CN114732804A - 一种含大麻二酚cbd提取物在新型冠状病毒肺炎的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种含大麻二酚CBD提取物在新型冠状病毒肺炎的应用，包括以下步骤：步骤一、高纯度CBD抑制SARS‑CoV‑2在人肺上皮细胞中的复制：在感染SARS‑CoV‑2之前，用0‑10％的浓度CBD预处理表达外源性人ACE2受体(A549‑ACE2)的A549人肺癌细胞2小时，48小时后，监测细胞中病毒刺突蛋白(S)和病毒滴度的表达，步骤二、CBD在病毒进入细胞后的早期发挥作用：将未经处理或用指定剂量的载体或CBD处理，用抗ACE2和微管蛋白的抗体探测印迹，将ACE2蛋白表达水平标准化为每个样品中的微管蛋白信号，将293个T‑ACE2细胞被棘突病毒或VSV‑G假病毒感染72小时。本发明中大麻二酚通过诱导宿主内质网应激和先天免疫反应来抑制SARS‑CoV‑2复制，从而达到对新冠病毒肺炎症状的预防及治疗。

Description

一种含大麻二酚CBD提取物在新型冠状病毒肺炎的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种含大麻二酚CBD提取物在新型冠状病毒肺炎的应用。
背景技术
新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)，简称“新冠肺炎”，世界卫生组织命名为“2019冠状病毒病”，是指2019新型冠状病毒感染导致的肺炎，自2019年12月起新型冠状病毒肺炎以极快的速度席卷全球。SARS-CoV-2的传播和持续进行的2019冠状病毒病大流行强调了对新治疗方法的必要性。
严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)是2019年冠状病毒病(COVID-19)的罪魁祸首，这种流行病继续在全球范围内造成广泛的发病率和死亡率，SARS-CoV-2是已知会感染人类的第七种冠状病毒，这些冠状病毒，包括SARS-CoV、229E、NL63、OC43、HKU1和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)，会引起从普通感冒到更严重疾病的一系列症状，尽管最近有疫苗可用，但SARS-CoV-2仍在迅速传播，这凸显了对替代疗法的需求，特别是对于倾向或获得疫苗的人群有限，迄今为止，几乎没有发现能够阻止SARS-CoV-2复制和病毒产生的疗法。
SARS-CoV-2是一种正链单链RNA包膜病毒，由脂质双层和四种驱动病毒颗粒形成的结构蛋白组成，刺突(S)、膜(M)和包膜(E)是病毒膜的整合蛋白，可促进病毒体出芽，同时还将核衣壳(N)蛋白和病毒基因组RNA募集到新生病毒体中，与其近亲SARS-CoV一样，SARS-CoV-2主要通过病毒S蛋白与血管紧张素转换酶2(ACE2)受体的结合进入人体细胞，然后S蛋白被跨膜蛋白酶丝氨酸2(TMPRSS2)或其他蛋白酶水解成两个非共价结合的肽(S1和S2)，促进病毒进入宿主细胞，N端S1与ACE2受体结合，C端S2在蛋白水解切割后介导病毒-细胞膜融合，根据细胞类型，病毒进入也可能发生在ACE2结合后，与蛋白水解切割无关，进入细胞后，SARS-CoV-2基因组被翻译成两个大多肽，被两种病毒蛋白酶Mpro和PLpro切割，除了合成编码另外10种辅助蛋白和4种结构蛋白的亚基因组RNA之外，还产生 15种蛋白质，这些蛋白质使病毒能够复制、组装和出芽。为了抑制 SARS-CoV-2冠状病毒以及其他进化中的致病病毒的感染，我们测试了一些针对宿主应激反应途径的小分子的抗病毒潜力。
发明内容
1.要解决的技术问题
本发明的目的是为了解决现有技术中SARS-CoV-2传播迅速，对替代疗法的需求强烈，特别是对于倾向或获得疫苗的人群有限，迄今为止，几乎没有发现能够阻止SARS-CoV-2复制和病毒产生的疗法的问题，而提出的一种含大麻二酚CBD提取物在新型冠状病毒肺炎的应用。
2.技术方案
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种含大麻二酚CBD提取物在新型冠状病毒肺炎的应用，包括以下步骤：
步骤一、高纯度CBD抑制SARS-CoV-2在人肺上皮细胞中的复制：在感染SARS-CoV-2之前，用0-10％的浓度CBD预处理表达外源性人 ACE2受体(A549-ACE2)的A549人肺癌细胞2小时，48小时后，监测细胞中病毒刺突蛋白(S)和病毒滴度的表达；
步骤二、CBD在病毒进入细胞后的早期发挥作用：将未经处理或用指定剂量的载体或CBD处理，用抗ACE2和微管蛋白的抗体探测印迹，将ACE2蛋白表达水平标准化为每个样品中的微管蛋白信号，将 293个T-ACE2细胞被棘突病毒或VSV-G假病毒感染72小时，并用指定剂量的CBD处理，并绘制被感染细胞的百分比，同时，A549-ACE2 细胞用SARS-CoV-2以0.5的MOI感染2小时，然后在感染后2、6或 15小时添加DMSO或10μM CBD，16小时后，对尖峰阳性细胞进行量化并标准化为仅受病毒感染的样本；
步骤三、CBD抑制病毒RNA表达并逆转病毒诱导的宿主基因表达变化：用CBD处理24小时的受感染A549-ACE2细胞的RNA测序 (RNA-seq)后通过Metascape的聚类分析，用非活性CBDV同系物处理 24小时的未感染或SARS-CoV-2感染细胞裂解物的RNA-seq，使用Metascape的聚类分析显示CBDV逆转病毒转录组变化的聚类；
步骤四、CBD诱导ER应激反应和IRE1α活性是其抗病毒作用的关键机制：A549-ACE2细胞用SARS-CoV-2感染SARS-CoV-2，MOI为3，有或没有CBD或CBDV处理，基于对每个通路和每次比较的激活z分数的独创性分析的预测通路激活热图，通过IRE1αRNase对XBP1剪接的分析，绘制RNA-seq样本的可变剪接读数的百分比，将 A549-ACE2细胞用指定浓度的CBD处理3和6小时，通过qRT-PCR确定CBD浓度和XBP1剪接之间的关系；
步骤五、CBD诱导干扰素表达作为其抗病毒活性的一部分： A549-ACE2细胞在感染前2小时用2.5μM载体或CBD处理，加或不加人IFN-γ抗体和人I型IFN中和抗体混合物，然后用0.5MOI SARS-CoV-2感染细胞并孵育24小时，并使用噬斑测定法测量活性病毒；
步骤六、CBD治疗显着抑制SARS-CoV-2在小鼠中的复制：在用 SARS-CoV-2[2×104斑块形成单位(PFU)]进行鼻内攻击之前，每天两次向小鼠腹膜内注射CBD(20或80mg/kg)，持续7天，攻击后，每天两次继续施用CBD，再持续4天，CBD治疗在感染后第5天以剂量依赖性方式显着抑制肺和鼻甲中的病毒复制；
步骤七、CBD与患者病历中的SARS-CoV-2感染迹象呈负相关：检查CBD处方或使用的用药记录是否与SARS-CoV-2感染的迹象(即 COVID-19检测呈阳性和/或COVID-19种接近COVID-19测试的诊断)，分析来自国家COVID队列协作(N3C)的1212名患者的分析有癫痫相关疾病史和CBD100药物记录。
优选地，所述步骤一中选择用来自四个不同供应商的指定剂量的 CBD处理A549-ACE2细胞，然后以0.5的MOI感染SARS-CoV-248小时，用来自四个不同供应商的CBD参考材料和CBD样品的1HqNMR光谱。
优选地，所述步骤二中SARS-CoV-2以0.5的MOI感染A549-ACE2 细胞2小时，然后在用尖峰中和抗体(nAb)感染后2小时添加DMSO或 10μMCBD以防止再次感染，16小时后，对尖峰阳性细胞进行量化并标准化为仅受病毒感染的样本，SARS-CoV-2病毒(400PFU)在有或没有100nM中和抗体的情况下孵育1小时，用该混合物处理A549-ACE2 细胞16小时，并对尖峰阳性细胞进行定量。
优选地，所述步骤三中RNA-seq数据的PCA，显示对照 (veh_mock)、SARS-CoV-2感染(veh_infect)、CBD处理(CBD_mock) 和SARS-CoV-2感染加CBD处理(CBD_infect)样本，绘制了每个样本的第一和第二主成分。
优选地，所述步骤四中用指定剂量的CBD处理缺乏IRE1α(IRE1 KO)的A549-ACE2或A549-ACE2细胞，然后以0.5的MOI感染 SARS-CoV-248小时，对细胞进行刺突蛋白染色，并绘制每种条件下表达刺突蛋白的细胞百分比。
优选地，所述步骤五中在2.5μM载体或CBD处理之前将 ACE2-A549细胞暴露于针对I型(α、β和ο)和II型(γ)干扰素的抗体混合物CBD治疗和病毒感染。
优选地，所述步骤六中病毒攻击后5天(第12天)测量所有动物肺中的病毒滴度，TCID 50，中值组织培养感染剂量，病毒攻击后5天(第12天)测量所有动物鼻甲中的病毒滴度，研究期间每个治疗组(n＝10)小鼠的体重测量，将每只小鼠的体重标准化为其在第0天测量的体重，在第7天通过鼻内滴注对所有动物进行SARS-CoV-2攻击。
优选地，所述步骤七中第一次COVID-19测试之日拥有CBD100药物记录与规模不断增加的匹配对照组(即1比1、2比1、和3比1 的对照组与CBD患者的比例)，不匹配的协变量具有大于0.10的标准化均值差和双边Fisher精确检验P在比较CBD患者与其匹配对照。
3.有益效果
相比于现有技术，本发明的优点在于：
(1)本发明中，证实了大麻二酚通过诱导宿主内质网应激和先天免疫反应抑制SARS-CoV-2复制，宿主应激和抗病毒炎症反应的一个潜在调节剂是大麻二酚(CBD)，它是大麻素类天然产物的成员，尽管对含CBD的产品进行了大量研究和许多未经证实的声明，但CBD本身的生物作用尚不清楚，具体目标大多未知，然而，CBD的口服溶液是美国食品和药物管理局(FDA)批准的药物，主要用于治疗癫痫，因此，CBD具有药物地位，可作为治疗剂使用，虽然有限，但一些研究报告说，某些大麻素对丙型肝炎病毒和其他病毒具有抗病毒作用。
(2)本发明确定提取的天然产物CBD是否具有抑制SARS-CoV-2 感染细胞的潜力，为此，我们使用了三种不同的人类或猴子细胞系，我们从化学和天然来源测试了四种独立的CBD制剂，还测试了相关的大麻素化合物和代谢物，我们使用RNA-seq分析证明CBD与无活性的大麻素CBDV相比，有效地从感染细胞中消除SARS-CoV-2病毒RNA，激活ER应激反应和XBP1剪接，诱导干扰素途径的表达，并抑制细胞因子的病毒诱导，使用IRE1α敲除细胞和抗干扰素阻断抗体证明IRE1和干扰素都有助于CBD的抗病毒活性，最后的，根据适当的机构审查委员会(IRB)协议，使用来自N3C的人类患者群体的医疗记录，我们分析了服用CBD的患者与他们的SARS-CoV-2检测呈阳性风险之间的关系，本发明中大麻二酚通过诱导宿主内质网应激和先天免疫反应来抑制SARS-CoV-2复制，从而达到对新冠病毒肺炎症状的预防及治疗。
附图说明
图1为本发明提出的一种含大麻二酚CBD提取物在新型冠状病毒肺炎的应用不同剂量CBD体外SARS-CoV-2感染有效抑制剂反应示意图；
图2为本发明提出的一种含大麻二酚CBD提取物在新型冠状病毒肺炎的应用ER伴侣诱导和ER相关降解成分表；
图3为本发明提出的一种含大麻二酚CBD提取物在新型冠状病毒肺炎的应用CBD在SARS-CoV-2进入宿主细胞后抑制病毒复制示意图；
图4为本发明提出的一种含大麻二酚CBD提取物在新型冠状病毒肺炎的应用SARS-CoV-2感染或CBD治疗后病毒和宿主细胞转录的变化示意图；
图5为本发明提出的一种含大麻二酚CBD提取物在新型冠状病毒肺炎的应用SARS-CoV-2感染或CBDV治疗后病毒和宿主细胞转录的变化示意图；
图6为本发明提出的一种含大麻二酚CBD提取物在新型冠状病毒肺炎的应用CBD促进宿主细胞ER应激反应示意图；
图7为本发明提出的一种含大麻二酚CBD提取物在新型冠状病毒肺炎的应用CBD促进宿主细胞干扰素反应并抑制细胞因子的病毒诱导示意图；
图8为本发明提出的一种含大麻二酚CBD提取物在新型冠状病毒肺炎的应用CBD抑制SARS-CoV-2在小鼠体内的复制实验结构示意图；
图9为本发明提出的一种含大麻二酚CBD提取物在新型冠状病毒肺炎的应用患者的CBD100药物记录图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
实施例1：
参照图1-9，一种含大麻二酚CBD提取物在新型冠状病毒肺炎的应用，包括以下步骤：
步骤一、高纯度CBD抑制SARS-CoV-2在人肺上皮细胞中的复制：：测试CBD对SARS-CoV-2复制的影响，我们在感染SARS-CoV-2之前，用0-10％的浓度CBD预处理表达外源性人ACE2受体(A549-ACE2)的 A549人肺癌细胞2小时，48小时后，我们监测细胞中病毒刺突蛋白(S)和病毒滴度的表达，CBD在无毒条件下有效抑制病毒复制，中位有效浓度(EC50)约为1μM(图1A)，CBD也抑制了SARS-CoV-2 在人Calu3肺和Vero E6猴肾上皮细胞中的复制，并且在有效剂量下未观察到毒性(图1C)，最后，除了原始的SARS-CoV-2毒株外，我们还测试了三种关注的SARS-CoV-2变体(α、β和γ)，它们感染细胞的能力被CBD抑制(图1C)。
(A)用来自四个不同供应商的指定剂量的CBD处理A549-ACE2细胞，然后以0.5的MOI感染SARS-CoV-248小时，对细胞进行刺突蛋白染色，并绘制每种条件下表达刺突蛋白的细胞百分比，指示了EC5 值；
(B)来自四个不同供应商的CBD参考材料和CBD样品的1HqNMR光谱；
(C)用供应商A的CBD处理A549-ACE2细胞，然后以0.5的MOI 感染SARS-CoV-2或α、β或γ变体48小时，对细胞进行刺突蛋白染色，并绘制每种条件下表达刺突蛋白的细胞百分比，欧共体50值表示。
步骤二、CBD在病毒进入细胞后的早期发挥作用：CBD可以通过阻止病毒进入宿主细胞或在感染后的后续步骤中起作用，由于据报道 CBD会降低包括A549在内的一些上皮细胞中的ACE2表达，我们首先确定CBD是否抑制A549-ACE2、Calu-3和Vero E6细胞中的SARS-CoV-2 受体，没有观察到ACE2表达的下降(图3A)，此外，分析用 SARS-CoV-2刺突蛋白或水泡性口炎病毒(VSV)糖蛋白假型的慢病毒表明10μM CBD仅微弱地抑制表达尖峰的病毒进入细胞，这表明其他机制在很大程度上是其抗病毒作用的原因，通过使用抗刺突抗体证实了该测定的稳健性，该抗体有效地阻止了用刺突假型化的慢病毒的病毒感染，而不是VSVg(图3B)，与对病毒进入的影响可忽略不计相比， CBD在感染后2小时和6小时后在宿主细胞中抑制SARS-CoV-2刺突蛋白表达方面非常有效(～95％至99％)(图3C)，即使在存在针对刺突蛋白的抗体以防止再感染的情况下也是如此(图3D)，表明CBD 在感染周期的早期，在进入后的步骤中起作用，CBD在感染后15小时对SARS-CoV-2的抑制也部分有效(～60％)(图3C)，这表明可能对病毒组装和释放产生二次影响，为了评估CBD是否可能阻止病毒蛋白酶Mpro或PLpro对病毒蛋白的加工，我们在体外测定了它们的活性，CBD不影响任何一种蛋白酶的活性，增加了CBD靶向宿主细胞过程的可能性。
(A)A549-ACE2细胞裂解物中ACE2蛋白表达的免疫印迹，未经处理或用指定剂量的载体或CBD处理(n＝3)，用抗ACE2和微管蛋白的抗体探测印迹，将ACE2蛋白表达水平标准化为每个样品中的微管蛋白信号，相对于未处理的样品绘制ACE2表达水平，DMSO，二甲基亚砜；
(B)293个T-ACE2细胞被棘突病毒或VSV-G假病毒感染72小时，并用指定剂量的CBD处理，并绘制被感染细胞的百分比；
(C)A549-ACE2细胞用SARS-CoV-2以0.5的MOI感染2小时，然后在感染后2、6或15小时添加DMSO或10μM CBD，16小时后，对尖峰阳性细胞进行量化并标准化为仅受病毒感染的样本；
(D)左图：SARS-CoV-2以0.5的MOI感染A549-ACE2细胞2小时，然后在用尖峰中和抗体(nAb)感染后2小时添加DMSO或10μMCBD以防止再次感染，16小时后，对尖峰阳性细胞进行量化并标准化为仅受病毒感染的样本，右图：中和抗体功效的验证，SARS-CoV-2病毒(400PFU)在有或没有100nM中和抗体的情况下孵育1小时，用该混合物处理A549-ACE2细胞16小时，并对尖峰阳性细胞进行定量。
步骤三、CBD抑制病毒RNA表达并逆转病毒诱导的宿主基因表达变化：与这种解释一致，用CBD处理24小时的受感染A549-ACE2细胞的RNA测序(RNA-seq)分析显示，SARS-CoV-2诱导的基因表达变化明显受到抑制，CBD有效地消除了宿主细胞中的病毒RNA表达，包括编码刺突蛋白、膜蛋白、包膜蛋白和核衣壳蛋白的RNA(图4A和图 4B)，SARS-CoV-2和CBD均引起细胞基因表达的显着变化，宿主细胞RNA的主成分分析(PCA)显示病毒变化几乎完全逆转，但CBD+病毒感染的细胞与仅用CBD处理的细胞相似，而不是恢复到正常细胞状态(图4C)，使用Metascape的聚类分析揭示了一些有趣的模式和相关主题(图4D)，例如，与染色质修饰和转录相关的基因(簇1) 的病毒诱导被CBD逆转，尽管单独的CBD没有效果，同样，与核糖体和中性粒细胞(第3组)相关的基因的病毒抑制在很大程度上被CBD 逆转，但单独的药物没有效果，这与集群5和6形成对比，其中CBD 单独诱导与宿主应激反应相关的基因的强烈激活，总之，这些结果表明CBD可以防止病毒蛋白翻译和相关的细胞变化。
A549-ACE2细胞被SARS-CoV-2感染，MOI为3，有或没有CBD处理10μM 24小时，如材料和方法中所述进行RNA-seq。
(A)RNA-seq样本中SARS-CoV-2基因相对水平的热图；
(B)SARS-CoV-2刺突和核衣壳基因的表达水平，与感染和CBD处理的细胞相比，来自感染细胞的基因的表达水平变化百分比针对每个基因进行了指示；
(C)RNA-seq数据的PCA，显示对照(veh_mock)、SARS-CoV-2感染(veh_infect)、CBD处理(CBD_mock)和SARS-CoV-2感染加CBD处理(CBD_infect)样本，绘制了每个样本的第一和第二主成分(PC1和 PC2)；
(D)所有RNA-seq样本中5000个最可变基因的标准化表达水平的热图，根据治疗条件之间的差异表达分为六组。
为了更好地了解CBD的特定抗病毒作用，我们分析了用非活性 CBDV同系物处理24小时的未感染或SARS-CoV-2感染细胞裂解物的 RNA-seq。CBDV对刺突蛋白、包膜蛋白和核衣壳蛋白的病毒基因的诱导仅减少了60％，而CBD则减少了约99％(图5A和图5B)，与CBD 相比，CBDV治疗在A549-ACE2细胞中引起的转录组变化更少，并且在逆转SARS-CoV-2诱导的转录变化方面基本上无效(图5C)，使用 Metascape的聚类分析仅揭示了几个显示CBDV逆转病毒转录组变化的聚类(图5D)，这些包括由CBDV诱导的自噬和脂质代谢(第1组) 以及由CBDV抑制的蛋白质翻译/细胞周期/DNA复制(第3组)。
A549-ACE2细胞被SARS-CoV-2感染，MOI为3，有或没有CBDV 处理10μM 24小时，如材料和方法中所述进行RNA-seq。
(A)RNA-seq样本中SARS-CoV-2基因相对水平的热图；
(B)SARS-CoV-2刺突和核衣壳基因的表达水平，与感染和CBD处理的细胞相比，来自感染细胞的基因的表达水平变化百分比针对每个基因进行了指示；
(C)RNA-seq数据的PCA，显示对照(veh_mock)、SARS-CoV-2感染(veh_infect)、CBDV处理(CBDV_mock)和SARS-CoV-2感染加CBDV 处理(CBDV_infect)样本，绘制了每个样本的第一和第二主成(PC1 和PC2)；
(D)所有RNA-seq样本中5000个最可变基因的标准化表达水平的热图，根据治疗条件之间的差异表达分为六组。
步骤四、CBD诱导ER应激反应和IRE1α活性是其抗病毒作用的关键机制：与内质网(ER)应激反应、未折叠蛋白反应(UPR)和干扰素诱导相关的三组基因，它们被CBD而不是CBDV选择性上调(图6A)，相比之下，与氧化应激反应相关的基因是由两种大麻素诱导的，当ER蛋白折叠机器的工作量超过其能力时，细胞会经历ER压力，在ER 应激下，分泌蛋白在细胞器内以未折叠形式积聚，以触发一组称为 UPR的细胞内信号通路，这是维持整个细胞内蛋白质稳态的更大细胞应激反应的一部分，UPR通路由三种ER跨膜蛋白控制，肌醇需要酶 1α(IRE1α)、蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)和激活转录因子6(ATF6)，它们包含一个ER腔结构域，能够直接或间接感知错误折叠的蛋白质，响应ER压力，这些传感器中的每一个都会启动运动转录和翻译变化，从而增加蛋白质折叠能力并试图恢复体内平衡，然而，如果ER上的压力无法弥补，那么UPR会切换输出并发出细胞死亡信号，我们通过定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)验证了CBD对 IRE1α、PERK和ATF6基因表达的诱导，与之前的报道一致，独创性分析证实，CBD比CBDV更能诱导UPR。
A549-ACE2细胞用SARS-CoV-2感染SARS-CoV-2，MOI为3，有或没有CBD或CBDV处理，10μM(A和B)或如所示(C)24小时(A和 B)或如所示(C)。
(A)基于对每个通路和每次比较的激活z分数的独创性分析的预测通路激活热图，红色：通路被激活，蓝色：通路被抑制，白色：通路未改变，灰色：由于缺乏显着性，无法预测，NRF2，核因子红系 2相关因子2；
(B)IRE1αRNase对XBP1剪接的分析，对于模拟处理、 SARS-CoV-2处理或单独或在病毒存在下用CBD或CBDV处理的细胞 (左)，识别并量化了代表剪接或未剪接XBP1的读数，绘制了RNA-seq 样本的可变剪接读数的百分比，并进行了非配对t检验，将每个实验的模拟样本与其他样本进行比较(右)；
(C)IRE1α对CBD抗病毒活性剂量反应的影响，用指定剂量的CBD 处理缺乏IRE1α(IRE1 KO)的A549-ACE2或A549-ACE2细胞，然后以0.5的MOI感染SARS-CoV-248小时，对细胞进行刺突蛋白染色，并绘制每种条件下表达刺突蛋白的细胞百分比，指示了EC 50 值，在每个浓度下进行了非配对t检验，并显示了显着的P值，这是三个独立实验的代表(复合EC501.7对1.2，P<0.05)。
(D)示意图说明了CBD和SARS-CoV-2对IRE1αRNase活性和 XBP1剪接的影响ERAD，ER相关的降解。
许多研究报告了令人信服的证据，表明UPR被过度激活，并且是其他密切相关的冠状病毒家族成员复制所必需的，出乎意料的是，尽管RNA-seq数据的基因集富集分析(GSEA)显示IRE1α通路在存在或不存在病毒的情况下被CBD强烈激活，但该通路并没有被 SARS-CoV-2单独激活，相比之下，PERK在功能上被SARS-CoV-2和 CBD激活，IRE1α是一种单通道ER跨膜蛋白，具有双功能激酶/核糖核酸内切酶[核糖核酸酶(RNase)]活性，为响应ER应激，IRE1 α经历寡聚化和自磷酸化，从而变构激活其RNase以启动X-box结合蛋白1(XBP1)mRNA的高效剪接，剪接的XBP1编码一种转录因子，该转录因子上调许多宿主应激反应，包括ER伴侣诱导和ER相关降解成分(图6E)。
响应CBD和/或SARS-CoV-2病毒诱导PERK、IRE1或ATF6基因表达和功能，RNA-seq基因表达数据用于GSEA的三个GO术语：“PERK 介导的UPR”、“IRE1介导的UPR”和“ATF6介导的UPR”(GO编号 36498、36499和36500)，归一化富集分数显示在“GSEA NES”(基因集富集分析正常富集分数)列下(更高的分数＝更多的富集)，PERK、 IRE1和ATF6之间转录表达差异的倍数变化显示在“RNA-seq倍数变化”列下的每个比较中，*ND，未确定，因为没有足够的基因来获得可靠的值。
CBD强烈激活IRE1αRNase活性，如使用RNA-seq数据分析XBP1 剪接以量化剪接的XBP1以及通过qRT-PCR直接确认(图6B)，正如预测的那样，CBD在病毒存在或不存在的情况下诱导XBP1剪接，而 CBDV没有显着影响，与单独的病毒相当，在没有病毒的情况下CBD 诱导XBP1剪接的时间过程和剂量反应曲线与CBD抑制A549-ACE2细胞中病毒刺突蛋白表达的时间过程和剂量反应一致(图6C)，此外，虽然IRE1α敲除对SARS-CoV-2感染没有显着影响，但它改变了剂量反应并显着降低了CBD的抗病毒作用，导致其对SARS-CoV-2的EC50 增加了大约两倍(图6D)，总之，这些结果表明CBD对IRE1α的诱导是其对SARS-CoV-2的抗病毒作用的关键组成部分。
步骤五：CBD诱导干扰素表达作为其抗病毒活性的一部分：CBD 抑制病毒感染和促进病毒RNA降解的另一种机制是通过诱导干扰素信号通路，干扰素是对病原体暴露的最早的先天免疫宿主反应之一，据报道，SARS-CoV-2感染会抑制干扰素信号通路(图7A)，该通路中的许多基因，如干扰素刺激基因15(ISG15)、干扰素诱导蛋白与四肽重复1(IFIT1)、IFIT3、细胞因子信号抑制因子1(SOCS1)和 2'-5'-寡腺苷酸合成酶1(OAS1))，一种干扰素诱导的基因，可导致RNase L激活和RNA降解，仅由CBD适度上调，但在病毒存在下由CBD高度诱导(图7A)，后面的这些结果与CBD充分降低有效病毒滴度以使干扰素途径正常宿主激活的可能性一致，同时，CBD有效地逆转了病毒对细胞因子的诱导，这些细胞因子会在感染的后期导致致命的细胞因子风暴(图7B)，相比之下，无活性的同源物CBDV 不会显着诱导干扰素途径内的基因或阻止细胞因子的诱导(图6A、图7A和图7C)。
(A)与模拟处理样本相比，所有病毒或CBD处理样本的干扰素反应规范途径基因的倍数变化(log2)热图，第1至3列使用来自CBD 和SARS-CoV-2的RNA-seq实验的样本，第4到6列使用来自 CBDV和SARS-COV-2的RNA-seq实验的样本；
(B)CBD和SARS-CoV-2实验中所有RNA-seq样本的GO细胞因子活性基因的归一化表达水平的热图，这些基因被病毒感染上调但被 CBD处理下调；
(C)CBDV和SARS-CoV-2实验中所有RNA-seq样本的相同基因归一化表达水平的热图；
(D)A549-ACE2细胞在感染前2小时用2.5μM载体或CBD处理，加或不加人IFN-γ抗体和人I型IFN中和抗体混合物，然后用0.5MOI SARS-CoV-2感染细胞并孵育24小时，并使用噬斑测定法测量活性病毒，结果代表三个独立实验。
为了直接测试干扰素可能部分解释CBD抗病毒活性的可能性，我们在2.5μM之前将ACE2-A549细胞暴露于针对I型(α、β和ο) 和II型(γ)干扰素的抗体混合物CBD治疗和病毒感染，结果表明，抗干扰素抗体降低了CBD的抗病毒作用，部分挽救了SARS-CoV-2感染(图7D)，总的来说，这些结果表明CBD部分通过激活IRE1α和干扰素途径抑制SARS-CoV-2感染，导致病毒RNA降解和随后病毒诱导的宿主基因表达变化，包括细胞因子。
步骤六、CBD治疗显着抑制SARS-CoV-2在小鼠中的复制：由于包括阳离子两亲性药物在内的几种药物可以阻断SARS-CoV-2在培养细胞中的复制，但不能在体内复制，我们确定CBD是否会降低雌性 K18-hACE2小鼠的病毒滴度，在用SARS-CoV-2[2×104斑块形成单位(PFU)]进行鼻内攻击之前，每天两次向小鼠腹膜内注射CBD(20 或80mg/kg)，持续7天，攻击后，每天两次继续施用CBD，再持续 4天(图8A)，CBD治疗在感染后第5天以剂量依赖性方式显着抑制肺和鼻甲中的病毒复制(图8，B和C)，较低剂量的CBD使肺中的病毒载量降低了4.8倍，鼻甲中的病毒载量降低了3.7倍，而较高剂量的CBD使肺和鼻甲中的病毒滴度分别降低了40倍和4.8倍,在此期间，小鼠没有表现出临床疾病的迹象，并且它们的体重没有显着变化(图8D),这些结果确立了CBD作为SARS-CoV-2在感染早期阶段的抗病毒药物的临床前疗效。
(A)小鼠实验的时间表；
(B)病毒攻击后5天(第12天)测量所有动物肺中的病毒滴度，TCID 50，中值组织培养感染剂量；
(C)病毒攻击后5天(第12天)测量所有动物鼻甲中的病毒滴度；
研究期间每个治疗组(n＝10)小鼠的体重测量，将每只小鼠的体重标准化为其在第0天测量的体重，在第7天通过鼻内滴注对所有动物进行SARS-CoV-2攻击。
步骤七、CBD与患者病历中的SARS-CoV-2感染迹象呈负相关：鉴于大量个体服用高纯度CBD制剂，我们检查了CBD处方或使用的用药记录是否与SARS-CoV-2感染的迹象(即COVID-19检测呈阳性和/ 或COVID-19种接近COVID-19测试的诊断),CBD(100mg/ml)(CBD100) 的口服溶液通常用于治疗癫痫发作,来自国家COVID队列协作(N3C) 的1212名患者的分析有癫痫相关疾病史和CBD100药物记录显示6.2％ (75名患者)在其N3C数据中的第一次COVID-19测试日期附近有 SARS-CoV-2感染迹象，这明显低于没有任何CBD100记录的匹配对照组患者的比率[例如，CBD100患者为6.2％，而非CBD100患者为8.9％， P＝0.014；多变量logit模型优势比(OR)为0.65，P＝0.009,95％置信区间(CI)(0.47to 0.90)]，CBD100患者的人口统计学和病史与匹配对照组相似，这些患者的病史包括与癫痫发作相关的疾病、疾病控制中心(CDC)的高危疾病列表和其他潜在的混杂因素，例如行动不便、慢性疼痛或可能限制发育障碍的疾病公众互动和COVID-19暴露，在对531名CBD100患者的亚组进行分析时，负相关更为显着，这些患者可能在第一次COVID-19测试之日服用CBD100[例如，这些 CBD100患者中的4.9％与531名匹配对照中的9.0％，P＝0.011；或＝ 0.48，P＝0.006,95％CI(0.29,0.81)](图9)。
图9显示了我们从国家COVID队列协作(N3C)获得的主要分析样本和CBD患者组的推导，说明了对患者子集的连续分析，最后一个面板显示了在第一次COVID-19测试之日拥有CBD100药物记录与规模不断增加的匹配对照组(即1比1、2比1、和3比1的对照组与CBD 患者的比例)，不匹配的协变量具有大于0.10的标准化均值差和双边Fisher精确检验P在比较CBD患者与其匹配对照之间的分布时，该值小于0.05，AUC是指受试者工作特征曲线下的面积。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种含大麻二酚CBD提取物在新型冠状病毒肺炎的应用，特征在于，包括以下步骤：
步骤一、高纯度CBD抑制SARS-CoV-2在人肺上皮细胞中的复制：在感染SARS-CoV-2之前，用0-10％的浓度CBD预处理表达外源性人ACE2受体(A549-ACE2)的A549人肺癌细胞2小时，48小时后，监测细胞中病毒刺突蛋白(S)和病毒滴度的表达；
步骤二、CBD在病毒进入细胞后的早期发挥作用：将未经处理或用指定剂量的载体或CBD处理，用抗ACE2和微管蛋白的抗体探测印迹，将ACE2蛋白表达水平标准化为每个样品中的微管蛋白信号，将293个T-ACE2细胞被棘突病毒或VSV-G假病毒感染72小时，并用指定剂量的CBD处理，并绘制被感染细胞的百分比，同时，A549-ACE2细胞用SARS-CoV-2以0.5的MOI感染2小时，然后在感染后2、6或15小时添加DMSO或10μM CBD，16小时后，对尖峰阳性细胞进行量化并标准化为仅受病毒感染的样本；
步骤三、CBD抑制病毒RNA表达并逆转病毒诱导的宿主基因表达变化：用CBD处理24小时的受感染A549-ACE2细胞的RNA测序(RNA-seq)后通过Metascape的聚类分析，用非活性CBDV同系物处理24小时的未感染或SARS-CoV-2感染细胞裂解物的RNA-seq，使用Metascape的聚类分析显示CBDV逆转病毒转录组变化的聚类；
步骤四、CBD诱导ER应激反应和IRE1α活性是其抗病毒作用的关键机制：A549-ACE2细胞用SARS-CoV-2感染SARS-CoV-2，MOI为3，有或没有CBD或CBDV处理，基于对每个通路和每次比较的激活z分数的独创性分析的预测通路激活热图，通过IRE1αRNase对XBP1剪接的分析，绘制RNA-seq样本的可变剪接读数的百分比，将A549-ACE2细胞用指定浓度的CBD处理3和6小时，通过qRT-PCR确定CBD浓度和XBP1剪接之间的关系；
步骤五、CBD诱导干扰素表达作为其抗病毒活性的一部分：A549-ACE2细胞在感染前2小时用2.5μM载体或CBD处理，加或不加人IFN-γ抗体和人I型IFN中和抗体混合物，然后用0.5MOI SARS-CoV-2感染细胞并孵育24小时，并使用噬斑测定法测量活性病毒；
步骤六、CBD治疗显着抑制SARS-CoV-2在小鼠中的复制：在用SARS-CoV-2[2×104斑块形成单位(PFU)]进行鼻内攻击之前，每天两次向小鼠腹膜内注射CBD(20或80mg/kg)，持续7天，攻击后，每天两次继续施用CBD，再持续4天，CBD治疗在感染后第5天以剂量依赖性方式显着抑制肺和鼻甲中的病毒复制；
步骤七、CBD与患者病历中的SARS-CoV-2感染迹象呈负相关：检查CBD处方或使用的用药记录是否与SARS-CoV-2感染的迹象(即COVID-19检测呈阳性和/或COVID-19种接近COVID-19测试的诊断)，分析来自国家COVID队列协作(N3C)的1212名患者的分析有癫痫相关疾病史和CBD100药物记录。
2.根据权利要求1所述的一种含大麻二酚CBD提取物在新型冠状病毒肺炎的应用，其特征在于：所述步骤一中选择用来自四个不同供应商的指定剂量的CBD处理A549-ACE2细胞，然后以0.5的MOI感染SARS-CoV-248小时，用来自四个不同供应商的CBD参考材料和CBD样品的1HqNMR光谱。
3.根据权利要求1所述的一种含大麻二酚CBD提取物在新型冠状病毒肺炎的应用，其特征在于：所述步骤二中SARS-CoV-2以0.5的MOI感染A549-ACE2细胞2小时，然后在用尖峰中和抗体(nAb)感染后2小时添加DMSO或10μMCBD以防止再次感染，16小时后，对尖峰阳性细胞进行量化并标准化为仅受病毒感染的样本，SARS-CoV-2病毒(400PFU)在有或没有100nM中和抗体的情况下孵育1小时，用该混合物处理A549-ACE2细胞16小时，并对尖峰阳性细胞进行定量。
4.根据权利要求1所述的一种含大麻二酚CBD提取物在新型冠状病毒肺炎的应用，其特征在于：所述步骤三中RNA-seq数据的PCA，显示对照(veh_mock)、SARS-CoV-2感染(veh_infect)、CBD处理(CBD_mock)和SARS-CoV-2感染加CBD处理(CBD_infect)样本，绘制了每个样本的第一和第二主成分。
5.根据权利要求1所述的一种含大麻二酚CBD提取物在新型冠状病毒肺炎的应用，其特征在于：所述步骤四中用指定剂量的CBD处理缺乏IRE1α(IRE1 KO)的A549-ACE2或A549-ACE2细胞，然后以0.5的MOI感染SARS-CoV-248小时，对细胞进行刺突蛋白染色，并绘制每种条件下表达刺突蛋白的细胞百分比。
6.根据权利要求1所述的一种含大麻二酚CBD提取物在新型冠状病毒肺炎的应用，其特征在于：所述步骤五中在2.5μM载体或CBD处理之前将ACE2-A549细胞暴露于针对I型(α、β和ο)和II型(γ)干扰素的抗体混合物CBD治疗和病毒感染。
7.根据权利要求1所述的一种含大麻二酚CBD提取物在新型冠状病毒肺炎的应用，其特征在于：所述步骤六中病毒攻击后5天(第12天)测量所有动物肺中的病毒滴度，TCID 50，中值组织培养感染剂量，病毒攻击后5天(第12天)测量所有动物鼻甲中的病毒滴度，研究期间每个治疗组(n＝10)小鼠的体重测量，将每只小鼠的体重标准化为其在第0天测量的体重，在第7天通过鼻内滴注对所有动物进行SARS-CoV-2攻击。
8.根据权利要求1所述的一种含大麻二酚CBD提取物在新型冠状病毒肺炎的应用，其特征在于：所述步骤七中第一次COVID-19测试之日拥有CBD100药物记录与规模不断增加的匹配对照组(即1比1、2比1、和3比1的对照组与CBD患者的比例)，不匹配的协变量具有大于0.10的标准化均值差和双边Fisher精确检验P在比较CBD患者与其匹配对照。
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