CN114716441A - 新冠治疗药物帕罗韦德中的杂质化合物a及其制法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种新冠治疗药物帕罗韦德中的杂质化合物A及其制备方法以及应用。该杂质化合物A可作为标准品使用，对帕罗韦德的药品质量进行控制研究。本发明还提供杂质化合物A的制备方法，该制备方法具有反应路线简短、条件温和、产率和纯度高的优点。
Description
技术领域
本发明涉及药物化学技术领域，具体涉及新冠治疗药物帕罗韦德中的杂质化合物A及其制备方法以及应用。
背景技术
美国辉瑞公司(Pfize)开发的帕罗韦德(Paxlovid)是治疗新冠病毒的特效药，帕罗韦德由奈玛特韦(nirmatrelvir)和利托那韦片(ritonavir)两部分组成，前者抑制一种SARS-CoV-2蛋白以阻止病毒复制，后者减缓奈玛特韦的分解，以帮助其在体内保持较高浓度的时间。奈玛特韦分子式为C23H32F3N5O4，结构式如I所示：
专利US 11124497报道了奈玛特韦的合成路线和方法，如下所示。
为了保证帕罗韦德的药品纯度和质量，关于帕罗韦德及其可用盐的新合成工艺路线仍正在被持续研究中。在按既定工艺进行生产和正常贮藏过程中，不可避免地可能含有或产生需要控制的杂质。申请人在合成帕罗韦德的工艺过程中发现，按照现有路线可产生特定结构的杂质化合物A，该物质有一定的细胞毒性，需要在帕罗韦德的合成过程中进行监测控制，从而进一步保证帕罗韦德的药品纯度和质量。
发明内容
基于此，本发明提供一种新冠治疗药物帕罗韦德中的杂质化合物A及其制备方法。
本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种新冠治疗药物帕罗韦德中的杂质化合物A，其结构式如下式所示：
本发明还提供一种杂质化合物A制备方法，包括如下步骤：有机碱性的条件下，使作为原料1的(1R,2S,5S)-3-((S)-2-氨基-3,3-二甲基丁酰基)-6,6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-羧酸和作为原料2的三氟乙酸酯在醇类溶剂中发生关环缩合反应，制备得化合物A。
发明人团队通过对帕罗韦德的大量合成路线研究探索中发现了杂质化合物A的存在以及化合物A的细胞毒性作用，因此有必要对其进行质量控制。
因此，本发明还提供一种帕罗韦德中的杂质化合物A在帕罗韦德质量控制中的应用，其特征在于，将杂质化合物A作为标准品，使用常规检测方法如TLC、LCMS或NMR等监测帕罗韦德中的杂质化合物A的含量。
本发明的有益效果为：
(1)与现有技术相比，本发明在重复现有帕罗韦德的合成工艺的过程中，首次发现新的杂质化合物A，作为标准品使用，可以对进一步提高现有帕罗韦德的制备过程中的质量控制提供理论基础，有望进一步完善和提高帕罗韦德的质量标准。
(2)本发明还提供杂质化合物A的制备方法，该方法具有路线简短、条件温和、产率较高和纯度高的优点。
附图说明
图1为实施例1重复现有工艺路线制备帕罗韦德的液质联用检测谱图，方框显示为杂质化合物A。
图2为实施例1中保留时间为2.992min的化合物A的正离子质谱图。
图3为实施例3中化合物A的液质联用检测谱图。
图4为实施例3中化合物A的1HNMR检测谱图。
图5为实施例6中化合物A的细胞毒性测试实施结果统计图。
具体实施方式
本发明提供的新冠治疗药物帕罗韦德中的杂质化合物A，其结构式如下式所示：
本发明提供的杂质化合物A的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：使作为原料1的(1R,2S,5S)-3-((S)-2-氨基-3,3-二甲基丁酰基)-6,6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-羧酸和作为原料2的三氟乙酸酯在醇类溶剂中发生关环缩合反应，制备得到化合物A。
本发明对原料的加入顺序没有特别的限定，例如可以在30-50℃优选40℃下，向醇类溶剂中加入原料1、有机碱优选三乙胺、以及作为原料2的三氟乙酸酯，进行所述关环缩合反应；也可以先将原料1溶于醇类溶剂中，再在30-50℃优选40℃条件下，向反应液中加入有机碱优选三乙胺和作为原料2的三氟乙酸酯，进行所述关环缩合反应。在该优选的温度下同时以优选的三乙胺为有机碱进行关环缩合反应，所得产物收率最高。
其中，所述三氟乙酸酯为三氟乙酸甲酯、三氟乙酸乙酯、三氟乙酸叔丁酯、三氟乙酸五氟苯酯、三氟硫代乙酸S-酯等，优选为三氟乙酸乙酯。
所述醇类溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇等，优选为甲醇。
所述有机碱为三乙胺、二异丙基乙二胺、三亚乙基二胺、N,N-二异丙基乙胺等，优选三乙胺。
原料1、有机碱与三氟乙酸酯的摩尔比可以为1：(3-4):(2-3)，优选为1：3.5:2.5。每克原料1，使用8～10mL醇类溶剂。在该优选的用量比内，能保证关环缩合反应更充分的进行，并避免了原料的浪费。
所述关环缩合反应的反应温度为40～50℃，反应时间为14-18小时。LCMS监测反应结束。然后对得到的化合物A粗品进行纯化操作，包括以下工序：在0-5℃优选在0℃条件下调pH为3-4，用乙酸乙酯萃取剂进行萃取形成有机层，利用无水硫酸钠干燥有机层，减压除去溶剂，从而得到白色固体化合物A。
本发明还提供一种帕罗韦德中的杂质化合物A在帕罗韦德质量控制中的应用，其特征在于，将杂质化合物A作为标准品，使用TLC、LCMS或NMR检测方法监测帕罗韦德中的杂质化合物A的含量。
实施例
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
以下各实施例，仅用于说明本发明，但并非用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明反应的进程可采用本领域中的常规监测方法(例如TLC、LCMS或NMR)进行监测，一般以反应底物消失时为反应终点。
下列实施例中，对制备化合物检测鉴定的液相条件为：岛津LCMS2020，G1322A脱气机，G1312二元高压泵，G1329A自动进样器，G1316A柱温箱，G4212B二极管阵列检测器。色谱柱为XbridgeC18(50mm×4.6mm，5.0μm)，以去离子水为流动相A，以含0.1％的三氟乙酸的乙腈为流动相B，按下表进行梯度洗脱：
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0.01 | 95 | 5 |
| 1.50 | 95 | 5 |
| 3.00 | 5 | 95 |
| 3.50 | 95 | 5 |
| 4 | 5 | 95 |
| 5 | 5 | 95 |
流速为1.5mL/min，柱温为40℃，检测波长为220nm。
实施例1
根据专利US 11124497及Science杂志报道的方法【2021,374(6575):1586-1593】合成帕罗韦德时，本发明研究团队检测发现如下情况：
如图1所示，杂质1(出峰时间为2.992min)的含量大于0.1％，超出了帕罗韦德的杂质限量要求。
如图2的正离子质谱所示，结果显示：该杂质1的分子离子峰为251.20，292.2[M+CH3CN]+。综合反应机理和质谱结果，推测该化合物结构极大可能为化合物A。
实施例2
本实施例提供帕罗韦德中的化合物A，其合成路线如下反应式所示：
本实施例中化合物A的具体合成方法，包括如下步骤：
将原料1(1.0g，3.73mmol)和无水乙醇(8mL)加入反应瓶中，搅拌至原料1完全溶解。在30℃下，将三乙胺(1.13g,11.18mmol)和三氟乙酸乙酯(原料2)(1.06g,7.45mmol)缓慢加到原料1中(其中，原料1、三乙胺与三氟乙酸酯的摩尔比为1:3:2)。加毕，将反应体系温度升至40℃，搅拌反应14h。在5℃下用盐酸中和反应液pH到pH为4，采用乙酸乙酯(50mL*3次)萃取得到有机层，旋转蒸发除溶剂(旋干)，得到化合物A。
采用本实施例的方法制备得到化合物A白色固体0.7g，收率为51.6％。
对本实施例制得的化合物A进行鉴定，结果如下：
ESI-MS(m/z):251.20，292.2；出峰时间：3.001min.
1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.07(s,1H),4.03(s,1H),3.75(s,1H),3.63(dd,J＝12.2,6.3Hz,1H),3.11(d,J＝12.2Hz,1H),1.96(d,J＝8.0Hz,1H),1.56–1.46(m,1H),1.08(d,J＝4.0Hz,12H),0.98(s,3H).
实施例3
本实施例提供帕罗韦德中的化合物A，其合成路线如下反应式所示：
本实施例中化合物A的具体合成方法，包括如下步骤：
将原料1(1.0g，3.73mmol)和无水甲醇(10mL)加入反应瓶中，搅拌至原料1完全溶解。在50℃下，将三乙胺(1.36g,13.42mmol)和三氟乙酸乙酯(原料2)(1.32g,9.32mmol)缓慢加到原料1中(其中，原料1、三乙胺与三氟乙酸酯的摩尔比为1:3.6:2.5)。加毕，维持反应体系温度50℃，搅拌反应16h。在0℃下用盐酸中和反应液pH到pH为3，采用乙酸乙酯(50mL*3次)萃取得到有机层，旋转蒸发除溶剂(旋干)，得到化合物A。
采用本实施例的方法制备得到化合物A白色固体0.84g，收率为61.87％，纯度为99.599％。
对本实施例制得的化合物A进行鉴定，结果如下：
ESI-MS(m/z):251.20，292.2；出峰时间：3.003min.
1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.06(s,1H),4.03(s,1H),3.75(s,1H),3.63(dd,J＝12.2,6.3Hz,1H),3.10(d,J＝12.2Hz,1H),1.96(d,J＝8.0Hz,1H),1.56–1.46(m,1H),1.08(d,J＝4.0Hz,12H),0.97(s,3H).
实施例4
本实施例提供帕罗韦德中的化合物A，其合成路线如下反应式所示：
本实施例中化合物A的具体合成方法，包括如下步骤：
将原料1(1.0g，3.73mmol)和无水乙醇(10mL)加入反应瓶中，搅拌至原料1完全溶解。在40℃下，将N,N-二异丙基乙胺(DIPEA,1.93g,14.91mmol)和三氟乙酸甲酯(1.43g,11.18mmol)缓慢加到原料1中(其中，原料1、N,N-二异丙基乙胺与三氟乙酸酯的摩尔比为1:4:3)。加毕，将反应体系温度升至50℃，搅拌反应18h。在0℃下用盐酸中和反应液pH到pH为3，采用乙酸乙酯(50mL*3次)萃取得到有机层，旋转蒸发除溶剂(旋干)，得到化合物A。
采用本实施例的方法制备得到化合物A白色固体0.68g，收率为50.08％。
对本实施例制得的化合物A进行鉴定，结果如下：
ESI-MS(m/z):251.20，292.2；出峰时间：3.003min.
1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.08(s,1H),4.03(s,1H),3.75(s,1H),3.63(dd,J＝12.2,6.3Hz,1H),3.11(d,J＝12.2Hz,1H),1.97(d,J＝8.0Hz,1H),1.56–1.46(m,1H),1.08(d,J＝4.0Hz,12H),0.98(s,3H).
实施例5
采用与实施例4相同的方法制备帕罗韦德中的化合物A，唯一不同的是，使用14.91mmol的三乙胺代替14.91mmol的N,N-二异丙基乙胺。
其结果，采用本实施例的方法制备得到化合物A白色固体0.9g，收率为66.34％。
从实施例5与实施例4的对比可以看出，在实施例5中，在优选的40℃下混合原料且以优选的三乙胺为有机碱进行关环缩合反应时，所得产物收率比实施例4高。而且在实施例1-5中，实施例5的收率也最高。
实施例6毒性试验
采用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)进行细胞毒性研究，结果如图5所示。表明：化合物A对HUVEC有一定细胞毒性作用，其IC50为24μM。而帕罗韦德没有显示出明显细胞毒性(IC50＞100μM)。同时采用帕罗韦德+10μM化合物A，导致帕罗韦德的细胞毒性提升。
以上研究结果表明：帕罗韦德中化合物A的存在对人体有潜在毒副作用，需要去除该杂质。
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种新冠治疗药物帕罗韦德中的杂质化合物A，其结构式如下式所示：
2.权利要求1所述的杂质化合物A的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
有机碱的条件下，使作为原料1的(1R,2S,5S)-3-((S)-2-氨基-3,3-二甲基丁酰基)-6,6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-羧酸和作为原料2的三氟乙酸酯在醇类溶剂中发生关环缩合反应，制备得到化合物A。
3.根据权利要求2所述的杂质化合物A的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
在30-50℃下，向醇类溶剂中加入原料1、有机碱、以及作为原料2的三氟乙酸酯，进行所述关环缩合反应。
4.根据权利要求2所述的杂质化合物A的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将原料1溶于醇类溶剂中，在30-50℃的条件下，向反应液中加入有机碱和作为原料2的三氟乙酸酯，进行所述关环缩合反应。
5.根据权利要求2-4中任意一项所述的杂质化合物A的制备方法，其特征在于，所述三氟乙酸酯为三氟乙酸甲酯、三氟乙酸乙酯、三氟乙酸叔丁酯、三氟乙酸五氟苯酯、三氟硫代乙酸S-酯，优选三氟乙酸乙酯；
所述醇类溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇，优选甲醇；
所述有机碱为三乙胺、二异丙基乙二胺、三亚乙基二胺、N,N-二异丙基乙胺，优选三乙胺。
6.根据权利要求3或4所述的杂质化合物A的制备方法，其特征在于，原料1、有机碱与三氟乙酸酯的摩尔比为1：(3-4):(2-3)。
7.根据权利要求2-4中任意一项所述的杂质化合物A的制备方法，其特征在于，每克原料1，使用8～10mL醇类溶剂。
8.根据权利要求2-4中任意一项所述的杂质化合物A的制备方法，其特征在于，所述关环缩合反应的反应温度为40-50℃；反应时间为14-18小时。
9.根据权利要求2-4中任意一项所述的杂质化合物A的制备方法，其特征在于，在所述关环缩合反应完成后，还包括以下纯化工序：向关环缩合反应产物液中加盐酸调节体系pH为3-4、优选在0-5℃下调节pH为3-4；用乙酸乙酯进行萃取得到有机层；用无水硫酸钠干燥有机层；减压除去溶剂。
10.一种帕罗韦德中的杂质化合物A在帕罗韦德质量控制中的应用，其特征在于，将杂质化合物A作为标准品，使用TLC、LCMS或NMR检测方法监测帕罗韦德中的杂质化合物A的含量。
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