CN114689552B

CN114689552B - 一种小分子荧光传感器及其应用

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Publication number: CN114689552B
Application number: CN202011604223.0A
Authority: CN
Inventors: 王猛; 王瑾
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2020-12-30
Filing date: 2020-12-30
Publication date: 2024-11-26
Anticipated expiration: 2040-12-30
Also published as: CN114689552A

Abstract

本发明通过利用腺苷结构域和酰基中间载体结构域(PCP)的三维结构与催化机理，开发了具有很强通用性的有机小分子生物荧光传感器的构建方法，并获得一系列小分子荧光传感器，实现含有羧基的有机小分子化合物的快速检测。本发明涉及的小分子荧光传感器的构建方法简便、通用性强。用于检测小分子时具有检测周期短、灵敏度高、特异性强、成本低、应用范围广、易于实现高通量检测等优点。

Description

一种小分子荧光传感器及其应用

技术领域

本发明涉及一种生物传感器，具体涉及一种小分子荧光传感器及其在检测小分子化合物中的应用。

背景技术

小分子是指分子量小于900道尔顿的有机化合物，大小约为1nm。小分子化合物在生物学、化学、医学等领域具有多重功能或应用，在生物学方面可作为细胞信号分子、初级代谢产物、次级代谢产物、代谢过程中的中间体等；在化学方面可作为药物，化工原料等；在医学方面可以作为疾病诊断的关键指标，具有很高的应用价值。目前小分子化合物的常规检测方法包括物理化学分析和免疫分析。物理化学分析方法包括气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)、薄层色谱(TLC)、毛细管区带电泳(CZE)、质谱(MS)、串联质谱(MS/MS)等。免疫分析方法包括放射免疫法(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、荧光免疫分析法(FIA)等。物理化学分析方法可以进行准确的定性和定量分析，但操作步骤复杂，检测周期长，仪器价格昂贵而且不能实现实时快速检测。免疫分析方法具有快速、特异的优点，但敏感性不够高，信息量很低。

除物理化学分析方法外，利用生物传感器对小分子化合物进行检测也是一种行之有效的方法。其中，基因编码的小分子生物传感器大致可分为三种类型，第一类是转录因子生物传感器，第二类是核糖体开关生物传感器，第三类是基于荧光共振能量转移的生物传感器。

转录因子是一种在转录水平上控制细胞代谢物水平的蛋白。有些转录因子已经进化出根据代谢物浓度或环境变化来调节基因表达的功能。相关研究人员根据转录因子可感应代谢物浓度的特点来设计转录因子生物传感器。目前转录因子生物传感器已应用在检测维生素、氨基酸、糖类等物质中，成为了代谢工程中应用最广泛的高通量筛选工具。然而还有大量的应用价值较高的小分子没有找到其合适的转录因子以用于生物传感器的构建。关于转录因子生物传感器的构建和应用还存在一些关键的问题，例如：转录因子生物传感器必须以细胞为载体，很难体外应用；将转录因子应用于异源宿主中并产生功能性转录因子生物传感器是比较困难的，而且转录因子传感器无法检测胞外代谢产物。

核糖体开关是mRNA分子的调节区，具有保守的配体结合结构域和可调节下游基因翻译的可变序列。与转录因子传感器相比，核糖体开关传感器可提供更快的响应速度，因为RNA已经被转录，因此可以立即与效应器结合并执行其调节功能。核糖体开关传感器已被开发用于检测嘌呤及其衍生物、辅酶及相关化合物、氨基酸、抗生素等物质。虽然核糖体开关传感器的功能强大，但是许多保守的mRNA元件的天然配体还未被发现，而且关于核糖开关的结构与其相应代谢物相互作用的关系尚不明确，且核糖体开关传感器也很难用于体外快速检测，所以核糖体开关传感器的发展受到了限制。

可基因编码的荧光共振能量转移(FRET)生物传感器通常有一对供体和受体荧光团。传感器的配体结合域插入到两个荧光团之间。当传感器与目标配体结合时，配体结合域的构象发生变化，改变了供体和受体荧光团的距离，导致荧光共振能量转移信号发生变化。基于荧光共振能量转移的生物传感器已被用于在细胞体内监测各种小分子，如糖磷酸盐、丙酮酸、辅因子、氨基酸等。荧光共振能量转移生物传感器在细胞体内应用广泛，但通常此类型的生物传感器动态变化范围不高，需要耗费大量时间精力来对其进行优化。基于上述原因，荧光共振能量转移生物传感器通常适用于监测细胞内部的代谢过程及成像，不适用于小分子化合物的高通量筛选。

基因编码的不同类型的小分子生物传感器可以监测和筛选工程细胞中目标小分子产物，与物理化学分析方法相比，可以做到对不同类型细胞的体内或者体外的实时快速检测。但每种类型的小分子生物传感器都有其各自的优缺点，每种传感器中所利用的配体结合域也各不相同，缺乏共性。目前还没有一种小分子生物传感器构建方法可以做到系统性的快速构建一系列针对不同小分子化合物的传感器。因此，亟需开发一种简单快速、低成本、高灵敏度、高通量且能实时检测小分子化合物的方法。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，以及实现需求，提供一种小分子荧光生物传感器及其构建方法和应用。

通过以下技术方案实现的：本发明涉及一种小分子荧光生物传感器构建方法，首先选择结合特定小分子的感应蛋白基因，然后将其克隆到底盘细菌(如大肠杆菌)的表达质粒中，在确定荧光蛋白插入位点后，将带有随机连接肽的荧光蛋白DNA序列克隆到表达质粒中，并将表达质粒转化至底盘细菌(如大肠杆菌)中进行诱导表达，随后利用特定小分子对克隆的小分子荧光生物传感器突变库进行筛选，最终筛选得到小分子荧光生物传感器，并对其进行表征及后续应用。

本发明由此提供一种有机小分子荧光传感器的融合基因，其特征在于，将带有随机连接肽的荧光蛋白DNA序列插入到所述结合特定小分子的感应蛋白基因的N端大亚基与C端小亚基相连的铰链处，或者C端小亚基与酰基中间载体结构域(PCP)相连的连接肽处，或者在C端小亚基后插入荧光蛋白而形成。

在具体实施方式中，所述结合特定小分子的感应蛋白基因是所述芳香基和酰基-CoA合成酶的DNA序列、非核糖体肽合成酶的腺苷结构域和酰基中间载体结构域的DNA序列，或羧酸还原酶的腺苷结构域和酰基中间载体结构域的DNA序列.

所述的带有随机连接肽的荧光蛋白是循环排列荧光蛋白的N末端和C末端分别带有随机长度的连接肽。优选地，所述连接肽的长度为20个氨基酸以内，优选在15个氨基酸以内，更优选在10个氨基酸以内，进一步优选为5个氨基酸以内，例如1至4个氨基酸，最优选为2氨基酸；所述荧光蛋白是绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白，更具体的是，其荧光蛋白的DNA编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，优选地其核苷酸序列如SEQ IDNO.12所示。

在一个更具体的实施方式中，所述芳香基和酰基-CoA合成酶的DNA序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示、非核糖体肽合成酶的腺苷结构域和酰基中间载体结构域的DNA序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7所示，或羧酸还原酶的腺苷结构域和酰基中间载体结构域的DNA序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，优选地，所述芳香基和酰基-CoA合成酶的DNA序列如SEQ ID NO.2所示、非核糖体肽合成酶的腺苷结构域和酰基中间载体结构域的DNA序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6或SEQ IDNO.8所示，或羧酸还原酶的腺苷结构域和酰基中间载体结构域的DNA序列如SEQ ID NO.10所示。

在具体实施方式中，荧光蛋白有三种插入方式，第一种是在感应蛋白的N端大亚基与C端小亚基相连的铰链处插入荧光蛋白，第二种是当有酰基中间载体结构域时，在C端小亚基与酰基中间载体结构域相连的连接肽处插入荧光蛋白，第三种是当无(或移除)酰基中间载体结构域时，在感应蛋白的C端小亚基后插入荧光蛋白。其中，C端小亚基指的是芳香基和酰基-CoA合成酶、非核糖体肽合成酶和羧酸还原酶的腺苷结构域末端大概80-120个氨基酸左右组成的亚基。优选地，所述带有随机连接肽的荧光蛋白DNA序列插入到所述结合特定小分子的感应蛋白基因上的位点是在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第438位亮氨酸与439位异亮氨酸之间、SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的第532位丝氨酸与第533位丝氨酸之间、SEQ ID NO.5所示氨基酸序列的第524位脯氨酸与525位谷氨酸之间、SEQ ID NO.5所示氨基酸序列的第524位脯氨酸与组氨酸标签之间、SEQ ID NO.7所示氨基酸序列的第528位脯氨酸与第529位天门冬酰胺之间、或SEQ ID NO.9所示氨基酸序列的第651位丙氨酸与652位谷氨酸之间。

进一步优选地，所述融合基因还包括纯化标签编码序列，例如组氨基酸标签编码序列。

本发明还提供所述的融合基因的表达质粒，优选的是适合于底盘细胞诱导表达的表达质粒，更优选地是表达质粒的出发载体是pET表达系统如pET28a、pET24a、pET17b等，或pBAD表达系统如pBAD/His、pBAD/gIII等。其中诱导表达是指底盘细菌(如大肠杆菌)在培养基中于最适生长条件下培养生长到一定浓度时，加入相应地诱导剂如异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、葡萄糖、甘油、阿拉伯糖等诱导剂，诱导剂的终浓度为0.1-0.4mM，在16℃-20℃进行低温诱导表达蛋白。通过低温表达有利于蛋白质的正确折叠，也有利于循环排列荧光蛋白的成熟，因此是优选操作方式。

进而，本发明提供含有所述的表达质粒的宿主细胞，优选为细菌，更优选为大肠杆菌。

本发明进一步提供一种有机小分子荧光传感器，其特征在于，其是所述的融合基因编码的融合蛋白。

本发明还提供一种检测有机小分子化合物的方法，其特征在于，将所述的有机小分子荧光传感器溶于缓冲溶液中，加入ATP、MgCl₂以及待测的有机小分子化合物构成反应体系，随后测定荧光强度；优选地，所述缓冲液是Tris，更具体的是100mM Tris，pH7.5；优选地，所述反应体系中各物质终浓度分别为ATP 0.5-2mM，MgCl₂ 1.0-3.0mM，有机小分子化合物0.05μM-5mM，所述有机小分子荧光传感器0.5-4μM。

所述有机小分子化合物是含有羧基的有机小分子，例如苯丙氨酸、酪氨酸、脯氨酸、异亮氨酸等天然氨基酸，(2S，3S)-MeAsp、6-chloro-L-Trp等氨基酸衍生物，以及苯甲酸、香豆酸、肉桂酸等有机酸。

优选地，所述有机小分子荧光传感器通过基因重组表达的方式获得。

在具体实施方式中，所述方法还包括所述有机小分子荧光传感器与待测有机小分子浓度之间的标准曲线的制作环节。更具体地，以待测有机小分子的浓度为横坐标，以所述有机小分子荧光生物传感器的荧光强度为纵坐标，进行曲线绘制，得到特定小分子与传感器荧光强度的关系图。

本发明的优点和有益效果为：本发明通过利用腺苷结构域和酰基中间载体结构域的三维结构与催化机理，开发了具有很强通用性的小分子生物荧光传感器的构建方法，并获得一系列小分子荧光传感器，实现氨基酸、有机酸等小分子化合物的快速检测；本发明开发的小分子荧光传感器一方面构建方法简便，另一方面在用于检测小分子时检测周期短、灵敏度高、特异性强，无需对样本进行特殊处理，且无需昂贵复杂的仪器设备，因此具有成本低、应用范围广、易于实现高通量检测等优点。

附图说明

图1为ANL与CAR催化的两步反应示意图；

图2为ANL中NRPSs腺苷功能域循环模式示意图；

图3为本发明小分子荧光生物传感器原理示意图；

图4为本发明技术路线图；

图5为利用本发明所涉及的方法筛选到的4-香豆酸荧光生物传感器底物浓度与传感器荧光信号强度关系图；

图6为利用本发明所涉及的方法筛选到的L-组氨酸荧光生物传感器底物浓度与传感器荧光信号强度关系图；

图7为利用本发明所涉及的方法筛选到的L-苯丙氨酸荧光生物传感器3-2C2底物浓度与传感器荧光信号强度关系图；

图8为利用本发明所涉及的方法筛选到的L-苯丙氨酸荧光生物传感器3-2E6底物浓度与传感器荧光信号强度关系图；

图9为利用本发明所涉及的方法筛选到的L-脯氨酸荧光生物传感器底物浓度与传感器荧光信号强度关系图；

图10为利用本发明所涉及的方法筛选到的苯甲酸荧光生物传感器底物浓度与传感器荧光信号强度关系图；

具体实施方式

本发明构建的有机小分子荧光生物传感器，是本发明人充分分析梳理相关已知知识，结合研究探索最终实现的。其中发明人技术原理描述如下，虽然其中有些知识为已知的知识，但其中如何利用并非现有技术。连接酶家族中的ANL腺苷形成酶家族(ANLAdenylating Enzymes)由芳香基和酰基-CoA合成酶，非核糖体肽合成酶(NRPSs)的腺苷结构域(A domain)，以及萤火虫荧光素酶组成。ANL超家族以及与NRPSs相关的羧酸还原酶(Carboxylic acid reductase，CAR)的腺苷结构域(A domain)具有相似的三维结构以及相似的催化反应步骤。ANL超家族与羧酸还原酶的一级序列同源性约为20％，但是它们具有极为相似的三维结构，都是由N末端大亚基通过5-10个氨基酸的铰链与C端小亚基相连，其中绝大部分的NRPSs与CAR的腺苷结构域后还会有一个保守的酰基中间载体结构域(Peptidyl-Carrier Pritein，PCP)。基于这种相似的三维结构，ANL腺苷形成酶家族与羧酸还原酶共享了一种非常相似的催化机制，均通过两步催化反应完成底物的活化和后续反应(图1)。首先是腺苷形成反应，羧基与ATP在酶催化下形成酰基-腺苷酸，并释放出无机焦磷酸，腺苷是高能量的酸酐，这为第二步反应提供了活化能。第二步是硫酯形成反应，对于乙酰-CoA合成酶、NRPSs以及CAR的腺苷功能结构域，CoA或酰基中间载体结构域上的泛酰巯基乙胺通过硫醇进攻羧基碳，取代AMP，而在荧光素酶中，则是通过中间产物的氧化脱羧来完成的。

研究表明，ANL以及CAR蛋白在催化的不同阶段，通过蛋白构象的变化对底物活性位点进行重新配置。研究也揭示了ANL家族可能的催化循环过程，循环过程以腺苷结构域的开放构象开始，底物和ATP在蛋白的底物结合位点结合，N端大亚基与C端小亚基彼此远离，底物进入结合口袋之后，ATP水解伴随氨酰基-AMP的形成，导致蛋白处于一个闭合的构象。随后，闭合状态中C端小亚基上的活性位点接近中间体，活化的底物被转移到酰基中间载体结构域(或CoA)上，完成第二步硫酯形成步骤。随着酰基中间载体结构域或产物的离开，腺苷功能域完成催化反应并回到开放构象，在此过程中C端小亚基发生了大约140°的位移(图2)。

在上述分析的基础上，本发明利用ANL以及CAR蛋白在催化的不同阶段有不同的蛋白构象，即C端小亚基发生的位移变化，将对构象变化敏感的荧光蛋白插入到N端大亚基与C端小亚基相连的铰链处，或者插入到C端小亚基与酰基中间载体结构域相连的连接肽处，或者插入到C端小亚基后，来产生特异性的小分子荧光生物传感器，传感器中荧光蛋白的荧光强度会随底物浓度的变化而变化(图3)。在一个具体实施方式中，如图4所示，本发明的一种小分子荧光生物传感器构建方法，首先选择结合特定小分子的感应蛋白基因，然后将其克隆到大肠杆菌表达质粒中，在确定荧光蛋白插入位点后，将带有随机连接肽的荧光蛋白DNA序列克隆到感应蛋白所在的表达质粒中，并将表达质粒转化至大肠杆菌中形成小分子荧光生物传感器突变库，并进行诱导表达，随后利用特定小分子对克隆的小分子荧光生物传感器突变库进行筛选，最终对筛选得到的小分子荧光生物传感器进行表征及后续应用。

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。

实施例1感应蛋白序列的确定与表达载体的构建

步骤1：查阅文献找到结合4-香豆酸的芳香基和酰基-CoA合成酶Nicotianatabacum4CL isoform 2(Nt4CL2)，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1，结合组氨酸的非核糖体肽合成酶的腺苷结构域和酰基中间载体结构域(BacC His A和PCP结构域)，其氨基酸序列为SEQ ID NO.3，结合苯丙氨酸的非核糖体肽合成酶的腺苷结构域和酰基中间载体结构域(GrsA Phe A和PCP结构域)，其氨基酸序列为SEQ ID NO.5，结合脯氨酸的非核糖体肽合成酶的腺苷结构域和酰基中间载体结构域(GrsB Pro A和PCP结构域)，其氨基酸序列为SEQID NO.7，结合苯甲酸的羧酸还原酶的腺苷结构域和酰基中间载体结构域(srCAR A和PCP结构域)，其氨基酸序列为SEQ ID NO.9。

步骤2：根据步骤1各结构域的氨基酸序列分别得到其对应的核苷酸序列为SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10，并通过同源重组的方法将上述核苷酸序列克隆到大肠杆菌蛋白表达载体PET28a或PET24a中，构建得到传感器骨架载体PET28a-Nt4CL2、PET28a-BacC His A和PCP结构域、PET28a-GrsA Phe A和PCP结构域、PET28a-GrsA Phe A结构域、PET28a-GrsB Pro A和PCP结构域、PET24a-srCAR A和PCP结构域。

在本实施例中，下述SEQ ID NO.13-23是感应蛋白表达载体构建时所使用到的引物，其作用是将感应蛋白基因克隆到表达载体上，以便进行实施例2的操作：

4cl2-F:GATATACCATGGGCAGCAGCGAGAAGGATACCAAACAGGT(SEQ ID NO.13)

4cl2-R:TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGATTAGGTAAGCCCGCCGCTA(SEQ ID NO.14)

His-N-F:GATATACCATGGGCAGCAGCatcaaaagggtcgctgagca(SEQ ID NO.15)

His-pcp-R:ATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGtttctcttccgcctgtgtga(SEQ IDNO.16)

GrsAa-F:ATATACCATGGGCAGCAGCATGTTAAACAGTTCTAAAAGT(SEQ ID NO.17)

GrsAapcp-R:TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTGCTCACTTCTTCTTTTAC(SEQ IDNO.18)

GrsAa-R:TGGTGGTGGTGGTGCTCGAGCAACTGCTTTCGATCAATCT(SEQ ID NO.19)

Pro-F:GATATACCATGGGCAGCAGCTTATGCGTGGCAAATAATCC(SEQ ID NO.20)

Pro-R:TCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTGTTCTGGTACAGGCTGAA(SEQ ID NO.21)

SrCAR-F:TTTAAGAAGGAGATATACATATGACCGAAAGTCAGAGTTA(SEQ ID NO.22)

SrCAR-R:ATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGGGTCTGTGCATCCAGAAA(SEQ IDNO.23)。

实施例2荧光小分子生物传感器表达载体的构建

步骤1：在PDB数据库中找到Nt4CL2的晶体结构5BSM，GrsA Phe A domain的晶体结构1AMU，srCAR A and PCP domain的晶体结构5MSW，利用SWISS-MODEL对BacC His Adomain and PCP domain、GrsB Pro A and PCP domain进行同源建模，确定上述蛋白的N端大亚基与C端小亚基相连的铰链处或者C端小亚基与PCP相连的连接肽处。

步骤2：确定荧光蛋白插入位点，在步骤1确定的Nt4CL2第438位亮氨酸与439位异亮氨酸之间、BacC His A结构域和PCP结构域第532位丝氨酸与第533位丝氨酸之间、GrsAPhe A结构域和PCP结构域的第524位脯氨酸与525位谷氨酸之间、GrsA Phe A结构域的第524位脯氨酸与组氨酸标签之间、GrsB Pro A和PCP结构域第528位脯氨酸与第529位天门冬酰胺之间、srCAR A和PCP结构域第651位丙氨酸与652位谷氨酸之间插入带有随机荧光蛋白连接肽的荧光蛋白。引物包括20-25bp感应蛋白片段用于PCR扩增，6bp简并引物为随机荧光蛋白连接肽序列，20bp荧光蛋白序列的同源臂。下面是为本实施例中所使用到的引物：

cp-4CL2-MF:GGCACAAGCTGGAGTACAACBNKBNKATTAAGTATAAGGGCTTTCA(SEQ IDNO.24)

cp-4CL2-MR:TCGGCCATGATATAGACGTTMNVMNVCAGTTCTTTCAGGCGATCCA(SEQ IDNO.25)

His-pcp-R:TCGGCCATGATATAGACGTTMNVMNVgctaggttcagggagcgctt(SEQ IDNO.26)

His-pcp-F:GGCACAAGCTGGAGTACAACBNKBNKagcacaatcagtgaagcgac(SEQ IDNO.27)

cp-GrsA-R:GTCGGCCATGATATAGACGTTMNVMNVCGGCAACTGCTTTCGATCAA(SEQ IDNO.28)

cp-GrsAp-F:GGCACAAGCTGGAGTACAACBNKBNKGAACCTGATTTAACTTTCGG(SEQ IDNO.29)

cp-GrsA-F:GGCACAAGCTGGAGTACAACBNKBNKCACCACCACCACCACCACTGAGAT(SEQ IDNO.30)

cp-GrsB-R:TCGGCCATGATATAGACGTTMNVMNVCGGAAGAGATTTTCTGTCTA(SEQ IDNO.31)

cp-GrsB-F:GGCACAAGCTGGAGTACAACBNKBNKAATCTAGAGGGGATTGTGAA(SEQ IDNO.32)

cp-SrCAR-R:TCGGCCATGATATAGACGTTMNVMNVGGCCAGCTGGGCATACAGTG(SEQ IDNO.33)

cp-SrCAR-R:GGCACAAGCTGGAGTACAACBNKBNKGAAACCCAGGCAGGCGAACT(SEQ IDNO.34)

上述SEQ ID NO.24-34是本实施例中荧光小分子生物传感器表达载体构建时所用到的引物，其作用是将荧光蛋白的基因插入到实施例1中所构建的感应蛋白表达载体中，以获得完整的荧光小分子生物传感器。其中SEQ ID NO.24-34中“BNK”与“MNV”为简并引物。简并引物是指用来编码一段短肽序列的不同碱基序列的混合物。B代表C或G或T，N代表G或A或T或C，K代表G或T，M代表A或C，V代表A或G或C。

以实施例1中构建的表达载体PET28a-Nt4CL2、PET28a-BacC His A和PCP结构域、PET28a-GrsA Phe A和PCP结构域、PET28a-GrsA Phe A结构域、PET28a-GrsB Pro A和PCP结构域、PET24a-srCAR A和PCP结构域为模板，通过PCR的方式得到带有随机荧光蛋白连接肽DNA序列的线性化感应蛋白传感器DNA片段。

步骤3：通过同源重组的方法将荧光蛋白的DNA片段(荧光蛋白为cpEGFP荧光蛋白，氨基酸序列为SEQ ID NO.11，核苷酸序列为SEQ ID NO.12)克隆到步骤2中得到的线性化感应蛋白DNA片段中，得到完整的荧光生物传感器载体PET28a-Nt4CL2-cpEGFP、PET28a-BacCHis A和PCP结构域-cpEGFP、PET28a-GrsA Phe A和PCP结构域-cpEGFP、PET28a-GrsA Phe A结构域-cpEGFP、PET28a-GrsB Pro A和PCP结构域-cpEGFP、PET24a-srCAR A和PCP结构域-cpEGFP。

实施例3小分子荧光生物传感器的诱导表达

步骤1：于-80冰箱中取100μL大肠杆菌BAPI感受态6管，冰上融化备用。

步骤2：将实施例2中构建得到的传感器载体PET28a-Nt4CL2-cpEGFP、PET28a-BacCHis A和PCP结构域-cpEGFP、PET28a-GrsA Phe A和PCP结构域-cpEGFP、PET28a-GrsA Phe A结构域-cpEGFP、PET28a-GrsB Pro A和PCP结构域-cpEGFP、PET24a-srCAR A和PCP结构域-cpEGFP质粒分别加入步骤1中大肠杆菌BAPI感受态中，于冰上静置5分钟，随后42℃水浴锅中热激45秒，热激后加入900μL无抗LB培养基，37℃，220rpm摇床中恢复培养1小时。恢复培养完成后涂平板，平板倒置放于37℃培养箱中过夜培养。

步骤3：将步骤2中平板上长出的转化子挑入装有150μL卡那霉素抗性的LB培养基的96浅孔板中，置于37℃，800rpm摇床中过夜培养。

步骤4：将步骤3中得到菌株以2％的接种量转接入装有1ml卡那霉素抗性的LB培养基的96深孔板中，置于37℃，800rpm摇床中培养1-2小时，直到菌液的OD600为0.6-0.8。

步骤5：向步骤4中的菌株中加入IPTG，使IPTG的终浓度为0.4mM。

步骤6：将步骤5中的96深孔板置于16℃，800rpm摇床中培养48小时。

实施例4小分子荧光生物传感器的筛选

步骤1：将实施例3中的96深孔板放入4℃离心机中5000rpm离心10分钟，使菌体沉淀，弃上清。

步骤2：用500μL PBS缓冲液将步骤1中孔板中的菌体重悬，放入4℃离心机中5000rpm离心10分钟，使菌体沉淀，弃上清。重复此步骤2-3次。

步骤3：用500μLPBS缓冲液将步骤2中孔板中的菌体重悬，反复冻融8-10次，使菌体裂解。

步骤4：将步骤3中的孔板放入4℃离心机中5000rpm离心40分钟，使细胞不溶碎片沉淀。

步骤5：将步骤4中得到的孔板中的上清液转移至96孔荧光酶标板中。在荧光酶标仪中以激发光460nm，发射光510nm，测得上清液的初始荧光值。

步骤6：向步骤5中的荧光酶标板中加入ATP，Mgcl₂以及各小分子溶液，使其终浓度分别为1mM，2.5mM，0.1-1mM。

步骤7：将步骤6中的酶标板放入荧光酶标仪中，每1分钟测1次数值，参数同步骤5，共15分钟。

步骤8：将步骤5中测得的初始荧光值与步骤7中测得的最终荧光值相减后除以初始荧光值，选取其中荧光强度变化幅度大于20％的菌株进行蛋白纯化验证。

实施例5小分子荧光生物传感器的验证和表征

步骤1：将实施例4中得到的待验证菌株重新接种于培养基中，置于37℃，220rpm摇床中过夜培养。

步骤2：将步骤1中的菌株以2％的接种量转接入装有50ml卡纳抗性的LB培养基的摇瓶中，置于37℃，220rpm摇床中培养1-2小时，直到菌液OD₆₀₀为0.6-0.8。

步骤3：向步骤2中的菌液中加入IPTG，使IPTG的终浓度为0.2-0.4mM。

步骤4：将步骤3中的菌株置于16℃，220rpm摇床中培养48小时。

步骤5：将步骤4中的菌株放入4℃离心机中7500rpm离心5分钟，使菌体沉淀，弃上清。

步骤6：用20mM Tris，500mM NaCl pH7.9缓冲液将步骤5中的菌株重悬，放入4℃离心机中7500rpm离心5分钟，使菌体沉淀，弃上清。重复此步骤2-3次。

步骤7：用20mM Tris，500mM Nacl pH7.9缓冲液将步骤6中的菌株重悬，超声破碎使菌体裂解。

步骤8：将步骤7中的菌株放入4℃离心机中10000rpm离心45分钟，使细胞不溶碎片沉淀。

步骤9：利用传感器中的His标签纯化蛋白，20mM Tris，500mM Nacl，20mM咪唑pH7.9缓冲液洗杂，20mM Tris，500mM Nacl，500mM咪唑pH7.9缓冲液洗脱目标蛋白。

步骤10：使用超滤管离心降低目标蛋白中的咪唑浓度，使其降低到0.1mM以下。

步骤11：验证传感器是否有效，缓冲溶液为100mM Tris，pH7.5，反应体系中各物质终浓度分别为ATP 1mM，Mgcl₂ 2.5mM，特定小分子溶液0.1μM-1mM，待测传感器1-2μM。

步骤12：将步骤11中的反应体系转移至96孔荧光酶标板中。在荧光酶标仪中以激发光460nm，发射光510nm测试待测传感器的荧光强度是否会随其特异性结合小分子浓度的变化而变化。

步骤13：分别以4-香豆酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、苯甲酸五种不同浓度的小分子为横坐标，荧光小分子生物传感器的荧光强度为纵坐标，进行曲线绘制。

步骤14：测序获得荧光小分子生物传感器的连接肽的氨基酸序列。4-香豆酸传感器N端连接肽为LE，C端连接肽为TR。L-组氨酸传感器N端连接肽为GG，C端连接肽PV。L-苯丙氨酸传感器3-2C2 N端连接肽CV，C端连接肽为LL。L-苯丙氨酸传感器3-2E6N端连接肽VF，C端连接肽为QS。L-脯氨酸传感器N端连接肽为PF，C端连接肽为LH。苯甲酸传感器N端连接肽为GL，C端连接肽为QR。

通过实验得到各种小分子与对应的荧光传感器荧光强度的关系图(具体见图5至10，其中图7、图8均为苯丙氨酸，其区别为传感器3-2C2的构成为A domain-cpEGFP-PCPdomain，传感器3-2E6的构成为A domain-cpEGFP，荧光蛋白处的linker不同)。如图所示，4-香豆酸传感器在4-香豆酸浓度为0.1-10μM时，传感器的荧光强度随4-香豆酸浓度的升高而下降，荧光强度下降的幅度为32.8％。L-组氨酸传感器在L-组氨酸浓度为0.1-50μM时，传感器的荧光强度随L-组氨酸浓度的升高而升高，荧光强度升高的幅度为45.2％。L-苯丙氨酸传感器3-2C2在L-苯丙氨酸浓度为0.1-50μM时，传感器的荧光强度随L-苯丙氨酸浓度的升高而升高，荧光强度升高的幅度为44.6％。L-苯丙氨酸传感器3-2E6在L-苯丙氨酸浓度为0.1-50μM时，传感器的荧光强度随L-苯丙氨酸浓度的升高而升高，荧光强度升高的幅度为290％。L-脯氨酸传感器在L-苯丙氨酸浓度为10-500μM时，传感器的荧光强度随L-脯氨酸浓度的升高而升高，荧光强度升高的幅度为12.4％。苯甲酸传感器在苯甲酸浓度为0.1-25μM时，传感器的荧光强度随苯甲酸浓度的升高而升高，荧光强度升高的幅度为15.9％。可见小分子在一定浓度时，传感器的荧光强度会随小分子浓度的变化而变化，在一定范围内小分子的浓度与荧光信号强弱呈线性关系，可以通过测量荧光强度确定小分子的浓度。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一种小分子荧光传感器及其应用

<160> 34

<170> PatentIn Version 3.1

<210> 1

<211> 542

<212> PRT

<213> Nicotiana tabacum

<400> 1

MEKDTKQVDI IFRSKLPDIY IPNHLPLHSY CFENISEFSS RPCLINGANK QIYTYADVEL 60

NSRKVAAGLH KQGIQPKDTI MILLPNSPEF VFAFIGASYL GAISTMANPL FTPAEVVKQA 120

KASSAKIIVT QACHVNKVKD YAFENDVKII CIDSAPEGCL HFSVLTQANE HDIPEVEIQP 180

DDVVALPYSS GTTGLPKGVM LTHKGLVTSV AQQVDGENPN LYIHSEDVML CVLPLFHIYS 240

LNSVLLCGLR VGAAILIMQK FDIVSFLELI QRYKVTIGPF VPPIVLAIAK SPMVDDYDLS 300

SVRTVMSGAA PLGKELEDTV RAKFPNAKLG QGYGMTEAGP VLAMCLAFAK EPFEIKSGAC 360

GTVVRNAEMK IVDPKTGNSL PRNQSGEICI RGDQIMKGYL NDPEATARTI DKEGWLYTGD 420

IGYIDDDDEL FIVDRLKELI KYKGFQVAPA ELEALLLNHP NISDAAVVPM KDEQAGEVPV 480

AFVVRSNGST ITEDEVKDFI SKQVIFYKRI KRVFFVDAIP KSPSGKILRK DLRAKLAAGL 540

PN 542

<210> 2

<211> 1626

<212> DNA

<213> Nicotiana tabacum

<400> 2

atggagaagg ataccaaaca ggtggacatt atttttcgca gcaagctgcc ggatatttat 60

attccgaacc atctgccgct gcatagctat tgctttgaga acatcagcga atttagcagc 120

cgcccgtgct taattaacgg cgcgaacaaa cagatttata cctacgcgga tgtggaactg 180

aacagccgca aagttgcggc gggcttacat aaacagggca ttcagccgaa agataccatt 240

atgattctgc tgccgaacag cccggaattt gtgtttgcgt ttattggcgc gagctatctg 300

ggtgcgatta gcactatggc gaacccgtta tttaccccgg cggaagtggt gaaacaggcg 360

aaagcgagca gcgcgaaaat tattgtgacc caggcgtgcc atgtgaacaa agtgaaggat 420

tacgcgtttg agaacgacgt gaagatcatc tgcattgata gcgcgccgga aggctgctta 480

cattttagcg tgctgaccca ggcgaacgaa catgatattc cggaagtgga aattcagccg 540

gatgatgttg tggcgctgcc gtatagcagc ggtaccaccg gtttaccgaa aggcgttatg 600

ctgacccata aaggcctggt gaccagcgtt gcgcagcaag ttgatggcga aaacccgaac 660

ctgtatattc atagcgaaga tgtgatgctg tgcgtgctgc cgctgtttca tatttatagc 720

ctgaacagcg tgctgctgtg tggtttacgt gtgggcgcgg cgattctgat tatgcagaag 780

tttgacatcg tgagctttct ggaactgatt cagcgctata aagtgaccat tggcccgttt 840

gtgccgccta ttgtgctggc gattgcgaaa agcccgatgg tggatgatta tgatctgagc 900

agcgtgcgta ctgttatgtc aggcgcggcg cctttaggca aagaactgga agataccgtg 960

cgcgcgaaat ttccgaacgc gaaactgggt cagggctatg gtatgaccga agcgggtcct 1020

gtgttagcga tgtgtctggc gtttgcgaaa gaaccgttcg aaattaaaag cggcgcgtgc 1080

ggtaccgttg ttcgcaacgc ggaaatgaaa attgtggatc cgaaaaccgg caatagcctg 1140

cctcgtaacc aaagcggcga aatttgcatt cgcggcgatc agattatgaa aggctatctg 1200

aacgatcctg aagcaaccgc gcgcaccatt gataaagaag gctggctgta taccggcgat 1260

attggctata ttgacgatga tgacgagctg tttattgtgg atcgcctgaa agaactgatt 1320

aagtataagg gctttcaggt ggcgcctgcg gaattagaag cgctgctgct gaaccatccg 1380

aacattagcg atgcagcggt ggtgccgatg aaagatgaac aggcgggcga agtgcctgtt 1440

gcgtttgtgg ttcgctcaaa cggcagcacc attaccgaag atgaagtgaa ggacttcatt 1500

agcaagcagg tgatttttta caagcgcatc aagcgcgtgt ttttcgtgga tgcgattccg 1560

aaaagcccga gcggcaaaat tctgcgcaaa gatctgcgtg cgaaattagc ggcgggctta 1620

cctaat 1626

<210> 3

<211> 632

<212> PRT

<213> Bacillus licheniformisATCC10716

<400> 3

IKRVAEQVTA NENRKIAEID MLAEEERKTL LYEFNRTNAD YPRNKTIHQL FEEQAERTPG 60

HTAVVFEKEE LSYKALNERS NQLAGLLREK GVKPDMIVGV MAERSVEMIV GMLAVLKAGG 120

AYLPIDPEYP EDRIRYMIED SGISILLKKA DKQIDVDFTC IDMNEKGLAK DMAAENLGHT 180

SGSSDMAYVI YTSGSTGKPK GVMVNHQSIV NTLYWRKQSY GYSTADATLQ VPSFSFDSSV 240

EDIFTTLISG AKLVLIRDLR MNPREIIGVL RTHKATNLLA VPSFYLNLLD TIEQPLDDLR 300

FVTVAGEGFN ESLIRQHFEK LPNVKLFNEY GPTENSVCST RGELRKDDEK VVIGRPISNH 360

KVYILNHNQQ LLPLGTPGEL CLSGEGLARG YLNRPDLTLE KFVPNPFAPG ESMYRTGDLA 420

RFLPDGQIEY LGRIDHQVKI RGFRIELGEI ENQLLKIEGI DAAAVMARED QAGGKYLCAY 480

IVADKAAGVA DVRKCLLKEL PDYMVPSYFV KLDQLPLTAN GKIDRKALPE PSSTISEATY 540

EAPRNRTEEK LVSIWEDVLG IENIGISHNF FELGGHSLKA AALTAKLHKE MKIEVPLRQL 600

FETPTIKDIG DFIESMKESP YASITQAEEK LE 632

<210> 4

<211> 1896

<212> DNA

<213> Bacillus licheniformisATCC10716

<400> 4

atcaaaaggg tcgctgagca agtgacggca aatgagaacc ggaaaattgc agagattgac 60

atgctggcgg aggaagaaag aaagacgctc ctatatgagt tcaaccggac aaacgcagat 120

tatccaagga ataaaacgat ccatcaatta tttgaagaac aggcggaacg gacgcctggg 180

catactgcgg ttgtatttga aaaggaggag ctttcttaca aagcattgaa tgaaaggtca 240

aatcagctgg cgggactgtt aagggaaaaa ggcgtcaaac ctgacatgat cgtcggcgtt 300

atggcggaac gttctgtgga gatgatcgtc ggaatgctgg cggtgctgaa agccggaggc 360

gcatacttgc cgatcgatcc cgaatatccg gaagaccgga tcaggtacat gatcgaagac 420

agcggcatca gcatcctgct gaaaaaggcg gacaaacaga ttgacgttga tttcacctgt 480

atcgatatga acgaaaaagg gctggcaaaa gacatggccg cagagaactt agggcacacg 540

agcggctctt ccgacatggc ttatgtcatc tatacttcag gttcgaccgg aaagccgaag 600

ggtgtcatgg tcaaccatca atcaattgtc aatacgcttt attggaggaa acaatcgtat 660

ggctacagta cagccgatgc cacgcttcaa gtgccgtcct tttctttcga cagttctgtt 720

gaagatattt tcacgacgct tatatctggg gcgaagctgg ttttaattag agatttacgg 780

atgaatccgc gtgagatcat cggcgtgctg cgaacgcata aagcgacaaa cttgctggcc 840

gttccgagct tttatctaaa cctgctcgac acgattgagc agcctttaga cgatttaaga 900

tttgtcacgg tcgcagggga aggcttcaat gaaagtctga tccggcagca ttttgaaaag 960

ctgccgaacg tcaaattgtt taatgaatac ggaccgacgg aaaacagcgt ttgctcaacg 1020

cggggcgagc tgcgaaaaga tgacgaaaaa gtcgtcatcg gccggccgat cagcaaccac 1080

aaggtttata ttttaaatca caaccagcag ctgctgccgt tgggcacgcc cggtgaactt 1140

tgtctgagcg gggaaggcct tgcccgcgga tacttaaaca gaccagacct cacgcttgaa 1200

aaatttgttc caaacccgtt tgctccaggg gaaagcatgt accggacggg ggatctcgca 1260

agatttttgc ctgatggtca aatcgaatat ttaggaagaa tcgaccacca agtcaaaatc 1320

cgcggattca gaatcgaact gggcgaaatc gaaaaccaat tgctgaaaat cgaaggcatt 1380

gacgcggcag cagtcatggc gcgggaagat caagccggcg gcaaatacct atgcgcatat 1440

atcgtcgcgg acaaagcggc aggcgttgca gacgtcagaa aatgcttgtt aaaggaactg 1500

ccggattaca tggtgccgtc atactttgtc aagcttgatc aattgccgct tacggcaaac 1560

ggcaaaatcg acagaaaagc gctccctgaa cctagcagca caatcagtga agcgacgtac 1620

gaagcaccga ggaaccgcac agaggaaaag cttgtctcaa tctgggagga cgttttaggg 1680

atcgaaaaca tcggaatcag ccacaatttc tttgaacttg gcggccattc cttaaaagct 1740

gcggcattga ctgcaaaatt gcataaagaa atgaagattg aagtcccttt aagacaacta 1800

ttcgaaacac cgacaattaa agacatcggt gattttatcg aatccatgaa agaaagcccg 1860

tatgcgtcca tcacacaggc ggaagagaaa ctcgag 1896

<210> 5

<211> 523

<212> PRT

<213> Brevibacillus brevis

<400> 5

MLNSSKSILI HAQNKNGTHE EEQYLFAVNN TKAEYPRDKT IHQLFEEQVS KRPNNVAIVC 60

ENEQLTYHEL NVKANQLARI FIEKGIGKDT LVGIMMEKSI DLFIGILAVL KAGGAYVPID 120

IEYPKERIQY ILDDSQARML LTQKHLVHLI HNIQFNGQVE IFEEDTIKIR EGTNLHVPSK 180

STDLAYVIYT SGTTGNPKGT MLEHKGISNL KVFFENSLNV TEKDRIGQFA SISFDASVWE 240

MFMALLTGAS LYIILKDTIN DFVKFEQYIN QKEITVITLP PTYVVHLDPE RILSIQTLIT 300

AGSATSPSLV NKWKEKVTYI NAYGPTETTI CATTWVATKE TIGHSVPIGA PIQNTQIYIV 360

DENLQLKSVG EAGELCIGGE GLARGYWKRP ELTSQKFVDN PFVPGEKLYK TGDQARWLSD 420

GNIEYLGRID NQVKIRGHRV ELEEVESILL KHMYISETAV SVHKDHQEQP YLCAYFVSEK 480

HIPLEQLRQF SSEELPTYMI PSYFIQLDKM PLTSNGKIDR KQL 523

<210> 6

<211> 1569

<212> DNA

<213> Brevibacillus brevis

<400> 6

atgttaaaca gttctaaaag tatattgatt catgctcaaa ataaaaatgg aacgcatgaa 60

gaggagcagt atctctttgc tgtgaacaac accaaagcgg agtatccacg tgataagacg 120

atccatcagt tatttgaaga gcaggttagt aagagaccaa acaatgtagc cattgtatgt 180

gaaaatgagc aacttaccta ccatgagctt aatgtgaaag ccaatcaact agcacggatt 240

tttatagaaa aagggattgg aaaagacact cttgttggaa ttatgatgga gaaatctatc 300

gatttattta taggcatatt agccgtttta aaagcaggtg gagcatatgt tccgattgat 360

attgaatatc ctaaggaaag aattcaatat attcttgatg atagtcaggc aagaatgcta 420

cttacccaga agcatttggt tcatttaatt cataatattc aatttaatgg gcaagtggaa 480

atttttgaag aagatactat caaaattaga gaaggaacta atctacatgt accaagtaaa 540

tcaaccgatc ttgcttatgt tatttatact tctggtacaa caggcaatcc aaaaggtaca 600

atgctggagc ataaaggaat aagtaatcta aaggtatttt tcgaaaatag tcttaacgtg 660

actgaaaagg atagaattgg tcaatttgcc agcatctctt ttgatgcatc tgtatgggag 720

atgtttatgg ctttgttaac gggggctagc ctgtatatta tcctgaagga tacaatcaat 780

gattttgtga agtttgaaca atacattaac caaaaggaaa tcactgttat tacgttacca 840

cctacctatg tagttcatct tgatccagaa cgtattttat cgatacaaac gttaattaca 900

gcaggctcag ctacctcgcc ttccttagta aacaagtgga aggagaaagt aacttacata 960

aatgcctatg gccctacgga aacaactatt tgtgcgacta catgggtagc caccaaagaa 1020

acaataggtc attcagttcc aatcggagca ccaattcaaa atacacaaat ttatattgtc 1080

gatgaaaatc ttcaattaaa atcggttggt gaagctggtg aattgtgtat tggtggagaa 1140

gggttagcaa ggggatattg gaagcgaccg gaattaactt cccagaagtt cgttgataac 1200

ccgtttgttc caggagagaa gttgtataaa acaggagatc aggcaagatg gctatctgat 1260

ggaaatattg aatatctcgg aagaatagat aaccaggtaa agattagagg tcaccgagtt 1320

gaactagaag aagttgagtc tattcttcta aagcatatgt atattagcga aactgcagta 1380

agtgtgcata aagatcacca agaacagccg tatttgtgcg cttattttgt atcggaaaag 1440

catataccac tagaacagtt aagacaattc tcatcagaag aactgccaac gtatatgatc 1500

ccttcttatt ttatccagtt agacaaaatg ccgcttacat caaatgggaa gattgatcga 1560

aagcagttg 1569

<210> 7

<211> 630

<212> PRT

<213> Brevibacillus brevis

<400> 7

LCVANNPHVL VQDVPLLTKQ EKQHLLVELH DSITEYPDKT IHQLFTEQVE KTPEHVAVVF 60

EDEKVTYREL HERSNQLARF LREKGVKKES IIGIMMERSV EMIVGILGIL KAGGAFVPID 120

PEYPKERIGY MLDSVRLVLT QRHLKDKFAF TKETIVIEDP SISHELTEEI DYINESEDLF 180

YIIYTSGTTG KPKGVMLEHK NIVNLLHFTF EKTNINFSDK VLQYTTCSFD VCYQEIFSTL 240

LSGGQLYLIR KETQRDVEQL FDLVKRENIE VLSFPVAFLK FIFNEREFIN RFPTCVKHII 300

TAGEQLVVNN EFKRYLHEHN VHLHNHYGPS ETHVVTTYTI NPEAEIPELP PIGKPISNTW 360

IYILDQEQQL QPQGIVGELY ISGANVGRGY LNNQELTAEK FFADPFRPNE RMYRTGDLAR 420

WLPDGNIEFL GRADHQVKIR GHRIELGEIE AQLLNCKGVK EAVVIDKADD KGGKYLCAYV 480

VMEVEVNDSE LREYLGKALP DYMIPSFFVP LDQLPLTPNG KIDRKSLPNL EGIVNTNAKY 540

VVPTNELEEK LAKIWEEVLG ISQIGIQDNF FSLGGHSLKA ITLISRMNKE CNVDIPLRLL 600

FEAPTIQEIS NYINGAKKES YVAIQPVPEQ 630

<210> 8

<211> 1890

<212> DNA

<213> Brevibacillus brevis

<400> 8

acatgtgtta gtacaggacg ttcctctgct tacaaagcaa 60

gaaaaacaac atttattggt agagctgcat gattcgataa cagagtatcc tgataagacg 120

attcatcagt tatttacaga acaggtagaa aaaacaccag agcatgtggc agttgtattc 180

gaagatgaga aagtgaccta tagagagctg catgagagat ctaatcaatt agccagattc 240

ttaagagaaa aaggcgtaaa aaaagaaagc atcataggca ttatgatgga gcgttcagtt 300

gaaatgattg ttgggatctt agggatttta aaagctggtg gagcttttgt gcctattgat 360

cctgaatatc caaaagaaag aatcggctat atgttagatt ctgtacggct agtacttaca 420

caacgccatt taaaggataa atttgctttt acgaaagaaa cgatagtaat tgaagatcca 480

agtatttcac acgagttaac tgaagaaata gattatatta atgaatcaga ggacttgttt 540

tatattattt atacatcagg aacaacaggt aaaccaaaag gggttatgct agagcacaaa 600

aacatcgtta atctgcttca ttttactttc gagaaaacaa atatcaactt tagtgacaaa 660

gtattacagt atacaacatg cagttttgat gtgtgttacc aagaaatttt ttcgacgctc 720

ttgtctggag ggcaattata tcttattagg aaagaaactc aacgcgatgt agagcaatta 780

tttgatttag taaaacgtga aaatattgaa gtattatctt ttcctgtggc ttttctaaaa 840

tttattttca atgaaagaga atttatcaat cgttttccaa cttgcgtgaa acatattatc 900

acagcaggag aacaattagt agttaacaat gagtttaaac gttatttgca tgaacataac 960

gtacatttac acaatcatta tggtccatca gaaacgcatg ttgttaccac ctatactatt 1020

aatcctgaag ctgaaattcc tgaattacca ccgataggaa aacctatctc caatacatgg 1080

atttatattt tggatcaaga acaacaacta caaccacaag gaattgtagg agagttatat 1140

atttcgggcg caaatgttgg aagaggatat ttgaataatc aagaattaac ggcagaaaaa 1200

ttctttgcag atccctttag gccaaacgaa cggatgtacc gaacagggga tttagcaagg 1260

tggttgccag acggaaatat cgaattttta ggaagagccg atcatcaggt gaaaattagg 1320

gggcatcgaa tagagcttgg tgagatcgag gcacaattat taaattgtaa gggtgtaaaa 1380

gaagctgttg ttatcgataa agcggatgat aaaggcggaa aatatttatg tgcctatgtt 1440

gttatggaag tagaagtaaa tgactctgag cttcgagaat atttggggaa agctttgcct 1500

gattatatga tcccgtcgtt ctttgttccg ttggatcagc tgccgcttac accaaacgga 1560

aaaatagaca gaaaatctct tccgaatcta gaggggattg tgaatacaaa cgcaaaatat 1620

gtagtaccta caaatgagct ggaagaaaaa ttggctaaaa tatgggaaga agtacttggg 1680

atttctcaga tcggtataca agacaatttc ttttcgttag gcgggcattc tcttaaagcc 1740

attacgctta tttcccgtat gaacaaagag tgtaatgtag acattcctct acgtttgtta 1800

tttgaagcac caaccattca ggaaatctct aattatataa acggggcaaa gaaagaaagc 1860

tatgttgcca ttcagcctgt accagaacaa 1890

<210> 9

<211> 788

<212> PRT

<213> Segniliparus rugosus ATCC BAA-974

<400> 9

MTESQSYETR MTESQSYETR QARPAGQSLA ERVARLVAID PQAAAAVPDK AVAERATQQG 60

LRLAQRIEAF LSGYGDRPAL AQRAFEITKD PITGRAVATL LPKFETVSYR ELLERSHAIA 120

SELANHAEAP VKAGEFIATI GFTSTDYTSL DIAGVLLGLT SVPLQTGATT DTLKAIAEET 180

APAVFGASVE HLDNAVTTAL ATPSVRRLLV FDYRQGVDED REAVEAARSR LAEAGSAVLV 240

DTLDEVIARG RALPRVALPP ATDAGDDSLS LLIYTSGSTG TPKGAMYPER NVAQFWGGIW 300

HNAFDDGDSA PDVPDIMVNF MPLSHVAGRI GLMGTLSSGG TTYFIAKSDL STFFEDYSLA 360

RPTKLFFVPR ICEMIYQHYQ SELDRIGAAD GSPQAEAIKT ELREKLLGGR VLTAGSGSAP 420

MSPELTAFIE SVLQVHLVDG YGSTEAGPVW RDRKLVKPPV TEHKLIDVPE LGYFSTDSPY 480

PRGELAIKTQ TILPGYYKRP ETTAEVFDED GFYLTGDVVA EVAPEEFVYV DRRKNVLKLS 540

QGEFVALSKL EAAYGTSPLV RQISVYGSSQ RSYLLAVVVP TPEALAKYGD GEAVKSALGD 600

SLQKIAREEG LQSYEVPRDF IIETDPFTIE NGILSDAGKT LRPKVKARYG ERLEALYAQL 660

AETQAGELRS IRVGAGERPV IETVQRAAAA LLGASAAEVD PEAHFSDLGG DSLSALTYSN 720

FLHEIFQVEV PVSVIVSAAN NLRSVAAHIE KERSSGSDRP TFASVHGAGA TTIRASDLKL 780

EKFLDAQT 788

<210> 10

<211> 2334

<212> DNA

<213> Segniliparus rugosus ATCC BAA-974

<400> 10

atgaccgaaa gtcagagtta tgaaacccgc caggcccgtc cggcaggtca gtcactggcc 60

gaacgtgtgg cccgtctggt tgcaattgat ccgcaggcag ccgcagccgt tccggataaa 120

gcagttgcag aacgtgcaac ccagcagggt ctgcgcctgg cacagcgcat tgaagcattt 180

ctgagtggtt atggtgaccg cccggcactg gcccagcgtg catttgaaat taccaaagat 240

ccgattaccg gtcgcgcagt ggcaaccctg ctgccgaaat ttgaaaccgt gagctatcgc 300

gaactgctgg aacgtagcca tgcaattgca agtgaactgg ccaatcatgc cgaagccccg 360

gttaaagccg gtgagtttat tgcaaccatt ggctttacca gcaccgatta taccagtctg 420

gatattgcag gcgtgctgct gggcctgacc agcgtgcctc tgcagaccgg cgcaaccacc 480

gataccctga aagccattgc cgaagaaacc gcaccggccg tgtttggcgc aagtgttgaa 540

catctggata atgccgtgac caccgcactg gcaaccccga gcgtgcgccg tctgctggtg 600

tttgattatc gccagggcgt tgatgaagat cgcgaagccg ttgaagccgc ccgtagtcgc 660

ctggcagaag ccggtagcgc agtgctggtg gataccctgg atgaagttat tgcccgcggt 720

cgtgcactgc cgcgtgttgc actgccgccg gcaaccgatg caggtgacga tagtctgagt 780

ctgctgatct ataccagtgg tagtaccggt acaccgaaag gtgccatgta tccggaacgc 840

aatgttgcac agttttgggg cggcatttgg cataatgcat ttgatgatgg cgatagcgca 900

ccggatgttc cggatattat ggttaatttt atgccgctga gtcatgtggc cggccgtatt 960

ggcctgatgg gcaccctgag cagcggcggt acaacctatt ttattgcaaa aagcgatctg 1020

agcacctttt tcgaagatta tagcctggcc cgcccgacca aactgttttt cgtgccgcgt 1080

atttgcgaaa tgatctatca gcattatcag agcgaactgg atcgcattgg cgcagcagat 1140

ggcagcccgc aggccgaagc aattaagacc gaactgcgtg aaaaactgct gggtggccgt 1200

gttctgaccg ccggcagtgg tagtgccccg atgagcccgg aactgaccgc ctttattgaa 1260

agcgtgctgc aggtgcatct ggtggatggt tatggtagca ccgaagccgg tccggtgtgg 1320

cgtgatcgta aactggtgaa accgccggtt accgaacata aactgattga tgttccggaa 1380

ctgggttatt ttagcaccga tagtccgtat ccgcgtggcg aactggcaat taagacacag 1440

accattctgc cgggctatta taaacgcccg gaaaccaccg ccgaagtgtt tgatgaagat 1500

ggcttttatc tgaccggcga tgttgttgcc gaagtggccc cggaagaatt tgtgtatgtt 1560

gatcgtcgta aaaatgttct gaaactgagt cagggtgaat ttgttgccct gagcaaactg 1620

gaagccgcct atggtacaag tccgctggtg cgtcagatta gcgtgtatgg tagtagtcag 1680

cgtagctatc tgctggccgt tgttgttccg accccggaag cactggcaaa atatggtgac 1740

ggcgaagcag ttaaaagcgc actgggtgac agtctgcaga aaattgcccg cgaagaaggc 1800

ctgcagagct atgaagttcc gcgcgatttt attattgaaa ccgatccgtt taccattgaa 1860

aatggtattc tgagtgatgc aggtaaaacc ctgcgcccga aagtgaaagc ccgttatggc 1920

gaacgtctgg aagcactgta tgcccagctg gccgaaaccc aggcaggcga actgcgcagt 1980

attcgtgttg gcgccggcga acgtccggtt attgaaaccg tgcagcgtgc cgccgccgcc 2040

ttactgggtg ctagcgcagc agaagttgat ccggaagcac attttagtga tctgggtggc 2100

gatagcctga gtgccctgac ctatagtaat tttctgcatg aaattttcca ggttgaagtg 2160

ccggtgagtg tgattgttag cgccgccaat aatctgcgca gcgttgcagc ccatattgaa 2220

aaagaacgta gcagtggtag cgatcgcccg acctttgcaa gtgtgcatgg cgcaggtgcc 2280

accaccattc gcgccagtga tctgaaactg gaaaaatttc tggatgcaca gacc 2334

<210> 11

<211> 241

<212> PRT

<213> 人工序列cpEGFP

<400> 11

NVYIMADKQK NGIKANFKIR HNIEDGGVQL AYHYQQNTPI GDGPVLLPDN HYLSTQSKLS 60

KDPNEKRDHM VLLEFVTAAG ITLGMDELYK GGTGGSMVSK GEELFTGVVP ILVELDGDVN 120

GHKFSVSGEG EGDATYGKLT LKFICTTGKL PVPWPTLVTT LTYGVQCFSR YPDHMKQHDF 180

FKSAMPEGYI QERTIFFKDD GNYKTRAEVK FEGDTLVNRI ELKGIDFKED GNILGHKLEY 240

N 241

<210> 12

<211> 723

<212> DNA

<213> 人工序列cpEGFP

<400> 12

aacgtctata tcatggccga caagcagaag aacggcatca aggcaaactt caagatccgc 60

cacaacatcg aggacggcgg cgtccagctc gcctaccact accagcagaa cacccccatc 120

ggcgacggcc ccgtcctgct gcccgacaac cactacctga gcacccagtc caaactgagc 180

aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtaac cgccgccggg 240

atcactctcg gcatggacga gctgtacaag ggcggaaccg gcggaagcat ggtcagcaag 300

ggcgaggagc tgttcaccgg ggtcgtaccc atcctggtcg agctggacgg cgacgtaaac 360

ggccacaagt tcagcgtctc cggcgagggc gagggcgatg ccacctacgg caagctgacc 420

ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg cccgtaccct ggcccaccct cgtcaccacc 480

ctgacctacg gcgtccagtg cttcagccgc taccccgacc acatgaagca gcacgacttc 540

ttcaagtccg ccatgcccga aggctacatc caggagcgca ccatcttctt caaggacgac 600

ggcaactaca agacccgcgc cgaggtcaag ttcgagggcg acaccctggt caaccgcatc 660

gagctgaagg gcatcgactt caaggaggac ggcaacatcc tggggcacaa gctggagtac 720

aac 723

<210> 13

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列4cl2-F

<400> 13

gatataccat gggcagcagc gagaaggata ccaaacaggt 40

<210> 14

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列4cl2-R

<400> 14

tcagtggtgg tggtggtggt gctcgagatt aggtaagccc gccgcta 47

<210> 15

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列his -N-F

<400> 15

gatataccat gggcagcagc atcaaaaggg tcgctgagca 40

<210> 16

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列his-pcp-R

<400> 16

atctcagtgg tggtggtggt ggtgctcgag tttctcttcc gcctgtgtga 50

<210> 17

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列GrsAa-F

<400> 17

atataccatg ggcagcagca tgttaaacag ttctaaaagt 40

<210> 18

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列GrsAapcp-R

<400> 18

tcagtggtgg tggtggtggt gctcgagttg ctcacttctt cttttac 47

<210> 19

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列GrsAa-R

<400> 19

tggtggtggt ggtgctcgag caactgcttt cgatcaatct 40

<210> 20

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列Pro-F

<400> 20

gatataccat gggcagcagc ttatgcgtgg caaataatcc 40

<210> 21

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列Pro-R

<400> 21

tctcagtggt ggtggtggtg gtgctcgagt tgttctggta caggctgaa 49

<210> 22

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列SrCAR-F

<400> 22

tttaagaagg agatatacat atgaccgaaa gtcagagtta 40

<210> 23

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23 SrCAR-R

atctcagtgg tggtggtggt ggtgctcgag ggtctgtgca tccagaaa 48

<210> 24

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列cp-4CL2-MF

<223> b=c或g或t，n=g或a或t或c，k=g或t

<400> 24

ggcacaagct ggagtacaac bnkbnkatta agtataaggg ctttca 46

<210> 25

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列cp-4CL2-MR

<223> n=g或a或t或c，m代表a或c，v=a或g或c

<400> 25

tcggccatga tatagacgtt mnvmnvcagt tctttcaggc gatcca 46

<210> 26

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列his-pcp-R

<223> n=g或a或t或c，m代表a或c，v=a或g或c

<400> 26

tcggccatga tatagacgtt mnvmnvgcta ggttcaggga gcgctt 46

<210> 27

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列his-pcp-F

<223> b=c或g或t，n=g或a或t或c，k=g或t

<400> 27

ggcacaagct ggagtacaac bnkbnkagca caatcagtga agcgac 46

<210> 28

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列cp-GrsA-R

<223> n=g或a或t或c，m代表a或c，v=a或g或c

<400> 28

gtcggccatg atatagacgt tmnvmnvcgg caactgcttt cgatcaa 47

<210> 29

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列cp-GrsAp-F

<223> b=c或g或t，n=g或a或t或c，k=g或t

<400> 29

ggcacaagct ggagtacaac bnkbnkgaac ctgatttaac tttcgg 46

<210> 30

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列cp-GrsA-F

<223> b=c或g或t，n=g或a或t或c，k=g或t

<400> 30

ggcacaagct ggagtacaac bnkbnkcacc accaccacca ccactgagat 50

<210> 31

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列cp-GrsB-R

<223> n=g或a或t或c，m代表a或c，v=a或g或c

<400> 31

tcggccatga tatagacgtt mnvmnvcgga agagattttc tgtcta 46

<210> 32

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列cp-GrsB-F

<223> b=c或g或t，n=g或a或t或c，k=g或t

<400> 32

ggcacaagct ggagtacaac bnkbnkaatc tagaggggat tgtgaa 46

<210> 33

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列cp-SrCAR-R

<223> n=g或a或t或c，m代表a或c，v=a或g或c

<400> 33

tcggccatga tatagacgtt mnvmnvggcc agctgggcat acagtg 46

<210> 34

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列cp-SrCAR-R

<223> b=c或g或t，n=g或a或t或c，k=g或t

<400> 34

ggcacaagct ggagtacaac bnkbnkgaaa cccaggcagg cgaact 46

10

Claims

1.一种含有羧基的有机小分子荧光传感器的融合基因，其特征在于，将带有随机连接肽的荧光蛋白DNA序列插入到结合特定含有羧基的有机小分子的感应蛋白基因的N端大亚基与C端小亚基相连的铰链处，或者插入到C端小亚基与酰基中间载体结构域相连的连接肽处，或者插入到感应蛋白的C端小亚基后而形成；

所述结合特定含有羧基的小分子的感应蛋白基因是芳香基和酰基-CoA合成酶的DNA序列、非核糖体肽合成酶的腺苷结构域和酰基中间载体结构域的DNA序列，或羧酸还原酶的腺苷结构域和酰基中间载体结构域的DNA序列；所述的带有随机连接肽的荧光蛋白是循环排列荧光蛋白的N末端和C末端分别带有随机长度的连接肽；

所述芳香基和酰基-CoA合成酶的DNA序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示、非核糖体肽合成酶的腺苷结构域和酰基中间载体结构域的DNA序列编码的氨基酸序列如SEQ IDNO.3或SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7所示，或羧酸还原酶的腺苷结构域和酰基中间载体结构域的DNA序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。

2.如权利要求1所述的融合基因，其特征在于，所述连接肽的长度为20个氨基酸长度以内；所述荧光蛋白是绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白。

3.如权利要求2所述的融合基因，其特征在于，所述连接肽的长度为10个氨基酸以内；荧光蛋白DNA编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。

4.如权利要求2所述的融合基因，其特征在于，所述芳香基和酰基-CoA合成酶的DNA序列如SEQ ID NO.2所示、非核糖体肽合成酶的腺苷结构域和酰基中间载体结构域的DNA序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8所示，或羧酸还原酶的腺苷结构域和酰基中间载体结构域的DNA序列SEQ ID NO.10所示；所述荧光蛋白DNA的核苷酸序列如SEQ IDNO.12所示。

5.如权利要求4所述的融合基因，其特征在于，所述带有随机连接肽的荧光蛋白DNA序列插入到所述结合特定小分子的感应蛋白基因上的位点是在感应蛋白的N端大亚基与C端小亚基相连的铰链处或者C端小亚基与酰基中间载体结构域相连的连接肽处。

6.如权利要求5所述的融合基因，其特征在于，所述带有随机连接肽的荧光蛋白DNA序列插入到所述结合特定小分子的感应蛋白基因上的位点是在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第438位亮氨酸与439位异亮氨酸之间、SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的第532位丝氨酸与第533位丝氨酸之间、SEQ ID NO.5所示氨基酸序列的第524位脯氨酸与525位谷氨酸之间、SEQ ID NO .5所示氨基酸序列的第524位脯氨酸与组氨酸标签之间、SEQ ID NO .7所示氨基酸序列的第528位脯氨酸与第529位天门冬酰胺之间、或SEQ ID NO .9所示氨基酸序列的第651位丙氨酸与652 位谷氨酸之间。

7.如权利要求6所述的融合基因，其特征在于，所述融合基因还包括纯化标签编码序列。

8.含有如权利要求1-7任一项所述的融合基因的表达质粒。

9.如权利要求8所述的表达质粒，其特征在于，其适合于底盘细胞诱导表达的表达质粒，其出发载体是pET表达系统质粒，或pBAD表达系统质粒。

10.一种含有羧基的有机小分子荧光传感器，其特征在于，其是由如权利要求1-7任一项所述的融合基因编码的融合蛋白。

11.含有如权利要求8或9所述的表达质粒的宿主细胞。

12.如权利要求11所述的宿主细胞，其特征在于，其是细菌。

13.如权利要求12所述的宿主细胞，其特征在于，其是大肠杆菌。

14.一种检测有机小分子化合物的方法，其特征在于，将如权利要求10所述的含有羧基的有机小分子荧光传感器溶于缓冲溶液中，加入ATP、MgCl₂以及待测的含有羧基的有机小分子化合物的样品构成反应体系，随后测定荧光强度。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述缓冲液是100 mM Tris， pH7.5；所述反应体系中各物质终浓度分别为ATP 0.5-2 mM，MgCl₂ 1.0-3.0 mM，含有羧基的有机小分子化学合物0.05 μM-5 mM，所述含有羧基的有机小分子荧光传感器0.5-4 μM。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述含有羧基的有机小分子是苯丙氨酸、酪氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、（2S,3S）-甲基天冬氨酸、6-氯-L-色氨酸、苯甲酸、香豆酸、肉桂酸。

17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述含有羧基的有机小分子荧光传感器通过基因重组表达的方式获得。

18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，还包括所述含有羧基的有机小分子荧光传感器荧光强度与待测有机小分子浓度之间的标准曲线的制作环节。