CN114728021A - 同种异体t细胞和其产生方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于产生同种异体T细胞的方法，所述方法包含使用在可控启动子控制下的工程化核酸酶。通过用诱导型核酸酶制备T细胞，可以制备大量细胞，所述细胞中的每个细胞都含有单独产生期望的核酸酶的能力。然后可以根据需要通过引入所关注基因来修饰这些细胞，或者可以敲除不期望的基因。本文还提供了用于各种治疗应用的同种异体T细胞。

Description

同种异体T细胞和其产生方法
技术领域
本发明提供了用于产生同种异体T细胞的方法，所述方法包含使用在可控启动子控制下的工程化核酸酶。通过用诱导型核酸酶制备T细胞，可以制备大量细胞，所述细胞中的每个细胞都含有单独产生期望的核酸酶的能力。然后可以根据需要通过引入所关注基因来修饰这些细胞，或者可以敲除不期望的基因。本文还提供了用于各种治疗应用的同种异体T细胞。
背景技术
随着先进的细胞疗法的临床采用开始受到关注，因此更多的注意力转向将使这些疗法惠及全世界患者的基础制造策略。使用嵌合抗原受体(CAR)T细胞的免疫疗法试验的成功结果为患有先前无法治愈的癌症的患者提供了新的希望。虽然细胞疗法在临床上拥有广阔的前景，但相对于偿付的高制造成本是商业化的巨大障碍。
CAR T细胞疗法面临的挑战之一是产生可以用于任何患者的同种异体细胞。由于需要大量病毒载体和/或重组核酸内切酶，扩大同种异体T细胞疗法的规模可能非常昂贵并且需要较长的研制时间。
克服这些挑战所需要的是用于产生T细胞系的方法，这些方法不需要大量的时间和金钱投资，但仍能提供可以用于多个患者群体的细胞系。本发明满足了这些需要。
发明内容
在一些实施例中，本文提供的是一种产生用于同种异体应用的T细胞系的方法，所述方法包括：将编码在可控启动子控制下的工程化核酸酶的核酸分子引入到T细胞系中；将所述核酸分子整合到所述T细胞系的基因组中；以及扩增所述T细胞系。
在另外的实施例中，提供了一种产生经基因修饰的T细胞系的方法，所述方法包括：将编码在可控启动子控制下的CRISPR相关核酸酶的核酸分子引入到T细胞系中；将所述核酸分子整合到所述T细胞系的基因组中；扩增所述T细胞系；通过激活所述可控启动子诱导所述CRISPR相关核酸酶的表达；将向导RNA和所关注基因引入到经扩增的T细胞系中；敲除T细胞受体的表达并将所述所关注基因引入到所述T细胞系的所述基因组中；以及回收所述经基因修饰的T细胞系。
本文还提供了一种产生嵌合抗原受体(CAR)T细胞系的方法，所述方法包括：将编码在可控启动子控制下的Cas9核酸酶的核酸分子引入到T细胞系中；将所述核酸分子整合到所述T细胞系的基因组中；扩增所述T细胞系；通过激活所述可控启动子诱导所述Cas9核酸酶的表达；将向导RNA和编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸引入到经扩增的T细胞系中；敲除T细胞受体的表达并将所述编码所述CAR的核酸引入到所述T细胞系的所述基因组中；以及回收所述CAR T细胞系。
在另外的实施例中，本文提供了一种同种异体T细胞系，其包括整合到T细胞系的基因组中的在可控启动子控制下的CRISPR相关(Cas)核酸酶。
附图说明
图1示出了T细胞疗法的自体方法和同种异体方法的示意图。
图2示出了产生同种异体T细胞的步骤。
图3示出了同种异体T细胞产生的三个示例性阶段。
图4A-4B示出了用于本文的示例性可去阻遏启动子系统。
图4C-4D示出了用于其实施例的诱导型载体系统。
图4E示出了在其实施例中使用的TRE3G Tet-On系统。
图5A-C示出了用Cas9诱导型载体转导T细胞的三种处理方案。
图6A-6B示出了用Cas9诱导型载体转导T细胞的结果。查看图例上的符号以跟踪折线图。
图7A-7B示出了选择后和细胞扩增期间的活细胞数量。
图8示出了三种处理方案的耗竭标志物、衰老标志物、激活标志物和T细胞标志物的测量。
图9示出了在T细胞中诱导Cas9表达的结果。
图10A和10B示出了冷冻保存后的T细胞扩增。
图11示出了三种TRAC基因敲除方法。
图12A-12C示出了核转染后4天的TRAC敲除。
图13A-13C示出了核转染后7天的TRAC敲除。
图14A-14C示出了核转染后14天的TRAC敲除。
图15A-15B示出了敲除实验的汇编。
具体实施方式
在权利要求书和/或说明书中，当结合术语“包括(comprising)”使用时，词语“一个”或“一种”的使用可以意指“一个/一种(one)”，但是还与“一个或多个/一种或多种(oneor more)”、“至少一个/至少一种(at least one)”、以及“一个或多于一个/一种或多于一种(one or more than one)”一致。
贯穿本申请，术语“约”用于指示值包含用于测定值的方法/装置的固有的误差变化。通常，根据情况，所述术语意在涵盖大约或小于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％可变性。
权利要求中对术语“或”的使用用于意指“和/或”，除非明确指出仅指代替代方案或替代方案相互排斥，尽管本公开支持仅指代替代方案以及指代“和/或”的定义。
如本说明书和权利要求中所使用的，词语“包括(comprising)”(以及包括的任何形式，如“包括(comprise和comprises)”)、“具有(having)”(以及具有的任何形式，如“具有(have和has)”)、“包含(including)”(以及包含的任何形式，如“包含(includes和include)”)或“含有(containing)”(以及含有的任何形式，如“含有(contains和contain)”)是包容性的或开放性的并且不排除另外的未列举的元素或方法步骤。可设想到，本说明书中讨论的任何实施例可以相对于本发明的任何方法、系统、宿主T细胞、表达载体和/或组合物来实施。此外，本发明的组合物、系统、细胞和/或核酸可以用于实现如本文所描述的方法中的任何方法。
嵌合抗原受体T细胞
嵌合抗原受体T细胞或“CAR T细胞”是用嵌合抗原受体(CAR)修饰以更特异性地靶向癌细胞的T细胞(本文也称为T细胞)。通常，CAR包含三个部分：胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。胞外结构域是受体暴露于细胞外液的区域，并且包含三个部分：信号传导肽、抗原识别区域和间隔子。信号传导肽引导新生蛋白进入内质网中。在CAR中，信号传导肽是单链可变片段(scFv)。scFv包含与短接头肽连接的轻链的可变片段。在一些实施例中，接头包含甘氨酸和丝氨酸。在一些实施例中，接头包含谷氨酸和赖氨酸。
CAR的跨膜结构域是跨膜的疏水性α螺旋。在一些实施例中，CAR的跨膜结构域是CD28跨膜结构域。在一些实施例中，CD28跨膜结构域产生高度表达的CAR。在一些实施例中，CAR的跨膜结构域是CD3-ζ跨膜结构域。在一些实施例中，CD3-ζ跨膜结构域产生并入到天然T细胞受体中的CAR。
CAR的胞内结构域通常被认为是受体的“官能”末端。在胞外结构域的抗原识别区域识别抗原之后，CAR簇和信号传递到细胞。在一些实施例中，胞内结构域是CD3-ζ胞内结构域，其包含3个基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。在此情况下，在抗原结合之后，ITAM向T细胞传递激活信号，从而触发T细胞免疫应答。本领域已知的另外的CAR设计也可以用于本文所描述的方法的实践。
在产生CAR T细胞期间，将T细胞从人受试者中取出，经基因改造，并且重新引入到患者中以攻击癌细胞。CAR T细胞可以源自患者自身血液(自体)，或者源自另外的健康供体(同种异体)。通常，CAR T细胞被开发为对相对于健康细胞在肿瘤上过度表达的抗原具有特异性。
产生用于同种异体应用的T细胞的方法
虽然自体T细胞表示了治疗各种疾病以及具体地癌症的重要机会，但使用异体细胞，并且具体地产生可以根据每个个体患者的需要而修饰的细胞系的方法表示了基于T细胞疗法的巨大进步。通过产生可以用于任何患者的T细胞系，不仅潜在细胞的供应显著增加，而且产生此类细胞的成本也显著增加。
在从患者供体中取出细胞之后，用于产生同种异体T细胞的传统方法包含在引入期望的CAR以进行必要的治疗之前扩增细胞的步骤。然而，在这种方法中，由于T细胞受体是扩增所必需的，但必须在引入到患者中之前去除，所有的CAR引入都必须发生在细胞扩增之后。这不仅需要大量的病毒和期望的CAR，而且还需要进行基因编辑可能需要大量的任何工程化核酸酶。这显著增加了成本和复杂性。
然而，本文所描述的方法允许产生在细胞内包含在可控启动子控制下的工程化核酸酶的T细胞，但仍保留允许扩增的天然T细胞受体。一旦细胞扩增，就可以插入期望的CAR，去除T细胞受体，并且将细胞进行进一步处理并适当地注射到患者体内。
图1示出了T细胞疗法的自体方法和同种异体方法的示意图。在自体应用中，将T细胞从患者中分离，将CAR构建体病毒转导到患者的T细胞中，并且然后将CAR T细胞重新引入到同一患者中。在同种异体方法中，将T细胞从健康供体中分离，用期望的CAR构建体对细胞进行病毒转导。同时，敲除T细胞受体以预防移植物抗宿主病(GvHD)，这是通用CAR T疗法的先决条件(也可以敲除另外的基因，包含B2M和PD1以帮助预防GvHD)。现在可以将包含期望的CAR的同种异体T细胞引入到任何患者中。如本文所描述的，产生可以在引入CAR构建体之前扩增的T细胞来源将允许规模显著增加，并且还减少所需的资源和成本。
然后在实施例中，本文提供了产生用于同种异体应用的T细胞系的方法。如本文所使用的，“T细胞系”是指在胸腺中发育并在其表面上包含T细胞受体的淋巴细胞。T细胞包含永生化T细胞。如本文所使用的，“同种异体”或“同种异体应用”是指将来自一种或多种供体来源(通常是健康供体)的细胞用于对一个或多个患者的治疗应用，其可以与供体来源无关。
在实施例中，本文所描述的方法包含将编码在可控启动子控制下的工程化核酸酶的核酸分子引入到T细胞系中。将核酸分子引入到T细胞系中的方法包含使用各种转导或转染系统，包含各种病毒系统，例如，可以使用慢病毒载体将核酸分子引入到T细胞系中。另外的转导或转染系统包含核转染、外泌体系统的使用、脂质体系统的使用、基于聚合物的系统的使用等。
如本文所使用的，“核酸”、“核酸分子”或“寡核苷酸”意指包括共价连接的核苷酸的聚合化合物。术语“核酸”包含聚核糖核酸(RNA)和聚脱氧核糖核酸(DNA)，两者都可以是单链的或双链的。DNA包含但不限于互补DNA(cDNA)、基因组DNA、质粒或载体DNA以及合成DNA。RNA包含但不限于mRNA、tRNA、rRNA、snRNA、微RNA、miRNA或MIRNA。核酸还包含引入到细胞中的RNA，并且然后在整合到细胞基因组中之前被逆转录为DNA。
如本文所使用的，“基因”是指编码多肽的核苷酸的组装并且包含cDNA和基因组DNA核酸分子。“基因”还指可以充当编码序列之前(5'非编码序列)和之后(3'非编码序列)的调控序列的核酸片段。在一些实施例中，基因与多个拷贝整合。在一些实施例中，基因以预定义的拷贝数整合。
如本文所使用的，“转染”意指将包含载体的外源核酸分子引入到细胞中。“经转染的”细胞包括细胞内部的外源核酸分子，并且“经转化的”细胞是其中细胞内的外源核酸分子诱导细胞中的表型改变的细胞。经转染的核酸分子可以引入到细胞中作为RNA，由细胞逆转录成DNA，并且然后整合到宿主T细胞的基因组DNA中和/或可以由细胞在染色体外暂时或长时间维持。表达外源核酸分子或片段的宿主细胞或生物体被称为“重组”、“经转化的”或“转基因”生物体。多种转染技术通常是本领域已知的。参见例如Graham等人,《病毒学(Virology)》,52:456(1973)；Sambrook等人,《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:alaboratory manual)》,纽约冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory,New York)(1989)；Davis等人,《分子生物学基础方法(Basic Methods in Molecular Biology)》,爱思唯尔(Elsevier)(1986)；以及Chu等人,《基因(Gene)》,13:197(1981)。适当地，将T细胞用本文所描述的载体中的一种或多种载体转染利用了转染剂，如聚乙烯亚胺(PEI)或其它合适的试剂，包含各种脂质和聚合物，以将核酸整合到宿主T细胞的基因组DNA中。在一些实施例中，转染包含病毒感染(也称为“转导”)、转座子、mRNA转染、电穿孔或其组合。在一些实施例中，转染包含电穿孔。在另外的实施例中，转染包含病毒转导。载体可以是病毒载体，例如慢病毒载体、γ逆转录病毒载体、腺相关病毒载体或腺病毒载体。在实施例中，转染包含将病毒载体引入到细胞培养物的激活的T细胞中。在另外的实施例中，将载体递送作为病毒颗粒。
如图2所示，T细胞适当地与病毒颗粒内含有的核酸分子接触，以允许核酸整合到T细胞系的基因组中。将核酸引入作为RNA，由细胞逆转录为DNA，并且然后整合到细胞的基因组中。这提供了一种T细胞系，在每个细胞内都包含在可控启动子的控制下的经基因整合的工程化核酸酶。然后这些T细胞可以如本文所描述地进行扩增，以产生用于同种异体应用的T细胞系。
如本文所使用的，术语“工程化核酸酶”是指已从其作为核酸酶的天然状态分离、修饰、突变和/或改变的核酸酶。“核酸酶”是指能够切割DNA和/或RNA分子的酶。通过对核酸酶进行工程化，切割的特定位置可以根据期望的细胞类型和/或所关注基因设计和定制。
可以插入到T细胞中的示例性工程化核酸酶包含例如大范围核酸酶、甲基转移酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶(TALENS)、FokI核酸酶和CRISPR相关核酸酶。通常，工程化核酸酶使用既具有期望的催化活性又通过蛋白质-核酸相互作用以类似于限制酶的方式结合期望的靶序列的能力的DNA结合蛋白。实例包含天然存在或工程化的稀有序列切割酶的大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)或转录激活因子样核酸酶(TALEN)，其含有与经修饰的DNA结合结构域连接的FokI催化核酸酶亚基，并且可以各自切割一个预定序列。在ZFN中，结合结构域包含折叠成定制锌指结构域的氨基酸链。类似地，在TALEN中，源自转录因子的34个氨基酸重复序列折叠成一个巨大的DNA结合结构域。在基因靶向的情况下，这些酶可以切割基因组DNA以形成双链断裂(DSB)或产生切口，这可以通过两种修复途径，非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HR)之一修复。NHEJ途径可能会导致特异性突变、缺失、插入或替代事件。HR途径导致靶向序列被所供应的供体序列替代。示例性的基于FokI和甲基转移酶的系统在美国专利第10,220,052号中进行了描述，所述美国专利的公开内容以全文引用的方式并入本文中。
在合适的实施例中，CRISPR相关核酸酶是Cas9核酸酶，或者可以是其它Cas核酸酶，如Cas12核酸酶、Cas13核酸酶、Cas14核酸酶等。在实施例中，Cas9核酸酶是已降低免疫原性的Cas9核酸酶，如在美国公开专利申请第2018-0319850号中公开的，所述美国公开专利申请的公开内容以全文引用的方式并入本文中。
包括CRISPR-Cas系统的成簇的规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)和相关蛋白(CRISPR相关核酸酶或Cas蛋白)首先在所选细菌物种中被鉴定，并形成原核适应性免疫系统的一部分。参见Sorek等人,“CRISPR-提供对细菌和古细菌中的噬菌体的获得性抗性的广泛的系统(CRISPR–a widespread system that provides acquired resistance againstphages in bacteria and archaea)”《自然综述：微生物学(Nat.Rev.Microbiol.)》6(3)181-6(2008)，所述文献以全文引用的方式并入本文中。CRISPR-Cas系统主要分类为三种类型：I型、II型和III型。单独类型的主要定义特征在于所采用的各种Cas基因和其编码的相应蛋白质。cas1基因和cas2基因似乎在三种主要类型中是通用的，而cas3、cas9和cas10被认为对I型、II型和III型系统具有特异性。参见例如Barrangou,R.和Marraffini,L.A.,“CRISPR-Cas系统：原核生物升级到适应性免疫(CRISPR-Cas systems:prokaryotesupgrade to adaptive immunity)”,《分子细胞(Mol.Cell.)》54(2):234-44(2014)，所述文献以全文引用的方式并入本文中。
通常，CRISPR-Cas系统通过捕获入侵病毒或质粒DNA的短区域并将所捕获的DNA整合到宿主基因组中发挥作用，以形成所谓的CRISPR阵列，所述阵列由CRISPR基因座内的重复序列间隔开。将DNA采集到CRISPR阵列中，然后进行转录和RNA处理。
取决于细菌物种，进行的CRISPR RNA处理也有所不同。例如，在最初在细菌化脓性链球菌中描述的II型系统中，经转录的RNA与反式激活RNA(tracrRNA)配对，然后被RNaseIII切割以形成单独的CRISPR-RNA(crRNA)。crRNA在与Cas9核酸酶结合后进一步处理，以产生成熟的crRNA。crRNA/Cas9复合物随后与含有与所捕获的区域互补的序列(被称为原型间隔子)的DNA结合。然后Cas9蛋白以位点特异性方式切割DNA的两条链，从而形成双链断裂(DSB)。这提供了基于DNA的记忆，从而导致病毒或质粒DNA在重复暴露和/或感染时快速降解。天然CRISPR系统已经过全面审查(参见例如Barrangou,R.和Marraffini,L.A.,2014)。
自最初发现以来，多个小组已围绕CRISPR系统在基因工程化中的潜在应用进行了广泛的研究，包含基因编辑(Jinek等人,“适应性细菌免疫中的可编程双RNA引导的DNA核酸内切酶(A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterialimmunity)”,《科学(Science)》337(6096):816-21(2012)；Cong等人,“使用CRISPR/Cas系统进行多重基因组工程化(Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems)”,《科学》339(6121):819-23(2013)；以及Mali等人,“通过Cas9进行RNA引导的人基因组工程化(RNA-guided human genome engineering via Cas9,)”，《科学》339(6121):823-26；所述文献中的每个献以全文引用的方式并入本文中)。一个主要的发展是利用嵌合RNA来靶向Cas9蛋白，所述Cas9蛋白被设计在来自与tracrRNA融合的CRISPR阵列的单个单元周围。这会产生单一RNA物种，被称为小向导RNA(gRNA)，其中对原型间隔子区域中的序列进行修饰可以位点特异性地靶向Cas9蛋白。已经进行了相当多的工作来了解嵌合RNA与靶位点之间的碱基配对相互作用的性质及其对错配的耐受性，这与预测和评估脱靶效应高度相关(参见例如Fu等人,“使用截短的向导RNA改进CRISPR-Cas核酸酶(Improving CRISPR-Casnucleases using Truncated guide RNAs)”,《自然生物技术(Nature Biotechnology)》32(3):279-84(2014)，以及载体材料，所述文献以全文引用的方式并入本文中)。
CRISPR-Cas9基因编辑系统已成功用于多种生物体和细胞系，可以使用野生型Cas9蛋白诱导双链断裂形成，或者可以使用被称为Cas9n/Cas9 D10A的突变蛋白切割单个DNA链(参见例如Mali等人,(2013)和Sander和Joung,“用于编辑、调控和靶向基因组的CRISPR-Cas系统(CRISPR-Cas systems for editing,regulating and targetinggenomes)”,《自然生物技术》32(4):347-55(2014)，所述文献中的每个文献以全文引用的方式并入本文中)。虽然双链断裂(DSB)的形成会导致产生可能破坏基因功能的小插入和缺失(插入缺失)，但Cas9n/Cas9D10A切口酶在刺激内源同源重组机制的同时避免了插入缺失的产生(通过非同源末端连接进行修复的结果)。因此，Cas9n/Cas9 D10A切口酶可以用于将DNA区域以高保真度插入到基因组中。
如本文所描述的，适当地，插入到T细胞基因组中的CRISPR相关核酸酶是Cas9核酸酶。通过将Cas9核酸酶置于可控启动子控制之下，核酸酶可以在其用作基因编辑工具之前保持休眠或沉默。如本文所使用的，“可控启动子”是指可以打开或关闭的启动子，这取决于在启动子控制下的基因的期望的控制。
除了Cas9核酸酶，Cas12、Cas13和Cas14核酸酶也可以用于本文所描述的方法。Cas12核酸酶在dsDNA中产生交错切割(5个核苷酸5'突出端dsDNA断裂)。Cas12处理自身的向导RNA，从而提高多路复用能力。Cas13t靶向RNA，而不是DNA。一旦其被与其crRNA间隔子具有互补性的ssRNA序列激活，就会释放非特异性RNase活性并破坏所有附近的RNA，而不管其序列如何。参见例如Yan等人,“CRISPR-Cas12和Cas13：CRISPR Cas9的鲜为人知的兄弟姐妹(CRISPR-Cas12 and Cas13:the lesser known siblings of CRISPR Cas9)”,《细胞生物学和毒理学(Cell Biology and Toxicology)》第1页到第4页(2019年8月29日)，所述文献的公开内容以全文引用的方式并入本文中。
在另外的实施例中，灭活的Cas9(dCas9)酶可以与活性核酸内切酶连接并用于本文所描述的方法，包含例如dCas9-Fok1融合。
如本文所使用的，“在……的控制下”是指基因受“启动子”、“启动子序列”或“启动子区域”调控，这是指DNA调控区域/序列能够结合RNA聚合酶并启动下游编码基因序列或非编码基因序列的转录。换句话说，启动子与基因可操作地组合或可操作地连接。如本文所提及的，术语“以可操作的组合”、“以可操作的顺序”和“可操作地连接”是指核酸序列以使得产生能够引导给定基因的转录和/或期望蛋白质分子的合成的启动子的方式连接。所述术语还指以使得产生功能蛋白质的方式连接氨基酸序列。
在本公开的一些实例中，启动子序列包含转录起始位点并且向上游延伸以包含在高于背景的可检测水平下启动转录所必需的最小数量的碱基或元件。在一些实施例中，启动子序列包含转录起始位点以及负责结合RNA聚合酶的蛋白结合结构域。真核启动子将经常但并非总是含有“TATA”盒和“CAT”盒。
各种启动子，包含诱导型启动子可以用于例如在本公开的宿主T细胞或载体中驱动基因表达。在一些实施例中，启动子不是泄漏启动子，即，启动子不组成型地表达如本文所描述的任何基因产物。在如本文所描述的其它实施例中，启动子是组成型启动子，所述组成型启动子不受外部调控的影响而启动mRNA合成。在示例性实施例中，用于控制工程化核酸酶的启动子是诱导型启动子。“诱导型启动子”是指能够在特定物理、化学或病原体信号的刺激下增强外源基因表达的一组启动子。在本文的实施例中，可以用于控制工程化核酸酶的示例性诱导型启动子包含但不限于4HT诱导型启动子、雷帕霉素诱导型启动子、激素应答元件、TET-on系统或谷氨酸诱导型启动子。
适当地，用于控制工程化核酸酶的启动子是可去阻遏启动子。如本文所使用的，“可去阻遏启动子”是指包含功能性启动子和能够结合阻遏子元件以引起功能性启动子阻遏的另外的元件或序列的结构。“阻遏”是指减少或抑制启动启动子对下游编码或非编码基因序列的转录。“阻遏子元件”是指能够结合启动子(或启动子附近)以减少或抑制启动子活性的蛋白质或多肽。阻遏子元件可以与阻遏子元件的底物或结合配偶体相互作用，使得阻遏子元件经历构象变化。阻遏子元件的这种构象变化带走了阻遏子元件减少或抑制启动子的能力，从而导致启动子的“去阻遏”，由此允许启动子继续启动转录。“功能性启动子”是指在没有阻遏子元件作用的情况下将能够启动转录的启动子。可以用于本发明的实践的各种功能性启动子是本领域已知的，并且包含例如PCMV、PH1、P19、P5、P40和腺病毒辅助基因的启动子(例如，E1A、E1B、E2A、E4Orf6和VA)。
可以用作可去阻遏启动子的示例性阻遏子元件及其对应的结合配偶体是本领域已知的，并且包含如cumate基因开关系统(CuO操纵子、CymR阻遏子和cumate结合配偶体)(参见例如Mullick等人,“cumate基因开关：用于哺乳动物细胞中的调控表达的系统(Thecumate gene-switch:a system for regulated expression in mammalian cells)”,《BMC生物技术(BMC Biotechnology)》6:43(1-18)(2006)，所述文献的公开内容以全文引用的方式并入本文中，包含其中所描述的可去阻遏启动子系统的公开内容)和本文所描述的TetO/TetR系统(参见例如Yao等人,“四环素阻遏子tetR而非tetR-哺乳动物细胞转录因子融合衍生物调控哺乳动物细胞中的诱导型基因表达(Tetracycline Repressor,tetR,rather than the tetR-Mammalian Cell Transcription Factor Fusion Derivatives,Regulates Inducible Gene Expression in Mammalian Cells)”,《人类基因疗法》9:1939-1950(1998)，所述文献的公开内容以全文引用的方式并入本文中)。在示例性实施例中，可去阻遏启动子包括功能性启动子和任一两个四环素操纵子序列(TetO或TetO2)。在此类实施例中，引入到T细胞中的核酸进一步包含四环素阻遏蛋白以控制TetO可去阻遏系统。
在示例性实施例中，如图3所示，在阶段1，T细胞可以通过病毒系统，如慢病毒，用诱导型Cas9(iCas9)(或在可去阻遏启动子控制下的Cas9)转染。这会产生包含经基因整合的Cas9(或其它工程化核酸酶)的T细胞。
在阶段2，如图3所示，适当地，iCas9 T细胞(或含有另一种工程化核酸酶的T细胞)可以使用各种细胞扩增方法进行扩增。本文所描述的T细胞的扩增方法可以利用任何合适的反应器，包含但不限于搅拌罐生物反应器、气升、纤维、微纤维、中空纤维、陶瓷基质、流化床、固定床和/或喷射床生物反应器。如本文所使用的，“反应器”可以包含发酵罐或发酵单元或任何其它反应容器，并且术语“反应器”与“发酵罐”可互换地使用。术语发酵罐或发酵是指微生物培养物和哺乳动物培养物两者。例如，在一些方面，示例生物反应器单元可以执行以下中的一项或多项或全部：营养物和/或碳源的进料、合适的气体(例如，氧气)的注射、发酵或细胞培养基的入口和出口流动、气相和液相的分离、温度的维持、氧气和CO2水平的维持、pH水平的维持、搅动(例如，搅拌)和/或清洁/灭菌。示例反应器单元，如发酵单元可以含有在单元内的多个反应器，例如所述单元可以具有在每个单元中的1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、60个、70个、80个、90个或100个或更多个生物反应器和/或设施可以含有多个单元，所述多个单元具有在所述设施内的单个或多个反应器。在各个实施例中，生物反应器可以适于分批、半进料分批、进料分批、灌注和/或连续发酵过程。可以使用任何合适的反应器直径。在实施例中，生物反应器的容积可以介于约100mL与约50,000L之间。非限制性实例的容积为100mL、250mL、500mL、750mL、1升、2升、3升、4升、5升、6升、7升、8升、9升、10升、15升、20升、25升、30升、40升、50升、60升、70升、80升、90升、100升、150升、200升、250升、300升、350升、400升、450升、500升、550升、600升、650升、700升、750升、800升、850升、900升、950升、1000升、1500升、2000升、2500升、3000升、3500升、4000升、4500升、5000升、6000升、7000升、8000升、9000升、10,000升、15,000升、20,000升和/或50,000升。另外，合适的反应器可以是多次使用的、单次使用的、一次性的或非一次性的，并且可以由任何合适的材料形成，包含金属合金，如不锈钢(例如，316L或任何其它合适的不锈钢)和Inconel、塑料和/或玻璃。
在实施例中，扩增适当地包含T细胞的激活。如本文所描述的，由于T细胞受体尚未从工程化T细胞系中去除，因此细胞仍可以被激活。在体内，抗原呈递细胞(APC)，如树突细胞通过T细胞受体(TCR)与APC主要组织相容性复合物(MHC)的相互作用作为T细胞激活的刺激物。TCR与CD3相关，CD3是一种T细胞共受体，有助于激活细胞毒性T细胞(例如，CD8+原初T细胞)和T辅助细胞(例如，CD4+原初T细胞)。通常，T细胞激活遵循双信号模型，从而需要刺激TCR/CD3复合物以及共刺激受体。
T细胞的共刺激分子的非限制性实例包含CD28，其是APC膜上CD80和CD86的受体；和CD278或ICOS(诱导型T细胞共刺激因子)，其是在与ICOS-L相互作用的激活的T细胞上表达的CD28超家族分子。因此，在一些实施例中，共刺激分子是CD28。在其它实施例中，共刺激分子是ICOS。在体内，共刺激信号可以由APC上的B7分子提供，所述B7分子与T细胞上的CD28受体结合。B7是一种存在于激活的APC上的外周跨膜蛋白，可以与T细胞上的CD28或CD152表面蛋白相互作用以产生共刺激信号。因此，在一些实施例中，共刺激分子是B7。
在体外使用各种激活方法来模拟T细胞激活。在实施例中，将T细胞培养物用激活试剂激活。在另外的实施例中，激活试剂是抗原呈递细胞(APC)。在仍另外的实施例中，激活试剂是树突细胞。树突细胞是处理抗原并将其在细胞表面呈递给T细胞的APC。在一些实施例中，激活试剂与T细胞培养物共培养。共培养可能需要单独纯化和培养第二细胞类型，这可能会增加劳动力需求和变异性来源。因此，在一些实施例中，使用替代性激活方法。
在一些实施例中，激活试剂是抗体。在一些实施例中，将细胞培养物用结合到表面(包含聚合物表面，包含珠粒)的抗体激活。在另外的实施例中，所述一种或多种抗体是抗CD3和/或抗CD28抗体。例如，珠粒可以是磁珠，例如，涂覆有抗CD3和抗CD28的DYNABEADS。抗CD3珠粒和抗CD28珠粒可以适当地提供刺激信号以支持T细胞激活。参见例如Riddell1990；Trickett 2003。
在其它实施例中，将细胞培养物用可溶性抗体激活。在另外的实施例中，可溶性抗体是可溶性抗CD3抗体。OKT3是免疫球蛋白IgG2a同种型的鼠单克隆抗体，并且靶向CD3。因此，在一些实施例中，可溶性抗CD3抗体是OKT3。OKT3在例如Dudley 2003；Manger 1985；Ceuppens 1985；Van Wauwe 1980；Norman 1995中进一步描述。
在一些实施例中，T细胞激活的共刺激信号由辅助细胞提供。辅助细胞可以包含例如Fc受体，其能够使CD3抗体与T细胞上的TCR/CD3复合物交联。在一些实施例中，细胞培养物是外周血单核细胞(PBMC)的混合群体。PBMC可以包含能够支持T细胞激活的辅助细胞。例如，CD28共刺激信号可以由PBMC中的单核细胞上存在的B7分子提供。因此，在一些实施例中，辅助细胞包含单核细胞或单核细胞衍生的细胞(例如，树突细胞)。在另外的实施例中，辅助细胞包含B7、CD28和/或ICOS。辅助细胞在例如Wolf 1994；Chai 1997；Verwilghen1991；Schwartz 1990；Ju 2003；Baroja 1989；Austyn 1987；Tax 1983中进一步描述。
如本文所描述的，激活试剂可以确定所产生的CAR T细胞的表型，从而促进期望的表型。在一些实施例中，激活试剂确定T细胞亚群，即CD4+辅助T细胞与CD8+细胞毒性T细胞的比率。细胞毒性CD8+T细胞通常负责杀伤癌细胞(即抗肿瘤应答)、已感染的细胞(例如，用病毒感染)或以其它方式受损的细胞。CD4+T细胞通常产生细胞因子并帮助调节免疫应答，并且在一些情况下可能支持T细胞裂解。CD4+细胞激活APC，然后使原初CD8+T细胞致敏以进行抗肿瘤应答。因此，在实施例中，本公开的方法进一步包含产生预定义表型的CAR T细胞(即，促进期望表型的细胞)。预定义表型可以是例如CD8+细胞与CD4+细胞的预定义比率。在一些实施例中，CAR T细胞群中CD8+细胞与CD4+细胞的比率为约1:1、约0.25:1或约0.5:1。在其它实施例中，CAR T细胞群体中CD8+细胞与CD4+细胞的比率为约2:1、约3:1、约4:1或约5:1。
在一些实施例中，将T细胞培养物扩增到预定义的培养物大小(即，细胞数量)。预定义的培养物大小可以包含足够数量的适于临床使用即输血到患者体内、研发工作等的细胞。在一些实施例中，用于施用于患者的临床或治疗剂量的T细胞是约105个细胞、约106个细胞、约107个细胞、约108个细胞、约109个细胞或约1010个细胞。在一些实施例中，所述方法产生至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个或至少100个临床剂量的T细胞(并且因此最终是CAR T细胞)。在实施例中，通过本文所描述的方法产生的T细胞的数量为至少约1亿个(即100*106)个细胞，或至少约10亿个(即1*109)个细胞，至少约500亿个、至少约1000亿、至少约2500亿、至少约5000亿、至少约7500亿、或至少约1万亿(即1*1012)个细胞，包含至少约2万亿、至少约3万亿、至少约4万亿、至少约5万亿或至少约10万亿个T细胞。
在T细胞扩增之后，适当地制备细胞以用于储存，包含例如在扩增之后将经扩增的T细胞系冷冻。将经扩增的细胞冷冻的方法是本领域已知的，并且包含使用液氮、干冰，并且可以包含各种冻干程序。适当地，将细胞在约-80℃到约0℃的温度下冷冻，并且可以包含使用冷冻保护剂，如二甲亚砜(DMSO)。细胞可以在冷冻状态下储存数周、数月并且甚至数年，直至期望时间，然后可以将其解冻以进行如本文所描述的另外的处理和/或基因修饰。
在另外的实施例中，本文提供了一种产生经基因修饰的T细胞系的方法，所述方法包括：将编码在可控启动子控制下的CRISPR相关核酸酶的核酸分子引入到T细胞系中；将所述核酸分子整合到所述T细胞系的基因组中；以及扩增所述T细胞系。如本文所描述的，编码CRISPR相关核酸酶的核酸分子是逆转录成DNA的RNA，并且然后整合到细胞的基因组中。如本文所描述的，适当地，CRISPR相关核酸酶是Cas9核酸酶或Cas12核酸酶。
如本文所描述的，在扩增之后，可以将T细胞冷冻(如果需要的话)并储存。然后在进一步处理之前将所储存的细胞适当解冻。
如本文所描述的，所述方法可以进一步包含通过激活可控启动子来诱导CRISPR相关核酸酶的表达。在诱导型启动子，如4HT诱导型启动子、雷帕霉素诱导型启动子、激素应答元件或谷氨酸诱导型启动子的情况下，通过分别添加例如4-羟基他莫昔芬、雷帕霉素、激素或谷氨酸诱导启动子。在可去阻遏启动子，如本文所描述的与CMV启动子偶联的TetO序列的情况下，添加强力霉素去除阻遏，并允许基因(工程化核酸酶)通过CMV启动子来表达。适当地，编码Cas9的核酸分子还编码TetR阻遏子元件，适当地在另一启动子系统，如组成型启动子如hPGK启动子的控制下。如本文所描述的，可控启动子也可以是Tet-on系统，包含使用TRE3G启动子序列。
图4A-4B展示了示例性可去阻遏系统，即本文所描述的TetO系统。如图4A所示，两个TetO序列(连同一个启动子序列)在工程化核酸酶(EN)之前被适当地定向。在四环素阻遏蛋白(TetR-TetO序列的阻遏子元件)与TetO序列结合后，启动子(例如，CMV)被阻遏。换句话说，这些启动子很少或没有发生转录。如图4B所示，在TetR的结合配偶体(适当地强力霉素(Dox))的结合之后，TetR蛋白改变构象，从TetO序列中释放，并且功能性启动子(例如，CMV)开始其正常的转录过程，就像其自然地那样，导致产生工程化核酸酶(EN)。
图4C示出了可以用于整合诱导型工程化核酸酶的示例性诱导型载体(例如，慢病毒载体)，在这种情况下，所述诱导型工程化核酸酶为在TET-on操作系统(TRE3G)控制下的Cas9核酸酶，从而允许在用强力霉素诱导后在细胞中表达Cas9。图4D示出了更详细的载体图。
图4E示出了TET-on操作系统TRE3G的操作。如所示的，在没有强力霉素的情况下，Tet-On 3G反式激活蛋白不与TRE3G启动子序列结合。在存在强力霉素的情况下，Tet-On 3G反式激活蛋白能够与TRE3G启动子序列结合，这激活了转录，并导致Cas9核酸酶(或其它核酸酶，如果需要的话)的表达。
如图4D所示，本文所描述的用于引入核酸酶(例如，Cas9或Cas12)的可控系统还适当地包含可选择标志物，如抗生素抗性基因(例如，氨苄青霉素抗性)以允许生产可以容易地选择和富集的含有诱导型核酸酶的细胞(包含T细胞)。本文所描述的其它可控系统(其它诱导型系统以及可去阻遏系统)还可以与可选择标志物组合使用以允许选择表达核酸酶的细胞，并且然后进行富集以提供具有整合到基因组中的期望的核酸酶(例如，Cas9或Cas12)的纯细胞群。
如图3所示，在阶段3，除了激活Cas9核酸酶的表达之外，还将向导RNA和所关注基因也引入到经扩增的T细胞系中。如本文所描述的，可以通过如核转染等转染机制来引入向导RNA和所关注基因的这种引入。
由于这种向导RNA和所关注基因的引入，T细胞受体被适当地敲除，并且所关注基因被引入到T细胞系的基因组中。在引入所关注基因之后，适当地扩增T细胞，然后回收经基因修饰的T细胞系。用于扩增的方法是本领域已知的并且在此处描述。回收期望的细胞的方法包含各种过滤方法、离心以及细胞分离和洗涤。
适当地敲除T细胞受体包含敲除TRAC基因(T细胞受体α亚基)，这会导致整个T细胞受体的消融。如本文所描述的，各种向导RNA序列可以用于敲除TRAC基因，并且包含实例中指出的那些，以及本领域普通技术人员容易确定的其它序列。
如本文所描述的，为了产生嵌合抗原受体T细胞，所关注基因适当地编码嵌合抗原受体(CAR)。如图2所示，通过Cas9核酸酶(或Cas12核酸酶)进行的基因编辑导致T细胞受体的敲除，并导致期望的CAR在T细胞上表达。现在可以基于期望的CAR将此类T细胞施用于期望的患者群体。
期望的CAR构建体整合到T细胞中合适地在TRAC基因敲除的位置处发生，使得CAR在TRAC基因的内源启动子控制下。
如本文所描述的，在诱导Cas9表达之前将T细胞扩增到显著数量，并且然后对所关注基因进行随后整合的能力允许产生大量T细胞，约109-1012个T细胞。
在另外的实施例中，可以在T细胞中敲除一个或多个基因以产生期望的修饰，而不是引入所关注基因。例如，发现负责编码血清蛋白的如程序性细胞死亡蛋白1(PD1)和/或B2M基因(β2微球蛋白)等基因与主要组织相容性复合物(MHC)I类重链相关。可以使用各种方法如反义、siRNA、微RNA和本领域已知的其它方法来敲除此类基因。
在另外的实施例中，本文提供了一种产生嵌合抗原受体(CAR)T细胞系的方法，所述方法包括：将编码在可控启动子控制下的Cas9核酸酶的核酸分子引入到T细胞系中；将所述核酸分子整合到所述T细胞系的基因组中；扩增所述T细胞系；通过激活所述可控启动子诱导所述Cas9核酸酶的表达；将向导RNA和编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸引入到经扩增的T细胞系中；敲除T细胞受体的表达并将所述编码所述CAR的核酸引入到所述T细胞系的所述基因组中；以及回收所述CAR T细胞系。
本文描述了各种可控启动子的实例，包含诱导型启动子和可去阻遏启动子，以及通过引入诱导表达或去阻遏可去阻遏启动子的分子来诱导Cas9核酸酶表达的方法。
在另外的实施例中，本文提供了一种同种异体T细胞系，其包括整合到T细胞系的基因组中的在可控启动子控制下的CRISPR相关(Cas)核酸酶。如本文所描述的，Cas核酸酶适当地是Cas9核酸酶。
如本文所描述的，适当地，同种异体T细胞系包含可控启动子作为诱导型启动子，包含例如4HT诱导型启动子、雷帕霉素诱导型启动子、激素应答元件或谷氨酸诱导型启动子。可控启动子还可以是Tet-on系统。
在另外的实施例中，可控启动子可以是可去阻遏启动子，如使用一个或多个四环素操纵子序列(TetO)。在此类实施例中，T细胞进一步包含编码四环素阻遏蛋白的核酸分子。
如所描述的，根据所描述的实施例制备的同种异体T细胞允许产生至少约109个T细胞、至少约1010个T细胞、至少约1011个T细胞，或在实施例中产生至少约1012个T细胞。
本文还提供了治疗哺乳动物受试者，适当地人受试者的方法，所述方法包括施用使用本文所描述的同种异体T细胞制备的CAR T细胞，以及使用本文所描述的方法制备的CAR T细胞。对人受试者的施用可以包含例如吸入、注射或静脉内施用以及本领域已知的其它施用方法。
实例
实例1：将T细胞用Cas9诱导型载体转导
研究了三种处理方案以用于用诱导型Cas9载体转导T细胞。载体包含绿色荧光蛋白(GFP)标签以确定转导水平。
如图5A-5C所展示的，处理1(IL2)包含在T细胞分离当天用15ng/mL的IL-2和CD3/CD28进行24小时激活。病毒转导后，扩增仅包含15ng/mL(IL2)的IL-2。处理2(IL2+CD3/CD28)包含在T细胞分离当天用15ng/mL的IL-2和CD3/CD28进行24小时激活。转导后，扩增包含在每次更换培养基时用15ng/mL的IL-2和CD3/CD28处理。处理3(IL2+IL)包含在T细胞分离当天用15ng/mL的IL-2和CD3/CD28进行24小时激活。转导后，将细胞用15ng/mL的IL-2和CD3/CD28处理。在存在仅IL-2和IL-7的情况下进行扩增。
转导的结果提供于图6A-6B中。如图6A所示，使用CD3/CD28+IL-2治疗组合的GFP阳性细胞百分比具有最高的转导效率，其中对照载体(#)和含有Cas9核酸酶基因的载体(@)两者都是如此。用IL-2+IL-7处理也示出了良好的转导($)。图6B示出了GFP阳性群体的稀释率。
Cas9诱导型载体中的杀稻瘟菌素耐药性基因用于选择包含正确插入到基因组中的Cas9载体的细胞。图7A示出了此实例中描述的三种处理的活细胞的数量。如所展示的，用IL-2+IL-7处理示出了最多活细胞。在选择后扩增12天后，用CD3/CD28+IL-2和IL-2+IL-7处理的细胞均示出了大量活细胞(图7B)。
测量三种处理方案的耗竭、衰老和激活标志物，并且结果示出于图8中。
在第11天进行Cas9表达的诱导，用杀稻瘟菌素进行后选择。将细胞用1μg/mL强力霉素诱导24小时，并通过蛋白质印迹分析蛋白质裂解物。如图9所示，用处理3(IL-2+IL-7)进行的细胞生长示出了在诱导后的较高的Cas9表达，但用CD3/CD28+IL-2处理的细胞也示出了Cas9核酸酶的表达。
然后将细胞冷冻，并且解冻以确定插入Cas9载体是否对细胞活力有任何影响。如图10A所示，在冷冻保存前后，两种处理下的活力几乎相同。图10B示出了解冻后几天的细胞活力，表明对于两种处理，细胞都能够成功增殖。
实例2：TRAC基因的敲除
选择了三个sgRNA序列来研究敲除已用Cas9载体转导的T细胞中的TRAC基因的能力。图11示出了所研究的三个sgRNA序列(SEQ ID NO:1-3)，以及其在已翻译的TRAC基因(SEQ ID NO:4)中靶向的区域。使用核转染程序将sgRNA序列转染到T细胞中。简而言之，使用AMAXA P2原代细胞4D nucleofector X试剂盒和EO-115程序，在室温下将20μL中的1×106个细胞用约3.3μg的sgRNA转导。
用sgRNA TRAC#1-3(SEQ ID NO:1-3)进行敲除实验，并相对于CD-3进行校准。在第1天，将Cas9 T细胞(用15ng/mL的CD3/CD28和IL-2、IL-7处理，并且然后用15μg/mL的杀稻瘟菌素选择)解冻。在第2天，将Cas9用强力霉素诱导(用2μg/mL诱导持续24小时)。在第3天，通过核转染将细胞用sgRNA TRAC#1(SEQ ID NO:1)、TRAC#2(SEQ ID NO:2)和TRAC#3(SEQ IDNO:3)转导，并且然后扩增。在第4天、第7天和第14天，进行了CD-3和TCRαβ表达水平的FACS分析。
图12A和12B示出了用TRAC#1-#3sgRNA序列的核转染后4天的TRAC敲除。图12C示出了结果的汇编。如所指示的，TRAC#1-TRAC#3中的每一个都导致大约41-47％的TRAC基因被敲除，其中TRAC#2sgRNA显示出最高的敲除量(47％)。
图13A和13B示出了用TRAC#1-#3sgRNA序列的核转染后7天的TRAC敲除。图13C示出了结果的汇编。如所指示的，TRAC#1-TRAC#3中的每一个都导致大约66-74％的TRAC基因被敲除，其中TRAC#2sgRNA显示出最高的敲除量(74％)。
图14A和14B示出了用TRAC#1-#3sgRNA序列的核转染后14天的TRAC敲除。图14C示出了结果的汇编。如所指示的，TRAC#1-TRAC#3中的每一个都导致大约84-89％的TRAC基因被敲除，其中TRAC#2sgRNA显示出最高的敲除量(89％)。
14天的实验的复杂情况示出于图15A-15B中，从而展示了使用本文所描述的方法有效敲除TRAC基因。
实例3：CAR构建体的敲入
以下实验旨在证明敲入构建到含有Cas9的T细胞中的期望的CAR结构的能力。
CAR敲入实验将在上述敲除实验之后进行，并添加以下内容。在gRNA(朝向TRAC基因)的核转染期间，添加DNA模板。此DNA模板旨在通过使用同源重组机制在核酸酶产生双链断裂时整合到TRAC基因座中。
要检查以下三种类型的DNA模板：
单链DNA；
微环DNA；
线性双链DNA。
要检查两个构建体：
常规抗CD19 CAR，其使用FACS或功能测定评估；
抗CD19-CAR，其在胞质侧与可以使用FACS容易检测到的绿色荧光蛋白(GFP)分子融合。
另外的示例性实施例
实施例1是一种产生用于同种异体应用的T细胞系的方法，所述方法包括：将编码在可控启动子控制下的工程化核酸酶的核酸分子引入到T细胞系中；将所述核酸分子整合到所述T细胞系的基因组中；以及扩增所述T细胞系。
实施例2包含根据实施例1所述的方法，其中所述工程化核酸酶选自由以下组成的组：大范围核酸酶、锌指核酸酶、基于转录激活因子样效应物的核酸酶和CRISPR相关核酸酶。
实施例3包含根据实施例2所述的方法，其中所述CRISPR相关核酸酶是Cas9核酸酶或Cas12核酸酶。
实施例4包含根据实施例1到3中任一项所述的方法，其中所述可控启动子是诱导型启动子。
实施例5包含根据实施例4所述的方法，其中所述诱导型启动子是4HT诱导型启动子、雷帕霉素诱导型启动子、激素应答元件或谷氨酸诱导型启动子。
实施例6包含根据实施例1到3中任一项所述的方法，其中所述可控启动子是可去阻遏启动子。
实施例7包含根据实施例6所述的方法，其中所述可去阻遏启动子包含一个或多个四环素操纵子序列(TetO)。
实施例8包含根据实施例7所述的方法，其中所述核酸分子进一步包含四环素阻遏蛋白。
实施例9包含根据权利要求1到3中任一项所述的方法，其中所述可控启动子包括Tet-on系统。
实施例10包含根据实施例1到9中任一项所述的方法，其进一步包括在所述扩增之后将经扩增的T细胞系冷冻。
实施例11包含根据实施例1到10中任一项所述的方法，其中所述核酸分子是使用慢病毒载体引入到所述T细胞系中的。
实施例12包含根据实施例1到11中任一项所述的方法，其中所述T细胞系包括至少约109个T细胞。
实施例13是一种产生经基因修饰的T细胞系的方法，所述方法包括：将编码在可控启动子控制下的CRISPR相关核酸酶的核酸分子引入到T细胞系中；将所述核酸分子整合到所述T细胞系的基因组中；扩增所述T细胞系；通过激活所述可控启动子诱导所述CRISPR相关核酸酶的表达；将向导RNA和所关注基因引入到经扩增的T细胞系中；敲除T细胞受体的表达并将所述所关注基因引入到所述T细胞系的所述基因组中；以及回收所述经基因修饰的T细胞系。
实施例14包含根据实施例13所述的方法，其中所述CRISPR相关核酸酶是Cas9核酸酶或Cas12核酸酶。
实施例15包含根据实施例13或实施例14所述的方法，其中所述可控启动子是诱导型启动子。
实施例16包含根据实施例15所述的方法，其中所述诱导型启动子是4HT诱导型启动子或谷氨酸诱导型启动子。
实施例17包含根据实施例13或实施例14所述的方法，其中所述可控启动子是可去阻遏启动子。
实施例18包含根据实施例17所述的方法，其中所述可去阻遏启动子包含一个或多个四环素操纵子序列(TetO)。
实施例19包含根据实施例18所述的方法，其中所述核酸分子进一步包含四环素阻遏蛋白。
实施例20包含根据实施例18或实施例19所述的方法，其中所述激活所述可去阻遏启动子包括向所述T细胞系添加强力霉素。
实施例21包含根据实施例13或14所述的方法，其中所述可控启动子包括Tet-on系统。
实施例22包含根据实施例21所述的方法，其中所述激活所述Tet-on系统包括向所述T细胞系添加强力霉素。
实施例23包含根据实施例13到22中任一项所述的方法，其中所述所关注基因编码嵌合抗原受体(CAR)。
实施例24包含根据实施例13到23中任一项所述的方法，其进一步包括在c中所述扩增之后将所述T细胞系冷冻，并在d中所述诱导之前将其解冻。
实施例25包含根据实施例13到24中任一项所述的方法，其中所述经基因修饰的T细胞系包括至少约109个T细胞。
实施例26是一种产生嵌合抗原受体(CAR)T细胞系的方法，所述方法包括：将编码在可控启动子控制下的Cas9核酸酶的核酸分子引入到T细胞系中；将所述核酸分子整合到所述T细胞系的基因组中；扩增所述T细胞系；通过激活所述可控启动子诱导所述Cas9核酸酶的表达；将向导RNA和编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸引入到经扩增的T细胞系中；敲除T细胞受体的表达并将所述编码所述CAR的核酸引入到所述T细胞系的所述基因组中；以及回收所述CAR T细胞系。
实施例27包含根据实施例26所述的方法，其中所述可控启动子是诱导型启动子。
实施例28包含根据实施例27所述的方法，其中所述诱导型启动子是4HT诱导型启动子或谷氨酸诱导型启动子。
实施例29包含根据实施例26所述的方法，其中所述可控启动子是可去阻遏启动子。
实施例30包含根据实施例29所述的方法，其中所述可去阻遏启动子包含一个或多个四环素操纵子序列(TetO)。
实施例31包含根据实施例30所述的方法，其中所述核酸分子进一步包含四环素阻遏蛋白。
实施例32包含根据实施例30或实施例31所述的方法，其中所述激活所述可去阻遏启动子包括向所述T细胞系添加强力霉素。
实施例33包含根据实施例26所述的方法，其中所述可控启动子包括Tet-on系统。
实施例34包含根据实施例33所述的方法，其中所述Tet-on系统包括向所述T细胞系添加强力霉素。
实施例35包含根据实施例26到34中任一项所述的方法，其进一步包括在c中所述扩增之后将所述T细胞系冷冻，并在d中所述诱导之前将其解冻。
实施例36包含根据实施例26到35中任一项所述的方法，其中所述CAR T细胞系包括至少约109个T细胞。
实施例37是一种同种异体T细胞系，其包括整合到T细胞系的基因组中的在可控启动子控制下的CRISPR相关(Cas)核酸酶。
实施例38包含根据实施例37所述的同种异体T细胞系，其中所述CRISPR相关核酸酶是Cas9核酸酶或Cas12核酸酶。
实施例39包含根据实施例37或实施例38所述的同种异体T细胞系，其中所述可控启动子是诱导型启动子。
实施例40包含根据实施例39所述的同种异体T细胞系，其中所述诱导型启动子是4HT诱导型启动子或谷氨酸诱导型启动子。
实施例41包含根据实施例37或实施例38所述的同种异体T细胞系，其中所述可控启动子是可去阻遏启动子。
实施例42包含根据实施例41所述的同种异体T细胞系，其中所述可去阻遏启动子包含一个或多个四环素操纵子序列(TetO)。
实施例43包含根据实施例42所述的同种异体T细胞系，其中T细胞进一步包含编码四环素阻遏蛋白的核酸。
实施例44包含根据实施例37或实施例38所述的同种异体T细胞系，其中所述可控启动子包括Tet-on系统。
实施例45包含根据实施例37到44中任一项所述的同种异体T细胞系，其包括至少约109个T细胞。
实施例46包含根据实施例45所述的同种异体T细胞系，其包括至少约1010个T细胞。
对相关领域普通技术人员而言将显而易见的是，在不脱离任何实施例的范围的情况下，可以对本文所描述的方法和应用作出其它适合的修改和调整。
应当理解的是，虽然本文中已经展示和描述了某些实施例，但是权利要求不限于所描述和示出的部分的特定形式或布置。在本说明书中已经公开了说明性实施例，并且尽管采用了具体术语，但其仅用于一般性和描述性意义，而不是出于限制的目的。鉴于以上教导，对所述实施例的修改和变化都是可能的。因此，应当理解的是，可以以与具体描述的方式不同的方式实践所述实施例。
本说明书中所提及的所有公开、专利以及专利申请通过引用并入本文中，其程度如同每个单独的公开、专利或专利申请被专门地且单独地指示通过引用并入。

Claims (46)

1.一种产生用于同种异体应用的T细胞系的方法，所述方法包括：
a.将编码在可控启动子控制下的工程化核酸酶的核酸分子引入到T细胞系中；
b.将所述核酸分子整合到所述T细胞系的基因组中；以及
c.扩增所述T细胞系。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述工程化核酸酶选自由以下组成的组：大范围核酸酶、锌指核酸酶、基于转录激活因子样效应物的核酸酶和CRISPR相关核酸酶。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述CRISPR相关核酸酶是Cas9核酸酶或Cas12核酸酶。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的方法，其中所述可控启动子是诱导型启动子。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述诱导型启动子是4HT诱导型启动子、雷帕霉素诱导型启动子、激素应答元件或谷氨酸诱导型启动子。
6.根据权利要求1到3中任一项所述的方法，其中所述可控启动子是可去阻遏启动子。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述可去阻遏启动子包含一个或多个四环素操纵子序列(TetO)。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述核酸分子进一步包含四环素阻遏蛋白。
9.根据权利要求1到3中任一项所述的方法，其中所述可控启动子包括Tet-on系统。
10.根据权利要求1到9中任一项所述的方法，其进一步包括在所述扩增之后将经扩增的T细胞系冷冻。
11.根据权利要求1到10中任一项所述的方法，其中所述核酸分子是使用慢病毒载体引入到所述T细胞系中的。
12.根据权利要求1到11中任一项所述的方法，其中所述T细胞系包括至少约109个T细胞。
13.一种产生经基因修饰的T细胞系的方法，所述方法包括：
a.将编码在可控启动子控制下的CRISPR相关核酸酶的核酸分子引入到T细胞系中；
b.将所述核酸分子整合到所述T细胞系的基因组中；
c.扩增所述T细胞系；
d.通过激活所述可控启动子诱导所述CRISPR相关核酸酶的表达；
e.将向导RNA和所关注基因引入到经扩增的T细胞系中；
f.敲除T细胞受体的表达并将所述所关注基因引入到所述T细胞系的所述基因组中；以及
g.回收所述经基因修饰的T细胞系。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述CRISPR相关核酸酶是Cas9核酸酶或Cas12核酸酶。
15.根据权利要求13或权利要求14所述的方法，其中所述可控启动子是诱导型启动子。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述诱导型启动子是4HT诱导型启动子或谷氨酸诱导型启动子。
17.根据权利要求13或权利要求14所述的方法，其中所述可控启动子是可去阻遏启动子。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述可去阻遏启动子包含一个或多个四环素操纵子序列(TetO)。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述核酸分子进一步包含四环素阻遏蛋白。
20.根据权利要求18或权利要求19所述的方法，其中所述激活所述可去阻遏启动子包括向所述T细胞系添加强力霉素。
21.根据权利要求13或权利要求14所述的方法，其中所述可控启动子包括Tet-on系统。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述激活所述Tet-on系统包括向所述T细胞系添加强力霉素。
23.根据权利要求13到22中任一项所述的方法，其中所述所关注基因编码嵌合抗原受体(CAR)。
24.根据权利要求13到23中任一项所述的方法，其进一步包括在c中所述扩增之后将所述T细胞系冷冻，并且在d中所述诱导之前将其解冻。
25.根据权利要求13到24中任一项所述的方法，其中所述经基因修饰的T细胞系包括至少约109个T细胞。
26.一种产生嵌合抗原受体(CAR)T细胞系的方法，所述方法包括：
a.将编码在可控启动子控制下的Cas9核酸酶或Cas12核酸酶的核酸分子引入到T细胞系中；
b.将所述核酸分子整合到所述T细胞系的基因组中；
c.扩增所述T细胞系；
d.通过激活所述可控启动子诱导所述Cas9核酸酶或所述Cas12核酸酶的表达；
e.将向导RNA和编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸引入到经扩增的T细胞系中；
f.敲除T细胞受体的表达并将所述编码所述CAR的核酸引入到所述T细胞系的所述基因组中；以及
g.回收所述CAR T细胞系。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述可控启动子是诱导型启动子。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述诱导型启动子是4HT诱导型启动子或谷氨酸诱导型启动子。
29.根据权利要求26所述的方法，其中所述可控启动子是可去阻遏启动子。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述可去阻遏启动子包含一个或多个四环素操纵子序列(TetO)。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述核酸分子进一步包含四环素阻遏蛋白。
32.根据权利要求30或权利要求31所述的方法，其中所述激活所述可去阻遏启动子包括向所述T细胞系添加强力霉素。
33.根据权利要求26所述的方法，其中所述可控启动子包括Tet-on系统。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述激活所述Tet-on系统包括向所述T细胞系添加强力霉素。
35.根据权利要求26到34中任一项所述的方法，其进一步包括在c中所述扩增之后将所述T细胞系冷冻，并且在d中所述诱导之前将其解冻。
36.根据权利要求26到35中任一项所述的方法，其中所述CAR T细胞系包括至少约109个T细胞。
37.一种同种异体T细胞系，其包括整合到T细胞系的基因组中的在可控启动子控制下的CRISPR相关(Cas)核酸酶。
38.根据权利要求37所述的同种异体T细胞系，其中所述CRISPR相关核酸酶是Cas9核酸酶或Cas12核酸酶。
39.根据权利要求37或权利要求38所述的同种异体T细胞系，其中所述可控启动子是诱导型启动子。
40.根据权利要求39所述的同种异体T细胞系，其中所述诱导型启动子是4HT诱导型启动子或谷氨酸诱导型启动子。
41.根据权利要求37或权利要求38所述的同种异体T细胞系，其中所述可控启动子是可去阻遏启动子。
42.根据权利要求41所述的同种异体T细胞系，其中所述可去阻遏启动子包含一个或多个四环素操纵子序列(TetO)。
43.根据权利要求42所述的同种异体T细胞系，其中T细胞进一步包含编码四环素阻遏蛋白的核酸。
44.根据权利要求37或38所述的同种异体T细胞系，其中所述可控启动子包括Tet-on系统。
45.根据权利要求37到44中任一项所述的同种异体T细胞系，其包括至少约109个T细胞。
46.根据权利要求45所述的同种异体T细胞系，其包括至少约1010个T细胞。
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