变株的生物学鉴定(菌落形态及显微特征、基因序列测定)
本申请将上述诱变筛选的高抗紫外辐射球孢白僵菌菌株送入中国科学院微生物研究所进行生物鉴定及保藏，送检时间为2021年7月5日，菌株编号为TICZJU618(中国微生物菌种保藏中心保藏号CGMCC No.22466)，鉴定结果为球孢白僵菌(Beauveria bassiana)。
菌落形态及显微特征(参见图1)如下：
送检菌种在马铃薯葡糖糖培养基上生长较快，25℃黑暗条件下7天，菌落直径30-35mm，质地紧密，絮状，白色，略隆起；菌落背面浅褐色，无可溶性色素。
分生孢子梗特化不明显，产孢细胞烧瓶状，直或弯曲，6.1–35.8×1.5–2.5μm，颈部细长，顶端“之”字形延伸，宽度不足1μm，单生或聚集成簇；分生孢子宽椭圆形、近球形，无色，壁光滑，1.5-3.0μm，未见有性态产孢结构。
rRNA基因序列测定结果如下：
包括18SrRNA片段，ITS1、5.8SrRNA、ITS2的全序列及28S区序列片段，序列如SEQID NO.1所示。
定向诱变方法的重复再现性
选择三个实验员按实施例1的定向诱变方法分别进行试验，分别进行上述生物学鉴定，可以得到三个试验员所获诱变株的发菌落形态、显微特征和保守基因序列均相同，可见本申请的定向诱变方法具有重复再现性，能够稳定诱导选育出本申请的诱变株。
诱变株与野生株的性能对比试验
选择在最后一轮诱变筛选中UVB抗性表现理想的诱变株与野生株进行如下比对实验。
1、UVB抗性测定
测定方法为：将分生孢子悬液(107个孢子/mL)60μL等量涂布于SDAY平板(直径9cm)上，置于上述阳光紫外辐射模拟箱样品台上进行梯度剂量(0.1～0.5J/cm2)的UVB辐射，经辐射的平板加盖后置于25℃和光周期12:12的条件下培养24小时，以不辐射的平板作为对照。培养期间，从第4小时开始每隔2小时显微镜检3个视野的总孢子数和萌发孢子数，计算孢子存活指数(百分率除以100)，然后对梯度剂量下的存活指数进行模型拟合分析，获得UVB的致死中剂量LD50。各剂量实验设三个独立重复。
检测结果参见图2A和图2B。
2、关键光裂合酶基因的表达水平测定
测定方法为：将野生株与诱变株的分生孢子悬液100μL等量涂布于贴有玻璃纸的SDAY平板上，在25℃和光周期12:12的条件下培养3天后收获培养物，液氮研磨后用RNAisoPlus Kit试剂盒(中国大连TaKaRa公司)提取各菌株的总RNA，再用PrimeScript RTreagentKit试剂盒(TaKaRa)将RNA反转录为cDNA。以所获cDNA为模板，在SYBRPremixEx Taq酶(TaKaRa)作用下进行实时定量PCR分析，测定光裂合酶基因phr2在各菌株cDNA中的转录水平，以β-actin基因作为内参。目标基因在诱变株中相对于野生株中的表达水平采用2-△△CT方法进行试算。各菌株重复测定3个cDNA独立样本。
检测结果参见图2C。
3、经体壁和血腔注射侵染的毒力测定
测定方法为：以模式昆虫大蜡螟五龄幼虫作为试虫，每35头一组没入40mL孢子悬液(107个/mL)中浸渍10秒钟，作为正常体壁侵染接种方式。对各组幼虫的每一头用微注射器注入5μL孢子悬液(105个/mL)至血腔中，作为血腔注射侵染接种方式。然后，将每组试虫转入透明塑料盒中，置于25℃和光周期12:12的条件下，每天观察记录死亡和存活虫数，直到全部死亡为止。以0.02％吐温-80液的等量浸渍或注射处理作为对照，逐日计算校正死亡率。各处理重复3次。所获时间-死亡率曲线经模型拟合分析，计算各菌株不同接种方式下试虫死亡50％所需的时间LT50值。
检测结果参见图3A。
4、决定正常体壁侵染成功率的分生孢子附着昆虫体表能力的测定测定方法为：取东亚飞蝗(Locusta migratoria manilensis)后翅，在37％H2O2水溶液中浸渍消毒5分钟，无菌水清洗三次后贴在0.7％水琼脂平板上。孢子悬液(107个/mL)5μL等量滴在后翅表面中央，用移菌环涂抹均匀后。在25℃下培养8小时，即刻取下后翅置于载玻片上，在显微镜下观察3个视野，计数各视野中的分生孢子数。观察的后翅随后在无菌水中漂洗30秒钟去除未粘附在后翅体壁上的孢子，再次在显微镜下观察翅面的3个视野并计数存留的孢子数。计算漂洗后孢子数与漂洗前翅面上的孢子数百分比，即得分生孢子在蝗虫后翅体壁上的附着率。
检测结果参见图3B。
5、主要昆虫体壁降解酶的总酶活测定
测定方法为：将各菌株分生孢子悬液接种于以0.3％牛血清蛋白(BSA)作为唯一氮源的基础培养液CDB(3％蔗糖、0.3％NaNO3、0.1％K2HPO4、0.05％KCl、0.05％MgSO4及0.001％FeSO4)中，终浓度为104个分生孢子/mL。在25℃下振荡(150r/min)培养3天后过滤收集菌丝，75℃烘干后测定生物量；培养液的上清在4℃下13,500×g离心2min，收集上清液作为粗提物，用于测定分泌的胞外酶(蛋白酶、几丁质酶、脂酶等总称，缩写为ECEs)和Pr1家族蛋白酶的总酶活。胞外酶总酶活的测定，取100μL浓度为5mg/mL的偶氮蛋白(溶于50mMTris-HCl,pH 8.0)溶液，与100μL经沸水浴15min变性的蛋白粗提液(对照组)或不变性的蛋白粗提液(实验组)充分混匀，37℃下避光孵育1小时后，加入400μL 10％(w/v)三氯乙酸终止反应。12,000×g离心5min后，吸取上清液转移至新离心管中，与700μL 525mM NaOH充分混匀，在442nm波长下读取吸光值(OD442)。Pr1蛋白酶总酶活的测定，取100μL沸水浴灭活(对照)或不灭活蛋白粗提液与50μL浓度为1mM的反应底物[succinyl-(alanine)2-proline-phenylalanine-p-nitroanilide]和850μL Tris-HCl缓冲液(15mM，pH 8.5)充分混匀，28℃下静置1小时；加入250μL 30％(w/v)乙酸终止反应。将反应体系冰浴15分钟，4℃下13,000×g离心5分钟，取上清液在410nm波长下读取吸光值(OD410)。酶活单位定义为反应期间OD442或OD410读数变化0.01的增量，总酶活表示每毫升培养液上清所含的胞外酶活单位数(U/mL)。
检测结果参见图3C。
6、正常生长产孢水平的测定
测定方法为：参照SB/T 10315-1999的孢子数测定法进行测定。
检测结果参见图3D。
7、虫尸体表生长产孢水平的观察
测定方法为：目测。
检测结果参见图3E。
综上，本申请经反复UVB亚致死剂量辐射诱变获得的球孢白僵菌诱变株，其分生孢子对UVB辐射的抗性较出发菌株提高53％(图2B)，其修复DNA损伤的光裂合酶基因phr2的表达水平大幅上调98倍(图2C)，其细胞中无任何源外抗性分子标记，因而无生态安全隐患。
由于野外杀菌对虫体一一进行血腔注射耗时耗力，因此通常采用体壁穿透感染方式进行，况且野外环境具有不可控性，因此球孢白僵菌的体壁穿透感染效率越快、对虫体的附着率越高，则能使球孢白僵菌更好地发挥杀虫效果。参见图3A和3B，本实施例的球孢白僵菌诱变株通过体壁穿透感染的死亡率在3-7天高于野生株，其中经体壁穿透感染第六天的校正死亡率为52.0％(野生株为46.2％)，经体壁穿透感染第七天的校正死亡率为61.3％(野生株为57.0％)，可见诱变株经体壁穿透感染的效率更快。对虫体附着率方面，诱变株对虫体附着率为101.2％(加标准差后落在94.7-109.8％区间内)，而野生株对虫体的附着率为99.0％(加标准差后落在90.3-110.0％区间内)，即诱变株的分生孢子在蝗翅上的附着率以及附着稳定性高于野生株。
除此之外，本实施例收获的球孢白僵菌诱变株的生长、产孢和毒力性状与出野生株一致(图3C-E)。
因此，本实施例的球孢白僵菌诱变株可作为抗阳光紫外辐射真菌杀虫剂的生产菌株，增强真菌杀虫剂对紫外辐射的抵抗力和对田间害虫防治效果的稳定性，此外还具有优异的经体壁穿透感染效率以及对虫体附着率，因而具有重要的应用价值。
实施例2
本实施例在实施例1的方法基础上，将光周期12:12调整为10:14，定向筛选出对应的诱变株。
实施例3-4
实施例3-4在实施例1的方法基础上，将亚致死剂量0.38J/cm2进行调整，实施例3具体为0.3J/cm2，实施例4具体为0.45J/cm2，定向筛选出对应的诱变株。
按照上述实施例1的性能对比试验步骤，测定实施例2-4对应筛选的诱变株与野生株的性能，检测结果显示实施例2-4筛选的诱变株与实施例1筛选的诱变株菌落形态及显微特征相近，其分生孢子对UVB辐射的抗性较出发菌株依次提高为45％、46％和49％，其修复DNA损伤的光裂合酶基因phr2的表达水平依次上调56倍、67倍和77倍，经体壁穿透感染第六天的校正死亡率依次为50.2％、50.5％和51.0％，经体壁穿透感染第七天的校正死亡率依次为60.0％、60.2％和60.6％，对虫体附着率依次为99.1％(加标准差后均落在92.5-110.3％区间内)、100.5％(加标准差后均落在93.7-110.1％区间内)和100.7％(加标准差后均落在94.1-110.0％区间内)。由此可见，实施例1获得的诱变株具有更为优异的抗紫外辐射效果、经体壁穿透感染效率以及对虫体附着率，因此本申请将实施例1的定向诱变方法作为进一步的优选。
实施例5
本实施例在实施例1的定向诱变方法的基础上，还设有步骤⑤，具体包括如下步骤：
收获步骤④中挑选的菌落的分生孢子，将所获分生孢子浸泡于海藻糖-乙醇水溶液中10-15min，海藻糖的浓度为0.3-0.6g/L，乙醇水溶液中乙醇的体积浓度为5-10％，上述范围内对孢子处理效果相近，超过上述范围其收获的诱变株长势欠佳，本实施例中具体采用0.5g/L海藻糖-8％乙醇水溶液浸泡10min，制得孢子悬液；
用上述孢子悬液60μL等量均匀涂布SDAY平板，空气干燥数分钟后(使涂布的孢子悬液干燥)，将平板置于阳光紫外辐射模拟箱Bio-Sun++UV Chamber(Vilber Lourmat,Marne-la-Vallée,France)的样品台(12cm×16cm)上，按亚致死剂量0.38J/cm2(允许在0.35-0.4J/cm2范围内波动)进行UVB辐射；
将涂有孢子的平板经辐射后即刻加盖，在温度为25℃、光周期为12:12(允许在22-28℃、(10-14):(10-14)的范围内波动)的条件下培养，直到存活孢子长出菌落，挑选生长势旺盛的菌落转移至新的SDAY平板培养直到充分产孢，所获孢子用于UVB抗性测定，筛选出在上一轮最佳菌落基础上UVB抗性进一步显著增强的菌落，并同时测定生长产孢和毒力性状有无显著变化；
选择最后一轮诱变筛选中UVB抗性表现理想的诱变株即为高抗紫外辐射球孢白僵菌菌株。
按照上述实施例1的性能对比试验步骤，测定实施例5对应筛选的诱变株与野生株的性能，检测结果显示实施例5筛选的诱变株与实施例1筛选的诱变株菌落形态及显微特征相近，其分生孢子对UVB辐射的抗性较出发菌株提高为61％(实施例1为53％)，其修复DNA损伤的光裂合酶基因phr2的表达水平上调112倍(实施例1为98倍)；经体壁穿透感染第六天的校正死亡率为54.3％(实施例1为52.0％)，经体壁穿透感染第七天的校正死亡率为62.5％(实施例1为61.3％)，对虫体附着率为101.0％(加标准差后均落在96.0-107.2％区间内)(实施例1为101.2％(加标准差后落在94.7-109.8％区间内))。
由此可见，经实施例1的定向诱变方法筛选出的诱变株，再用海藻糖-乙醇水溶液浸泡处理后再培养产出的孢子，能够获得抗紫外辐射效果、经体壁穿透感染效率以及对虫体附着率更为优异的诱变株，因此本申请将实施例5的定向诱变方法作为进一步的优选。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
序列表
<110> 浙江泰达作物科技有限公司
<120> 高抗紫外辐射球孢白僵菌菌株及其定向诱变方法和用途
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 500
<212> DNA
<213> 球孢白僵菌(Beauveria bassiana)
<400> 1
acctacctat cgttgcttcg gcggactcgc cccagcccgg acgcggactg gaccagcggc 60
ccgccgggga cctcaaactc ttgtattcca gcatcttctg aatacgccgc aaggcaaaac 120
aaatgaatca aaactttcaa caacggatct cttggctctg gcatcgatga agaacgcagc 180
gaaacgcgat aagtaatgtg aattgcagaa tccagtgaat catcgaatct ttgaacgcac 240
attgcgcccg ccagcattct ggcgggcatg cctgttcgag cgtcatttca accctcgacc 300
tccccttggg gaggtcggcg ttggggaccg gcagcacacc gccggccctg aaatggagtg 360
gcggcccgtc cgcggcgacc tctgcgcagt aatacagctc gcaccggaac cccgacgcgg 420
ccacgccgta aaacacccaa cttctgaacg ttgacctcga atcaggtagg actacccgct 480
gaacttaagc atatcaataa 500

Claims (4)

1.一种高抗紫外辐射球孢白僵菌菌株，其特征在于，保藏编号：CGMCC No.22466，保藏日期：2021年07月05日。
2.根据权利要求1所述的高抗紫外辐射球孢白僵菌菌株，其特征在于，所述高抗紫外辐射球孢白僵菌菌株经体壁穿透感染第六天的校正死亡率≥50％，经体壁穿透感染第七天的校正死亡率≥60％。
3.根据权利要求1所述的高抗紫外辐射球孢白僵菌菌株，其特征在于，所述高抗紫外辐射球孢白僵菌菌株的虫体附着率为92.5-110.3％。
4.权利要求1-3任一项所述的高抗紫外辐射球孢白僵菌菌株在制备真菌杀虫剂中的应用。
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