CN114681673A - 抗折痕的脱水交联生物材料及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本申请公开一种抗折痕的脱水交联生物材料及其制备方法，制备方法包括对生物材料进行(a)氧化处理、(b)第一交联处理、(c)第二交联处理和(d)脱水处理制得；其中，(b)在(a)之后进行且(a)(b)(c)均在(d)之前进行；其中氧化处理时采用能够致使羟基转化为醛基的氧化剂，所述羟基来自于所述生物材料中的粘多糖，第一交联处理时采用能够致使粘多糖的醛基间相互交联的第一交联剂，第二交联处理时采用能够致使所述生物材料中胶原纤维间相互交联的第二交联剂。本申请还提供一种基于所述脱水交联生物材料的心脏瓣膜和介入系统。本申请通过原位打开生物材料的粘多糖并将其形成交联网络的一部分，解决干膜瓣膜在输送器中长时间压握后重新复水折痕不能回复的问题。

Description

抗折痕的脱水交联生物材料及其制备方法和应用
技术领域
本申请涉及假体生物材料技术领域，具体涉及一种抗折痕的脱水交联生物材料及其制备方法和应用。
背景技术
近年来，介入生物材料如介入瓣膜置换手术由于其操作方便、大大降低了对病人的二次损伤，从而取得了越来越广泛的临床应用。现阶段介入瓣膜保存于戊二醛溶液中，在手术现场使用时，需要经过反复清洗和装载，增加了手术的时间和附加风险；其次，生物瓣膜残留的戊二醛易增加生物瓣膜的钙化和毒性。生物瓣膜通过脱水和预装载的方式能够完美地解决上述问题。然而，脱水和预装载的方式由于在上时间压握后再水合，要求生物瓣膜具有更好的弹性和韧性，解决长时间压握之后的折痕问题。现阶段，生物瓣仍然不能满足长时间压握之后的折痕问题，折痕的存在不仅影响瓣膜的流体力学性能而且在折痕处更易发生钙化和疲劳撕裂。
发明内容
本申请提供一种抗折痕的脱水交联生物材料及其制备方法和应用，解决干膜瓣膜在输送器中长时间压握后重新复水折痕不能回复的问题。
一种复合交联制备抗折痕的脱水生物材料的方法，其特征在于，对生物材料进行(a)氧化处理、(b)第一交联处理、(c)第二交联处理和(d)脱水处理制得；其中，(b)在(a)之后进行且(a)(b)(c)均在(d)之前进行；
其中氧化处理时采用能够致使羟基转化为醛基的氧化剂，所述羟基来自于所述生物材料中的粘多糖，第一交联处理时采用能够致使粘多糖的醛基间相互交联的第一交联剂，第二交联处理时采用能够致使所述生物材料中胶原纤维间相互交联的第二交联剂。
可选的，所述生物材料的胶原含量为60％～90％。
可选的，所述生物材料的生物来源为猪、牛、马或羊；所述生物材料的来源部位为心包膜、心脏瓣膜、血管、韧带、肌肉、肠或皮肤。
进一步可选的，所述生物材料包括猪心包膜或牛心包膜。
可选的，所述氧化处理包括将生物材料暴露于含氧化剂的溶液中。
可选的，所述羟基为粘多糖的邻羟基。
可选的，所述氧化剂为高碘酸钠。
可选的，所述含氧化剂的溶液中氧化剂的质量百分比浓度为0.1％～1％；配置氧化剂溶液的溶剂为处理生物材料的常规溶剂，不会破坏生物材料的结构，例如水、PBS或生理盐水等。
可选的，生物材料在含氧化剂的溶液中的暴露时间为1～12h。
可选的，生物材料在含氧化剂溶液中的暴露方式为静态接触或动态接触。
静态接触可以理解为氧化处理过程中，生物材料与含氧化剂的溶液之间保持相对静止，例如浸泡。动态接触可以理解为氧化处理过程中，生物材料与含氧化剂溶液之间相对运动，例如向所述生物材料循环喷淋含氧化剂溶液，或在生物材料浸泡于含氧化剂溶液时搅拌或摇动反应体系。以下提到的静态接触或动态接触中，如无特殊说明，也可同此理解。
生物材料暴露于含氧化剂的溶液中，氧化剂用于将生物材料中粘多糖的邻羟基氧化成醛基，粘多糖通过其氧化后的醛基与所述生物材料中的胶原纤维连接；氧化处理后的生物材料暴露于第一交联剂中进行交联处理，生物材料中粘多糖之间通过第一交联剂交联连接；生物材料暴露于第二交联剂中进行交联处理，生物材料中胶原纤维之间通过第二交联剂交联连接；交联处理后的生物材料经脱水或干燥处理。
生物材料暴露于含氧化剂的溶液中，在该处理步骤中，一方面氧化剂将生物材料中的粘多糖分子的邻羟基氧化成醛基，另一方面，氧化后的醛基与生物材料中胶原纤维的氨基发生交联。在进一步的交联处理中，粘多糖分子与粘多糖分子之间、胶原纤维与胶原纤维之间由对应的交联剂交联形成网状结构。生物材料中本身的糖基原位打开，并形成交联网络的一部分，得到的交联生物材料其弹性和吸水性明显提高，在输送器中长期压握后，重新复水基本无折痕。同时由于粘多糖分子为生物材料的一部分，原位打开并形成交联网络的一部分在解决折痕回复问题的同时还解决了免疫原性的问题。
氧化步骤中发生的主要反应如图1所示。在按(a)(b)(c)次序、(a)(c)(b)次序或(c)(a)(b)次序进行的制备方式中，氧化处理步骤的操作均相同。
一种可选的处理次序：对生物材料依次进行(a)氧化处理、(b)第一交联处理和(c)第二交联处理：将氧化处理后的生物材料依次暴露于第一交联剂溶液和第二交联剂溶液中。
可选的，所述第一交联剂具有至少两个与醛基反应的活性基团，所述第二交联剂与第一交联剂为不同物质且第二交联剂能与第一交联剂的活性基团反应。
该处理方式中先进行粘多糖的交联再进行胶原纤维的交联。氧化处理中，生物材料中粘多糖的邻羟基被氧化为醛基，一部分醛基与生物材料中胶原纤维的氨基反应，致使粘多糖与胶原纤维之间形成交联；第一交联剂的活性基团与粘多糖的剩余部分醛基反应，致使粘多糖之间交联连接；第一交联剂交联粘多糖醛基的同时也会引入部分游离活性基团，第二交联剂主要与胶原纤维的氨基或羧基之间反应，致使胶原纤维之间相互连接，同时，前一步交联引入的游离活性基团也被第二交联剂交联。可省去第一交联剂残余活性基团封闭的步骤。
可选的，所述第一交联剂为至少具有两个氨基的小分子物质。
至少具有两个氨基的小分子物质包括氨基酸、二元胺等；其中氨基酸可选择赖氨酸；二元胺为含有二个氨基的氨基化合物，例如，乙二胺、丙二胺、己二胺、对苯二胺等。
可选的，所述第一交联剂为赖氨酸、乙二胺或己二胺。
可选的，所述第一交联剂溶液中第一交联剂的质量百分比浓度为0.05％～5％；配置第一交联剂溶液的溶剂为处理生物材料的常规溶剂，不会破坏生物材料的结构，例如水、PBS或生理盐水等。
可选的，生物材料暴露于第一交联剂溶液中的时间为0.5～12h。
可选的，所述第二交联剂为戊二醛；所述第二交联剂溶液中第二交联剂的质量百分比浓度为0.05％～25％，配置第二交联剂溶液的溶剂为处理生物材料的常规溶剂，不会破坏生物材料的结构，例如水、PBS或生理盐水等；交联时间为6h～3周；交联温度为0～37℃。
可选的，生物材料在第一交联剂溶液和第二交联剂溶液中的暴露方式均为静态接触或动态接触。
该交联处理方式中，以第一交联剂为二元胺、第二交联剂为戊二醛为例，反应原理如图2所示，二元胺交联粘多糖分子，戊二醛交联胶原纤维。
以第一交联剂为二元胺、第二交联剂为戊二醛为例，氧化及两步交联的整个反应原理如图3所示：在氧化步骤中，一方面氧化剂将生物材料中的粘多糖分子的邻羟基氧化成醛基，另一方面，氧化后的醛基与生物材料中胶原纤维的氨基发生交联。在第一交联剂交联步骤中，第一交联剂如二元胺通过氨基与醛基的反应连接生物材料中的粘多糖分子。在第二交联剂交联处理步骤中，第二交联剂如戊二醛通过醛基与氨基或羧基的反应连接生物材料的胶原纤维，最终形成交联网络。交联网络中，粘多糖分子与胶原纤维连接、粘多糖分子之间相互连接、胶原纤维之间相互连接。生物材料本身的粘多糖分子形成交联网络的一部分，多糖基具有很好的亲水性能，改善生物材料的亲水性，在生物材料吸水后快速展平。
第一交联剂二元胺交联处理后，来自第一交联剂的残余氨基在第二交联剂处理过程中也被第二交联剂交联，可省去处理第一交联剂残余氨基的步骤。
可选的，还包括将交联处理后的生物材料暴露于含封端物质溶液中封闭残余活性基团的封端处理步骤；该残余活性基团来自于第二交联剂。
所述交联剂活性基团可以理解为来自于对应交联剂的活性基团，该方式中，交联活性基团为第二交联剂的活性基团。
可选的，所述封端物质为多氨基物质。
可选的，所述多氨基物质为聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、ε-聚赖氨酸、赖氨酸或己二胺。
可选的，配置所述含封端物质溶液的溶剂为处理生物材料的常规溶剂，不会破坏生物材料的结构，例如水、PBS或生理盐水等；封端物质的质量百分比浓度为0.5％～10％。
可选的，生物材料在含封端物质溶液中的暴露时间为0.5h～12h。
可选的，生物材料在含封端物质溶液中的暴露方式为静态接触或动态接触。
可选的，还包括将封端处理后生物材料暴露于第三交联剂溶液中交联残余活性基团的后交联处理步骤；该残余活性基团来自于所述封端物质。
在封端处理步骤中，封端物质采用多氨基物质，多氨基物质包括至少两个氨基，一部分氨基与残余醛基反应、剩余部分形成残余氨基，多氨基物质中氨基含量增多，封端处理后残余氨基含量多，在该后交联处理步骤中与第三交联剂的交联位点多，形成的交联网络可进一步增强生物材料的弹性。
可选的，所述第三交联剂溶液中的第三交联剂至少具有一个与氨基反应的基团和一个亲水基团。
可选的，所述与氨基反应的基团包括酯键或环氧基团；所述亲水基团包括醇羟基或醚键。
可选的，所述第三交联剂为聚乙二醇缩水甘油醚。
可选的，配置所述第三交联剂溶液的溶剂为处理生物材料的常规溶剂，不会破坏生物材料的结构，例如水、PBS或生理盐水等；第三交联剂的质量百分比浓度为0.01％～2％。
可选的，生物材料在第三交联剂溶液中的暴露时间为2～48h。
可选的，生物材料在第三交联剂溶液中的暴露方式为静态接触或动态接触。
另一种可选的处理次序：对生物材料依次进行(c)第二交联处理、(a)氧化处理和(b)第一交联处理：将生物材料依次暴露于第二交联剂溶液、含氧化剂溶液和第一交联剂溶液中。
另一种可选的处理次序：对生物材料依次进行(a)氧化处理、(c)第二交联处理和(b)第一交联处理：将生物材料依次暴露于含氧化剂溶液、第二交联剂溶液和第一交联剂溶液中。
可选的，所述第二交联剂具有至少两个与氨基或羧基反应的活性基团，所述第一交联剂与第二交联剂为不同物质且第一交联剂能与第二交联剂的活性基团反应。
该处理方式中先进行胶原纤维交联再进行粘多糖的交联。氧化处理中，生物材料中粘多糖的邻羟基被氧化为醛基，一部分醛基与生物材料中胶原纤维的氨基交联；第二交联剂与胶原纤维的氨基或羧基反应，将胶原纤维之间相互交联；第二交联剂交联胶原纤维的同时也会引入部分游离活性基团，第一交联剂主要与粘多糖的醛基反应，将粘多糖之间相互交联，同时，第二交联剂交联步骤中引入的游离活性基团也被第一交联剂交联。可省去第一交联剂残余活性基团封闭的步骤。
可选的，所述第一交联剂为至少具有两个氨基的小分子物质。
至少具有两个氨基的小分子物质包括氨基酸、多元胺等；其中氨基酸可选择赖氨酸、聚赖氨酸或ε-聚赖氨酸等；多元胺可采用二元胺，二元胺为含有二个氨基的氨基化合物，例如，乙二胺、丙二胺、己二胺、对苯二胺等；多元胺还可采用聚乙烯亚胺。
可选的，所述第一交联剂为赖氨酸、乙二胺、己二胺、聚乙烯亚胺、聚赖氨酸或ε-聚赖氨酸。
可选的，第一交联剂溶液中第一交联剂的质量百分比浓度为0.5％～10％；配置第一交联剂溶液溶剂为处理生物材料的常规溶剂，不会破坏生物材料的结构，例如水、PBS或生理盐水等。
可选的，生物材料暴露于第一交联剂溶液中的时间为0.5～12h。
可选的，所述第二交联剂为戊二醛；所述第二交联剂溶液中第二交联剂的质量百分比浓度为0.05％～25％；配置的第二交联剂溶液的溶剂为处理生物材料的常规溶剂，不会破坏生物材料的结构，例如水、PBS或生理盐水等；交联时间为6h～3周；交联温度为0～37℃。
可选的，生物材料在第一交联剂溶液和第二交联剂溶液中的暴露方式均为静态接触或动态接触。
可选的，还包括将第一交联剂处理后的生物材料暴露于第三交联剂溶液中交联残余活性基团的后交联处理步骤；所述残余活性基团来自于第一交联剂。
该处理方式中，当第一交联剂采用双氨基小分子物质时，第一交联剂处理后残余活性基团为氨基，可直接进行聚乙二醇的后交联处理步骤。
可选的，所述第三交联剂溶液中的第三交联剂至少具有一个与氨基反应的基团和一个亲水基团。
可选的，所述与氨基反应的基团包括酯键或环氧基；所述亲水基团包括醇羟基或醚键。
可选的，所述第三交联剂为聚乙二醇缩水甘油醚。
后交联处理过程中也可加入催化剂以加速反应的进程，催化剂可选择甲基咪唑、三乙胺、四甲基乙二胺。
聚乙二醇缩水甘油醚作为第三交联剂与残余氨基反应，通过聚乙二醇形成交联网络，一方面，聚乙二醇链高度对称性增强生物组织的高弹性，可完全恢复生物材料弹性变形的能力；另一方面，水是聚乙二醇的良性溶剂，浸水之后表现出高弹性，进一步改善生物材料的抗折痕性能。
可选的，配置所述第三交联剂溶液的溶剂为处理生物材料的常规溶剂，不会破坏生物材料的结构，例如水、PBS或生理盐水等；第三交联剂的质量百分比浓度为0.01％～2％。
可选的，生物材料在第三交联剂溶液中的暴露时间为2～48h。
可选的，生物材料在第三交联剂溶液中的暴露方式为静态接触或动态接触。
可选的，上上述的所有不同处理次序的方案中，均还包括将后交联处理后的生物材料暴露于还原剂溶液中的还原步骤。氨基和醛反应形成schiff-base化学键，但是schiff-base具有可逆的特点，通过还原反应转换成稳定的炭氮单键，避免压握过程中的化学键交换反应。
可选的，所述还原剂溶液中的还原剂为氰基硼氢化钠或者硼氢化钠；配置还原剂溶液的溶剂为处理生物材料的常规溶剂，不会破坏生物材料的结构，例如水、PBS或生理盐水等；还原剂的质量百分比浓度为0.01％～2％；生物材料在还原剂溶液中的暴露时间为1～12h；生物材料在还原剂溶液中的暴露方式为静态接触或动态接触。
可选的，还原处理后的生物材料进行所述的(d)脱水或干燥处理。
可选的，所述脱水采用乙醇脱水方法；所述干燥采用冷冻干燥。
一种如所述方法制备得到的抗折痕的脱水交联生物材料。
可选的，所述脱水交联生物材料的最大断裂力n为25～30N。
可选的，所述脱水交联生物材料的最大断裂力是在水合后测试。
可选的，所述最大断裂力的测定方法为：所述脱水交联生物材料水合后，切割成1cm*5cm膜条，通过万能拉伸机测得。
所述的脱水交联生物材料水合可以理解为脱水交联生物材料重新吸水例如浸泡于生理盐水水溶液中。
可选的，所述脱水交联生物材料折叠并至少保持72小时后展平无折痕。
可选的，所述脱水交联生物材料以3*3cm膜片折叠压缩于1ml注射器圆筒中，40℃恒温放置3天后释放到生理盐水溶液中，展平无折痕。
本申请制备的生物组织可以用于介入生物瓣膜，例如通过微创介入，也可用于外科生物瓣膜，例如通过外科手术植入。
一种生物瓣膜，包括支架和安装在支架上的瓣膜，所述瓣膜为本申请所述的抗折痕的脱水交联生物材料。
该生物瓣膜可以是通过微创介入的介入瓣膜，也可以是通过外科植入的植入瓣膜。
一种介入系统，包括心脏瓣膜和输送导管，所述心脏瓣膜折叠后由输送导管输送，所述心脏瓣膜为本申请所述的生物瓣膜。
与现有技术相比，本申请至少具有如下有益效果之一：
(1)生物材料中本身的糖基原位打开，并形成交联网络的一部分，得到的交联生物材料其弹性和吸水性明显提高，在输送器中长期压握后，重新复水基本无折痕。同时由于粘多糖分子为生物材料的一部分，原位打开并形成交联网络的一部分在解决折痕回复问题的同时还解决了免疫原性的问题。
(2)第一交联剂和第二交联剂之间的残余活性基团可以互相消耗，省略封闭残余活性基团的步骤。
(3)在封端处理步骤中，封端物质采用多氨基物质，多氨基物质包括至少两个氨基，一部分氨基与残余醛基反应、剩余部分形成残余氨基，多氨基物质中氨基含量增多，封端处理后残余氨基含量多，在该后交联处理步骤中与第三交联剂的交联位点多，形成的交联网络可进一步增强生物材料的弹性。
(4)氧化剂处理步骤把心包膜中的粘多糖的邻羟基氧化成醛基，多糖类化合物连接到胶原蛋白纤维上；再通过多胺类化合物交联，使得多糖与多糖之间以及多糖与蛋白纤维之间形成一体的交联网状结构。
(5)聚乙二醇缩水甘油醚作为第三交联剂与残余氨基反应，聚乙二醇形成交联网络，聚乙二醇链高度对称性增强生物组织的高弹性，且水是聚乙二醇的良性溶剂，浸水之后表现出高弹性，进一步改善生物材料的抗折痕性能。
附图说明
图1为氧化反应步骤的原理图；
图2为第一交联剂及第二交联剂交联处理步骤的原理图；
图3为氧化、第一交联剂交联及第二交联剂交联依次处理整过程的原理图。
图4为(a)氧化处理、(b)第一交联处理、(c)第二交联处理和(d)脱水处理依次进行的流程图。
图5为(c)第二交联处理、(a)氧化处理、(b)第一交联处理和(d)脱水处理依次进行的流程图。
图6为(a)氧化处理、b)第一交联处理、(c)第二交联处理和(d)脱水处理依次进行的流程图。
图7为实施例1的流程图。
图8为实施例1制备得到的交联膜与常规戊二醛交联膜的最大断裂力对比图。
图9为实施例1制备得到的交联膜抗折痕实验结果图。
图10为实施例2制备得到的交联膜与常规戊二醛交联膜的最大断裂力对比图。
图11为实施例2制备得到的交联膜抗折痕实验结果图。
图12为实施例4制备得到的交联膜与常规戊二醛交联膜的最大断裂力对比图。
图13为实施例4制备得到的交联膜抗折痕实验结果图。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。
第一种实施方式中，对生物材料依次进行氧化处理、交联处理和脱水处理，交联处理包括依次进行的第一交联处理和第二交联处理，氧化剂氧化过程中将生物材料中的粘多糖的邻羟基氧化成醛基，多糖类化合物连接到胶原蛋白纤维上；再通过交联处理使得多糖与多糖之间、蛋白纤维之间形成一体的交联网状结构，最终形成的网络结构中多糖与多糖之间、多糖与胶原纤维之间、胶原纤维之间均形成交联。
第二交联处理后还可包括封端处理、后交联处理和还原处理，再进行脱水处理。封端处理封闭第二交联剂的残余活性基团，后交联处理交联封端物质的残余活性基团，还原处理将schiff-base化学键换成稳定的炭氮单键。
该实施方式的流程图可参照图4，依次对生物材料进行氧化处理、第一交联处理、第二交联处理、封端处理、后交联处理、还原处理和脱水处理。
氧化处理：
取新鲜的心包膜，裁剪挂板；心包膜为猪心包膜或牛心包膜。裁剪挂板后暴露于氧化剂溶液中，暴露方式可采用浸泡或喷淋。氧化剂可选择高碘酸钠，氧化剂溶液的质量百分浓度为0.1％-1％，氧化处理时间为1-12小时。
氧化处理后，心包膜中的粘多糖的邻羟基被氧化成醛基，醛基与胶原纤维的氨基反应，将粘多糖连接在胶原纤维上。
第一交联处理：
粘多糖连接在胶原纤维上后，粘多糖之间通过醛基相互交联，第一交联剂需具备与醛基反应的基团，优选采用双氨基化合物，通过氨基与醛基的反应将粘多糖之连接在一起。
双氨基化合物可从赖氨酸、乙二胺或己二胺中选择；双氨基化合物溶液中双氨基化合物的质量百分浓度为0.05％～5％；生物材料在双氨基化合物溶液中的暴露时间为0.5～12h；暴露方式可采用浸泡或喷淋。
第二交联处理：
生物材料的胶原纤维之间通过第二交联剂交联，第二交联剂可选择戊二醛，该步骤中，生物材料暴露于戊二醛溶液中，暴露方式可采用浸泡或喷淋。戊二醛溶液中戊二醛的质量百分浓度为0.05％～25％，交联时间为6h～3周，交联温度为0～37℃。
封端处理：
戊二醛交联处理后，生物材料中存在残余醛基，在该步骤中，通过封端物质进行封闭处理，封端物质优选多氨基物质，多氨基物质可从聚乙烯亚胺，聚赖氨酸，ε-聚赖氨酸，赖氨酸，己二胺等中选择。
该步骤中，生物材料暴露于多氨基物质溶液中，多氨基物质的质量百分比浓度为0.5％～10％；暴露时间为0.5h～12h；暴露方式可采用浸泡或喷淋。
第三交联处理：
在前步封端处理步骤中，采用多氨基物质作为封端物质，残余氨基再经该步骤的第三交联剂交联，第三交联剂选用聚乙二醇二缩水甘油醚，聚乙二醇形成的交联网络增强心包膜的高弹性，一方面，聚乙二醇链高度对称性增强生物组织的高弹性，能够可完全恢复生物材料弹性变形的能力；另一方面，水是聚乙二醇的良性溶剂，浸水之后表现出高弹性，进一步改善生物材料的抗折痕性能。
第三交联剂溶液中第三交联剂的质量百分比浓度为0.01％～2％；交联时间为10～48h。
还原处理：
氨基和醛反应形成schiff-base化学键，但是schiff-base具有可逆的特点。通过还原反应转换成稳定的炭氮单键，避免压握过程中的化学键交换反应。
该步骤中，生物材料暴露于还原剂溶液中，还原剂可选择氰基硼氢化钠或者硼氢化钠；还原剂的质量百分浓度为0.01％～2％；暴露时间为1～12小时；暴露方式可采用浸泡或喷淋。
脱水处理：
甘油浸泡处理后采用乙醇脱水或冷冻干燥。
第二种实施方式中，对生物材料依次进行第二交联处理、氧化处理、第一交联处理和脱水处理，第二交联处理将生物材料的胶原纤维之间相互交联，氧化剂氧化过程中将生物材料中的粘多糖的邻羟基氧化成醛基，多糖类化合物连接到胶原蛋白纤维上，再通过第一交联处理使得多糖与多糖之间形成交联。最终形成胶原纤维与胶原纤维之间、多糖与胶原纤维之间、多糖与多糖之间的交联网状结构。
第一交联处理后还可包括后交联处理和还原处理，再进行脱水处理，无需进行封端处理。后交联处理交联第一交联剂的残余活性基团，还原处理将schiff-base化学键换成稳定的炭氮单键。
该实施方式的流程图可参照图5，依次对生物材料进行第二氧化处理、氧化处理、第一交联处理、后交联处理、还原处理和脱水处理。
第二交联处理：
生物材料的胶原纤维之间通过第二交联剂交联，第二交联剂可选择戊二醛，该步骤中，生物材料暴露于戊二醛溶液中，暴露方式可采用浸泡或喷淋。戊二醛溶液中戊二醛的质量百分浓度为0.05％～25％，交联时间为6h～3周，交联温度为0～37℃。
氧化处理：
取新鲜的心包膜，裁剪挂板；心包膜为猪心包膜或牛心包膜。裁剪挂板后暴露于氧化剂溶液中，暴露方式可采用浸泡或喷淋。氧化剂可选择高碘酸钠，氧化剂溶液的质量百分浓度为0.1％-1％，氧化处理时间为1-12小时。
氧化处理后，心包膜中的粘多糖的邻羟基被氧化成醛基，醛基与胶原纤维的氨基反应，将粘多糖连接在胶原纤维上。
第一交联处理：
粘多糖连接在胶原纤维上后，粘多糖之间通过醛基相互交联，第一交联剂需具备与醛基反应的基团，优选采用多氨基物质，例如可从赖氨酸、乙二胺、己二胺、聚乙烯亚胺、聚赖氨酸或ε-聚赖氨酸中选择，通过氨基与醛基的反应将粘多糖之连接在一起。
多氨基物质溶液中多氨基物质的质量百分浓度为0.5％～10％；生物材料在多氨基物质溶液中的暴露时间为0.5～12h；暴露方式可采用浸泡或喷淋。
后交联处理：
在前步第一交联处理步骤中，采用多氨基物质作为第一交联剂，残余氨基再经该步骤的第三交联剂交联，第三交联剂选用聚乙二醇二缩水甘油醚，聚乙二醇形成的交联网络增强心包膜的高弹性，一方面，聚乙二醇链高度对称性增强生物组织的高弹性，能够可完全恢复生物材料弹性变形的能力；另一方面，水是聚乙二醇的良性溶剂，浸水之后表现出高弹性，进一步改善生物材料的抗折痕性能。
第三交联剂溶液中第三交联剂的质量百分比浓度为0.01％～2％；交联时间为10～48h。
还原处理：
氨基和醛反应形成schiff-base化学键，但是schiff-base具有可逆的特点。通过还原反应转换成稳定的炭氮单键，避免压握过程中的化学键交换反应。
该步骤中，生物材料暴露于还原剂溶液中，还原剂可选择氰基硼氢化钠或者硼氢化钠；还原剂的质量百分浓度为0.01％～2％；暴露时间为1～12小时；暴露方式可采用浸泡或喷淋。
脱水处理：
甘油浸泡处理后采用乙醇脱水或冷冻干燥。
第三种实施方式中，对生物材料依次进行氧化处理、第二交联处理、第一交联处理和脱水处理，氧化剂氧化过程中将生物材料中的粘多糖的邻羟基氧化成醛基，多糖类化合物连接到胶原蛋白纤维上，第二交联处理将生物材料的胶原纤维之间相互交联，再通过第一交联处理使得多糖与多糖之间形成交联。最终形成胶原纤维与胶原纤维之间、多糖与胶原纤维之间、多糖与多糖之间的交联网状结构。
第一交联处理后还可包括后交联处理和还原处理，再进行脱水处理，无需进行封端处理。后交联处理交联第一交联剂的残余活性基团，还原处理将schiff-base化学键换成稳定的炭氮单键。
该实施方式的流程图可参照图6，依次对生物材料进行氧化处理、第二氧化处理、第一交联处理、后交联处理、还原处理和脱水处理。
氧化处理：
取新鲜的心包膜，裁剪挂板；心包膜为猪心包膜或牛心包膜。裁剪挂板后暴露于氧化剂溶液中，暴露方式可采用浸泡或喷淋。氧化剂可选择高碘酸钠，氧化剂溶液的质量百分浓度为0.1％-1％，氧化处理时间为1-12小时。
氧化处理后，心包膜中的粘多糖的邻羟基被氧化成醛基，醛基与胶原纤维的氨基反应，将粘多糖连接在胶原纤维上。
第二交联处理：
生物材料的胶原纤维之间通过第二交联剂交联，第二交联剂可选择戊二醛，该步骤中，生物材料暴露于戊二醛溶液中，暴露方式可采用浸泡或喷淋。戊二醛溶液中戊二醛的质量百分浓度为0.05％～25％，交联时间为6h～3周，交联温度为0～37℃。
第一交联处理：
粘多糖连接在胶原纤维上后，粘多糖之间通过醛基相互交联，第一交联剂需具备与醛基反应的基团，优选采用多氨基物质，例如可从赖氨酸、乙二胺、己二胺、聚乙烯亚胺、聚赖氨酸或ε-聚赖氨酸中选择，通过氨基与醛基的反应将粘多糖之连接在一起。
多氨基物质溶液中多氨基物质的质量百分浓度为0.5％～10％；生物材料在多氨基物质溶液中的暴露时间为0.5～12h；暴露方式可采用浸泡或喷淋。
后交联处理：
在前步第一交联处理步骤中，采用多氨基物质作为第一交联剂，残余氨基再经该步骤的第三交联剂交联，第三交联剂选用聚乙二醇二缩水甘油醚，聚乙二醇形成的交联网络增强心包膜的高弹性，一方面，聚乙二醇链高度对称性增强生物组织的高弹性，能够可完全恢复生物材料弹性变形的能力；另一方面，水是聚乙二醇的良性溶剂，浸水之后表现出高弹性，进一步改善生物材料的抗折痕性能。
第三交联剂溶液中第三交联剂的质量百分比浓度为0.01％～2％；交联时间为10～48h。
还原处理：
氨基和醛反应形成schiff-base化学键，但是schiff-base具有可逆的特点。通过还原反应转换成稳定的炭氮单键，避免压握过程中的化学键交换反应。
该步骤中，生物材料暴露于还原剂溶液中，还原剂可选择氰基硼氢化钠或者硼氢化钠；还原剂的质量百分浓度为0.01％～2％；暴露时间为1～12小时；暴露方式可采用浸泡或喷淋。
脱水处理：
甘油浸泡处理后采用乙醇脱水或冷冻干燥。
上述三种实施方式中，配置所用溶液的溶剂为处理生物材料的常规溶剂，不对生物材料的结果造成负面影响，例如可选择水、PBS或生理盐水等。
以下以具体实施例进行说明：
以下实施例中，以百分比表示的浓度如无特殊说明均表示质量百分比浓度；以下实施例中所说的溶液如无明确说明均采用PBS配置。
实施例1
参照图7所示流程图：以1％高碘酸钠溶液在室温条件下浸泡猪心包膜2h；2％的赖氨酸水溶液浸泡2h；随后，在0.05％戊二醛溶液中交联5天，用0.9％生理盐水清洗干净；2％的ε-聚赖氨酸水溶液浸泡2h；2％的聚乙二醇二缩水甘油醚水溶液加入0.1％的催化剂四甲基乙二胺反应24h。用0.9％生理盐水清洗3次，1％氰基硼氢化钠水溶液浸泡2h。清洗3次后，浸泡40％的甘油水溶液，之后冷冻干燥。
以实施例1制备得到的膜进行断裂力实验和吸水展平实验。
断裂力实验：干膜水合后，切割成1*5cm膜条，通过万能拉伸机测得最大断裂力；以常规戊二醛交联膜作为对照。结果如图8所示，实施例1制备得到的膜的断裂力在25～30N，明显优于常规戊二醛交联膜。
吸水展平实验：3*3cm膜片折叠压缩到1ml注射器圆筒里如(如图9中A所示)，在40℃的烘箱里放置3天；而后释放到生理盐水溶液中，观察膜片的展平情况。结果如图9中B和C所示，其中B为常规戊二醛交联干膜，膜片有大量折痕；C为HE干膜(实施例1制备)，释放浸水后，无明显可见折痕。
实施例2
参照图5所示流程图猪心包膜在0.05％戊二醛溶液中交联5天，用0.9％生理盐水清洗干净；以1％高碘酸钠溶液在室温条件下浸泡猪心包膜2h；随后，浸泡2％的ε-聚赖氨酸溶液2h。2％的聚乙二醇二缩水甘油醚加入0.1％的催化剂反应24h。用0.9％生理盐水清洗3次，浸泡1％氰基硼氢化钠溶液2h。清洗3次后，浸泡40％异丙醇溶液，之后鼓风干燥或者冷冻干燥。
断裂力实验同实施例1，结果如图10所示，实施例2制备得到的膜的断裂力明显优于常规戊二醛交联膜。
吸水展平实验：3*3cm膜片折叠压缩到1ml注射器圆筒里如(如图11中A所示)，在40℃的烘箱里放置3天；而后释放到生理盐水溶液中，观察膜片的展平情况。结果如图10中B和C所示，其中B为常规戊二醛交联干膜，膜片有大量折痕；C为HE干膜(实施例2制备)，释放浸水后，无明显可见折痕。
实施例3
以1％高碘酸钠溶液在室温条件下浸泡猪心包膜2h。浸泡2％的赖氨酸溶液2h；随后，在0.05％戊二醛溶液中交联5天，用0.9％生理盐水清洗干净。浸泡2％的双氨基化聚乙二醇溶液反应24h。用09％生理盐水清洗3次，浸泡1％氰基硼氢化钠溶液2h。清洗3次后，浸泡40％的甘油水溶液，之后冷冻干燥。
实施例4
以1％高碘酸钠溶液在室温条件下浸泡猪心包膜2h。在0.05％戊二醛溶液中交联5天，用0.9％生理盐水清洗干净。浸泡2％的聚乙烯亚胺溶液2h；随后，浸泡2％的双氨基化聚乙二醇水溶液反应24h。用0.9％生理盐水清洗3次，浸泡1％氰基硼氢化钠溶液2h。清洗3次后，浸泡60％的甘油水溶液，之后鼓风干燥。
断裂力实验同实施例1，结果如图12所示，实施例4制备得到的膜的断裂力明显优于常规戊二醛交联膜。
吸水展平实验：3*3cm膜片折叠压缩到1ml注射器圆筒里如(如图13中A所示)，在40℃的烘箱里放置3天；而后释放到生理盐水溶液中，观察膜片的展平情况。结果如图10中B和C所示，其中B为常规戊二醛交联干膜，膜片有大量折痕；C为HE干膜(实施例4制备)，释放浸水后，无明显可见折痕。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (48)

1.一种复合交联制备抗折痕的脱水生物材料的方法，其特征在于，对生物材料进行(a)氧化处理、(b)第一交联处理、(c)第二交联处理和(d)脱水处理制得；其中，(b)在(a)之后进行且(a)(b)(c)均在(d)之前进行；
其中氧化处理时采用能够致使羟基转化为醛基的氧化剂，所述羟基来自于所述生物材料中的粘多糖，第一交联处理时采用能够致使粘多糖的醛基间相互交联的第一交联剂，第二交联处理时采用能够致使所述生物材料中胶原纤维间相互交联的第二交联剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物材料的胶原含量为60％～90％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物材料的生物来源为猪、牛、马或羊；所述生物材料的来源部位为心包膜、心脏瓣膜、血管、韧带、肌肉、肠或皮肤。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氧化处理包括将生物材料暴露于含氧化剂的溶液中。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述羟基为粘多糖的邻羟基。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述氧化剂为高碘酸钠。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述含氧化剂的溶液中氧化剂的质量百分比浓度为0.1％～1％。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，生物材料在含氧化剂的溶液中的暴露时间为1～12h。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，生物材料在含氧化剂溶液中的暴露方式为静态接触或动态接触。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对生物材料依次进行(a)氧化处理、(b)第一交联处理和(c)第二交联处理：将氧化处理后的生物材料依次暴露于第一交联剂溶液和第二交联剂溶液中。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述第一交联剂具有至少两个与醛基反应的活性基团，所述第二交联剂与第一交联剂为不同物质且第二交联剂能与第一交联剂的活性基团反应。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述第一交联剂为至少具有两个氨基的小分子物质。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述第一交联剂为赖氨酸、乙二胺或己二胺。
14.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述第一交联剂溶液中第一交联剂的质量百分比浓度为0.05％～5％；。
15.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，生物材料暴露于第一交联剂溶液中的时间为0.5～12h。
16.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述第二交联剂为戊二醛；所述第二交联剂溶液中第二交联剂的质量百分比浓度为0.05％～25％；交联时间为6h～3周；交联温度为0～37℃。
17.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，生物材料在第一交联剂溶液和第二交联剂溶液中的暴露方式均为静态接触或动态接触。
18.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，还包括将交联处理后的生物材料暴露于含封端物质溶液中封闭残余活性基团的封端处理步骤；该残余活性基团来自于第二交联剂。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述封端物质为多氨基物质。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述多氨基物质为聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、ε-聚赖氨酸、赖氨酸或己二胺；所述含封端物质溶液中封端物质的质量百分比浓度为0.5％～10％；生物材料在含封端物质溶液中的暴露时间为0.5h～12h；生物材料在含封端物质溶液中的暴露方式为静态接触或动态接触。
21.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，还包括将封端处理后生物材料暴露于第三交联剂溶液中交联残余活性基团的后交联处理步骤；该残余活性基团来自于所述封端物质。
22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述第三交联剂溶液中的第三交联剂至少具有一个与氨基反应的基团和一个亲水基团。
23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述与氨基反应的基团为酯键或环氧基团；所述亲水基团为醇羟基或醚键。
24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，所述第三交联剂为聚乙二醇缩水甘油醚。
25.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，所述第三交联剂溶液中第三交联剂的质量百分比浓度为0.01％～2％；生物材料在第三交联剂溶液中的暴露时间为2h～48h；生物材料在第三交联剂溶液中的暴露方式为静态接触或动态接触。
26.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对生物材料依次进行(c)第二交联处理、(a)氧化处理和(b)第一交联处理：将生物材料依次暴露于第二交联剂溶液、含氧化剂溶液和第一交联剂溶液中。
27.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对生物材料依次进行(a)氧化处理、(c)第二交联处理和(b)第一交联处理：将生物材料依次暴露于含氧化剂溶液、第二交联剂溶液和第一交联剂溶液中。
28.根据权利要求26或27所述的方法，其特征在于，所述第二交联剂具有至少两个与氨基或羧基反应的活性基团，所述第一交联剂与第二交联剂为不同物质且第一交联剂能与第二交联剂的活性基团反应。
29.根据权利要求28所述的方法，其特征在于，所述第一交联剂为至少具有两个氨基的小分子物质。
30.根据权利要求29所述的方法，其特征在于，所述第一交联剂为赖氨酸、乙二胺、己二胺、聚乙烯亚胺、聚赖氨酸或ε-聚赖氨酸。
31.根据权利要求26或27所述的方法，其特征在于，第一交联剂溶液中第一交联剂的质量百分比浓度为0.5％～10％。
32.根据权利要求26或27所述的方法，其特征在于，生物材料暴露于第一交联剂溶液中的时间为0.5～12h。
33.根据权利要求26或27所述的方法，其特征在于，所述第二交联剂为戊二醛；所述第二交联剂溶液中第二交联剂的质量百分比浓度为0.05％～25％；交联时间为6h～3周；交联温度为0～37℃。
34.根据权利要求26或27所述的方法，其特征在于，生物材料在第一交联剂溶液和第二交联剂溶液中的暴露方式均为静态接触或动态接触。
35.根据权利要求26或27所述的方法，其特征在于，还包括将第一交联剂处理后的生物材料暴露于第三交联剂溶液中交联残余活性基团的后交联处理步骤；所述残余活性基团来自于第一交联剂。
36.根据权利要求35所述的方法，其特征在于，所述第三交联剂溶液中的第三交联剂至少具有一个与氨基反应的基团和一个亲水基团。
37.根据权利要求36所述的方法，其特征在于，所述与氨基反应的基团包括酯键或环氧基团；所述亲水基团包括醇羟基或醚键。
38.根据权利要求37所述的方法，其特征在于，所述第三交联剂为聚乙二醇缩水甘油醚。
39.根据权利要求35所述的方法，其特征在于，所述第三交联剂溶液中第三交联剂的质量百分比浓度为0.01％～2％；生物材料在第三交联剂溶液中的暴露时间为10～48h2～48h；生物材料在第三交联剂溶液中的暴露方式为静态接触或动态接触。
40.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，还包括将后交联处理后的生物材料暴露于还原剂溶液中的还原步骤。
41.根据权利要求35所述的方法，其特征在于，还包括将后交联处理后的生物材料暴露于还原剂溶液中的还原步骤。
42.根据权利要求40或41所述的方法，其特征在于，所述还原剂溶液中的还原剂为氰基硼氢化钠或者硼氢化钠；还原剂的质量百分比浓度为0.01％～2％；生物材料在还原剂溶液中的暴露时间为1～12h；生物材料在还原剂溶液中的暴露方式为静态接触或动态接触。
43.一种如权利要求1～42任一项权利要求所述方法制备得到的抗折痕的脱水交联生物材料。
44.根据权利要求43所述的脱水交联生物材料，其特征在于，所述脱水交联生物材料的最大断裂力n为25～30N。
45.根据权利要求44所述的脱水交联生物材料，其特征在于，所述脱水交联生物材料的最大断裂力是在水合后测试。
46.根据权利要求43所述的脱水交联生物材料，其特征在于，所述脱水交联生物材料折叠并至少保持72小时后展平无折痕。
47.一种生物瓣膜，包括支架和安装在支架上的瓣膜，其特征在于，所述瓣膜为权利要求43～46任一项权利要求所述的抗折痕的脱水交联生物材料。
48.一种介入系统，包括心脏瓣膜和输送导管，所述心脏瓣膜折叠后由输送导管输送，其特征在于，所述心脏瓣膜为权利要求47所述的生物瓣膜。
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