CN114698600A - 一种高效净化处理虾类育苗期用卤虫的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效净化处理虾类育苗期用卤虫的方法，属于生物饵料净化处理领域。该方法包括以下步骤：(1)将卤虫卵进行预处理后，孵化出幼体；(2)分离收集无节幼体，在投喂育苗期虾类之前，用质量浓度为0.5～1.5ppm强氯精浸泡消毒所述无节幼体15～30min，之后冲洗即可分料投喂所述虾类。本发明能显著去除生物饵料中可能携带的弧菌等病原，有效降低虾类苗种繁育过程中疾病暴发的风险。
Description
技术领域
本发明涉及生物饵料净化处理领域，特别是涉及一种高效净化处理虾类育苗期用卤虫的方法。
背景技术
卤虫也称丰年虾或丰年虫，是一种典型的无选择性滤食小型甲壳类动物，广泛分布于沿海日晒盐场和内陆盐湖等高盐水体中。卤虫具有营养价值高、休眠卵易保存、孵化操作简单等优点，被广泛用于水产育苗尤其是虾类育苗，是虾类繁育的重要生物饵料。我国是水产养殖大国，我国对卤虫卵需求量居于世界首位，占全球总需求量的50％左右。目前市场上流通的卤虫卵大部分来自中国、美国、俄罗斯、中亚国家的内陆盐湖，少部分来源于沿海日晒盐场和人工养殖区域。
生物饵料的安全状况直接关系到虾苗的健康和质量。研究已证明卤虫可被副溶血弧菌、坎贝氏弧菌和哈维氏弧菌等水产养殖致病性弧菌感染，存在传播急性肝胰腺坏死病的风险。因此，需要通过规范卤虫卵孵化操作，降低卤虫传播相关病原的风险。
现阶段大部分虾类育苗企业仅对卤虫卵进行消毒处理，孵化至无节幼体(大约24-30h)后直接作为饵料进行投喂，根据前期开展的卤虫孵化系统微生物多样性结果显示，孵化时微生物富集，特别是弧菌丰度很高，易增加虾类苗种繁育过程中疾病暴发的风险。急需增加无节幼体的净化方式，对该风险点进行把控，为正确使用卤虫等生物饵料提供技术支持，为水产养殖绿色发展和生物安保体系建设提供参考。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效净化处理虾类育苗期用卤虫的方法，以解决上述现有技术存在的问题，能去除生物饵料中可能携带的弧菌等病原，有效降低虾类苗种繁育过程中疾病暴发的风险。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种高效净化处理虾类育苗期用卤虫的方法，包括以下步骤：
(1)将卤虫卵进行预处理后，孵化出幼体；
(2)分离收集无节幼体，在投喂育苗期虾类之前，用质量浓度为0.5～1.5ppm强氯精浸泡消毒所述无节幼体15～30min，之后冲洗即可分料投喂所述虾类。
优选的是，步骤(1)中，所述预处理包括以下步骤：
S1：将冷冻的卤虫卵常温放置2～3d，让休眠卵苏醒；
S2：用水反复淘洗，然后消毒；
S3：消毒后的卤虫卵按照每升水3～4g的比例进行孵化。
优选的是，步骤S2中，用质量浓度200mg/kg的福尔马林溶液浸泡消毒30min。
优选的是，步骤S2中，用质量浓度为300mg/kg的次氯酸钠溶液浸泡30min，浸泡后用大苏打中和余氯。
优选的是，步骤S3中，孵化时，水温为27～30℃，盐度为2～3，并进行剧烈通气，经18～24h孵化出幼体。
优选的是，步骤(2)中，分离无节幼体时，先停气静止10～15min，利用收集网分离收集所述无节幼体。
优选的是，所述收集网孔径为150～200目。
本发明还提供一种所述的方法在虾类育种中的应用。
优选的是，应用于降低虾类育种过程中病原菌含量。
本发明公开了以下技术效果：
本发明通过探究罗氏沼虾育苗期生物饵料净化技术，发现经过冻存的卤虫卵孵化，分离出无节幼体后，改变现有的直接投喂的方式，而是将无节幼体投喂前，先用强氯精浸泡消毒后再进行投喂，可以显著降低在罗氏沼虾苗期育种过程中的弧菌等病原菌的含量；实际投产中发现，经过投喂本发明净化处理的无节幼体可以显著降低了罗氏沼虾发病的几率，在虾类的养殖发展方面具有实际应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为对比例1和实施例2的样品在属水平相对丰度柱形累加图；
图2为对比例1和实施例2的样品物种多样性曲线；
图3为对比例1和实施例2进行弧菌培养的对比结果。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
一种高效净化处理虾类育苗期用卤虫的方法，包括如下步骤：
(1)将冷冻的卤虫卵取出，在常温下放置2d，让休眠卵苏醒。
(2)装入120目尼龙筛绢网内，用水反复淘洗。
(3)移入质量浓度为200mg/kg的福尔马林溶液内浸泡消毒30min(或者用质量浓度为300mg/kg次氯酸钠溶液浸泡30min(有效氯含量为10％)，浸泡后要用大苏打中和余氯)。
(4)将消毒后的卵按每升水3g的比例放入孵化糟(池)内孵化，保持水温27℃，盐度为2，并进行剧烈通气，经18h孵化出幼体。
(5)无节幼体分离：首先停气静止10min，利用150目的卤虫收集网(直径28cm)直接从集幼管道收集无节幼体。
(6)无节幼体消毒：投喂前，用质量浓度为0.5ppm强氯精浸泡消毒15min。
(7)用120目尼龙筛绢网无节幼体，吸入筛绢的卤虫无节幼体用淡水冲洗数次后即可以分料投喂了。
实施例2
一种高效净化处理虾类育苗期用卤虫的方法，包括如下步骤：
(1)将冷冻的卤虫卵取出，在常温下放置3d，让休眠卵苏醒。
(2)装入120目尼龙筛绢网内，用水反复淘洗。
(3)移入质量浓度为200mg/kg的福尔马林溶液内浸泡消毒30min(或者用质量浓度为300mg/kg次氯酸钠溶液浸泡30min(有效氯含量为10％)，浸泡后要用大苏打中和余氯)。
(4)将消毒后的卵按每升水3.5g的比例放入孵化糟(池)内孵化，保持水温28℃，盐度为3，并进行剧烈通气，经20h孵化出幼体。
(5)无节幼体分离：首先停气静止10min，利用150目的卤虫收集网(直径28cm)直接从集幼管道收集无节幼体。
(6)无节幼体消毒：投喂前，用质量浓度为1.5ppm强氯精浸泡消毒25min。
(7)用120目尼龙筛绢网无节幼体，吸入筛绢的卤虫无节幼体用淡水冲洗数次后即可以分料投喂了。
实施例3
一种高效净化处理虾类育苗期用卤虫的方法，包括如下步骤：
(1)将冷冻的卤虫卵取出，在常温下放置3d，让休眠卵苏醒。
(2)装入120目尼龙筛绢网内，用水反复淘洗。
(3)移入质量浓度为200mg/kg的福尔马林溶液内浸泡消毒30min(或者用质量浓度为300mg/kg次氯酸钠溶液浸泡30min(有效氯含量为10％)，浸泡后要用大苏打中和余氯)。
(4)将消毒后的卵按每升水4g的比例放入孵化糟(池)内孵化，保持水温30℃，盐度为3，并进行剧烈通气，经24h孵化出幼体。
(5)无节幼体分离：首先停气静止10min，利用150目的卤虫收集网(直径28cm)直接从集幼管道收集无节幼体。
(6)无节幼体消毒：投喂前，用质量浓度为0.8ppm强氯精浸泡消毒30min。
(7)用120目尼龙筛绢网无节幼体，吸入筛绢的卤虫无节幼体用淡水冲洗数次后即可以分料投喂了。
对比例1
与实施例2的区别在于：投喂前，卤虫无节幼体不进行消毒处理。
对比例2
与实施例2的区别在于：投喂前，用质量浓度为0.25ppm强氯精浸泡消毒30min。
对比例3
与实施例2的区别在于：投喂前，用质量浓度为2.0ppm强氯精浸泡消毒30min。
对比例4
与实施例2的区别在于：投喂前，用质量浓度为2.0ppm强氯精浸泡消毒10min。
对比例5
与实施例2的区别在于：投喂前，用质量浓度为2.0ppm强氯精浸泡消毒40min。
实验效果验证：采集上述实施例2和对比例1-5的卤虫样本进行弧菌培养和宏基因组测序，比较分析微生物差异，判断杀菌效果，特别是针对弧菌的杀菌效果。
1、弧菌培养
取试验组和对照组卤虫样本各3份(20个卤虫样本为1份)，加入200μL无菌水，用手持式研磨棒研磨使其均匀。每个样品的体积调整为加水后1mL，划线法于硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆汁-蔗糖(TCBS)琼脂培养，30℃培养24h。结果显示：对比例1-5存在大量弧菌，实施例2菌落极少，见图3。
2、宏基因组测序：
2.1测序部分
2.1.1基因组DNA的提取和PCR扩增
采用CTAB方法对样本的基因组DNA进行提取(根据上述弧菌培养结果仅对实施例2和对比例1的样品DNA进行提取)，之后利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度，取适量的样本DNA于离心管中，使用无菌水稀释样本至1ng/μL。
以稀释后的基因组DNA为模板，根据测序区域的选择，使用带Barcode的特异引物，New England Biolabs公司的
High-Fidelity PCR Master Mix with GCBuffer和高效高保真酶进行PCR，确保扩增效率和准确性。
其中，引物对应区域：
16S V4区引物(515F和806R)：鉴定细菌多样性；
515F：5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’；
806R：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’。
18S V4区引物(528F和706R)：鉴定真核微生物多样性；
528F：5’-GCGGTAATTCCAGCTCCAA-3’；
706R：5’-AATCCRAGAATTTCACCTCT-3’。
ITS1区引物(ITS5-1737F和ITS2-2043R)：鉴定真菌多样性；
ITS5-1737F：5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’；
ITS2-2043R：5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’。
扩增反应体系：15μL
High-Fidelity PCR Master Mix(New EnglandBiolabs)；0.2μM引物；10ng DNA模板。
反应程序：预变性98℃1min；变性98℃10s，退火50℃30s，延伸72℃30s，变性-退火-延伸30个循环；充分延伸72℃5min。
2.1.2 PCR产物的混样和纯化
PCR产物使用2％浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测；对检测合格的PCR产物进行磁珠纯化，采用酶标定量，根据PCR产物浓度进行等量混样，充分混匀后使用2％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，对目的条带使用qiagen公司提供的胶回收试剂盒回收产物。
2.1.3文库构建和上机测序
使用
DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库构建，构建好的文库经过Qubit和Q-PCR定量，文库合格后，使用NovaSeq6000进行上机测序。
3、信息分析部分
3.1测序数据处理
根据Barcode序列和PCR扩增引物序列从下机数据中拆分出各样本数据，截去Barcode和引物序列后使用FLASH对每个样本的reads进行拼接，得到的拼接序列为原始Tags数据(Raw Tags)；拼接得到的Raw Tags，需要经过严格的过滤处理得到高质量的Tags数据(Clean Tags)。参照Qiime的Tags质量控制流程，进行如下操作：
a)Tags截取：将Raw Tags从连续低质量值(默认质量阈值为<＝19)碱基数达到设定长度(默认长度值为3)的第一个低质量碱基位点截断；
b)Tags长度过滤：Tags经过截取后得到的Tags数据集，进一步过滤掉其中连续高质量碱基长度小于Tags长度75％的Tags。
经过以上处理后得到的Tags需要进行去除嵌合体序列的处理，Tags序列通过(https://github.com/torognes/vsearch/)与物种注释数据库进行比对检测嵌合体序列，并最终去除其中的嵌合体序列，得到最终的有效数据(Effective Tags)。
3.2物种相对丰度展示
根据物种注释结果，选取每个样本或分组在属水平(Genus)上最大丰度排名前10的物种，生成物种相对丰度柱形累加图(图1)，以便直观查看各样本在属分类水平上，相对丰度较高的物种及其比例。结果显示，试验组较对照组弧菌丰度降低10％。
3.3 Alpha Diversity指数
对不同样本在97％一致性阈值下的Alpha Diversity分析指数(shannon、simpson、chao1、ACE)进行统计，Observed_species：直观观测到的物种数目(也即是OTUs数目)。Shannon：样品中的分类总数及其占比。群落多样性越高，物种分布越均匀，Shannon指数越大。Simpson：表征群落内物种分布的多样性和均匀度。Chao1：估计群落样品中包含的物种总数。ACE：估计群落中OTU数目。如表1(均一化时选取的数据量：cutoff＝63301)，结果显示：实施例1较对比例1的样品中微生物总数和多样性显著减少。
表1对照组和试验组Alpha Diversity指数统计
3.4物种多样性曲线
稀释曲线(Rarefaction Curve)是从样本中随机抽取一定测序量的数据，统计它们所代表物种数目(即OTUs数目)，以抽取的测序数据量与对应的物种数来构建曲线。稀释曲线可直接反映测序数据量的合理性，并间接反映样本中物种的丰富程度，当曲线趋向平坦时，说明测序数据量渐进合理，更多的数据量只会产生少量新的物种(OTUs)。如图2所示，结果显示：实施例2较对比例1微生物多样性显著减少。
综上所述，采用强氯精对卤虫无节幼体进行迅速的消毒杀菌处理，强氧化物质具有很强的细胞穿透力，可以快速高效杀灭生物饵料携带的病原微生物，作用快，效果显著，对生物饵料无营养破坏，使生物饵料的质量提高到了一个新的水平。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (9)
1.一种高效净化处理虾类育苗期用卤虫的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将卤虫卵进行预处理后，孵化出幼体；
(2)分离收集无节幼体，在投喂育苗期虾类之前，用质量浓度为0.5～1.5ppm强氯精浸泡消毒所述无节幼体15～30min，之后冲洗即可分料投喂所述虾类。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述预处理包括以下步骤：
S1：将冷冻的卤虫卵常温放置2～3d，让休眠卵苏醒；
S2：用水反复淘洗，然后消毒；
S3：消毒后的卤虫卵按照每升水3～4g的比例进行孵化。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S2中，用质量浓度200mg/kg的福尔马林溶液浸泡消毒30min。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S2中，用质量浓度为300mg/kg的次氯酸钠溶液浸泡30min，浸泡后用大苏打中和余氯。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S3中，孵化时，水温为27～30℃，盐度为2～3，并进行剧烈通气，经18～24h孵化出幼体。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，分离无节幼体时，先停气静止10～15min，利用收集网分离收集所述无节幼体。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述收集网孔径为150～200目。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法在虾类育种中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，应用于降低虾类育种过程中病原菌含量。
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