CN114717267B - 基因转染方法及系统 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基因转染方法系统及系统，基因转染方法，包括以下过程：提供两个以上的分立的超声发生器，各所述超声发生器能分别发出超声波，各所述超声波的中心频率不相同，各所述超声波发生相干叠加形成同时包括高频成分和低频成分的复合波束；用所述复合波束激励待转染生物体系实现转染。本发明利用分立的超声发生器差频激励基因转染，可实现无需微泡参与，兼具高转染效率和高细胞存活率的基因转染。
Description
技术领域
本发明涉及细胞生物学技术领域，更具体地，涉及一种基因转染方法及系统。
背景技术
转染，指将外源遗传物质(DNA或RNA)引入真核细胞内部并表达其特有功能的过程。目前，转染技术已经在生物医学的众多前沿领域中被广泛应用，包括基因功能研究、药物筛选、基因编辑研究、诱导性多能干细胞生产、免疫细胞治疗、DNA疫苗等，已经成为现代生命科学研究的核心技术之一。理想的基因转染方法应具有高度靶向性、高转染效率、高细胞存活率、长时间功能表达、低生物毒性、无免疫原性等特点，但目前还没有哪一种基因转染方法能同时满足上述所有条件。由于待转染细胞具有不同的生长特性和体外培养条件，其接受外源DNA的能力也具有很大差别，因此，选择合适的转染方式将基因物质高效转染到受体细胞中去，对相关科研或应用均具有重要意义。基因转染设备和试剂市场也呈现出多元化发展的局面，没有哪一种技术占据绝对主导地位，不同技术被应用于不同的特定场景以满足各种特殊需求。
基因转染方法可被分为病毒载体方法和非病毒载体方法两大类。病毒载体利用其将DNA片段注入宿主细胞的能力来实现基因转染，希望被递送的基因需要事先被包装到复制缺陷型病毒颗粒中，目前所使用的病毒包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒和单纯疱疹病毒等。然而，病毒载体只能转染分子量较小的DNA片段，制备过程复杂，成本高昂，并且存在随机插入位点、细胞毒性和诱发基因突变等风险。
非病毒载体方法既包括化学方法，如脂质体转染、聚合物转染等，也包括物理方法，如电穿孔、声穿孔、光穿孔、显微注射、机械压迫等。化学方法中，以LipofectamineTM2000试剂的应用范围最广，是脂质体转染技术的代表。但是，它存在一旦进入体内很难排出体外的弊端，并有可能产生生物毒性或免疫反应。物理方法中，以电穿孔技术的应用最为广泛，被认为是所有转染技术中心转染能力最强的，可以转染多种极难转染的原代细胞(如免疫细胞、干细胞、神经细胞等)。但其采用高能量电场作用于活体细胞，具有较高的细胞伤害性，极易出现细胞存活率低或细胞失能等问题，极大地限制了其进一步拓展应用范围。
基于超声的声穿孔技术也见于报道，但大都需要依赖额外加入的微米级的微泡来实现细胞穿孔，然而由于微泡尺寸的一致性难以实现，造成其共振频率不一，空化效应随机性较强，加上不同种类细胞的可接受剪切力阈值也有差别，导致基于微泡的声孔效应的进一步推广应用还存在较大障碍。另外，这种不可控性还容易造成较大比例的不可逆声穿孔的出现，从而严重降低细胞存活率。
本团队的在先申请(CN201810831296.X)主要是利用单一中心频率的超声发生器件来同时产生机械、空化、微流体等声学效应，将声学效应转化为热效应，通过热效应令受体细胞产生热穿孔。但是，该在先技术需要依赖具有高吸声导热性能的材料制备转染容器来配合实现，且随着研究的深入，我们发现利用单纯的热效应并不能达到高基因转染性能。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种基因转染方法及系统，利用分立的超声发生器差频激励基因转染，可实现无需微泡参与，兼具高转染效率和高细胞存活率的基因转染。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种基因转染方法，包括以下过程：
提供两个以上的分立的超声发生器，各所述超声发生器能分别发出超声波，各所述超声波的中心频率不相同，各所述超声波发生相干叠加形成同时包括高频成分和低频成分的复合波束；
用所述复合波束激励待转染生物体系实现转染。
本发明还提供了一种基因转染系统，包括转染容器和两个以上的分立的超声发生器；
各所述超声发生器能分别发出超声波，各所述超声波的中心频率不相同，各所述超声发生器的空间分布方式为处于同一水平面内，且各所述超声发生器发射的所述超声波的传播方向共同指向所述转染容器所在区域，各所述超声发生器发射的所述超声波在所述转染容器所在区域内发生相干叠加形成同时包括高频成分和低频成分的复合波束；
所述转染容器用于存储待转染生物体系，所述转染容器与各所述超声发生器相连接，所述复合波束激励所述待转染生物体系实现转染。
实施本发明实施例，将具有如下有益效果：
本发明实施例通过利用分立的超声发生器产生两束或更多束中心频率不同的超声波，这些超声波相互发生相干叠加，形成兼具高频和低频特性的复合波束，复合波束的超声波，对待转染生物体系产生包括力学效应、空化效应、微流体效应等多种效应的复合作用，复合波束能够大幅提高其产生机械、空化、微流体等声学效应和热效应的转换效率，进一步缩短细胞转染所需的时间，同时对细胞造成更少的伤害，从而提高其转染后的存活率。本发明可实现无需微泡参与，兼具高转染效率和高细胞存活率的基因转染。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
其中：
图1是本发明一具体实施例的复合波束的形成示意图。
图2是本发明一具体实施例的超声发生器的加工过程示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明公开了一种基因转染方法，包括以下步骤：
步骤1：提供两个以上的分立的超声发生器，各超声发生器能分别发出超声波，各超声波的中心频率不相同，各超声波发生相干叠加形成同时包括高频成分和低频成分的复合波束。
步骤2：用复合波束激励待转染生物体系实现转染。
参考图1，各超声波发生相干叠加的复合波束的频率为各超声波的频率之差，复合波束同时包括高频和低频，用复合波束进行激励，即也是用原各超声波的差频进行激励。本发明通过形成兼具高频和低频特性的复合波束，使复合波束的超声波作用于待转染生物体系，复合波束能够大幅提高其产生机械、空化、微流体等声学效应和热效应的转换效率，进一步缩短细胞转染所需的时间，同时，对细胞造成更少的伤害，从而提高其转染后的存活率。本发明可实现无需微泡参与，兼具高转染效率和高细胞存活率的基因转染。
待转染生物体系包括待转染细胞、培养待转染细胞的培养基和待转入至待转染细胞的基因物质(如DNA质粒或mRNA等)。待转染生物体系在超声波的作用下能产生膨胀、收缩、振荡、崩溃等物理过程，所引起的冲击波、微激流等效应可以导致待转染细胞的细胞膜表面产生孔状结构，待转入的药物和基因物质从孔状结构进入，当参数合适时，停止超声波作用后细胞膜的结构可以完全恢复，待转染细胞可继续存活，表示转染成功，为可逆穿孔，否则为不可逆穿孔，不可逆穿孔可导致细胞死亡。
复合波束可以为一束，也可以为两束以上，超声波可以是超声表面波，也可以是超声体波，通过调节待转染生物体系的声场的时间和空间分布来控制声穿孔程度和效率，以实现可逆声穿孔和提高转染效率。
声场的时间和空间分布可以通过调整各超声发生器发射的超声波的幅值、波形、占空比、单次持续激励时间和中心频率等参数以及调整各超声发生器的排列方式来实现。
在一具体实施例中，各超声波的幅值可以分别为0.001V-1000V；各超声波的波形可以分别选自正弦波、方波、梯形波或其它不规则波形；各超声波的占空比可以分别为0.001％-99.999％；各超声波的单次持续激励时间可以分别为0.001s-100min。各超声波的中心频率可以分别为0.001Hz-1000MHz。
在一具体实施例中，待转染生物体系中的待转染细胞可以是癌细胞等，待转入至待转染细胞的基因物质可以是DNA质粒或mRNA等，超声发生器的数量为两个，两个超声发生器发射的超声波的传播方向正相对，两个超声发生器的距离为1cm～2cm，待转染生物体系位于两个超声发生器的中间区域；两个超声发生器的发射的超声波的中心频率分别为20MHz～25MHz，幅值分别为10V～30V，占空比分别为40％～60％，单次持续激励时间分别为3s～8s，波形分别为正弦波，在上述参数范围内，可以实现高转染效率和高细胞存活率。
本发明还公开了一种基因转染系统，包括转染容器和两个以上的分立的超声发生器；各超声发生器能分别发出超声波，各超声波的中心频率不相同，各超声发生器的空间分布方式为处于同一水平面内，且各超声发生器发射的超声波的传播方向共同指向转染容器所在区域，各超声发生器发射的超声波在转染容器所在区域内发生相干叠加形成同时包括高频成分和低频成分的复合波束；转染容器用于存储待转染生物体系，转染容器与各超声发生器相连接，使复合波束可以进入待转染生物体系，并产生机械、空化、微流体等效应，上述效应也可以同时产生热量，进入待转染生物体系并提升其温度，最终改善细胞膜及细胞核膜的通透性，并实现高转染效率和高细胞存活率的基因转染。
基因转染系统还包括电子控制电路，电子控制电路包括主控模块和信号发生模块，主控模块用于分别设定各超声发生器的参数，参数具体可以是超声发生器产生的超声波的幅值、波形、占空比、单次持续激励时间和中心频率等中的一种或两种以上；信号发生模块用于根据参数产生各超声发生器的激励信号并向各超声发生器输出其对应的激励信号；各超声发生器将其对应的激励信号进行转换，产生超声波。
电子控制电路还可以包括功率放大模块，用于放大激励信号，以放大超声波的幅度。
在一具体实施例中，各超声发生器环绕转染容器设置，以在转染容器所在的中心区域产生复合波束。
在一具体实施例中，超声发生器包括压电基底和设置于压电基底上的叉指换能器，压电基底与转染容器相连接，叉指换能器接收激励信号驱动压电基底振动，压电基底振动产生超声波，超声波传导至转染容器及其内部的待转染体系，使复合波束激励待转染体系实现转染。通常，在压电基底上镀上叉指电极层，采用微纳加工技术，刻蚀叉指电极层形成叉指换能器。通过设置适当的涂胶厚度、曝光时间、镀膜厚度及角度等加工工艺参数，以及选择合适的金属膜材料、指条对数、声孔径尺寸等器件结构参数，制备能够产生所需要的超声声表面波的叉指换能器，使其发射频率、插入损耗、器件带宽等指标能够满足基因转染的需要。
通过调整叉指换能器的指条宽度，可以精确控制其所发生的超声波的中心频率。采用多个分立的叉指换能器，且其所发出的超声波束的中心频率存在差异，当这些波束在某一个空间区域内发生相干叠加时，会形成兼具高频和低频特性的复合超声波束。这种复合波束的物理特性与这些波束中心频率的差异值相关。
通过调节叉指换能器的形状和排列方式，能调节所产生的复合波束的空间分布。比如，叉指换能器的电极形状为圆形或弧形时，声场分布也会为形成相应的圆形或弧形，并在圆心处形成声场的聚焦效果。进一步的，当具有不同中心频率的多个分立的叉指换能器，其空间位置按照不同方式排列时，所产生的复合超声波束的声场的空间分布也会有很大不同。选择这些叉指换能器的最佳空间分布方式，有助于更快形成满足细胞转染需要的具有足够强度的各项生物学效应，从而大幅提高细胞转染的时间效率和细胞存活率。
还可以通过改变叉指换能器激励信号的幅值、波形、占空比、单个持续激励时间、中心频率等参数，改变所产生的声表面波声场的时间分布。通过上述方法，实现对所产生的声表面波的时空分布的精密调控。
为了获得较大的机电耦合系数，在一具体实施例中，选用128°YX双面抛光的铌酸锂作为压电基底。
在一具体实施例中，各超声波的幅值可以分别为0.001V-1000V；各超声波的波形可以分别选自正弦波、方波、梯形波或其它不规则波形；各超声波的占空比可以分别为0.001％-99.999％；各超声波的单次持续激励时间可以分别为0.001s-100min。各超声波的中心频率可以分别为0.001Hz-1000MHz。超声发生器的数量为2个-1000个。
以下为具体实施例。
实施例1
1、超声发生器的加工过程
(1)涂胶：在完全清洗干净的压电基底材料的表面，将正光刻胶AZ4620以5000rpm旋涂30s，涂胶后放置在120℃加热板上烘烤3min。利用台阶仪对光刻胶的厚度进行测试，光刻胶的厚度大概为5μm，如图2中的(a)所示。
(2)曝光和显影：根据超声发生器中叉指换能器的形状及结构，设计带有相应图案的菲林片，如图2中的(b)所示。将菲林片覆盖光刻胶上方进行曝光，透光部分被固化，采用AZ400显影溶解非固化部分后放在150℃的加热板上烘烤10min，形成如图2中的(c)所示的结构。
(3)溅射：对已完成图形转移的基底片进行磁控溅射，使其表面形成厚度约为200nm的金属膜(即叉指换能器)，如图2中的(d)所示。
(4)去胶：将生长有金属膜的基底片放在丙酮溶液中，利用超声清洗机产生的超声波震荡来剥离光刻胶，完成微纳尺度超声发生器的制作，如图2中的(e)所示。
2、使用1中所述生产工艺，一次性在压电基底材料上完成多个叉指换能器的制作。这些叉指换能器的空间分布方式为处于同一水平面内，且各超声发生器发射超声波的方向共同指向某一特定区域，则各超声发生器所发射的超声波可以在该区域内发生相干叠加形成复合波束。在本实施例中，超声发生器的数量为2个，其发射超声波的方向互相正对，两个超声发生器的距离为1.5cm。
3、在本实施例中，一台计算机(主控模块)控制一台数字信号发生器(信号发生模块)产生幅度为10mV，占空比为50％，长度为5秒，中心频率分别为22MHz和24MHz的两个低压正弦波信号。上述正弦波信号被发送到一台额定放大功率为2W的双通道数字功率放大器(功率放大模块)中。该放大器将上述两个低压正弦波信号放大为幅值为20V，其他参数与原信号一致的两个高压正弦波信号，并输出。这两个高压正弦波信号作为激励信号，被输出到所述的两个超声发生器，分别激励其工作。超声发生器将其对应的激励信号进行转换，产生超声波。所发出的两束中心频率不同的超声波，在位于两个超声发生器中间的区域发生相干叠加，形成同时包括高频成分和低频成分的复合波束。
4、在本实施例中，转染容器为由硅胶材料制作的小型圆筒状容器，其中存储待转染生物体系。转染容器被置于复合波束作用的区域内，复合波束通过转染容器的介导进入待转染生物体系，并产生机械、空化、微流体等效应，上述效应也可以同时产生热量，进入待转染生物体系并提升其温度，最终改善细胞膜及细胞核膜的通透性，并实现高转染效率和高细胞存活率的基因转染。
5、在本实施例的一次实验示例中，待转染生物体系包括作为转染目标的人类乳腺癌细胞MDA-MB-231，以及作为转染物质的绿色荧光DNA质粒。实验结果表明，上述细胞在转染后大部分都成功表达了绿色荧光蛋白，平均转染效率为93％，且上述细胞在转染后仍具有较高的生物活性，平均细胞存活率为91％。
6、与本实施例作为对比，我们采用对比例1进行了对比实验。在对比例1中，所使用的两个超声发生器的中心工作频率均为24MHz，其他参数与实施例1实验一致。所使用的待转染生物体系也与实施例实验一致。对比例实验结果表明，上述细胞在转染后也有一部分成功表达了绿色荧光蛋白，平均转染效率为69％，且上述细胞在转染后仍具有较高的生物活性，平均细胞存活率为92％。
7、因此，实施例表现出比对比例更高的转染效率，同时具有与对比例相当的细胞存活率。这表明实施例比对比例具有更好的转染性能。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (7)
1.一种基因转染方法，其特征在于，包括以下过程：
提供两个分立的超声发生器，各所述超声发生器能分别发出超声波，各所述超声波的中心频率不相同，各所述超声波发生相干叠加形成同时包括高频成分和低频成分的复合波束；
用所述复合波束激励待转染生物体系实现转染；
两个所述超声发生器发射的所述超声波的传播方向正相对，两个所述超声发生器的距离为1cm～2cm，待转染生物体系位于两个所述超声发生器的中间区域；
两个所述超声发生器发射的所述超声波的中心频率分别为20MHz～25MHz，幅值分别为10V～30V，占空比分别为40％～60％，单次持续激励时间分别为3s～8s，波形分别为正弦波。
2.一种实现如权利要求1所述的基因转染方法的基因转染系统，其特征在于，包括转染容器和两个分立的超声发生器；
各所述超声发生器能分别发出超声波，各所述超声波的中心频率不相同，各所述超声发生器的空间分布方式为处于同一水平面内，且各所述超声发生器发射的所述超声波的传播方向共同指向所述转染容器所在区域，各所述超声发生器发射的所述超声波在所述转染容器所在区域内发生相干叠加形成同时包括高频成分和低频成分的复合波束；
所述转染容器用于存储待转染生物体系，所述转染容器与各所述超声发生器相连接，所述复合波束激励所述待转染生物体系实现转染。
3.根据权利要求2所述的基因转染系统，其特征在于，各所述超声发生器环绕所述转染容器设置。
4.根据权利要求3所述的基因转染系统，其特征在于，所述超声发生器包括压电基底和设置于所述压电基底上的叉指换能器，所述压电基底与所述转染容器相连接，所述叉指换能器驱动所述压电基底振动，所述压电基底振动产生所述超声波，所述超声波传导至所述转染容器。
5.根据权利要求2～4中任意一项所述的基因转染系统，其特征在于，还包括主控模块和信号发生模块，所述主控模块用于分别设定各所述超声发生器的参数；所述信号发生模块用于根据所述参数产生各所述超声发生器的激励信号，并将各所述激励信号输出给对应的所述超声发生器；
各所述超声发生器将其对应的所述激励信号进行转换，产生所述超声波。
6.根据权利要求5所述的基因转染系统，其特征在于，所述参数包括所述超声发生器产生的所述超声波的幅值、波形、占空比、单次持续激励时间和中心频率中的一种或两种以上。
7.根据权利要求5所述的基因转染系统，其特征在于，还包括功率放大模块，所述功率放大模块用于放大所述激励信号。
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