CN114667451A - 用于鉴定调节与RBM20聚集体和/或Rbm20多肽相关的一种或多种特征的化合物的组合物、系统以及方法 - Google Patents

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Abstract

在一些方面中，本公开涉及用于筛选和鉴定调节与包含RBM20多肽的聚集体和/或RBM20多肽相关的一种或多种特征的化合物的方法。在其他方面中，本公开涉及其系统和组合物组分，诸如可用于本文所述方法的细胞模型。

Description

用于鉴定调节与RBM20聚集体和/或Rbm20多肽相关的一种或 多种特征的化合物的组合物、系统以及方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年9月18日提交的美国临时申请号62/902,309和于2020年9月4日提交的美国临时申请号63/074,985的优先权权益，所述申请各自的内容以全文引用的方式并入本文中。
在ASCII文本文件上提交序列表
在ASCII文本文件上的以下提交的内容以全文引用的方式并入本文中：序列表的计算机可读形式(CRF)(文件名：185992000240SEQLIST.TXT，记录日期：2020年9月16日，大小：11KB)。
技术领域
在一些方面中，本公开涉及用于筛选和鉴定调节与包含RBM20多肽的聚集体和/或RBM20多肽相关的一种或多种特征的化合物的方法。在其他方面中，本公开涉及其系统和组合物，诸如可用于本文所述方法的细胞模型。
背景技术
存在与筛选和鉴定可用于调节细胞过程的化合物相关的许多挑战，尤其是当靶生物分子或细胞组分在细胞过程中的作用尚不完全清楚时。举例来说，RBM20是一种已知负责泰坦(Titan)的剪接的蛋白质，泰坦是一种肌节蛋白，可提供结构支持并且在横纹肌拉伸过程中保持张力。突变体RBM20多肽的表达与导致扩张型心肌病(DCM)的病理性泰坦同种型的表达相关联。Guo等,Nat Med,18,2012。然而，目前尚不清楚RBM20如何导致疾病表现和进展。因此，用于筛选和鉴定可用于调节RBM20相关细胞过程的化合物的方法的开发受到阻碍。
本文引用的所有参考文献，包括专利申请和出版物以全文引用的方式并入本文中。
简述
在一些方面中，本文提供了一种鉴定调节与细胞的细胞质中的一种或多种包含RBM20多肽的聚集体(“RBM20聚集体”)和/或RBM20多肽相关的特征的化合物的方法，所述方法包括：(a)将化合物与包含细胞的组合物混合，其中(i)细胞包含一种或多种RBM20聚集体，和/或(ii)在化合物接触组合物后形成一种或多种RBM20聚集体；以及(b)测定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征，其中与参考相比，特征的调节表明化合物调节与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征。
在一些实施方案中，与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征是基于以下中的任何一者或多者：(i)一种或多种RBM20聚集体的定位；(ii)一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽的分布；(iii)一种或多种RBM20聚集体的数目；(iv)一种或多种RBM20聚集体的尺寸；(v)一种或多种RBM20聚集体与参考聚集体的量的比率；(vi)与一种或多种RBM20聚集体相关的功能活性；(vii)一种或多种RBM20聚集体的组成；(viii)一种或多种RBM20聚集体与生物分子的共定位；(ix)一种或多种RBM20聚集体的组分的扩散系数；(x)一种或多种RBM20聚集体的稳定性；(xi)一种或多种RBM20聚集体的溶解或尺寸减小；(xii)一种或多种RBM20聚集体的表面积；(xiii)一种或多种RBM20聚集体的球形度；(xiv)一种或多种RBM20聚集体的流动性；(xv)一种或多种RBM20聚集体的固化；(xvi)RBM20多肽的定位；(xvii)RBM20多肽或其前体的量；(xviii)RBM20多肽在一种或多种RBM20聚集体中的聚集体分配；(xix)与RBM20多肽相关的功能活性；(xx)RBM20多肽的聚集；(xxi)RBM20多肽的翻译后修饰状态；以及(xxii)RBM20多肽降解产物的量。
在一些实施方案中，特征的调节是基于细胞的细胞质中一种或多种RBM20聚集体的数目的减少。在一些实施方案中，特征的调节是基于细胞的细胞质中RBM20多肽或其前体的量的减少。在一些实施方案中，特征的调节是基于细胞的细胞质中一种或多种RBM20聚集体的溶解或尺寸减小。在一些实施方案中，特征的调节是基于细胞的细胞质中与一种和/或多种RBM20聚集体或RBM20多肽相关的功能活性的降低。
在一些实施方案中，与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征包括一种或多种RBM20聚集体的定位、一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽的分布、一种或多种RBM20聚集体的数目、一种或多种RBM20聚集体的尺寸以及一种或多种RBM20聚集体与参考聚集体的量的比率。在一些实施方案中，与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征包括一种或多种RBM20聚集体的组成，以及一种或多种RBM20聚集体与生物分子的共定位。在一些实施方案中，与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征还包括与一种或多种RBM20聚集体相关的功能活性。
在一些实施方案中，与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征包括一种或多种RBM20聚集体的稳定性、一种或多种RBM20聚集体的溶解或尺寸减小以及一种或多种RBM20聚集体的表面积。
在一些实施方案中，与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征包括一种或多种RBM20聚集体的球形度、一种或多种RBM20聚集体的流动性以及一种或多种RBM20聚集体的固化。
在一些实施方案中，与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征包括RBM20多肽的定位以及RBM20多肽或其前体的量。在一些实施方案中，与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征还包括RBM20多肽的翻译后修饰状态。在一些实施方案中，与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征还包括与RBM20多肽相关的功能活性。
在一些实施方案中，与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征包括一种或多种RBM20聚集体与生物分子的共定位以及一种或多种RBM20聚集体的组分的扩散系数。
在一些实施方案中，与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征包括一种或多种RBM20聚集体的稳定性以及一种或多种RBM20聚集体的溶解或尺寸减小。
在一些实施方案中，与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征包括一种或多种RBM20聚集体的表面积、一种或多种RBM20聚集体的球形度、一种或多种RBM20聚集体的流动性以及一种或多种RBM20聚集体的固化。
在一些实施方案中，RBM20多肽为野生型RBM20多肽。在一些实施方案中，RBM20多肽为突变体RBM20多肽。在一些实施方案中，突变体RBM20多肽包含内在无序区(IDR)中的突变。在一些实施方案中，突变体RBM20多肽包含RS富集区中的突变。在一些实施方案中，突变体RBM20多肽包含以下位置中的一者或多者中的突变：精氨酸634、丝氨酸635、精氨酸636、丝氨酸637以及脯氨酸638。在一些实施方案中，突变体RBM20多肽包含以下突变中的一者或多者：R636S、R636C、R636H、R634Q、S637G、P638L、S635A、S635E以及S637E。在一些实施方案中，突变体RBM20多肽包含以下突变中的一者或多者：E913K、R716Q以及V535L。
在一些实施方案中，RBM20多肽在细胞中异源表达。在一些实施方案中，RBM20多肽在细胞中同源表达。
在一些实施方案中，细胞为心脏细胞类型的模型。在一些实施方案中，细胞为心肌细胞。在一些实施方案中，细胞为大鼠H9C2细胞。在一些实施方案中，细胞为人AC-16细胞、源自患者的心肌细胞、分化为心肌细胞的人诱导多能干细胞或分化为心肌细胞的干细胞。在一些实施方案中，细胞选自由以下组成的组：HeLa细胞、U2OS细胞、人胚胎肾细胞、人诱导多能干细胞以及干细胞。在一些实施方案中，细胞对于编码RBM20多肽的等位基因来说为纯合的。在一些实施方案中，细胞对于编码RBM20多肽的等位基因来说为杂合的。
在一些实施方案中，参考包含包含与对照剂混合的细胞的组合物的等分试样。
在一些实施方案中，本文所述的方法还包括对组合物或细胞的至少一部分进行成像。
在一些实施方案中，本文所述的方法还包括测定细胞的一种或多种细胞特征。
在一些实施方案中，本文所述的方法还包括使组合物或细胞的至少一部分与固定剂接触。
在一些实施方案中，本文所述的方法还包括对组合物或细胞的至少一部分与染色剂接触。
在一些实施方案中，本文所述的方法还包括使用第二基于细胞的测定对所鉴定的化合物进行评估。
在一些实施方案中，本文所述的方法还包括使用体外测定对所鉴定的化合物进行评估。
在另一方面中，本文提供了一种鉴定使细胞的细胞质中包含RBM20多肽的聚集体(“RBM20聚集体”)的尺寸和/或数目减小的化合物的方法，所述方法包括：(a)测定接受化合物的细胞的至少一部分细胞质中的RBM20聚集体的尺寸和/或数目；以及(b)将RBM20聚集体的尺寸和/或数目与参考进行比较，从而鉴定使细胞的细胞质中RBM20聚集体的尺寸和/或数目减小的化合物。
在一些实施方案中，化合物使RBM20聚集体的数目减少。在一些实施方案中，化合物使RBM20聚集体的尺寸减小。
在另一方面中，本文提供了一种鉴定阻止细胞的细胞质中一种或多种包含RBM20多肽的聚集体(“RBM20聚集体”)的形成或生长的化合物的方法，所述方法包括：(a)将化合物与包含细胞的组合物合并，其中(i)细胞包含一种或多种RBM20聚集体，和/或(ii)在化合物接触组合物后形成一种或多种RBM20聚集体；以及(b)获得对细胞的至少一部分细胞质中一种或多种RBM20聚集体的尺寸和/或数目的第一次测量；以及(c)将所述第一次测量与参考进行比较，从而鉴定阻止细胞的细胞质中一种或多种RBM20聚集体的形成或生长的化合物。
在一些实施方案中，参考包含包含与对照剂混合的细胞的组合物的等分试样。在一些实施方案中，参考为对细胞的至少一部分细胞质中一种或多种RBM20聚集体的尺寸和/或数目的第二次测量，并且其中第二次测量在与第一次测量不同的时间进行。
在一些实施方案中，本文所述的方法还包括使细胞经受有助于一种或多种RBM20聚集体形成的条件。
在另一方面中，本文提供了一种鉴定使细胞的细胞质中RBM20多肽的量降低的化合物的方法，所述方法包括：(a)将化合物与包含细胞的组合物合并；以及(b)获得对细胞的至少一部分细胞质中RBM20多肽的量的第一次测量；以及(c)将所述第一次测量与参考进行比较，从而鉴定使细胞的细胞质中RBM20多肽的量减少的化合物。
在一些实施方案中，参考包含包含与对照剂混合的细胞的组合物的等分试样。
在一些实施方案中，参考为对细胞的至少一部分细胞质中RBM20多肽的量的第二次测量，并且其中第二次测量在与第一次测量不同的时间进行。
在另一方面中，本文提供了一种鉴定调节与一种或多种包含RBM20多肽的聚集体(“RBM20聚集体”)相关的特征的化合物的方法，所述方法包括：(a)将化合物与包含一种或多种RBM20聚集体的溶液以及额外聚集体溶液混合；以及(b)测定与一种或多种RBM20聚集体相关的特征，其中与参考相比，特征的调节表明化合物调节与一种或多种RBM20聚集体相关的特征。
在另一方面中，本文提供了一种鉴定调节与一种或多种包含RBM20多肽的聚集体(“RBM20聚集体”)和/或RBM20多肽相关的特征的化合物的方法，所述方法包括：(a)在存在化合物的情况下将一种剂与包含RBM20多肽的溶液合并，其中所述剂能够使得所述一种或多种RBM20聚集体形成，并且在所述剂接触所述溶液后形成所述一种或多种RBM20聚集体；以及(b)测定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征，其中与参考相比，特征的调节表明化合物调节与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征。
在一些实施方案中，与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征是基于以下中的任何一者或多者：(i)一种或多种RBM20聚集体的数目；(ii)一种或多种RBM20聚集体的组成；(iii)一种或多种RBM20聚集体的尺寸；(iv)一种或多种RBM20聚集体的稳定性；(v)一种或多种RBM20聚集体的溶解或尺寸减小；(vi)一种或多种RBM20聚集体的表面积；(vii)一种或多种RBM20聚集体的球形度；(viii)一种或多种RBM20聚集体的流动性；(ix)一种或多种RBM20聚集体的固化；(x)不在一种或多种RBM20聚集体中的RBM20多肽的量；(xi)RBM20多肽在一种或多种RBM20聚集体中的分配；和(xii)RBM20多肽的聚集。
在另一方面中，本文提供了一种鉴定可用于治疗RBM20相关疾病的化合物的方法，所述方法包括根据本文所述的任何一种方法来鉴定化合物。在一些实施方案中，RBM20相关疾病为心肌病。在一些实施方案中，心肌病为扩张型心肌病。
在另一方面中，本文提供了一种鉴定调节用于包含RBM20多肽的聚集体(“RBM20聚集体”)的生物分子的分配的化合物的方法，所述方法包括：(a)将化合物与包含细胞的组合物混合，其中(i)细胞包含RBM20聚集体，和/或(ii)化合物接触组合物后在细胞中形成RBM20聚集体；以及(b)测定用于RBM20聚集体的生物分子的分配。在一些实施方案中，生物分子为非RBM20多肽。在一些实施方案中，生物分子为野生型RBM20多肽。在一些实施方案中，包含RBM20多肽的RBM20聚集体包含突变体RBM20多肽。
本领域技术人员还应理解，在不脱离本公开的范围的情况下，可对本文所述的具体实施的形式和细节做出改变。另外，尽管已经参考各种具体实施描述了各种优点、方面以及目标，但是本公开的范围不应因提及此类优点、方面以及目标而受到限制。
附图说明
图1A和图1B示出了用野生型RBM20多肽(图1A)或R636S突变体RBM20多肽(图1B)瞬时转染的HeLa细胞的荧光图像。
图2A和图2B示出了用野生型RBM20多肽(图2A)或R636S突变体RBM20多肽(图2B)瞬时转染的U2OS细胞的荧光图像。
图3A至图3D示出了用野生型RBM20多肽(图3A)、R636S突变体RBM20多肽(图3B)、R636C突变体RBM20多肽(图3C)或R636H突变体RBM20多肽(图3D)瞬时转染的U2OS细胞的荧光图像。
图4A至图4H示出了用野生型RBM20多肽(图4A)、R636S突变体RBM20多肽(图4B)、R636C突变体RBM20多肽(图4C)、R636H突变体RBM20多肽(图4D)、R634Q突变体RBM20多肽(图4E)、S635A突变体RBM20多肽(图4F)、S637G突变体RBM20多肽(图4G)或P638L突变体RBM20多肽(图4H)瞬时转染的H9C2细胞的荧光图像。
图5A和图5B示出了用野生型RBM20多肽瞬时转染的U2OS细胞的荧光图像。
图6A至图6D示出了用野生型RBM20多肽瞬时转染以及用对照(DMSO)(图6A)、硫辛酰胺(30μM)(图6B)、米托蒽醌(mitoxantrone)(20μM)(图6C)或JQ1(10μM)(图6D)处理的H9C2细胞的荧光图像。
图7A为说明RBM20多肽的选择区域的示意图。图7B示出了对RBM20多肽序列的有序和无序区的分析的结果。
图8A和图8B示出了经过瞬时转染以表达野生型RBM20多肽的H9C2细胞的荧光图像。
图9示出了经过瞬时转染以表达具有C端NLS融合(上图)或不具有C端NLS融合(下图)的R636S突变体RBM20多肽的H9C2细胞的荧光图像。
图10示出了经过瞬时转染以表达与Dendra2标记连接的磷酸模拟突变体RBM20多肽(R636S、S635E、S637E)或与Dendra2标记连接的突变体R636S RBM20多肽的H9C2细胞的荧光图像。
图11示出了经过瞬时转染以表达各种RBM20多肽截短形式的H9C2细胞的荧光图像。
图12A至图12D示出了经过瞬时转染以表达(i)突变体R636S RBM20多肽与野生型RBM20多肽；(ii)突变体R636S RBM20多肽与NEC多肽；(iii)突变体R636S RBM20多肽；或(iv)野生型RBM20多肽的H9C2细胞的荧光图像和分析。
图13A至图13D示出了经过瞬时转染以表达各自与Dendra2标记连接的野生型RBM20多肽(图13A)、E913K突变体RBM20多肽(图13B)、R716Q突变体RBM20多肽(图13C)以及V535L突变体RBM20多肽(图13D)的H9C2细胞的荧光图像。
图14示出了经过瞬时转染以表达野生型RBM20多肽(上图)或突变体RBM20多肽(下图)的H9C2细胞的荧光图像。针对DAPI(以显示细胞核)和DDX3X蛋白(使用IF技术)对细胞进行共染色。
图15示出了经过瞬时转染以表达野生型RBM20多肽(上图)或突变体RBM20多肽(下图)的H9C2细胞的荧光图像。针对DAPI(以显示细胞核)和PSPC1蛋白(使用IF技术)对细胞进行共染色。
图16示出了经过瞬时转染以表达Dendra标记的野生型RBM20多肽或Dendra标记的R636S突变体RBM20多肽的H9C2细胞的荧光图像。针对各种核蛋白PTBP1、SRRM1、U2AF65以及SC35对细胞进行染色。
图17示出了经过瞬时转染以表达mCherry标记的野生型RBM20多肽或mCherry标记的R636S突变体RBM20多肽与GFP标记的DDX3X的组合的H9C2细胞的荧光图像。针对DAPI和应激颗粒标记物G3BP1蛋白对细胞进行共染色。
图18示出了经过诱导以表达与Dendra2标记连接的野生型RBM20多肽或与Dendra2标记连接的R636S突变体RBM20多肽的H9C2细胞的荧光和DIC图像。
图19A至图19D示出了用
Figure BDA0003548733440000101
NucLight快速红色试剂染色的经过诱导以表达野生型RBM20多肽或R636S突变体RBM20多肽的H9C2细胞的细胞增殖曲线。不添加多西环素(doxycycline)作为对照。
图20A至图20E示出了在具有或不具有星形孢菌素(Staurosporine)(STS)应激的情况下表达野生型RBM20多肽或R636S突变体RBM20多肽的H29C细胞的凋亡分析。细胞凋亡的程度由发光(RLU)信号指示。
图21示出了经过诱导以表达野生型或R636S突变体RBM20多肽的H29C细胞(未用STS应激处理)的荧光和DIC图像。
图22示出了经过诱导以表达形成细胞质聚集体的用Dendra2标记的R636S突变体RBM20多肽并且用DAPI和应激颗粒蛋白elF3e共染色的H9C2细胞的荧光图像。
图23示出了经过瞬时转染以表达R636S突变体RBM20多肽的H9C2细胞的荧光图像。将DMSO、石胆酸以及二盐酸奎纳克林(Quinacrine 2HCl)添加至细胞中以监测细胞质R636S突变体RBM20聚集体特性。未转染的H9C2细胞用作对照。
图24A至图24E示出了经过瞬时转染以表达R636S突变体RBM20多肽的H9C2细胞的荧光图像。将化合物雷公藤内酯(PG490)(图24A)、BIO(图24B)、优普色替(Uprosertib)(GSK2141795)(图24C)、茴香霉素(图24D)以及WS6(图24E)全部添加，以监测细胞质R636S突变体RBM20聚集体特性。
具体实施方式
本公开提供了用于鉴定调节与一种或多种包含RBM20多肽的聚集体(“RBM20聚集体”)和/或RBM20多肽相关的一种或多种特征的化合物的组合物、系统以及方法。本文所述的公开内容至少部分是基于关于与功能异常和/或位移的RBM20多肽和异常RBM20聚集体相关的疾病机制以及用于筛选和鉴定可用于调节细胞途径相关RBM20聚集体和/或RBM20多肽的化合物的组合物、系统以及方法的出人意料的发现和本发明人的独特见解。在正常生理条件下，在细胞质中产生野生型RBM20，然后转运至细胞核，在细胞核中它执行生物学功能，诸如参与编码包括泰坦在内的蛋白质的RNA的剪接。如本文所述，某些突变体RBM20多肽的表达和/或RBM20多肽(包括野生型RBM20多肽)的过表达导致RBM20多肽和RBM20聚集体存在和维持在细胞的细胞质中。不受理论束缚，本发明人相信细胞质中RBM20多肽和/或RBM20聚集体的存在导致异常分子过程以及疾病发展和表现，诸如扩张型心肌病(DCM)。举例来说，细胞质RBM20聚集体(诸如含有突变体RBM20多肽的那些细胞质RBM20聚集体)可充当某些生物分子(包括蛋白质(诸如野生型RBM20多肽)和核酸)的储池。这又可能会导致获得影响细胞活力、细胞毒性以及细胞增殖的毒性功能。本文所述的方法可用于鉴定和理解与RMB20相关疾病机制相关的特征，并且此类工具和知识进一步使得组合物、系统以及方法可用于筛选对RBM20聚集体和/或RBM20多肽的一种或多种特征具有所需影响的化合物。还可将此类组合物、系统以及方法整合在药物发现平台中以增强候选物鉴定和先导物优化。对调节与细胞的细胞质中的一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征的化合物的鉴定可实现对可用于治疗或预防异常分子过程、疾病和/或与存在细胞质RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的症状的化合物的鉴定。
本领域技术人员还应理解，在不脱离本公开的范围的情况下，可对本文所述的具体实施的形式和细节做出改变。另外，尽管已经参考各种具体实施描述了各种优点、方面以及目标，但是本公开的范围不应因提及此类优点、方面以及目标而受到限制。
I.定义
出于解释本说明书的目的，以下定义将适用，并且只要合适，以单数形式使用的术语也将包括复数，反之亦然。如果下文提出的任何定义与以引用方式并入本文中的任何文件相冲突，则应以所提出的定义为准。
如本文所用，“聚集体”是指由一种或多种蛋白质和/或其他大分子的相分离(包括相分离的所有阶段)形成的非膜包封隔室。
如本文所用，术语“多肽”和“蛋白质”可互换地用于指包含氨基酸残基的聚合物，并且不限于最小长度。此类聚合物可含有天然或非天然氨基酸残基或其组合，并且包括但不限于肽、多肽、寡肽、氨基酸残基的二聚体、三聚体以及多聚体。此定义涵盖全长多肽或蛋白质及其片段。所述术语还包括其修饰种类，诸如一个或多个残基的翻译后修饰，例如甲基化、磷酸化糖基化、唾液酸化或乙酰化。
如本文所用，术语“包含”、“具有”、“含有”和“包括”和其他类似形式以及其语法等价物意在含义上相同并且为开放性的，即跟在这些术语中的任一者后的一个或多个项不意味着是所述一个或多个项的详尽列表，或意味着仅限于所列的一个或多个项。举例来说，“包含”组件A、B以及C的物品可由(即，仅含有)组件A、B以及C组成，或者可不仅含有组件A、B以及C，而且还含有一个或多个其他组件。因此，“包含”及其类似形式以及其语法等价物意在并且应理解为包括“基本上由……组成”或“由……组成”的实施例的公开内容。
在提供数值范围时，应理解在所陈述范围内明确地排除极限值的条件下，在所述范围的上下限之间的每个中间值(除非上下文另外明确规定，否则所述中间值达到下限单位的十分之一)和在所述陈述范围内的任何其他陈述值或中间值涵盖在本公开内。在所陈述的范围包括所述限值中的一者或两者的情况下，排除这些所包括的限值中的一者或两者的范围也包括在本公开内容中。
本文中提到“约”一个值或参数包括(并且描述)针对所述值或参数本身的变化。举例来说，提到“约X”的描述包括对“X”的描述。
除非上下文另外明确规定，否则如本文中，包括随附权利要求中所用，单数形式“一个(种)”、“或”以及“所述”包括复数指示物。
II.鉴定化合物的方法
在一些方面中，本公开提供了鉴定调节与一种或多种包含RBM20多肽的聚集体(“RBM20聚集体”)和/或RBM20多肽相关的特征的化合物(或其部分)的方法。在一些实施方案中，一种或多种特征与同RBM20相关的细胞机制相关，并且一种或多种特征的调节引起对细胞机制的所需调节。本文所述的某些方法侧重于鉴定/评估/调节与细胞质中的RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的一种或多种特征，并且此类方法还可用于鉴定/评估/调节细胞系统的任何部分中(例如细胞质、细胞核或其他细胞器或生物化学系统中)与RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的一种或多种特征。在一些实施方案中，RBM20聚集体和/或RBM20多肽(例如野生型RBM20多肽)在细胞核中。在一些实施方案中，RBM20聚集体和/或RBM20多肽(例如突变体RBM20多肽)在细胞质中。本文所述的某些方法还可用于鉴定/评估/调节与非RBM20聚集体和/或非RBM20多肽相关的一种或多种特征，例如通过将不为RBM20的生物分子从细胞质RBM20聚集体释放回其正常位置(例如生物分子在隔离在细胞质RBM20聚集体中之前用于驻留其中的位置，诸如非RBM20聚集体)来调节不为RBM20的多肽。因此，本文所述的某些化合物(或其一部分)调节与非RBM20聚集体和/或非RBM20多肽相关的一种或多种特征，其进而调节与本文所述的RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的一种或多种特征。
在一些实施方案中，本文所述的方法可用于鉴定、评估、筛选、和/或设计调节分子(例如生物分子，包括蛋白质或核酸)在RBM20聚集体中的分配的化合物。举例来说，在一些实施方案中，RBM20聚集体隔离分子(诸如包括野生型RBM20或非RBM20多肽的生物分子)，并且本文所述的方法可用于鉴定、评估、筛选和/或设计将分子从RBM20聚集体中驱赶出来的化合物。在一些实施方案中，本文所述的方法可用于鉴定、评估、筛选和/或设计将野生型RBM20多肽从RBM20聚集体中驱赶出来的化合物。在一些实施方案中，本文所述的方法可用于鉴定、评估、筛选和/或设计将非RBM20多肽从RBM20聚集体中驱赶出来的化合物。在一些实施方案中，分子(诸如包括野生型RBM20或非RBM20多肽的生物分子)在从RBM20聚集体中出来后正常发挥功能(诸如具有正常生物功能和/或活性)。
在一些实施方案中，本文所述的方法可用于鉴定、评估、筛选和/或设计将分子驱赶至RBM20聚集体中的化合物。在一些实施方案中，本文所述的方法可用于鉴定、评估、筛选和/或设计将非RBM20多肽驱赶至RBM20聚集体中的化合物。
在一些实施方案中，本文描述了一种鉴定调节与细胞的细胞质中的一种或多种包含RBM20多肽的聚集体(“RBM20聚集体”)相关的特征的化合物(或其一部分)的方法，所述方法包括：(a)将化合物与包含细胞的组合物混合，其中(i)细胞包含一种或多种RBM20聚集体，和/或(ii)化合物接触组合物后形成一种或多种RBM20聚集体；以及(b)测定与一种或多种RBM20聚集体相关的特征，其中与参考相比，特征的调节表明化合物调节与一种或多种RBM20聚集体相关的特征。
在一些实施方案中，本文描述了一种鉴定调节与细胞的细胞质中的RBM20多肽相关的特征的化合物(或其一部分)的方法，所述方法包括：(a)将化合物与包含细胞的组合物混合；以及(b)测定与RBM20多肽相关的特征，其中与参考相比，特征的调节表明化合物调节与RBM20多肽相关的特征。
在一些实施方案中，本文描述了一种鉴定调节与细胞的细胞质中的一种或多种包含RBM20多肽的聚集体(“RBM20聚集体”)和RBM20多肽相关的一种或多种特征的化合物(或其一部分)的方法，所述方法包括：(a)将化合物与包含细胞的组合物混合，其中(i)细胞包含一种或多种RBM20聚集体，和/或(ii)化合物接触组合物后形成一种或多种RBM20聚集体；以及(b)测定与一种或多种RBM20聚集体和RBM20多肽相关的一种或多种特征，其中与参考相比，特征的调节表明化合物调节与一种或多种RBM20聚集体和RBM20多肽相关的一种或多种特征。
在一些实施方案中，本文描述了一种鉴定调节与细胞的细胞质中的一种或多种包含RBM20多肽的聚集体(“RBM20聚集体”)相关的特征的化合物(或其一部分)的方法，所述方法包括测定与包含细胞和化合物或其衍生物的组合物中的一种或多种RBM20聚集体相关的特征，其中与参考相比，特征的调节表明化合物调节与一种或多种RBM20聚集体相关的特征，并且其中(i)细胞包含一种或多种RBM20聚集体，和/或(ii)化合物接触组合物后形成一种或多种RBM20聚集体。
在一些实施方案中，本文描述了一种鉴定调节与细胞的细胞质(或细胞核)中的RBM20多肽相关的特征的化合物(或其一部分)的方法，所述方法包括测定与包含细胞和化合物或其衍生物的组合物中的RBM20多肽相关的特征，其中与参考相比，特征的调节表明化合物调节与RBM20多肽相关的特征。
在一些实施方案中，本文描述了一种鉴定调节与细胞的细胞质中的一种或多种包含RBM20多肽的聚集体(“RBM20聚集体”)和RBM20多肽相关的一种或多种特征的化合物(或其一部分)的方法，所述方法包括测定与包含细胞和化合物或其衍生物的组合物中的一种或多种RBM20聚集体和RBM20多肽相关的一种或多种特征，其中与参考相比，特征的调节表明化合物调节与一种或多种RBM20聚集体和RBM20多肽相关的一种或多种特征，并且其中(i)细胞包含一种或多种RBM20聚集体，和/或(ii)化合物接触组合物后形成一种或多种RBM20聚集体。
在一些实施方案中，本文描述了一种鉴定调节与细胞系统中的一种或多种包含RBM20多肽的聚集体(“RBM20聚集体”)相关的特征的化合物(或其一部分)的方法，所述方法包括：(a)将化合物与包含细胞的组合物混合，其中(i)细胞包含一种或多种RBM20聚集体，和/或(ii)化合物接触组合物后形成一种或多种RBM20聚集体；以及(b)测定与一种或多种RBM20聚集体相关的特征，其中与参考相比，特征的调节表明化合物调节与一种或多种RBM20聚集体相关的特征。
在一些实施方案中，本文描述了一种鉴定调节与细胞系统中的RBM20多肽相关的特征的化合物(或其一部分)的方法，所述方法包括：(a)将化合物与包含细胞的组合物混合；以及(b)测定与RBM20多肽相关的特征，其中与参考相比，特征的调节表明化合物调节与RBM20多肽相关的特征。
在一些实施方案中，本文描述了一种鉴定调节与细胞系统中的一种或多种包含RBM20多肽的聚集体(“RBM20聚集体”)和RBM20多肽相关的一种或多种特征的化合物(或其一部分)的方法，所述方法包括：(a)将化合物与包含细胞的组合物混合，其中(i)细胞包含一种或多种RBM20聚集体，和/或(ii)化合物接触组合物后形成一种或多种RBM20聚集体；以及(b)测定与一种或多种RBM20聚集体和RBM20多肽相关的一种或多种特征，其中与参考相比，特征的调节表明化合物调节与一种或多种RBM20聚集体和RBM20多肽相关的一种或多种特征。
在一些实施方案中，本文描述了一种鉴定调节与细胞系统中的一种或多种包含RBM20多肽的聚集体(“RBM20聚集体”)相关的特征的化合物(或其一部分)的方法，所述方法包括测定与包含细胞和化合物或其衍生物的组合物中的一种或多种RBM20聚集体相关的特征，其中与参考相比，特征的调节表明化合物调节与一种或多种RBM20聚集体相关的特征，并且其中(i)细胞包含一种或多种RBM20聚集体，和/或(ii)化合物接触组合物后形成一种或多种RBM20聚集体。
在一些实施方案中，本文描述了一种鉴定调节与细胞系统中的RBM20多肽相关的特征的化合物(或其一部分)的方法，所述方法包括测定与包含细胞和化合物或其衍生物的组合物中的RBM20多肽相关的特征，其中与参考相比，特征的调节表明化合物调节与RBM20多肽相关的特征。
在一些实施方案中，本文描述了一种鉴定调节与细胞系统中的一种或多种包含RBM20多肽的聚集体(“RBM20聚集体”)和RBM20多肽相关的一种或多种特征的化合物(或其一部分)的方法，所述方法包括测定与包含细胞和化合物或其衍生物中的一种或多种RBM20聚集体和RBM20多肽相关的一种或多种特征，其中与参考相比，特征的调节表明化合物调节与一种或多种RBM20聚集体和RBM20多肽相关的一种或多种特征，并且其中(i)细胞包含一种或多种RBM20聚集体，和/或(ii)化合物接触组合物后形成一种或多种RBM20聚集体。在一些实施方案中，本文描述了一种鉴定调节与一种或多种包含RBM20多肽的聚集体(“RBM20聚集体”)相关的特征的化合物(或其一部分)的方法，所述方法包括：(a)将化合物与包含一种或多种RBM20聚集体的溶液以及额外聚集体溶液混合；以及(b)测定与一种或多种RBM20聚集体相关的特征，其中与参考相比，特征的调节表明化合物调节与一种或多种RBM20聚集体相关的特征。
在一些实施方案中，本文描述了一种鉴定调节与一种或多种包含RBM20多肽的聚集体(“RBM20聚集体”)和/或RBM20多肽相关的特征的化合物(或其一部分)的方法，所述方法包括：(a)在存在化合物的情况下将一种剂与包含RBM20多肽的溶液合并，其中所述剂能够使得所述一种或多种RBM20聚集体形成，并且在所述剂接触所述溶液后形成所述一种或多种RBM20聚集体；以及(b)测定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征，其中与参考相比，特征的调节表明化合物调节与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征。
在一些实施方案中，与一种或多种RBM20聚集体相关的特征是基于以下中的任何一者或多者：(i)一种或多种RBM20聚集体的定位；(ii)一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽的分布；(iii)一种或多种RBM20聚集体的数目；(iv)一种或多种RBM20聚集体的尺寸；(v)一种或多种RBM20聚集体与参考聚集体的量的比率；(vi)与一种或多种RBM20聚集体相关的功能活性；(vii)一种或多种RBM20聚集体的组成；(viii)一种或多种RBM20聚集体与生物分子的共定位；(ix)一种或多种RBM20聚集体的组分的扩散系数；(x)一种或多种RBM20聚集体的稳定性；(xi)一种或多种RBM20聚集体的溶解或尺寸减小；(xii)一种或多种RBM20聚集体的表面积；(xiii)一种或多种RBM20聚集体的球形度；(xiv)一种或多种RBM20聚集体的流动性；以及(xv)一种或多种RBM20聚集体的固化。在一些实施方案中，与RBM20多肽相关的特征是基于以下中的任何一者或多项：(i)RBM20多肽的定位；(ii)RBM20多肽或其前体的量；(iii)RBM20多肽在一种或多种RBM20聚集体中的聚集体分配；(iv)与RBM20多肽相关的功能活性；(v)RBM20多肽的聚集；(vi)RBM20多肽的翻译后修饰状态；以及(vii)RBM20多肽降解产物的量。
本文所述的方法可采用低通量或高通量的多种形式(例如基于细胞的方法或生物化学方法，诸如体外方法)，并且其中使用的组分(例如细胞或RBM20多肽)可以多种方式使用，包括本文所述以外的方法。举例来说，在一些实施方案中，本文所述的方法可用于例如鉴定调节以下中的任何一者或多者的化合物：RBM20多肽的核转位、细胞质RBM20多肽(诸如调节定位或功能)或细胞质RBM20聚集体(诸如调节定位或功能)。本文提供的方法及其组成部分的某些实施例的描述并非旨在限制本公开的范围，并且本领域技术人员将容易理解可在不脱离本公开的范围的情况下对本文描述的实施方式的形式和细节作出改变。
A.基于细胞的方法
在一些方面中，本文所述的方法为基于细胞的方法。本领域普通技术人员将容易认识到细胞过程(包括聚集体及其组分的状态)为动态的。因此，本文所述的方法涵盖在RBM20多肽和/或RBM20聚集体生命周期的任何时间点使细胞与化合物接触。举例来说，所述方法涵盖当RBM20多肽位于细胞的任何位置、呈任何数量或具有任何翻译后修饰状态(诸如存在、不存在或具有一定水平的磷酸化残基)时，使细胞与化合物接触。在一些方面中，所述方法还可涵盖例如当RBM20聚集体位于细胞的任何位置、以任何数量存在(包括不存在)、正在经历形态变化(诸如尺寸或流动性变化)或组成正在发生变化时，使细胞与化合物接触。在一些实施方案中，所述方法包括将化合物与包含细胞的组合物混合，其中(i)细胞包含一种或多种RBM20聚集体，和/或(ii)在化合物接触组合物后形成一种或多种RBM20聚集体。在一些实施方案中，所述方法包括将化合物与包含细胞的组合物混合，其中细胞包含一种或多种RBM20聚集体。在一些实施方案中，所述方法包括将化合物与包含细胞的组合物混合，其中细胞在化合物接触组合物后形成一种或多种RBM20聚集体。在一些实施方案中，所述方法包括在使化合物与包含细胞的组合物混合或接触之前形成一种或多种RBM20聚集体。在一些实施方案中，所述方法包括在使化合物与包含细胞的组合物混合或接触之后形成一种或多种RBM20聚集体。在一些实施方案中，将化合物与包含细胞的组合物混合使得形成一种或多种RBM20聚集体。在本文所述方法的一些实施方案中，可例如通过诱导多肽(诸如RBM20多肽或聚集体支架蛋白)的表达或通过添加拥挤剂来触发RBM20聚集体形成。在本文所述方法的一些实施方案中，将两种或更多种化合物(诸如2、3、4或5种化合物中的任何一种)与包含细胞的组合物混合。在本文所述的方法的一些实施方案中，使包含细胞的组合物与化合物接触超过一次，例如在多于一个时间点将多于一个等分试样的化合物与包含细胞的组合物混合。
i.在基于细胞的方法中与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征
在一些方面中，本文描述了鉴定调节与细胞的细胞质(或另一组分)中的一种或多种包含RBM20多肽的聚集体(“RBM20聚集体”)和/或RBM20多肽相关的特征(包括一种或多种，诸如1、2、3、4或5种特征)的化合物(或其部分)的方法。在一些实施方案中，所述方法鉴定调节与一种或多种RBM20聚集体相关的特征的化合物。在一些实施方案中，所述方法鉴定调节与RBM20多肽相关的特征的化合物。在一些实施方案中，与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征是基于以下中的任何一者或多者：(i)一种或多种RBM20聚集体的定位；(ii)一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽的分布；(iii)一种或多种RBM20聚集体的数目；(iv)一种或多种RBM20聚集体的尺寸；(v)一种或多种RBM20聚集体与参考聚集体的数目的比率；(vi)与一种或多种RBM20聚集体相关的功能活性；(vii)一种或多种RBM20聚集体的组成；(viii)一种或多种RBM20聚集体与生物分子的共定位；(ix)一种或多种RBM20聚集体的组分的扩散系数；(x)一种或多种RBM20聚集体的稳定性；(xi)一种或多种RBM20聚集体的溶解或尺寸减小；(xii)一种或多种RBM20聚集体的表面积；(xiii)一种或多种RBM20聚集体的球形度；(xiv)一种或多种RBM20聚集体的流动性；(xv)一种或多种RBM20聚集体的固化；(xvi)RBM20多肽的定位；(xvii)RBM20多肽或其前体的量；(xviii)RBM20多肽在一种或多种RBM20聚集体中的聚集体分配；(xix)与RBM20多肽相关的功能活性；(xx)RBM20多肽的聚集；(xxi)RBM20多肽的翻译后修饰状态；以及(xxii)RBM20多肽降解产物的量。
在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的定位是在细胞的细胞质的任何方面中。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的定位是在细胞器、非膜结合细胞区室(例如在应激颗粒中或与应激颗粒共定位)或细胞质的颗粒中，或基于与它们的关联。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的定位描述了一种或多种RBM20聚集体与另一细胞特征(诸如细胞核或质心)的关联。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的定位是相对于另一细胞特征，例如细胞核或质心。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的定位是基于与另一细胞特征(诸如细胞核或质心)的距离。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的定位是在细胞核的任何方面中。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的定位在旁粒(paraspeckle)中和/或与旁粒共定位。
在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体(和/或RBM20多肽)的分布为一种或多种RBM20聚集体(和/或RBM20多肽)分布在细胞质的一部分(诸如细胞质的细胞特征或视野)中。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的分布为一种或多种RBM20聚集体(和/或RBM20多肽)相对于细胞特征(诸如细胞核、细胞器或细胞质中的颗粒)的分布。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体(和/或RBM20多肽)的分布为一种或多种RBM20聚集体(和/或RBM20多肽)分布在细胞质的一部分(诸如相对于其中的位置的视野)中。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体(和/或RBM20多肽)的分布是基于每个RBM20聚集体(和/或每个RBM20多肽)到一个参考点的距离。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体(和/或RBM20多肽)的分布为一种或多种RBM20聚集体(和/或RBM20多肽)分布在细胞核的一部分中。分布可为均匀的(例如跨细胞质和/或细胞核均匀的RBM20多肽)或不为均匀的。
在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的数目为细胞的一个方面或区域中RBM20聚集体的总数。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的数目为细胞质中RBM20聚集体的总数。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的数目为基于小于总细胞质的测量值估计的细胞质中RBM20聚集体的总数。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的数目为在细胞质的一部分中(诸如视野中)或与细胞特征相关联的RBM20聚集体的数目。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的数目为细胞核中RBM20聚集体的总数。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的数目为基于小于总细胞核的测量值估计的细胞核中RBM20聚集体的总数。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的数目为在细胞核的一部分中(诸如视野中)或与细胞特征相关联的RBM20聚集体的数目。
在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的尺寸是基于一种或多种RBM20聚集体中的每一者的最大跨聚集体尺寸测量值，诸如直径。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的尺寸是基于一种或多种RBM20聚集体中的每一者的周长。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的尺寸是基于一种或多种RBM20聚集体中的每一者的横截面积，或其诸如俯视图的成像表示。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的尺寸是基于一种或多种RBM20聚集体中的每一者的体积。在一些实施方案中，与一种或多种RBM20聚集体相关的特征是基于一种或多种RBM20聚集体的平均尺寸。在一些实施方案中，与一种或多种RBM20聚集体相关的特征是基于一种或多种RBM20聚集体的尺寸分布(诸如d5、d10、d90或d95)。
在一些实施方案中，与一种或多种RBM20聚集体相关的特征是基于一种或多种RBM20聚集体的量。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的量是基于一种或多种RBM20聚集体的数目和尺寸。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的量是基于细胞的一部分中一种或多种RBM20聚集体的数目和尺寸。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的量是基于细胞质的一部分中一种或多种RBM20聚集体的数目和尺寸。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的量是基于细胞核的一部分中一种或多种RBM20聚集体的数目和尺寸。
在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体与参考聚集体的数目的比率为一种或多种RBM20聚集体与另一种不包含RBM20多肽的聚集体的数目的比率。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体与参考聚集体的数目的比率为细胞质的一部分中的一种或多种RBM20聚集体与细胞质的另一部分中的一种或多种RBM20聚集体的数目的比率。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体与参考聚集体的数目的比率为一种或多种RBM20聚集体与定位于细胞核中的包含RBM20多肽的聚集体的数目的比率。在一些实施方案中，与一种或多种RBM20聚集体相关的特征是基于一种或多种RBM20聚集体与参考聚集体(诸如不包含RBM20多肽的另一种聚集体或细胞核中的RBM20聚集体)的量的比率。
在一些实施方案中，与一种或多种RBM20聚集体相关的功能活性为与RBM20多肽相关的功能活性。在一些实施方案中，与一种或多种RBM20聚集体相关的功能活性是基于与RBM20多肽之外的另一种多肽或核酸相关的功能活性。在一些实施方案中，与一种或多种RBM20聚集体相关的功能活性是基于与RBM20聚集体内或与RBM20聚集体相关的RBM20多肽之外的另一种多肽或核酸相关的功能活性。
在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的组成为RBM20多肽相对于一种或多种RBM20聚集体的至少一种其他组分(诸如生物分子)的量。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的组成为至少一种除RBM20多肽之外的组分(诸如多肽、核酸或化合物)的存在、水平或不存在。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的组成为聚集体内野生型RBM20多肽相对于突变体RBM20多肽的量。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的组成为聚集体内第一突变体RBM20多肽相对于第二突变体RBM20多肽的量。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的组成为第一RBM20多肽相对于第二RBM20多肽的量，其中第一和第二RBM20多肽具有组成差异，诸如翻译后修饰的差异。
在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体与生物分子的共定位为一种或多种RBM20聚集体与另一种多肽和/或核酸的共定位。在一些实施方案中，生物分子包含多肽。在一些实施方案中，生物分子包含核酸，诸如DNA或RNA。在一些实施方案中，在混合化合物之前和/或在形成一种或多种RBM20聚集体(例如包含突变体RBM20多肽的细胞质RBM20聚集体)之前，生物分子与不含RBM20多肽组分的另一聚集体缔合。
在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的组分的扩散系数为在一种或多种RBM20聚集体外的RBM20多肽(诸如野生型或突变体RBM20多肽)的扩散系数。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的组分的扩散系数为在一种或多种RBM20聚集体外的不是RBM20多肽的组分(例如其他蛋白质、核酸或化合物)的扩散系数。
在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的稳定性为一种或多种RBM20聚集体在存在细胞活性的情况下或在存在化合物的情况下随时间推移的稳定性。在一些实施方案中，稳定性是基于一种或多种RBM20聚集体的例如尺寸、数目、形状或量的维持。
在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的溶解或尺寸减小是基于一种或多种RBM20聚集体中的每一者的最大跨聚集体尺寸测量值，诸如直径。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的溶解或尺寸减小是基于一种或多种RBM20聚集体中的每一者的周长。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的溶解或尺寸减小是基于一种或多种RBM20聚集体中的每一者的平均尺寸。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的溶解或尺寸减小是基于一种或多种RBM20聚集体的尺寸分布(诸如d5、d10、d90或d95)。
在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的表面积为基于一种或多种RBM20聚集体中的每一者的尺寸特征(诸如周长)的估计表面积。
在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的球形度是基于一种或多种RBM20聚集体中的每一者与完美球体有多接近地相似。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的球形度是基于一种或多种RBM20聚集体中的每一者的横截面或俯视图的估计球形度。在一些实施方案中，与一种或多种RBM20聚集体相关的特征是基于一种或多种RBM20聚集体中的每一者的形状。在一些实施方案中，与一种或多种RBM20聚集体相关的特征为一种或多种RBM20聚集体的部分具有一定形状类型或满足一定形状参数。
在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的流动性和/或固化是基于一种或多种RBM20聚集体如何相互融合，和/或一种或多种RBM20聚集体中的每一者的结构、尺寸、形状、球形度、体积、数目和/或或表面积随时间的变化。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的流动性和/或固化是基于纤维形成。
在一些实施方案中，RBM20多肽的定位是在细胞的细胞质的任何方面中。在一些实施方案中，RBM20多肽的定位是在细胞器或细胞质的颗粒中，或基于与它们的关联。在一些实施方案中，RBM20多肽的定位描述了RBM20多肽与另一细胞特征(诸如细胞核)的关联。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的定位是相对于另一细胞特征，诸如细胞核或一种或多种RBM20聚集体。
在一些实施方案中，RBM20多肽或其前体的量为RBM20多肽的前体为RNA(诸如mRNA)的量。在一些实施方案中，RBM20多肽或其前体的量是基于在细胞的一部分(诸如细胞质或细胞核)中的RBM20多肽或其前体的量。
在一些实施方案中，RBM20多肽的聚集为RBM20多肽的非相分离聚集。在一些实施方案中，与RBM20多肽相关的特征为RBM20多肽的聚集的水平，诸如量或相对量。
在一些实施方案中，与RBM20多肽相关的功能活性是基于RBM20多肽(诸如野生型RBM20多肽)在定位于细胞核中时的正常活性(例如RNA剪接)。在一些实施方案中，与RBM20多肽相关的功能活性是基于细胞过程的功能或特征，诸如肌细胞或心脏功能(例如钙处理、射血分数、缩短分数、QT或QTc间期)，或细胞表型，诸如肌节长度/完整性。
在一些实施方案中，RBM20多肽的翻译后修饰状态是基于至少一处磷酸化或甲基化的存在、水平或不存在。在一些实施方案中，RBM20多肽的翻译后修饰状态是基于存在或不存在S635的磷酸化。在一些实施方案中，RBM20多肽的翻译后修饰状态是基于存在或不存在R636S的磷酸化。在一些实施方案中，RBM20多肽的翻译后修饰状态是基于存在或不存在S637的磷酸化。在一些实施方案中，RBM20多肽的翻译后修饰状态是基于存在或不存在S635和S637的磷酸化。在一些实施方案中，RBM20多肽的翻译后修饰状态是基于存在或不存在S635、R636S以及S637的磷酸化。
在一些实施方案中，RBM20多肽降解产物的量为RBM20多肽的诸如蛋白水解产物等产物的量。在一些实施方案中，RBM20多肽降解产物的量是基于细胞的一部分(诸如细胞质或细胞核)中的RBM20多肽降解产物的量。
在一些实施方案中，与RBM20多肽相关的特征(例如功能活性)是基于泰坦剪接的存在、不存在或水平。
在一些实施方案中，本文所述的方法评估与细胞的细胞质中的一种或多种RBM20聚集体和/或细胞的细胞质中的RBM20多肽相关的多个特征。举例来说，在一些实施方案中，特征包括一种或多种RBM20聚集体的定位、一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽的分布、一种或多种RBM20聚集体的数目、一种或多种RBM20聚集体的尺寸以及一种或多种RBM20聚集体与参考聚集体的量的比率。在一些实施方案中，特征还包括与一种或多种RBM20聚集体相关的功能活性。在一些实施方案中，特征包括一种或多种RBM20聚集体的组成，以及一种或多种RBM20聚集体与生物分子的共定位。在一些实施方案中，特征还包括与一种或多种RBM20聚集体相关的功能活性。在一些实施方案中，特征包括一种或多种RBM20聚集体的稳定性、一种或多种RBM20聚集体的溶解或尺寸减小以及一种或多种RBM20聚集体的表面积。在一些实施方案中，特征包括一种或多种RBM20聚集体的球形度、一种或多种RBM20聚集体的流动性以及一种或多种RBM20聚集体的固化。在一些实施方案中，特征包括一种或多种RBM20聚集体与生物分子的共定位以及一种或多种RBM20聚集体的组分的扩散系数。在一些实施方案中，特征包括一种或多种RBM20聚集体的稳定性以及一种或多种RBM20聚集体的溶解或尺寸减小。在一些实施方案中，特征包括一种或多种RBM20聚集体的表面积、一种或多种RBM20聚集体的球形度、一种或多种RBM20聚集体的流动性以及一种或多种RBM20聚集体的固化。
在一些实施方案中，特征包括RBM20多肽的定位以及RBM20多肽或其前体的量。在一些实施方案中，特征包括RBM20多肽的定位、RBM20多肽或其前体的量以及RBM20多肽的翻译后修饰状态。在一些实施方案中，特征包括RBM20多肽的定位、RBM20多肽或其前体的量以及与RBM20多肽相关的功能活性。在一些实施方案中，特征包括RBM20多肽的定位、RBM20多肽或其前体的量、RBM20多肽的翻译后修饰状态以及与RBM20多肽相关的功能活性。
ii.在基于细胞的方法中测定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征
在一些实施方案中，可基于以下中的任何一者或多者来测定与细胞的细胞质中的一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征：例如对细胞质或其一部分中的一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽的评估；对在细胞内部、外部或与细胞相关的任何其他位置(例如细胞核或其一部分)的一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽的评估；或对另一生物分子(诸如另一RBM20聚集体)的评估。
在一些实施方案中，测定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征是基于对至少一个细胞或至少其一部分的评估。在一些实施方案中，评估是对多个细胞的评估。在一些实施方案中，细胞的一部分为视野，诸如显微镜的视野，或其一部分。在一些实施方案中，细胞的一部分为细胞图像的限定区域或其一部分。在一些实施方案中，限定区域是基于一种或多种细胞特征(诸如通过荧光融合蛋白表达、核染料或IF染色)，例如细胞核或细胞膜的边界。在一些实施方案中，限定区域为诸如手动或通过软件任意限定的。在一些实施方案中，测定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征是基于重复评估。在一些实施方案中，重复评估是基于一个图像的多于一个部分或多于一个图像。在一些实施方案中，测定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征是基于从图像的两个或更多个部分、两个或更多个图像或从至少两个或更多个图像获得的两个或更多个部分获得的平均值或分布。
在一些实施方案中，测定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征是基于成像技术。在一些实施方案中，成像技术提供用于评估与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征的数据。在一些实施方案中，成像技术包括获得包含细胞或其一部分的组合物的一个或多个图像。在一些实施方案中，图像为二维图像。在一些实施方案中，图像为三维图像或其渲染。在一些实施方案中，将成像技术与可用于本文所述方法的另一方法特征(诸如荧光激活细胞分选(FACS)技术或荧光激活粒子分选(FAPS)技术)相结合。
在一些实施方案中，本文所述的方法包括经由成像技术对样品或其一部分(诸如包含细胞的组合物)进行成像。在一些实施方案中，成像技术为荧光成像技术。在一些实施方案中，成像技术包括荧光成像技术。在一些实施方案中，成像技术包括比色和荧光成像技术。在一些实施方案中，检测到的光是由于对靶标的直接标记，诸如将标记合并或缀合到化合物或RBM20多肽中。在一些实施方案中，直接标记包括Dendra2、GFP或mCherry。在一些实施方案中，检测到的光是由于对靶标的间接标记，诸如特异性结合至RBM20多肽的标记探针(例如标记的抗RBM20抗体或其片段)、核染料或结合至在细胞凋亡期间暴露于细胞膜外叶的磷脂酰丝氨酸(PS)的膜联蛋白V萤光素酶。在一些实施方案中，测定特征包括免疫荧光技术。在一些实施方案中，本文所述的方法包括使用直接标记技术和间接标记技术。
在一些实施方案中，所述方法还包括测定细胞的一种或多种细胞特征，诸如除RBM20聚集体和/或RBM20多肽(如果存在)或生物分子(如果存在)外。本领域的技术人员或普通技术人员将容易认识到可以多种方式测定细胞特征。在一些实施方案中，所述方法还包括使组合物或细胞的至少一部分与染色剂接触。在一些实施方案中，染色剂为荧光染色剂。在一些实施方案中，染色剂为组织化学染色剂。在一些实施方案中，染色剂为基于免疫的染色剂，诸如免疫组织化学或免疫细胞化学技术中所用。在一些实施方案中，染色允许诸如以下细胞特征(如果存在)的可视化：胞浆或细胞膜、细胞质、细胞骨架、细胞核、内质网(粗糙和/或光滑)、核糖体、高尔基体、溶酶体、线粒体、液泡或中心体中的任何一者或多者的至少一部分。在一些实施方案中，本文所述的方法还包括使组合物或细胞的至少一部分与固定剂接触。
在一些实施方案中，所述方法包括分析一个或多个图像以评估与细胞的细胞质(或细胞核)中的一种或多种RBM20聚集体和/或细胞的细胞质(或细胞核)中的RBM20多肽相关的特征。在一些实施方案中，分析包括绘制细胞边界或细胞的一部分(诸如细胞器)的边界。在一些实施方案中，分析包括绘制聚集体(诸如RBM20聚集体)的边界。在一些实施方案中，分析图像是通过分析软件来完成和/或促成。在一些实施方案中，诸如在时间过程研究中对一个或多个图像进行比较。在一些实施方案中，分析包括测量一种或多种RBM20聚集体、RBM20多肽、生物分子(例如不是RBM20多肽的共定位多肽)、不包含RBM20多肽的聚集体和/或化合物(例如与聚集体共定位的化合物)的信号(例如荧光融合蛋白、IF染色或发光的信号)强度。举例来说，在一些实施方案中，分析包括测量在由mCherry标记的RBM20聚集体边界内与mCherry标记连接的突变体R636S RBM20多肽的mCherry信号以及与Dendra2标记连接的Nestin多肽的Dendra2信号。在一些实施方案中，分析还包括计算测量信号(诸如聚集体边界内的测量信号)的富集。
在一些实施方案中，与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征是基于具有有所述特征的RBM20聚集体和/或RBM20多肽的细胞的数目与不具有有所述特征的RBM20聚集体和/或RBM20多肽的细胞的数目的比率来确定的。在一些实施方案中，与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征是基于具有有所述特征的RBM20聚集体和/或RBM20多肽的细胞的数目来确定的。在一些实施方案中，与一种或多种RBM20聚集体相关的特征是基于细胞内(或视野内)有所述特征的RBM20聚集体的数目的比率(诸如包含不是RBM20多肽的生物分子的RBM20聚集体的数目的比率)来确定。
在一些实施方案中，在一段时间内例如在两个或更多个时间点测定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征。在一些实施方案中，测定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征包括评估特征在一段时间内的变化。举例来说，在一些实施方案中，在一段时间内诸如通过监测细胞形态、细胞标记物的染色(诸如细胞凋亡标记物(例如暴露的PS))或碘化丙啶(PI)染色来监测细胞增殖、细胞凋亡或坏死。在一些实施方案中，在RBM20多肽在细胞中表达(例如通过瞬时转染，或通过使用TetOn系统的多西环素诱导表达)后的一段时间内测定一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽的尺寸、数目、定位(例如细胞质或细胞核)和/或分布(例如在细胞质或细胞核中均匀分布)。
在一些实施方案中，使用一种或多种测量和/或技术来测定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征。在一些实施方案中，使用一种或多种测量和/或技术来测定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的超过一种特征。
在一些实施方案中，本文所述的方法包括用于例如可视化、分析和/或定量聚集体、多肽和/或其前体的技术。此类技术为本领域普通技术人员熟知的。举例来说，本文涵盖用于可视化多肽的显微术技术，诸如荧光标记的多肽，包括那些与细胞系统相容的荧光标记的多肽。本文还涵盖用于分析多肽的组成(包括翻译后修饰)、定量多肽以及研究RBM20聚集体的组成(例如通过交联MS技术或“XL-MS”)的质谱(MS)技术。本文还涵盖用于评估细胞过程、细胞活力、细胞毒性以及细胞增殖的功能测定。本文还涵盖富集和/或分离技术，例如用于分离细胞级分的离心技术或用于分离多肽或核酸的基于亲和性的技术。在一些实施方案中，所述技术评估一个或多个细胞或一个或多个细胞的一个或多个限定区域中的特征。在一些实施方案中，所述技术评估一个或多个细胞或一个或多个细胞的一个或多个限定区域中的强度、面积以及聚集体计数中的一者或多者。在一些实施方案中，所述技术评估有或没有所述特征的细胞的数目。在一些实施方案中，所述技术评估细胞内有或没有所述特征的聚集体的数目。在一些实施方案中，所述方法包括使用z评分对测定和由其产生的结果进行评价。Z评分及其用途为本领域中已知的。参见例如Zhang等,J Biomol Screen,1999。
在一些实施方案中，通过评估在细胞的至少一部分(诸如细胞特征，例如细胞质或细胞核)中或与细胞的一部分相关联的一种或多种RBM20聚集体的存在、不存在或水平来测定一种或多种RBM20聚集体的定位。在一些实施方案中，测定一种或多种RBM20聚集体的定位包括测定细胞特征。
在一些实施方案中，通过评估相对于细胞特征或在细胞的一部分(诸如视野)中的一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽的存在、不存在或水平来测定一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽的分布。在一些实施方案中，测定一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽的分布包括测定一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相对于细胞的任意确定的点或其图像的分布。
在一些实施方案中，通过评估细胞(诸如细胞质或细胞核)中RBM20聚集体的总数来测定一种或多种RBM20聚集体的数目。在一些实施方案中，通过评估细胞(例如细胞质或细胞核)的一部分(诸如视野)中RBM20聚集体的数目来测定一种或多种RBM20聚集体的数目。在一些实施方案中，通过基于小于细胞总数的测量评估细胞(诸如细胞质或细胞核)或其一部分中RBM20聚集体的总数来测定一种或多种RBM20聚集体的数目。
在一些实施方案中，通过评估一种或多种RBM20聚集体中的每一者的最大跨聚集体尺寸测量值(诸如直径)来测定一种或多种RBM20聚集体的尺寸。在一些实施方案中，通过评估一种或多种RBM20聚集体中的每一者的周长来测定一种或多种RBM20聚集体的尺寸。在一些实施方案中，通过评估一种或多种RBM20聚集体中的每一者的横截面积或其诸如俯视图等成像表示来测定一种或多种RBM20聚集体的尺寸。在一些实施方案中，通过诸如动态光散射技术等粒度测量技术来测定一种或多种RBM20聚集体的尺寸。
在一些实施方案中，通过评估细胞的细胞质中RBM20聚集体的数目和参考聚集体的数目来测定一种或多种RBM20聚集体与参考聚集体的数目的比率，其中参考聚集体不包含RBM20多肽。在一些实施方案中，参考聚集体在细胞的细胞质中。在一些实施方案中，参考聚集体在细胞的细胞核中。在一些实施方案中，通过评估细胞的细胞质中RBM20聚集体的数目和细胞核中参考聚集体(诸如包含RBM20多肽的核聚集体)的数目来测定一种或多种RBM20聚集体与参考聚集体的数目的比率。在一些实施方案中，通过评估包含第一RBM20多肽的RBM20聚集体的数目和参考聚集体的数目来测定一种或多种RBM20聚集体与参考聚集体的数目的比率，其中参考聚集体为包含第二RMB20多肽的聚集体。
在一些实施方案中，通过评估一种或多种RBM20聚集体的数目和尺寸来测定一种或多种RBM20聚集体的量。在一些实施方案中，在细胞的一部分(诸如细胞质或细胞核)或细胞图像的一部分中测定一种或多种RBM20聚集体的量。
在一些实施方案中，通过评估与一种或多种RBM20聚集体相关的细胞过程的前体、中间体或产物来测定与一种或多种RBM20聚集体相关的功能活性。举例来说，在一些实施方案中，通过评估酶活性或其产物的存在、不存在或水平来测定与一种或多种RBM20聚集体相关的功能活性。在一些实施方案中，通过评估泰坦同种型或其前体的存在、不存在或水平来测定与一种或多种RBM20聚集体相关的功能活性。在一些实施方案中，通过评估一种或多种多肽或核酸(诸如DNA或RNA)的存在、不存在或水平来测定与一种或多种RBM20聚集体相关的功能活性。
在一些实施方案中，通过评估一种或多种RBM20聚集体中或与之相关的至少一种其他组分的存在、不存在或水平来测定一种或多种RBM20聚集体的组成。在一些实施方案中，测定一种或多种RBM20聚集体的组成包括测定一种或多种RBM20聚集体中或与一种或多种RBM20聚集体相关的相对于RBM20多肽的至少一种其他组分。在一些实施方案中，直接或间接地对另一组分进行评估，诸如测量。在一些实施方案中，使用诸如APEX或XL-MS等质谱技术对另一组分进行评估。在一些实施方案中，使用FAPS技术对另一组分(例如存在或不存在)进行评估。在一些实施方案中，使用标记技术对另一组分进行评估，诸如将标记直接缀合至另一组分或使用免疫标记。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体是从其他细胞组分分离和/或富集的。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体不是从其他细胞组分分离和/或富集的，例如原位评估。在测定前一种或多种RBM20聚集体的组成可为固定的或不固定的。
在一些实施方案中，通过评估一种或多种RBM20聚集体中或与之相关联的生物分子(或化合物)的存在、不存在或水平来测定一种或多种RBM20聚集体与生物分子(例如RNA或蛋白质，诸如肌动蛋白)或化合物的共定位。在一些实施方案中，直接或间接地对生物分子(或化合物)进行评估，诸如测量。在一些实施方案中，使用诸如APEX或XL-MS等质谱技术对生物分子进行评估。在一些实施方案中，使用FAPS技术对生物分子(例如存在或不存在)进行评估。在一些实施方案中，使用标记技术对生物分子进行评估，诸如将标记直接缀合至另一组分或使用免疫标记，诸如IF技术中所用的免疫标记。在一些实施方案中，从其他细胞组分分离和/或富集一种或多种RBM20聚集体，然后评估一种或多种RBM20聚集体中或与之相关的生物分子的存在、不存在或水平。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体不是从其他细胞组分分离和/或富集的，例如原位评估。在测定前一种或多种RBM20聚集体或包含一种或多种RBM20聚集体的细胞的组成可为固定的或不固定的。
在一些实施方案中，基于荧光相关光谱技术来测定一种或多种RBM20聚集体的组分(诸如RBM20多肽)的扩散系数。
在一些实施方案中，基于融合或分裂技术来测定一种或多种RBM20聚集体的稳定性。在一些实施方案中，基于一种或多种RBM20聚集体中的每一者的结构在存在细胞活性的情况下或在存在化合物的情况下随时间的变化来测定一种或多种RBM20聚集体的稳定性。在一些实施方案中，基于评估一种或多种RBM20聚集体中的每一者的尺寸、形状、球形度、体积或表面积中的任何一者或多者来测定一种或多种RBM20聚集体的稳定性。
在一些实施方案中，基于一种或多种RBM20聚集体中的每一者的结构在存在细胞活性的情况下或在存在化合物的情况下随时间的变化来测定一种或多种RBM20聚集体的溶解和尺寸减小。在一些实施方案中，基于评估一种或多种RBM20聚集体中的每一者的尺寸、形状、球形度、体积、数目(包括不存在)或表面积中的任何一者或多者来测定一种或多种RBM20聚集体的溶解或尺寸减小。
在一些实施方案中，基于使用一种或多种RBM20聚集体中的每一者的测量参数(例如周长、最大跨聚集体尺寸测量值)评估表面积来测定一种或多种RBM20聚集体的表面积。
在一些实施方案中，基于3D晶格光片技术来测定一种或多种RBM20聚集体的球形度。在一些实施方案中，基于2D成像技术来测定一种或多种RBM20聚集体的球形度。在一些实施方案中，基于一种或多种RBM20聚集体中的每一者的横截面或俯视图来测定一种或多种RBM20聚集体的球形度。
在一些实施方案中，基于融合或分裂技术来测定一种或多种RBM20聚集体的流动性和/或固化。在一些实施方案中，基于一种或多种RBM20聚集体中的每一者的结构随时间的变化来测定一种或多种RBM20聚集体的流动性和/或固化。在一些实施方案中，基于评估一种或多种RBM20聚集体中的每一者的尺寸、形状、球形度、体积、数目或表面积中的任何一者或多者的变化来测定一种或多种RBM20聚集体的流动性和/或固化。在一些实施方案中，基于纤维形成和其程度来测定一种或多种RBM20聚集体的流动性和/或固化。
在一些实施方案中，通过成像技术(诸如荧光成像技术)来测定RBM20多肽的定位。在一些实施方案中，直接地(诸如使用标记的RBM20多肽)或间接地(诸如使用标记的探针，例如标记的抗RBM20抗体或其片段)测定RBM20多肽的定位。在一些实施方案中，从细胞级分(诸如细胞质或细胞核)分离RBM20多肽，并且随后评估所述细胞级分中RBM20多肽的存在、不存在或水平。
在一些实施方案中，通过诸如荧光成像技术等成像技术来测定RBM20多肽或其前体(诸如RNA)的量。在一些实施方案中，直接地(诸如使用标记的RBM20多肽)或间接地(诸如使用标记的探针，例如标记的抗RBM20多肽)测定RBM20多肽的量。在一些实施方案中，从细胞级分(诸如细胞质或细胞核)分离RBM20多肽或其前体，并且随后评估所述细胞级分中RBM20多肽或其前体的量。本领域中的任何已知方法都可用于定量RBM20多肽或其前体的量，诸如蛋白质印迹法、免疫沉淀(IP)、原位免疫荧光(IF)染色、FISH、RNA印迹(northernblot)或qPCR。
在一些实施方案中，基于与在一种或多种RBM20聚集体中或与之相关的RBM20多肽的量相比在一种或多种RBM20聚集体外的RBM20多肽的量来测定RBM20多肽在一种或多种RBM20聚集体中的聚集体分配。在一些实施方案中，针对一种或多种不是RBM20多肽的其他生物分子(例如其他多肽或核酸)或化合物测定在一种或多种RBM20聚集体中的聚集体分配。在一些实施方案中，可通过成像技术(诸如荧光成像技术)例如通过直接标记生物分子(例如RBM20多肽)或化合物，或间接地诸如使用标记的探针(例如抗体染色)来测定聚集体分配。
在一些实施方案中，与RBM20多肽相关的功能活性是基于RBM20多肽在定位于细胞核中时的正常活性(诸如泰坦剪接的状态)。在一些实施方案中，通过泰坦剪接测定来测定与RBM20多肽相关的功能活性。
在一些实施方案中，基于非相分离RBM20多肽聚集的存在、不存在或水平来测定RBM20多肽的聚集。
在一些实施方案中，基于RBM20多肽PTM(诸如一处或多处磷酸化或甲基化)的存在、不存在或水平来测定RBM20多肽的翻译后修饰状态。在一些实施方案中，测定RBM20多肽的PTM状态包括富集一种或多种修饰的RBM20多肽。在一些实施方案中，可通过IF染色诸如使用抗磷酸化抗体来测定翻译后修饰的存在、不存在或水平。
在一些实施方案中，基于蛋白质测量技术(诸如本文所述的蛋白质测量技术)来测定RBM20多肽降解产物的量。在一些实施方案中，基于质谱技术或蛋白质印迹技术来测定RBM20多肽降解产物的量。在一些实施方案中，蛋白质测量技术为定量的。
在一些实施方案中，基于免疫荧光、荧光原位杂交(FISH)、质谱(MS)、RNA-seq或NMR光谱等来测定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征(例如组成)。
在一些实施方案中，基于光漂白荧光恢复(FRAP)技术来测定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征(例如流动性和/或固化)。在一些实施方案中，进行FRAP技术以评估完整聚集体，例如测量一种或多种RBM20聚集体的组分与细胞质或细胞核的交换。在一些实施方案中，执行FRAP技术以评估一半的聚集体，例如测量一种或多种RBM20聚集体内的内部动力学。
在一些实施方案中，基于荧光团(诸如Dendra2)的光转化来测定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征。
在一些实施方案中，基于荧光相关光谱(FCS)技术来测定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征。
在一些实施方案中，基于一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽的温度响应性来测定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征。
在一些实施方案中，基于跟踪聚集体融合和/或分裂(诸如细胞内的融合和/或分裂)来确定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征。
在一些实施方案中，基于3D晶格光片技术来测定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征。
在一些实施方案中，基于超分辨率成像技术(诸如受激发射损耗(STED)显微术、随机光学重建显微术(STORM)或光活化定位显微术(PALM)或它们的混合物)来测定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征。
在一些实施方案中，基于紫外-可见(UV-Vis)光谱、小角x射线散射或静态和动态光散射(SLS/DLS)技术来测定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征。举例来说，可使用如动态光散射(DLS)、静态光散射(STS)以及小角光散射(SLS)等光散射方法来测定聚集体的尺寸和形状。另请参见Basturea,G.N.(“Biological Condensates,”MATERMETHODS 2019；9:2794)中描述的各种体外和细胞内聚集体分析方法。
在一些实施方案中，在存在细胞应激的情况下测定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征。举例来说，在一些实施方案中，细胞应激为缺氧、氧化应激、细胞凋亡应激(例如星形孢菌素)、能量应激(OXPHOS或糖酵解)、ATP耗竭、温度(诸如热)或机械应激中的一者或多者，例如发生在不规则或过快频率的心跳期间。
在一些实施方案中，在细胞(诸如心肌细胞)中存在跳动/收缩的情况下测定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征。在一些实施方案中，基于心肌细胞的钙处理、射血分数、缩短分数、QT或QTc间期来测定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征。在一些实施方案中，基于肌节长度/完整性来测定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征。在一些实施方案中，在存在诸如使用原子力显微术技术施加的外部机械力的情况下测定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征。
在一些实施方案中，特征的调节是基于一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽的存在、不存在或水平的变化。在一些实施方案中，特征的调节是基于细胞的细胞质(或细胞核)中一种或多种RBM20聚集体的数目的减少。在一些实施方案中，特征的调节是基于细胞的细胞质(或细胞核)中一种或多种RBM20聚集体的数目的增加。在一些实施方案中，特征的调节是基于一种或多种RBM20聚集体的形成，诸如细胞的细胞质或细胞核中一种或多种RBM20聚集体的形成。在一些实施方案中，特征的调节是基于细胞的细胞质(或细胞核)中一种或多种RBM20聚集体的尺寸的减小。在一些实施方案中，特征的调节是基于细胞的细胞质(或细胞核)中一种或多种RBM20聚集体的尺寸的增加。
在一些实施方案中，特征的调节是基于细胞的细胞质(或细胞核)中RBM20多肽或其前体的量的减少。在一些实施方案中，特征的调节是基于细胞的细胞质(或细胞核)中RBM20多肽或其前体的量的增加。在一些实施方案中，特征的调节是基于RBM20多肽上一种或多种翻译后修饰的存在的增加。在一些实施方案中，特征的调节是基于RBM20多肽上一种或多种翻译后修饰的存在的减少。
在一些实施方案中，特征的调节是基于细胞的细胞核中一种或多种RBM20聚集体的量的增加。在一些实施方案中，特征的调节是基于细胞的细胞核中RBM20多肽的量的增加。
在一些实施方案中，特征的调节是基于与细胞的一部分(诸如细胞的细胞质(或细胞核))中一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的功能活性的降低。在一些实施方案中，特征的调节是基于与细胞的一部分(诸如细胞的细胞质(或细胞核))中一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的功能活性的增加。
在一些实施方案中，特征的调节是基于一种或多种RBM20聚集体内不是RBM20多肽的生物分子(例如其他多肽或核酸)的存在、不存在或水平的变化。在一些实施方案中，特征的调节是基于细胞的细胞质(或细胞核)中一种或多种RBM20聚集体内的生物分子的量的减少。在一些实施方案中，特征的调节是基于细胞的细胞质(或细胞核)中一种或多种RBM20聚集体内的生物分子的量的增加。
在一些实施方案中，基于与心脏或心脏组织相关的特征(诸如具有其特征的心脏尺寸和肌肉收缩，例如射血分数、缩短分数、QT或QTc间期)来测定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征。在一些实施方案中，基于泰坦剪接来测定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征。
在一些实施方案中，本文所述的方法包括测定化合物用于调节与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征的特异性。举例来说，在一些实施方案中，所述方法包括测定与第一RBM20聚集体和第二RBM20聚集体相关的特征的调节，其中化合物调节第一RBM20聚集体的特征而不调节第二RBM20聚集体的特征。在一些实施方案中，第一RBM20聚集体包含野生型RBM20多肽并且第二RBM20聚集体包含突变体RBM20多肽。在一些实施方案中，第一RBM20聚集体包含突变体RBM20多肽并且第二RBM20聚集体包含野生型RBM20多肽。在一些实施方案中，第一RBM20聚集体在细胞核中并且第二RBM20聚集体在细胞质中。在一些实施方案中，第一RBM20聚集体在细胞质中并且第二RBM20聚集体在细胞核中。在一些实施方案中，第一RBM20聚集体包含第一突变体RBM20多肽并且第二RBM20聚集体包含第二突变体RBM20多肽，其中第一和第二突变体RBM20多肽不同。
在一些实施方案中，所述方法包括测定与RBM20聚集体和非RBM20聚集体(不包含RBM20多肽的聚集体)相关的特征的调节，其中化合物调节RBM20聚集体的特征而不调节非RBM20聚集体的特征。在一些实施方案中，所述方法包括测定与RBM20聚集体和非RBM20聚集体(不包含RBM20多肽的聚集体)相关的特征的调节，其中化合物调节两种聚集体的特征。举例来说，在一些实施方案中，化合物使在疾病或应激状态下隔离在RBM20聚集体中的不是RBM20多肽的生物分子重新定位回到非RBM20聚集体或细胞位置(例如细胞质或细胞核)，在所述位置它本应处在健康或非应激状态下。在一些实施方案中，化合物使RBM20多肽从细胞质中的RBM20聚集体(例如在疾病或应激状态下)重新定位回到细胞核中的聚集体，在细胞核中它本应处在健康或非应激状态下。
在一些实施方案中，所述方法包括测定与第一RBM20聚集体和第二RBM20聚集体相关的特征的调节，其中化合物调节第一RBM20聚集体和第二RBM20聚集体的特征。在一些实施方案中，第一RBM20聚集体包含野生型RBM20多肽并且第二RBM20聚集体包含突变体RBM20多肽。在一些实施方案中，第一RBM20聚集体包含第一突变体RBM20多肽并且第二RBM20聚集体包含第二突变体RBM20多肽，其中第一和第二突变体RBM20多肽不同。在一些实施方案中，第一RBM20聚集体在细胞质中并且第二RBM20聚集体在细胞核中。在一些实施方案中，两种RBM20聚集体都在细胞核中。在一些实施方案中，两种RBM20聚集体都在细胞质中。
在一些实施方案中，所述方法包括测定细胞活力、细胞毒性以及细胞增殖中的一者或多者。在一些实施方案中，经由与活细胞数目和/或细胞功能相关的标记物来评估细胞活力。在一些实施方案中，诸如使用滴度格洛(titer glo)法经由ATP的水平评估细胞活力。在一些实施方案中，诸如使用RealTime-GloTM MT法经由细胞代谢评估细胞活力。在一些实施方案中，诸如使用RealTime-GloTM膜联蛋白V细胞凋亡和坏死测定经由PS暴露或膜完整性损失来评估细胞毒性(例如细胞凋亡或坏死)。在一些实施方案中，诸如使用嘌呤霉素合并经由翻译来评估细胞活力。在一些实施方案中，经由与死细胞和/或垂死细胞的数目相关的标记物来评估细胞毒性。在一些实施方案中，诸如使用细胞可渗透染料经由膜完整性评估细胞毒性。在一些实施方案中，诸如使用膜联蛋白V或TUNEL或通过碘化丙啶(PI)染色经由凋亡或坏死性死亡标记物评估细胞毒性。本领域已知的任何细胞凋亡测定都可用于本文中，诸如形成DNA梯状条带、通过TUNEL分析DNA片段化、针对组蛋白/DNA片段的酶联免疫吸附测定、聚ADP-核糖聚合酶裂解测定以及末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定。可对若干细胞凋亡标记物进行评估。举例来说，可通过蛋白质裂解的蛋白质印迹来评估抗凋亡Bcl-2家族蛋白的裂解。可通过微量滴定板中的基于比色/荧光底物的测定、流式细胞术/显微术中的荧光底物的裂解的检测或通过微量滴定板分析、前半胱天冬酶和活性半胱天冬酶的蛋白质印迹分析、使用特异性识别半胱天冬酶活性形式的抗体的流式细胞术/显微术分析或使用特异性识别半胱天冬酶活性形式的抗体的微孔板分光光度法分析来评估半胱天冬酶活化。可通过使用对裂解的PARP具特异性的抗体的微孔板分光光度法分析或对裂解的PARP的蛋白质印迹分析来评估半胱天冬酶底物(PARP)裂解。可通过微量滴定板中的基于比色/荧光底物的测定来评估非半胱天冬酶蛋白酶(组织蛋白酶和钙蛋白酶)活化。可通过使用Δψm敏感探针的流式细胞术/显微术/微孔板分光光度法分析或耗氧研究来评估线粒体跨膜电位(Δψm)降低。可通过蛋白质印迹或对胞质溶胶中细胞色素C的存在的基于抗体的显微术分析来评估细胞色素C释放。可通过亚G1峰的流式细胞术分析来评估亚G1群体的增加。可通过流式细胞术或显微术分析或染色质浓缩来评估核浓缩。可通过光学显微术或裂解底物(凝溶胶蛋白，ROCK1)的蛋白质印迹分析来评估膜起泡。在一些实施方案中，经由细胞汇合来评估细胞增殖。在一些实施方案中，经由增殖标记物(诸如用于测量Ki67的标记物)、eFluor染料和/或核染料来评估细胞增殖。
iii.细胞和包含细胞的组合物
在一些实施方案中，本文所述的包含细胞的组合物包含多个细胞。在一些实施方案中，本文所述的包含细胞的组合物包含多个细胞，其中所述多个细胞基于RBM20多肽的表达水平进行选择，诸如基于具有相似的RBM20多肽表达水平进行选择。在一些实施方案中，本文所述的包含细胞的组合物包含多个细胞，其中所述多个细胞为衍生自单个细胞的克隆。
在一些实施方案中，细胞包含一种或多种RBM20聚集体，诸如在与本文的方法中所述的化合物接触之前包含一种或多种RBM20聚集体。在一些实施方案中，在化合物接触组合物后在细胞中形成一种或多种RBM20聚集体。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体能够在不存在化合物的情况下在细胞中形成，诸如在细胞在开始RBM20多肽表达后与化合物接触时的情况下，此情况在不存在化合物的情况下形成细胞质RBM20聚集体。在一些实施方案中，在应激下在细胞中形成一种或多种RBM20聚集体。
在一些实施方案中，细胞以大约内源RBM20多肽表达的水平表达RBM20多肽，诸如标记的RBM20多肽。在一些实施方案中，细胞以大约参考细胞中RBM20多肽表达的水平表达RBM20多肽，诸如标记的RBM20多肽。在一些实施方案中，细胞以高于内源RBM20多肽表达的水平表达RBM20多肽，诸如标记的RBM20多肽。在一些实施方案中，细胞以大约内源RBM20多肽表达的水平表达RBM20多肽，诸如标记的RBM20多肽，其中改变细胞以降低RBM20多肽的降解水平。在一些实施方案中，细胞以低于内源RBM20多肽表达的水平表达RBM20多肽，诸如标记的RBM20多肽。在一些实施方案中，基于RBM20多肽的表达水平来分选本文所述方法中使用的细胞。在一些实施方案中，细胞表达第一RBM20多肽和第二RBM20多肽，其中第一和第二RBM20多肽不同，例如第一RBM20多肽为野生型RBM20多肽并且第二RBM20多肽为突变体RBM20多肽，或第一RBM20多肽为第一突变体RBM20多肽并且第二RMB20多肽为第二突变体RBM20多肽，其中第一和第二突变体RBM20多肽不同。在一些实施方案中，细胞表达野生型RBM20多肽和突变体RBM20多肽。
在一些实施方案中，细胞包含含有RBM20多肽的核酸序列的构建体。在一些实施方案中，构建体包含启动子。在一些实施方案中，启动子为巨细胞病毒(CMV)启动子。在一些实施方案中，启动子为诱导型启动子，诸如受四环素或多西环素的存在控制的启动子。在一些实施方案中，细胞包含一种或多种编码野生型RBM20多肽和突变体RBM20多肽的构建体。在一些实施方案中，编码第一RBM20多肽和第二RBM20多肽的核酸位于相同载体上、受相同启动子控制或受不同启动子控制。在一些实施方案中，编码第一RBM20多肽和第二RBM20多肽的核酸位于不同载体上。第一RBM20多肽和第二RBM20多肽可以相同或不同量表达。
在一些实施方案中，细胞具有诸如经由CRISPR敲低或敲除的内源RBM20多肽，并且细胞表达异源RBM20多肽，诸如标记的RBM20多肽和/或突变体RBM20多肽。在一些实施方案中，细胞包含RBM20多肽的修饰内源基因座。在一些实施方案中，对RBM20多肽的内源基因座进行修饰以调节表达的RBM20多肽，例如以产生突变体RBM20多肽。在一些实施方案中，对RBM20多肽的内源基因座进行修饰以插入标记。
在一些实施方案中，细胞具有使用用于立即和靶标特异性蛋白质降解的dTAG系统敲低或敲除的内源RBM20多肽(Nabet等,Nature Chemical Biology,2018)。简单来说，此系统将FKBP的降解剂与RBM20框内的FKBP表达配对，并且dTAG的存在可将E3泛素连接酶募集到RBM20，从而针对蛋白酶体降解对其进行标记。此类细胞系可通过CRISPR介导的基因座特异性敲入来构建。
在一些实施方案中，细胞为哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞为灵长类动物细胞。在一些实施方案中，细胞为灵长类动物细胞。在一些实施方案中，细胞为人细胞。在一些实施方案中，细胞为大鼠细胞。在一些实施方案中，细胞为小鼠细胞。
在一些实施方案中，细胞为心脏细胞类型的模型，诸如心脏细胞类型的特征或特性的模型。在一些实施方案中，细胞为心肌细胞。在一些实施方案中，心肌细胞为H9C2细胞。在一些实施方案中，心肌细胞为源自患者的心肌细胞。在一些实施方案中，心肌细胞为分化为心肌细胞的诱导多能干(iPS)细胞，诸如人iPS，例如KOLF细胞或WTC-11细胞。在一些实施方案中，心肌细胞为分化为心肌细胞的干细胞，诸如人干细胞。在一些实施方案中，细胞为源自患者的心肌细胞，诸如AC-16细胞。
在一些实施方案中，细胞为HeLa细胞。在一些实施方案中，细胞为U2OS(人骨骨肉瘤上皮)细胞。在一些实施方案中，细胞为诱导多能干(iPS)细胞。在一些实施方案中，细胞为人iPS细胞，诸如KOLF细胞或WTC-11细胞)。在一些实施方案中，细胞为干细胞，诸如人干细胞。
在一些实施方案中，细胞对于编码RBM20多肽的等位基因来说为纯合的。在一些实施方案中，细胞对于编码RBM20多肽的等位基因来说为杂合的。
iv.基于细胞的参考
在一些实施方案中，本文所述的方法测定与参考相比与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征的调节。
在一些实施方案中，参考为特征的确定值。在一些实施方案中，参考包含与媒介物对照混合的包含细胞的组合物。在一些实施方案中，参考包含与参考化合物(诸如阴性或阳性对照参考化合物)混合的包含细胞的组合物。在一些实施方案中，参考包含与化合物混合的包含细胞的组合物，其中对于参考来说，与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征是在不同的时间测定。在一些实施方案中，参考为包含不同RBM20多肽(诸如野生型或突变体RBM20多肽)的细胞。在一些实施方案中，参考为包含不同水平的RBM20多肽的细胞。在一些实施方案中，参考为包含具有不同翻译后修饰状态的RBM20多肽的细胞。在一些实施方案中，参考为未被诱导表达RBM20多肽或不表达RBM20多肽的细胞。在一些实施方案中，参考为处于应激或疾病状况下的细胞。在一些实施方案中，参考为处于非应激或健康状况下的细胞。在一些实施方案中，参考为包含用细胞定位标签(例如核定位信号)标记的RBM20多肽的细胞。
在一些实施方案中，经由本文所述的特征程度的变化(诸如增加、降低或没有变化)来评估调节。在一些实施方案中，对多于一个读数或重复进行分析以确定特征的调节。在一些实施方案中，针对参考的测量值对调节测量值进行归一化。在一些实施方案中，使用统计方法来评估调节的显著性，诸如p值。
v.示例性基于细胞的方法
在一些实施方案中，本文描述了一种鉴定使细胞的细胞质中的RBM20聚集体的尺寸和/或数目减小的化合物的方法，所述方法包括：(a)测定接受化合物的细胞的至少一部分细胞质中的RBM20聚集体的尺寸和/或数目；以及(b)将RBM20聚集体的尺寸和/或数目与参考进行比较，从而鉴定使细胞的细胞质中RBM20聚集体的尺寸和/或数目减小的化合物。在一些实施方案中，化合物使RBM20聚集体的数目减少。在一些实施方案中，化合物使RBM20聚集体的尺寸减小。在一些实施方案中，使用CRISPR对细胞进行修饰以敲除内源RBM20基因并且进行修饰以表达包含荧光标记的异源RBM20多肽。在一些实施方案中，RBM20多肽为突变体RBM20多肽，诸如R636S RBM20多肽。在一些实施方案中，RBM20多肽为野生型多肽。在一些实施方案中，参考为与媒介物对照接触的包含突变体RBM20多肽的细胞。在一些实施方案中，参考为与化合物接触的包含野生型RBM20多肽的细胞。在一些实施方案中，使用诸如荧光成像技术等成像技术来测定RBM20聚集体的尺寸和/或数目。
在一些实施方案中，本文描述了一种鉴定阻止细胞的细胞质中一种或多种包含RBM20多肽的聚集体(“RBM20聚集体”)的形成或生长的化合物的方法，所述方法包括：(a)将化合物与包含细胞的组合物合并，其中(i)细胞包含一种或多种RBM20聚集体，和/或(ii)在化合物接触组合物后形成一种或多种RBM20聚集体；以及(b)获得对细胞的至少一部分细胞质中一种或多种RBM20聚集体的尺寸和/或数目的第一次测量；以及(c)将所述第一次测量与参考进行比较，从而鉴定阻止细胞的细胞质中一种或多种RBM20聚集体的形成或生长的化合物。在一些实施方案中，参考包含包含与对照剂混合的细胞的组合物的等分试样。在一些实施方案中，参考为对细胞的至少一部分细胞质中一种或多种RBM20聚集体的尺寸和/或数目的第二次测量，并且其中第二次测量在与第一次测量不同的时间进行。在一些实施方案中，所述方法还包括使细胞经受有助于一种或多种RBM20聚集体形成的条件。在一些实施方案中，有助于一种或多种RBM20聚集体形成的条件为以下中的一者或多者：RBM20多肽的表达水平或量增加、RBM20聚集体支架分子的表达水平或量增加或PTM的水平增加。在一些实施方案中，使用CRISPR对细胞进行修饰以敲除内源RBM20基因并且进行修饰以表达包含荧光标记的异源RBM20多肽。在一些实施方案中，RBM20多肽为突变体RBM20多肽，诸如R636SRBM20多肽。在一些实施方案中，RBM20多肽为野生型多肽。在一些实施方案中，参考为与媒介物对照接触的包含突变体RBM20多肽的细胞。在一些实施方案中，参考为与化合物接触的包含野生型RBM20多肽的细胞。在一些实施方案中，使用诸如荧光成像技术等成像技术来测定RBM20聚集体的尺寸和/或数目。
在一些实施方案中，本文描述了一种鉴定使细胞的细胞质中RBM20多肽的量降低的化合物的方法，所述方法包括：(a)将化合物与包含细胞的组合物合并；以及(b)获得对细胞的至少一部分细胞质中RBM20多肽的量的第一次测量；以及(c)将所述第一次测量与参考进行比较，从而鉴定使细胞的细胞质中RBM20多肽的量减少的化合物。在一些实施方案中，参考包含包含与对照剂混合的细胞的组合物的等分试样。在一些实施方案中，参考为对细胞的至少一部分细胞质中RBM20多肽的量的第二次测量，并且其中第二次测量在与第一次测量不同的时间进行。在一些实施方案中，使用CRISPR对细胞进行修饰以敲除内源RBM20基因并且进行修饰以表达包含荧光标记的异源RBM20多肽。在一些实施方案中，RBM20多肽为突变体RBM20多肽，诸如R636S RBM20多肽。在一些实施方案中，RBM20多肽为野生型多肽。在一些实施方案中，参考为与媒介物对照接触的包含突变体RBM20多肽的细胞。在一些实施方案中，参考为与化合物接触的包含野生型RBM20多肽的细胞。在一些实施方案中，使用诸如荧光成像技术等成像技术来测定RBM20聚集体的尺寸和/或数目。
在一些实施方案中，对本文所述的基于细胞的方法进行设计以鉴定调节与细胞的细胞质中的一种或多种RBM20聚集体和/或细胞的细胞质中的RBM20多肽相关的一种或多种特征的化合物或其一部分，其中一种或多种特征被鉴定为与疾病发展和/或进展相关。举例来说，在一些实施方案中，需要驱散细胞的细胞质中的一种或多种RBM20聚集体，并且因此使用本文所述方法评估的一种或多种特征包括以下中的一者或多者：一种或多种RBM20聚集体的定位；一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽的分布；一种或多种RBM20聚集体的数目；一种或多种RBM20聚集体的尺寸；一种或多种RBM20聚集体与参考聚集体的量的比率；与一种或多种RBM20聚集体相关的功能活性；一种或多种RBM20聚集体的组成；一种或多种RBM20聚集体与生物分子的共定位；一种或多种RBM20聚集体的组分的扩散系数；一种或多种RBM20聚集体的稳定性；一种或多种RBM20聚集体的溶解或尺寸减小；一种或多种RBM20聚集体的表面积；一种或多种RBM20聚集体的球形度；一种或多种RBM20聚集体的流动性；以及一种或多种RBM20聚集体的固化。在一些实施方案中，需要拯救RBM20聚集体的组分在细胞的细胞质中的定位，诸如使野生型RBM20多肽回到细胞核中，或使非RBM20多肽回到其正常位置(例如被隔离在细胞质RBM20聚集体内之前的位置)，并且因此使用本文所述方法评估的一种或多种特征包括以下中的一者或多者：与一种或多种RBM20聚集体相关的功能活性、一种或多种RBM20聚集体的组成、一种或多种RBM20聚集体与生物分子的共定位、一种或多种RBM20聚集体的组分的扩散系数、一种或多种RBM20聚集体的溶解或尺寸减小、RBM20多肽的定位、RBM20多肽或其前体的量、RBM20多肽在一种或多种RBM20聚集体的聚集体分配、与RBM20多肽相关的功能活性、RBM20多肽的聚集、RBM20多肽的翻译后修饰状态以及RBM20多肽降解产物的量。
在一些实施方案中，本文所述的基于细胞的方法包括确定细胞系，所述细胞系表达(瞬时表达、组成型表达或具有可诱导表达的稳定细胞系)RBM20多肽(野生型或突变体)。举例来说，可将编码RBM20多肽(野生型或突变体)的质粒瞬时转染(例如通过电穿孔)至细胞(例如H9C2)中，使RBM20多肽诸如在转染后约16-18小时表达至所需量，和/或所需表型(例如>90％的细胞在细胞质中不形成突变体RBM20聚集体)。在一些实施方案中，可用多西环素诱导携带编码RBM20多肽(野生型或突变体)的TetOn控制构建体的稳定细胞系，使RBM20多肽诸如在诱导后约24小时表达至所需量，和/或所需表型(例如>90％的细胞在细胞质中不形成突变体RBM20聚集体)。然后可将细胞置于板(例如96孔或384孔)中，例如用于转染后或诱导后24小时的活细胞成像。在一些实施方案中，将细胞用核染料染色以指示细胞活力。可同时将测试化合物与细胞混合，然后可在一段时间(例如施加化合物后1-3天)内监测所需标记物(例如RBM20多肽、其他生物分子或化合物的荧光标记、细胞形态、细胞增殖或细胞毒性)，或在测定结束时进行分析。在一些实施方案中，此类方法包括固定细胞，用所需标记物染色(例如IF染色或DAPI)，和/或用显微术。在一些实施方案中，所述方法包括将用测试化合物处理与未用测试化合物处理的细胞样品之间的与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征进行比较。在一些实施方案中，所述方法包括将表达野生型RBM20多肽的细胞系与表达突变体RBM20多肽的细胞系之间的与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征进行比较。在一些实施方案中，将非转导或非诱导细胞用作对照。
B.生物化学方法
在一些方面中，本文公开的方法为生物化学方法。本领域普通技术人员将容易认可诸如RBM20多肽等多肽和诸如RBM20聚集体等聚集体为动态的。因此，本文所述的方法涵盖在RBM20多肽和/或RBM20聚集体生命周期中的任何时间点使系统与化合物接触。举例来说，所述方法涵盖当RBM20多肽呈任何数量或具有任何翻译后修饰状态(诸如存在、不存在或具有一定水平的磷酸化残基)时，使系统与化合物接触。在一些方面中，所述方法还可涵盖例如当RBM20聚集体以任何数量存在(包括不存在)、正在经历形态变化(诸如尺寸或流动性变化)或组成正在发生变化时，使系统与化合物接触。在一些实施方案中，化合物在形成一种或多种RBM20聚集体之前与系统接触。在一些实施方案中，化合物在形成一种或多种RBM20聚集体之后与系统接触。在一些实施方案中，在系统与化合物接触后调节一种或多种RBM20聚集体的存在、不存在或量，例如在混合化合物之前，一种或多种RBM20聚集体存在于系统中，并且在化合物与系统混合后，一种或多种RBM20聚集体的量增加或减少。在本文所述方法的一些实施方案中，所述系统与所述化合物接触超过一次，例如在多于一个时间点将多于一个等分试样的化合物与系统混合。
在一些实施方案中，本文描述了一种鉴定调节与一种或多种包含RBM20多肽的聚集体(“RBM20聚集体”)相关的特征的化合物的方法，所述方法包括：(a)将化合物与包含一种或多种RBM20聚集体的溶液以及额外聚集体溶液混合；以及(b)测定与一种或多种RBM20聚集体相关的特征，其中与参考相比，特征的调节表明化合物调节与一种或多种RBM20聚集体相关的特征。在一些实施方案中，额外聚集体溶液包含RBM20多肽。在一些实施方案中，所述方法还包括鉴定调节与RBM20多肽相关的特征的化合物。在一些实施方案中，RBM20多肽为野生型RBM20多肽。在一些实施方案中，RBM20多肽为突变体RBM20多肽。在一些实施方案中，RBM20多肽包含可检测标记，诸如荧光标记。
在一些实施方案中，本文描述了一种鉴定调节与一种或多种包含RBM20多肽的聚集体(“RBM20聚集体”)和/或RBM20多肽相关的特征的化合物的方法，所述方法包括：(a)在存在化合物的情况下将一种剂与包含RBM20多肽的溶液合并，其中所述剂能够使得所述一种或多种RBM20聚集体形成，并且在所述剂接触所述溶液后形成所述一种或多种RBM20聚集体；以及(b)测定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征，其中与参考相比，特征的调节表明化合物调节与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征。在一些实施方案中，在将所述剂与包含RBM20多肽的溶液合并之前将所述剂与化合物混合。在一些实施方案中，所述剂为媒介物或缓冲剂，并且所述剂调节(诸如增加或降低)包含RBM20多肽的溶液的离子强度。在一些实施方案中，所述剂为核酸，诸如RNA。在一些实施方案中，所述剂为分子拥挤剂，诸如PEG、葡聚糖、Ficoll或它们的组合。在一些实施方案中，在将所述剂与包含RBM20多肽的溶液合并之前，溶液还包含一种或多种RBM20聚集体。在一些实施方案中，RBM20多肽为野生型RBM20多肽。在一些实施方案中，RBM20多肽为突变体RBM20多肽。在一些实施方案中，RBM20多肽包含可检测标记，诸如荧光标记。
形成聚集体的方法为已知的并且可基于例如聚集体的组成而变化。举例来说，在一些实施方案中，通过改变、添加或去除以下中的一者或多者来形成聚集体：系统的温度、系统的盐含量、聚集体的组分(诸如支架多肽、核酸或RBM20多肽)的浓度、系统中的缓冲剂、系统的离子强度、pH值或拥挤剂(诸如PEG或葡聚糖)。Alberti等,JMol Biol,430,2018也公开了一些形成聚集体的示例性方法，所述参考文献以全文引用的方式并入本文中。
i.在生物化学方法中与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征
在一些方面中，本文描述了鉴定调节与包含一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽的测定系统(诸如包含一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽的溶液)中的一种或多种包含RBM20多肽的聚集体(“RBM20聚集体”)和/或RBM20多肽相关的特征(包括一种或多种，诸如1、2、3、4或5种特征)的化合物的方法。在一些实施方案中，所述方法鉴定调节与一种或多种RBM20聚集体相关的特征的化合物。在一些实施方案中，所述方法鉴定调节与RBM20多肽相关的特征的化合物。
在一些实施方案中，与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征是基于以下中的任何一者或多者：(i)一种或多种RBM20聚集体的数目；(ii)一种或多种RBM20聚集体的组成；(iii)一种或多种RBM20聚集体的尺寸；(iv)一种或多种RBM20聚集体的稳定性；(v)一种或多种RBM20聚集体的溶解或尺寸减小；(vi)一种或多种RBM20聚集体的表面积；(vii)一种或多种RBM20聚集体的球形度；(viii)一种或多种RBM20聚集体的流动性；(ix)一种或多种RBM20聚集体的固化；(x)不在一种或多种RBM20聚集体中的RBM20多肽的量；(xi)RBM20多肽在一种或多种RBM20聚集体中的分配；和(xii)RBM20多肽的聚集。在一些实施方案中，与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征如本文任何部分中(诸如基于细胞的方法部分中)所描述。在一些实施方案中，与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征进一步是基于与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的功能活性，诸如RNA剪接，或RBM20多肽与生物分子(例如非RBM20多肽或核酸)或化合物(或其一部分)的结合能力(例如结合亲和力)。
在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的数目为RBM20聚集体的总数。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的数目为系统中RBM20聚集体的总数的估计值。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的数目为系统(诸如包含一种或多种RBM20聚集体的溶液)的一部分(例如视野)中的RBM20聚集体的数目。
在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的组成为RBM20多肽相对于一种或多种RBM20聚集体的至少一种其他组分的量。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的组成为至少一种除RBM20多肽之外的组分(诸如多肽、核酸或化合物)的存在、水平或不存在。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的组成为野生型RBM20多肽相对于突变体RBM20多肽的量。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的组成为第一突变体RBM20多肽相对于第二突变体RBM20多肽的量。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的组成为第一RBM20多肽相对于第二RBM20多肽的量，其中第一和第二RBM20多肽具有组成差异，诸如翻译后修饰的差异。
在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的尺寸是基于一种或多种RBM20聚集体中的每一者的最大跨聚集体尺寸测量值，诸如直径。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的尺寸是基于一种或多种RBM20聚集体中的每一者的周长。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的尺寸是基于一种或多种RBM20聚集体中的每一者的横截面积，或其诸如俯视图的成像表示。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的尺寸是基于一种或多种RBM20聚集体中的每一者的体积。在一些实施方案中，与一种或多种RBM20聚集体相关的特征是基于一种或多种RBM20聚集体的平均尺寸。在一些实施方案中，与一种或多种RBM20聚集体相关的特征是基于一种或多种RBM20聚集体的尺寸分布(诸如d5、d10、d90或d95)。
在一些实施方案中，与一种或多种RBM20聚集体相关的特征是基于一种或多种RBM20聚集体的量。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的量是基于一种或多种RBM20聚集体的数目和尺寸。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的量是基于细胞质的一部分中一种或多种RBM20聚集体的数目和尺寸。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的数目和尺寸如本文所描述。
在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的稳定性为一种或多种RBM20聚集体在存在应激物(诸如使一种或多种RBM20聚集体的尺寸减小的化合物)的情况下或在存在化合物的情况下随时间推移的稳定性。在一些实施方案中，稳定性为一种或多种RBM20聚集体的尺寸或数目的维持。
在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的溶解或尺寸减小是基于一种或多种RBM20聚集体中的每一者的最大跨聚集体尺寸测量值，诸如直径。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的溶解或尺寸减小是基于一种或多种RBM20聚集体中的每一者的周长。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的溶解或尺寸减小是基于一种或多种RBM20聚集体中的每一者的平均尺寸。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的溶解或尺寸减小是基于一种或多种RBM20聚集体的尺寸分布(诸如d5、d10、d90或d95)。
在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的表面积为基于一种或多种RBM20聚集体中的每一者的周长的估计表面积。
在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的球形度是基于一种或多种RBM20聚集体中的每一者与完美球体有多接近地相似。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的球形度是基于一种或多种RBM20聚集体中的每一者的横截面或俯视图的估计球形度。在一些实施方案中，与一种或多种RBM20聚集体相关的特征是基于一种或多种RBM20聚集体中的每一者的形状。在一些实施方案中，与一种或多种RBM20聚集体相关的特征为一种或多种RBM20聚集体的部分具有一定形状类型或满足一定形状参数。
在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的流动性和/或固化是基于一种或多种RBM20聚集体如何相互融合，和/或一种或多种RBM20聚集体中的每一者的结构、尺寸、形状、球形度、体积、数目和/或或表面积随时间的变化。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体的流动性和/或固化是基于纤维形成。
在一些实施方案中，RBM20多肽的聚集为RBM20多肽的非相分离聚集。
ii.在生物化学方法中测定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征
在一些实施方案中，可基于例如系统或其一部分中的一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽的评估或另一生物分子(诸如另一RBM20聚集体组分)的评估中的任何一者或多者来测定与测定系统(诸如包含一种或多种RBM20聚集体的溶液)中的一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征。在一些实施方案中，如本文任何部分中(诸如基于细胞的方法部分中)所描述来测定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征。
在一些实施方案中，测定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征是基于对测定系统的至少一部分的评估。在一些实施方案中，所述部分为视野，诸如显微镜的视野，或其一部分。在一些实施方案中，所述部分为图像的限定区域。在一些实施方案中，限定区域为任意限定的。在一些实施方案中，测定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征是基于重复评估。在一些实施方案中，重复评估是基于一个图像的多于一个部分或多于一个图像。在一些实施方案中，测定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征是基于从图像的两个或更多个部分、两个或更多个图像或从至少两个或更多个图像获得的两个或更多个部分获得的平均值或分布。
在一些实施方案中，测定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征是基于成像技术。在一些实施方案中，成像技术提供用于评估与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征的数据。在一些实施方案中，成像技术包括获得系统或其一部分的图像。在一些实施方案中，图像为二维图像。在一些实施方案中，图像为三维图像或其渲染。在一些实施方案中，将成像技术与可用于本文所述方法的另一方法特征(诸如荧光激活细胞分选(FACS)技术或FAPS技术)相结合。
在一些实施方案中，本文所述的方法包括经由成像技术对样品或其一部分(诸如包含一种或多种RBM20聚集体的溶液)进行成像。在一些实施方案中，成像技术为荧光成像技术。在一些实施方案中，成像技术包括荧光成像技术。在一些实施方案中，成像技术包括比色和荧光成像技术。在一些实施方案中，检测到的光是由于对靶标的直接标记，诸如将标记合并或缀合到化合物或RBM20多肽中。在一些实施方案中，检测到的光是由于靶标的间接标记，诸如特异性结合至RBM20多肽的标记探针，例如标记的抗RBM20抗体或其片段。
在一些实施方案中，在一段时间内例如在两个或更多个时间点测定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征。在一些实施方案中，测定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征包括评估特征在一段时间内的变化。
在一些实施方案中，使用一种或多种测量和/或技术来测定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征。在一些实施方案中，使用一种或多种测量和/或技术来测定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的超过一种特征。
在一些实施方案中，本文所述的方法包括用于例如可视化、分析和/或定量多肽和/或其前体的技术。此类技术为本领域普通技术人员熟知的。举例来说，本文涵盖用于可视化多肽的显微术技术，诸如荧光标记的多肽。本文还涵盖用于分析多肽的组成(包括翻译后修饰)、定量多肽以及研究RBM20聚集体的组成的质谱技术。本文还涵盖用于评估细胞过程的功能测定。本文还涵盖富集和/或分离技术，例如用于分离多肽和/或RBM20聚集体的离心技术或用于分离多肽或核酸的基于亲和性的技术。
在一些实施方案中，通过评估系统(诸如包含一种或多种RBM20聚集体的溶液)中RBM20聚集体的总数来测定一种或多种RBM20聚集体的数目。在一些实施方案中，通过评估系统的一部分(诸如视野)中RBM20聚集体的数目来测定一种或多种RBM20聚集体的数目。在一些实施方案中，通过基于小于系统总数的测量值估计系统中RBM20聚集体的总数来测定一种或多种RBM20聚集体的数目。
在一些实施方案中，通过评估一种或多种RBM20聚集体中RBM20多肽的量来测定一种或多种RBM20聚集体的组成。在一些实施方案中，通过评估一种或多种RBM20聚集体中或与之相关的至少一种其他组分的存在、不存在或水平来测定一种或多种RBM20聚集体的组成。在一些实施方案中，测定一种或多种RBM20聚集体的组成包括测定一种或多种RBM20聚集体中或与一种或多种RBM20聚集体相关的相对于RBM20多肽的至少一种其他组分。在一些实施方案中，直接或间接地对另一组分进行评估，诸如测量。在一些实施方案中，使用诸如APEX或XL-MS等质谱技术对另一组分进行评估。在一些实施方案中，使用标记技术对另一组分进行评估，诸如将标记直接缀合至另一组分或使用免疫标记。在一些实施方案中，一种或多种RBM20聚集体为分离和/或富集的。
在一些实施方案中，通过评估一种或多种RBM20聚集体中的每一者的最大跨聚集体尺寸测量值(诸如直径)来测定一种或多种RBM20聚集体的尺寸。在一些实施方案中，通过评估一种或多种RBM20聚集体中的每一者的周长来测定一种或多种RBM20聚集体的尺寸。在一些实施方案中，通过评估一种或多种RBM20聚集体中的每一者的横截面积或其诸如俯视图等成像表示来测定一种或多种RBM20聚集体的尺寸。在一些实施方案中，通过诸如动态光散射技术等粒度测量技术来测定一种或多种RBM20聚集体的尺寸。
在一些实施方案中，基于融合或分裂技术来测定一种或多种RBM20聚集体的稳定性。在一些实施方案中，基于一种或多种RBM20聚集体中的每一者的结构在存在细胞活性的情况下或在存在化合物的情况下随时间的变化来测定一种或多种RBM20聚集体的稳定性。在一些实施方案中，基于评估一种或多种RBM20聚集体中的每一者的尺寸、形状、球形度、体积或表面积中的任何一者或多者来测定一种或多种RBM20聚集体的稳定性。
在一些实施方案中，基于一种或多种RBM20聚集体中的每一者的结构在存在细胞活性的情况下或在存在化合物的情况下随时间的变化来测定一种或多种RBM20聚集体的溶解和尺寸减小。在一些实施方案中，基于评估一种或多种RBM20聚集体中的每一者的尺寸、形状、球形度、体积、数目(包括不存在)或表面积中的任何一者或多者来测定一种或多种RBM20聚集体的溶解或尺寸减小。
在一些实施方案中，基于使用一种或多种RBM20聚集体中的每一者的测量参数(例如周长、最大跨聚集体尺寸测量值)评估表面积来测定一种或多种RBM20聚集体的表面积。
在一些实施方案中，基于3D晶格光片技术来测定一种或多种RBM20聚集体的球形度。在一些实施方案中，基于2D成像技术来测定一种或多种RBM20聚集体的球形度。在一些实施方案中，基于一种或多种RBM20聚集体中的每一者的横截面或俯视图来测定一种或多种RBM20聚集体的球形度。
在一些实施方案中，基于融合或分裂技术来测定一种或多种RBM20聚集体的流动性和/或固化。在一些实施方案中，基于一种或多种RBM20聚集体中的每一者的结构随时间的变化来测定一种或多种RBM20聚集体的流动性和/或固化。在一些实施方案中，基于评估一种或多种RBM20聚集体中的每一者的尺寸、形状、球形度、体积、数目或表面积中的任何一者或多者的变化来测定一种或多种RBM20聚集体的流动性和/或固化。
在一些实施方案中，基于评估一种或多种RBM20聚集体中RBM20多肽的量来测定不在一种或多种RBM20聚集体中的RBM20多肽的量。在一些实施方案中，基于评估额外聚集体溶液中RMB20多肽的量来测定不在一种或多种RBM20聚集体中的RBM20多肽的量。
在一些实施方案中，基于与在一种或多种RBM20聚集体中或与之相关的RBM20多肽的量相比在一种或多种RBM20聚集体外的RBM20多肽的量来测定RBM20多肽在一种或多种RBM20聚集体中的聚集体分配。
在一些实施方案中，基于非相分离RBM20多肽聚集的存在、不存在或水平来测定RBM20多肽的聚集。
在一些实施方案中，基于光漂白荧光恢复(FRAP)技术来测定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征。在一些实施方案中，进行FRAP技术以评估完整聚集体，例如测量一种或多种RBM20聚集体的组分与细胞质的交换。在一些实施方案中，执行FRAP技术以评估一半的聚集体，例如测量一种或多种RBM20聚集体内的内部动力学。
在一些实施方案中，基于荧光团(诸如Dendra2)的光转化来测定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征。
在一些实施方案中，基于荧光相关光谱技术来测定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征。
在一些实施方案中，基于一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽的温度响应性来测定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征。
在一些实施方案中，基于跟踪聚集体融合和/或分裂(诸如细胞内的融合和/或分裂)来确定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征。在一些实施方案中，基于光镊技术来测定聚集体融合和/或分裂。在一些实施方案中，使用光镊技术来测定RBM20聚集体的表面张力。
在一些实施方案中，基于3D晶格光片技术来测定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征。
在一些实施方案中，基于超分辨率成像技术(诸如受激发射损耗(STED)显微术、随机光学重建显微术(STORM)或光活化定位显微术(PALM)或它们的混合物)来测定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征。
在一些实施方案中，基于紫外-可见(UV-Vis)光谱、小角x射线散射或静态和动态光散射(SLS/DLS)技术来测定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征。举例来说，可使用如动态光散射(DLS)、静态光散射(STS)以及小角光散射(SLS)等光散射方法来测定聚集体的尺寸和形状。另请参见Basturea,G.N.(“Biological Condensates,”MATERMETHODS 2019；9:2794)中描述的各种体外聚集体分析方法。
在一些实施方案中，在存在应激物的情况下测定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征。举例来说，在一些实施方案中，应激物为氧化应激、ATP耗竭或存在、聚集体溶解化合物、温度(诸如热)或机械应激中的一者或多者，例如在不规则或过快频率的心跳期间。
在一些实施方案中，在存在诸如使用原子力显微术技术施加的外部机械力的情况下测定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征。
在一些实施方案中，使用从杆状病毒系统表达和纯化的一种或多种RBM20多肽测定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征。
在一些实施方案中，在存在诸如PEG或葡聚糖等分子拥挤剂的情况下使用一种或多种RBM20聚集体的复溶来测定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征。在一些实施方案中，不在存在诸如PEG或葡聚糖等分子拥挤剂的情况下使用一种或多种RBM20聚集体的复溶来测定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征。在一些实施方案中，在存在诸如RNA、DNA或肌动蛋白等生物聚合物的情况下使用一种或多种RBM20聚集体的复溶来测定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征。在一些实施方案中，在存在盐或缓冲液的情况下使用一种或多种RBM20聚集体的复溶来测定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征。
在一些实施方案中，通过获得例如经由改变诸如选自盐浓度、蛋白质浓度、RNA浓度、DNA浓度、生物分子浓度、pH值以及温度的两个变量所获得的相图的数据来确定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征。
在一些实施方案中，通过评估一种或多种RBM20聚集体响应于不同缓冲条件(例如具有不同盐和其浓度、pH值、水溶助剂和其浓度、ATP浓度、核苷酸和其浓度、代谢物和其浓度的缓冲液)的溶解来确定与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征。
在一些实施方案中，特征的调节是基于一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽的存在、不存在或水平的变化。在一些实施方案中，特征的调节是基于一种或多种RBM20聚集体的数目的减少。在一些实施方案中，特征的调节是基于一种或多种RBM20聚集体的数目的增加。在一些实施方案中，特征的调节是基于一种或多种RBM20聚集体的形成，诸如一种或多种RBM20的形成。在一些实施方案中，特征的调节是基于一种或多种RBM20聚集体的尺寸的减小。在一些实施方案中，特征的调节是基于一种或多种RBM20聚集体的尺寸的增加。
在一些实施方案中，本文所述的方法包括测定化合物用于调节与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征的特异性。举例来说，在一些实施方案中，所述方法包括测定与第一RBM20聚集体和第二RBM20聚集体相关的特征的调节，其中化合物调节第一RBM20聚集体的特征而不调节第二RBM20聚集体的特征。在一些实施方案中，第一RBM20聚集体包含野生型RBM20多肽并且第二RBM20聚集体包含突变体RBM20多肽。在一些实施方案中，第一RBM20聚集体包含第一突变体RBM20多肽并且第二RBM20聚集体包含第二突变体RBM20多肽，其中第一和第二突变体RBM20多肽不同。
在一些实施方案中，所述方法包括测定与第一RBM20聚集体和第二RBM20聚集体相关的特征的调节，其中化合物调节第一RBM20聚集体和第二RBM20聚集体的特征。在一些实施方案中，第一RBM20聚集体包含野生型RBM20多肽并且第二RBM20聚集体包含突变体RBM20多肽。在一些实施方案中，第一RBM20聚集体包含第一突变体RBM20多肽并且第二RBM20聚集体包含第二突变体RBM20多肽，其中第一和第二突变体RBM20多肽不同。
iii.生物化学参考
在一些实施方案中，本文所述的方法测定与参考相比与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征的调节。
在一些实施方案中，参考为特征的确定值。在一些实施方案中，参考为与媒介物对照接触的系统，诸如包含一种或多种RBM20聚集体的溶液。在一些实施方案中，参考为与参考化合物(诸如阴性或阳性对照参考化合物)接触的系统，诸如包含一种或多种RBM20聚集体的溶液。在一些实施方案中，参考为与化合物接触的系统，诸如包含一种或多种RBM20聚集体的溶液，其中对于参考来说，与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征是在不同的时间测定。在一些实施方案中，参考为包含不同的RBM20多肽(诸如野生型或突变体RBM20多肽)的系统，诸如包含一种或多种RBM20聚集体的溶液。在一些实施方案中，参考为包含不同水平的RBM20多肽的系统，诸如包含一种或多种RBM20聚集体的溶液。在一些实施方案中，参考为包含具有不同翻译后修饰状态的RBM20多肽的系统，诸如包含一种或多种RBM20聚集体的溶液。
C.RBM20多肽
在本公开的一些方面中，本文描述了(RNA结合蛋白20)RBM20多肽。在一些实施方案中，RBM20多肽为全长RBM20多肽。在一些实施方案中，RBM20多肽为修饰的RBM20多肽，诸如全长RBM20多肽的一部分。
SEQ ID NO:1下方提供了RBM20多肽的示例性氨基酸序列，即人RBM20(Uniprotentry Q5T481)。如SEQ ID NO:1中所示，残基上方的星号(*)表示残基R636，斜体残基表示跨越I613-R673的RS区域，双下划线表示示例性无序区域(区域包括跨越V2-N64、P174-G220、Y628-Q937以及E975-K1150的残基)，并且粗体且斜体的残基表示跨越R634-P638的RSRSP区域。图7A为说明RBM20多肽的所选区域的示意图。图7B示出了对RBM20多肽序列的有序和无序区域的分析的结果。
Figure BDA0003548733440000641
Figure BDA0003548733440000651
在一些实施方案中，RBM20多肽为哺乳动物RBM20多肽。在一些实施方案中，RBM20多肽为灵长类动物RBM20多肽。在一些实施方案中，RBM20多肽为人RBM20多肽。在一些实施方案中，RBM20多肽为大鼠RBM20多肽。在一些实施方案中，RBM20多肽为小鼠RBM20多肽。
在一些实施方案中，RBM20多肽为野生型RBM20多肽。在一些实施方案中，RBM20多肽为突变体RBM20多肽。在一些实施方案中，突变体RBM20多肽包含一个或多个氨基酸残基的取代、添加或缺失中的一者或多者。在一些实施方案中，突变体RBM20多肽包含富含亮氨酸的结构域、富含谷氨酸的结构域、一个或多个锌指结构域、RPM结构域以及富含SR的结构域中的一者或多者的缺失。在一些实施方案中，突变体RBM20多肽包含与疾病或病症(例如DCM或心脏骤停)相关的家族性突变。
在一些实施方案中，突变体RBM20多肽包含内在无序区(IDR)中的突变。在一些实施方案中，突变体RBM20多肽包含RS富集区中的突变。在一些实施方案中，突变体RBM20多肽包含以下位置中的一者或多者中的突变：精氨酸634、丝氨酸635、精氨酸636、丝氨酸637以及脯氨酸638。在一些实施方案中，突变体RBM20多肽包含精氨酸634位的突变。在一些实施方案中，突变体RBM20多肽在丝氨酸635位具有突变。在一些实施方案中，突变体RBM20多肽在精氨酸636位具有突变。在一些实施方案中，突变体RBM20多肽在丝氨酸637位具有突变。在一些实施方案中，突变体RBM20多肽在脯氨酸638位具有突变。
在一些实施方案中，突变体RBM20多肽包含以下突变中的一者或多者：R636S、R636C、R636H、R634Q、S637G、P638L、S635A、S635E以及S637E。在一些实施方案中，突变体RBM20多肽具有R636S突变。在一些实施方案中，突变体RBM20多肽具有R636C突变。在一些实施方案中，突变体RBM20多肽具有R636H突变。在一些实施方案中，突变体RBM20多肽具有R634Q突变。在一些实施方案中，突变体RBM20多肽具有S637G突变。在一些实施方案中，突变体RBM20多肽具有P638L突变。在一些实施方案中，突变体RBM20多肽具有S635A突变。在一些实施方案中，突变体RBM20多肽具有S635E突变。在一些实施方案中，突变体RBM20多肽具有S637E突变。在一些实施方案中，突变体RBM20多肽具有S635E、R636S以及S637E突变。
在一些实施方案中，突变体RBM20多肽包含在RS富集区外部的突变。在一些实施方案中，突变体RBM20多肽包含在RS富集区与E富集区之间的突变。在一些实施方案中，突变体RBM20多肽在精氨酸716位具有突变。在一些实施方案中，突变体RBM20多肽包含RPM结构域中的突变。在一些实施方案中，突变体RBM20多肽在缬氨酸535位具有突变。在一些实施方案中，突变体RBM20多肽包含E富集区中的突变。在一些实施方案中，突变体RBM20多肽在谷氨酸913位具有突变。在一些实施方案中，突变体RBM20多肽包含以下突变中的一者或多者：E913K、R716Q以及V535L。在一些实施方案中，突变体RBM20多肽具有E913K突变。在一些实施方案中，突变体RBM20多肽具有R716Q突变。在一些实施方案中，突变体RBM20多肽具有V535L突变。
在一些实施方案中，RBM20多肽(诸如野生型RBM20多肽或突变体多肽)为修饰的RBM20多肽，诸如标记的RBM20多肽、全长RBM20多肽的一部分或RBM20多肽衍生物。在一些实施方案中，RBM20多肽为衍生物或类似物。在一些实施方案中，RBM20多肽为标记的。在一些实施方案中，RBM20多肽诸如共价连接至标记。在一些实施方案中，标记为可检测标记。在一些实施方案中，RBM20多肽包含荧光标记。在一些实施方案中，RBM20多肽包含衍生自八放珊瑚(例如棘穗软珊瑚属某种(Dendronephthya sp))的荧光蛋白，诸如Dendra2。
在一些实施方案中，RBM20多肽在细胞中异源表达。在一些实施方案中，RBM20多肽在细胞中同源表达。
在其中使用两种或更多种不同的RBM20多肽(诸如表达野生型RBM20多肽和突变体RBM20多肽的细胞或表达两种不同的突变体RBM20多肽的细胞)的一些实施方案中，可用可同时区分的剂对两种或更多种不同的RBM20多肽进行标记。
D.化合物
在本公开的一些方面中，本文描述了使用本文公开的方法测试和鉴定的化合物。本公开的描述所涵盖的化合物包括但不限于适合于向个体施用以用于治疗或预防目的的化合物或其前体。在一些实施方案中，化合物为监管部门批准的化合物，诸如美国食品和药物管理局(United States Food and Drug Administration)批准用于医学治疗的化合物。在一些实施方案中，化合物为新颖化合物。在一些实施方案中，化合物具有小于1,000Da，诸如500Da或更小的分子量。在一些实施方案中，化合物满足里宾斯基五规则(Lipinski'srule of five)。在一些实施方案中，化合物为小分子(诸如1,000Da或更小和/或满足里宾斯基五规则的治疗性小分子)。
在一些实施方案中，化合物包括小分子、多肽、脂质或核酸或其组分中的一者或多者。在一些实施方案中，化合物为小分子，其中化合物具有小于或约900道尔顿的分子量。在一些实施方案中，化合物或其一部分为带电荷的。在一些实施方案中，化合物或其一部分为疏水的。在一些实施方案中，化合物或其一部分为亲水的。在一些实施方案中，化合物包括抗体。在一些实施方案中，化合物包括核酸或其组分。在一些实施方案中，化合物包括RNA，诸如siRNA、miRNA、mRNA或lnRNA。在一些实施方案中，化合物包括siRNA、miRNA或mRNA。在一些实施方案中，化合物为非天然存在的化合物。
在一些实施方案中，化合物为前体或前药。在一些实施方案中，化合物在包含细胞的组合物内代谢。在一些实施方案中，化合物的代谢物为调节与一种或多种“RBM20聚集体”和/或RBM20多肽相关的特征的活性实体。
在一些实施方案中，化合物包含标记。在一些实施方案中，标记为放射性标记、比色标记、发光标记或荧光标记。在一些实施方案中，化合物为包含标记的小分子。在一些实施方案中，化合物为包含荧光团的小分子。在一些实施方案中，化合物为包含标记的多肽。在一些实施方案中，化合物为包含荧光团的多肽。在一些实施方案中，化合物为包含标记的核酸。在一些实施方案中，化合物为包含荧光团的核酸。在一些实施方案中，化合物与化合物共价或非共价缀合。
在其中使用标记的RBM20多肽的一些实施方案中，化合物包含可同时与标记的RBM20多肽的标记区分开来的标记。
在本文所述方法的一些实施方案中，化合物存在于媒介物中。在一些实施方案中，媒介物包含能够引起聚集体形成的另一剂，诸如核酸(例如RNA)或分子拥挤剂(例如REG、葡聚糖或Ficoll)。在一些实施方案中，媒介物使得如本文所述的与包含细胞的组合物或包含一种或多种RBM20聚集体的溶液以及额外聚集体溶液混合使得形成一种或多种RBM20聚集体。
在一些实施方案中，化合物直接与RBM20多肽相互作用或缔合。在一些实施方案中，化合物间接与RBM20多肽相互作用或缔合。在一些实施方案中，化合物与RBM20聚集体相互作用或缔合。在一些实施方案中，化合物与RBM20聚集体的除RBM20多肽外的组分相互作用或缔合。在一些实施方案中，化合物与生物分子相互作用或缔合，其中生物分子与RBM20聚集体的组分相互作用或缔合。
E.本文所述方法的其他用途和其他方法步骤
在一些方面中，本文所述的方法可以各种模式使用、用于各种目的并且具有额外的方法步骤。
在一些方面中，在筛选中使用本文所述的方法以测定化合物的库。在一些方面中，在筛选中使用本文所述的方法以测定化合物的库，其中筛选包括基于细胞的方法。在一些方面中，在筛选中使用本文所述的方法以测定化合物的库，其中筛选使用具有单一RBM20表达型态的细胞，例如全部表达突变体RBM20多肽的细胞和/或表达基本相似水平的RBM20多肽的细胞。在一些方面中，在筛选中使用本文所述的方法以测定化合物的库，其中筛选包括生物化学方法。在一些方面中，在筛选中使用本文所述的方法以测定细胞的库。在一些方面中，在筛选中使用本文所述的方法以测定细胞的库，其中细胞的库包含具有不同RBM20表达型态(例如不同的RBM20突变、RBM20突变的不同组合以及RBM20突变与野生型RBM20的组合)的细胞。在一些实施方案中，本文所述的方法包括评估单一系统(诸如包含细胞的组合物)中的两种或更多种化合物。
在一些方面中，本文所述的方法经过模式化用于任何水平的通量，诸如高通量、中等通量或低通量。
在一些实施方案中，本文所述的方法还包括使用第二基于细胞的测定对所鉴定的化合物进行评估。在一些实施方案中，本文所述的方法还包括使用体外测定对所鉴定的化合物进行评估。举例来说，所述方法还包括评估所鉴定的化合物与处于非聚集体状态(例如轻相)的RBM20聚集体的一种或多种组分的体外结合亲和力。化合物或其部分对处于非聚集体状态的聚集体的组分的结合亲和力可通过本领域已知的任何合适的方法来测量，诸如微量热泳动(MST)、等温滴定量热法(ITC)、表面等离子共振(SPR)、核磁共振(NMR)、荧光偏振(FP)或荧光共振能量转移(FRET)技术。示例性方法另请参见Vuignier等“Drug-proteinbinding:a critical review of analytical tools”(Anal Bioanal Chem,2010)以及Basturea,G.N.(“Biological Condensates,”MATER METHODS 2019；9:2794)。
在一些实施方案中，本文所述的方法还包括测定细胞或其部分或RBM20聚集体中化合物的量。在一些实施方案中，测定化合物的量包括定量地检测化合物。在一些实施方案中，测定化合物的量包括定量地检测化合物的标记。在一些实施方案中，测定化合物的量包括检测化合物的活性和计算产生检测到的活性量所需的化合物的量。在一些实施方案中，通过质谱、液相色谱和/或紫外可见分光光度法来测定化合物的量。在一些实施方案中，通过荧光显微术来测定化合物的量。可使用标准曲线来帮助确定化合物的量。
在一些方面中，本文提供了一种鉴定可用于治疗RBM20相关疾病的化合物的方法，所述方法包括根据本文所述的任何一种方法来鉴定化合物。在一些实施方案中，RBM20相关疾病为心肌病。在一些实施方案中，心肌病为扩张型心肌病(DCM)。
可在基于所需化合物活性和/或所需的与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征对化合物的智能筛选和/或设计中使用本文所述的方法。在一些实施方案中，化合物或其部分的所需特性是基于对调节疾病相关RBM20聚集体以减轻疾病的一种或多种病因或症状的考虑。
在一些方面中，本文提供了一种基于使用本文所述的任何方法鉴定每种化合物以及RBM20聚集体和/或RBM20多肽的一种或多种特征的调节在多种测试化合物或其一部分中筛选候选化合物的方法。在一些实施方案中，基于诸如与一组筛选的化合物或其一部分相比与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的至少一种特征的所需调节来选择候选化合物或其部分。
在一些实施方案中，所需化合物活性选自以下中的一者或多者：(i)与细胞核中的RBM20聚集体相比，测试化合物(或其部分)与细胞质中的RBM20聚集体优先缔合；(ii)与不含RBM20多肽的聚集体相比，测试化合物(或其部分)优先分配至RBM20聚集体中(例如在细胞质中)；(iii)与非RBM20多肽相比，测试化合物(或其部分)与RBM20多肽优先结合；(iv)测试化合物(或其部分)与RBM20聚集体的组分(诸如不是RBM20多肽的生物分子)优先结合；(v)与野生型RBM20多肽相比，测试化合物(或其部分)与突变体RBM20多肽优先结合。
在一些实施方案中，所需的与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的一种或多种特征的调节选自以下中的一者或多者：(i)使一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽从细胞质重新定位至细胞核；(ii)减少细胞质中RBM20聚集体的量；(iii)增加核中RBM20聚集体的量；(iv)减小细胞质中一种或多种RBM20聚集体的尺寸；(v)增加包含RBM20多肽的细胞核聚集体与包含RBM20多肽的细胞质聚集体相比的比率；(vi)恢复和/或增加与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的功能活性，诸如细胞核中的RNA剪接；(vii)从一种或多种RBM20聚集体中排除生物分子，诸如在健康或非应激状况下通常不被发现与细胞质RBM20聚集体相关的生物分子；(viii)将生物分子从一种或多种RBM20聚集体重新定位至其在健康或非应激状况下本应在的位置；(ix)降低一种或多种细胞质RBM20聚集体的稳定性；(x)增加一种或多种细胞核RBM20聚集体的稳定性；(xi)将细胞质中的一种或多种RBM20聚集体溶解；(xii)减小细胞质中一种或多种RBM20聚集体的表面积；(xiii)恢复细胞核中一种或多种RBM20聚集体的球形度；(xiv)增加细胞核和/或细胞质中一种或多种RBM20聚集体的流动性；(xv)减少细胞核和/或细胞质中一种或多种RBM20聚集体的固化；(xvi)将RBM20多肽从细胞质中的一种或多种RBM20聚集体重新定位至细胞核；(xvii)减少RBM20多肽或其前体的量(例如当RBM20过表达或活性过大时)；(xviii)增加细胞核中RBM20多肽或其前体的量；(xix)促进RBM20多肽分配至细胞核中的一种或多种RBM20聚集体中(例如与细胞质中的那些相比)；(xx)减少细胞质中RBM20多肽的聚集；(xxi)促进或消除细胞质中RBM20多肽的翻译后修饰(例如泛素化或磷酸化)；以及(xxii)增加细胞质中RBM20多肽降解产物的量。
在一些方面中，本文提供了一种设计候选化合物的方法，所述候选化合物具有本文所述的与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的一种或多种特征的所需调节。在一些实施方案中，设计方法包括将一个或多个部分合并至候选化合物中，其中每个部分整个或部分驱动一种或多种特征的所需调节。举例来说，在一些实施方案中，候选化合物可经过设计具有驱使减小一种或多种RBM20聚集体的尺寸的第一部分和驱使RBM20多肽从细胞质中的一种或多种RBM20聚集体重新定位至细胞核的第二部分。在一些实施方案中，候选化合物可经过设计具有驱使分配于细胞质中的RBM20聚集体中的第一部分和驱动另一功能(诸如激活或抑制另一生物分子的功能或选择性地阻断另一生物分子分配于RBM20聚集体中)的第二部分。在一些实施方案中，候选化合物可经过设计具有驱使降低细胞质中一种或多种RBM20聚集体的稳定性并且溶解细胞质中的一种或多种RBM20聚集体的第一部分，以及驱使从细胞质中的一种或多种RBM20聚集体排除生物分子的第二部分，其中生物分子在健康或非应激状况下不与细胞质RBM20聚集体缔合。在一些实施方案中，候选化合物可经过设计具有调节(诸如促使存在或不存在)RBM20多肽的翻译后修饰的部分。在一些实施方案中，设计方法包括取代、去除或添加与一种或多种所需化合物活性相关的部分和/或调节本文所述的与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的一种或多种特征。在一些实施方案中，设计方法还包括重复设计和测试步骤，直到实现所需的需要/特性。在一些实施方案中，设计方法包括合成候选化合物。
在一些方面中，本文提供了一种设计候选化合物的方法，所述方法包括组合两个或更多个部分，其中每个部分与本文所述的一种或多种特征的所需调节相关。在一些实施方案中，设计方法包括在任何数目的位置和/或立体化学方向连接经由本文所述的方法鉴定的包含所需特征的部分。在一些实施方案中，所得候选化合物包含所需化合物活性和/或本文所述的一种或多种特征的所需调节的组合。在一些实施方案中，设计方法还包括重复设计和测试步骤，直到实现所需的需要/特性。在一些实施方案中，设计方法包括合成候选化合物。
在一些实施方案中，本文所述的方法可用于基于所实现的本文所述的一种或多种特征的所需调节来开发一种或多种规则集合。在一些实施方案中，可将一种或多种规则集合用作使用包括模型化、基于计算机和/或计算的技术(例如对具有本文所述的一种或多种特征的所需调节的化合物的生物信息学、化学信息学和/或基于人工智能(AI)的鉴定)的方法鉴定和/或设计一种或多种化合物的基础。还提供了用于确定和/或应用一种或多种规则集的计算机软件。
在一些方面中，本文提供了一种鉴定用于治疗与RBM20聚集体活性相关的疾病或病症的候选化合物的方法。在一些实施方案中，与RBM20聚集体活性相关的疾病或病症是指发生以下中的任何一者或多者的疾病或病症：1)细胞质中形成一种或多种RBM20聚集体；2)细胞核中一种或多种RBM20聚集体消失(例如溶解)；3)一种或多种RBM20聚集体或其组分分布至RBM20聚集体或其组分在健康状况下通常不会定位的位置(例如在疾病状况下易位至细胞质)；4)RBM20聚集体数目增加或减少(例如在细胞核和/或细胞质中)；5)包含和/或不包含一种组分(例如RBM20多肽或成为RBM20聚集体组分的一种或多种其他生物分子)的RBM20聚集体的数目增加或减少；6)一种或多种RBM20聚集体改变尺寸、形状、表面积和/或球形度；7)一种或多种RBM20聚集体的聚集体组成改变；8)一种或多种RBM20聚集体的流动性改变(或为动态)；9)一种或多种RBM20聚集体的固化改变；10)RBM20纤维形成的存在和/或量改变；11)RBM20聚集体组分分配至RBM20聚集体中改变；以及12)RBM20多肽的聚集。根据疾病状况下的一种或多种特征(并且与健康状况下的特征进行比较)，人们可使用本文所述的任何方法鉴定/筛选/修改/设计具有一种或多种所需化合物活性和/或本文所述的一种或多种特征的所需调节的候选化合物。
本领域技术人员将认识到，在本申请公开的范围和精神内，若干实施方案为可能的。通过以下实施例进一步说明本公开，所述实施例不应解释为将本发明的范围或精神限于其中所述的具体程序。
III.本公开的组合物
在一些方面中，本公开提供了如本文公开的方法的各个方面所述的组合物，诸如试剂盒。
在一些实施方案中，本文提供了一种包含诸如本申请通篇所述的RBM20多肽的细胞。举例来说，在一些实施方案中，提供了一种表达一定水平的野生型RBM20多肽的细胞。在一些实施方案中，提供了一种表达一定水平的突变体RBM20多肽的细胞。在一些实施方案中，提供了一种不表达内源RBM20多肽的细胞，诸如敲除细胞。在一些实施方案中，提供了一种具有异源RBM20多肽的细胞。在一些实施方案中，RBM20多肽为标记的RBM20多肽。
在一些实施方案中，本文提供了一种包含RBM20多肽(诸如本申请通篇所述的富集或分离的RBM20多肽)的组合物。举例来说，在一些实施方案中，RBM20多肽为野生型RBM20多肽。在一些实施方案中，RBM20多肽为突变体多肽。在一些实施方案中，RBM20多肽为标记的RBM20多肽。
IV.示例性实施方案
实施方案1.一种鉴定调节与细胞的细胞质中的一种或多种包含RBM20多肽的聚集体(“RBM20聚集体”)和/或细胞的细胞质中的RBM20多肽相关的特征的化合物的方法，所述方法包括：(a)将所述化合物与包含所述细胞的组合物混合，其中(i)所述细胞包含所述一种或多种RBM20聚集体，和/或(ii)在所述化合物接触所述组合物后所述细胞中形成所述一种或多种RBM20聚集体；以及(b)测定与所述一种或多种RBM20聚集体和/或所述RBM20多肽相关的所述特征，其中与参考相比，所述特征的调节表明所述化合物调节与所述一种或多种RBM20聚集体和/或所述RBM20多肽相关的所述特征。
实施方案2.如实施方案1所述的方法，其中与所述一种或多种RBM20聚集体和/或所述RBM20多肽相关的所述特征是基于以下中的任何一者或多者：(i)所述一种或多种RBM20聚集体的定位；(ii)所述一种或多种RBM20聚集体和/或所述RBM20多肽的分布；(iii)所述一种或多种RBM20聚集体的数目；(iv)所述一种或多种RBM20聚集体的尺寸；(v)一种或多种RBM20聚集体与参考聚集体的量的比率；(vi)与所述一种或多种RBM20聚集体相关的功能活性；(vii)所述一种或多种RBM20聚集体的组成；(viii)所述一种或多种RBM20聚集体与生物分子的共定位；(ix)所述一种或多种RBM20聚集体的组分的扩散系数；(x)所述一种或多种RBM20聚集体的稳定性；(xi)所述一种或多种RBM20聚集体的溶解或尺寸减小；(xii)所述一种或多种RBM20聚集体的表面积；(xiii)所述一种或多种RBM20聚集体的球形度；(xiv)所述一种或多种RBM20聚集体的流动性；(xv)所述一种或多种RBM20聚集体的固化；(xvi)所述RBM20多肽的定位；(xvii)所述RBM20多肽或其前体的量；(xviii)所述RBM20多肽在所述一种或多种RBM20聚集体中的聚集体分配；(xix)与所述RBM20多肽相关的功能活性；(xx)所述RBM20多肽的聚集；(xxi)所述RBM20多肽的翻译后修饰状态；以及(xxii)RBM20多肽降解产物的量。
实施方案3.如实施方案2所述的方法，其中所述特征的调节是基于所述细胞的所述细胞质中所述一种或多种RBM20聚集体的数目的减少。
实施方案4.如实施方案2或3所述的方法，其中所述特征的调节是基于所述细胞的所述细胞质中所述RBM20多肽或其前体的量的减少。
实施方案5.如实施方案2-4中任一项所述的方法，其中所述特征的调节是基于所述细胞的所述细胞质中所述一种或多种RBM20聚集体的溶解或尺寸减小。
实施方案6.如实施方案2-5中任一项所述的方法，其中所述特征的调节是基于与所述细胞的所述细胞质中的所述一种或多种RBM20聚集体和/或所述RBM20多肽相关的功能活性的降低。
实施方案7.如实施方案1所述的方法，其中与所述一种或多种RBM20聚集体和/或所述RBM20多肽相关的所述特征包括所述一种或多种RBM20聚集体的定位、所述一种或多种RBM20聚集体和/或所述RBM20多肽的分布、所述一种或多种RBM20聚集体的数目、所述一种或多种RBM20聚集体的尺寸以及一种或多种RBM20聚集体与参考聚集体的量的比率。
实施方案8.如实施方案1所述的方法，其中与所述一种或多种RBM20聚集体和/或所述RBM20多肽相关的所述特征包括所述一种或多种RBM20聚集体的组成，以及所述一种或多种RBM20聚集体与生物分子的共定位。
实施方案9.如实施方案7或8所述的方法，其中与所述一种或多种RBM20聚集体和/或所述RBM20多肽相关的所述特征还包括与所述一种或多种RBM20聚集体相关的功能活性。
实施方案10.如实施方案1所述的方法，其中与所述一种或多种RBM20聚集体和/或所述RBM20多肽相关的所述特征包括所述一种或多种RBM20聚集体的稳定性、所述一种或多种RBM20聚集体的溶解或尺寸减小以及所述一种或多种RBM20聚集体的表面积。
实施方案11.如实施方案1所述的方法，其中与所述一种或多种RBM20聚集体和/或所述RBM20多肽相关的所述特征包括所述一种或多种RBM20聚集体的球形度、所述一种或多种RBM20聚集体的流动性以及所述一种或多种RBM20聚集体的固化。
实施方案12.如实施方案1所述的方法，其中与所述一种或多种RBM20聚集体和/或所述RBM20多肽相关的所述特征包括所述RBM20多肽的定位以及所述RBM20多肽或其前体的量。
实施方案13.如实施方案12所述的方法，其中与所述一种或多种RBM20聚集体和/或所述RBM20多肽相关的所述特征还包括所述RBM20多肽的翻译后修饰状态。
实施方案14.如实施方案12或13所述的方法，其中与所述一种或多种RBM20聚集体和/或所述RBM20多肽相关的所述特征还包括与所述RBM20多肽相关的功能活性。
实施方案15.如实施方案1所述的方法，其中与所述一种或多种RBM20聚集体和/或所述RBM20多肽相关的所述特征包括所述一种或多种RBM20聚集体与生物分子的共定位以及所述一种或多种RBM20聚集体的组分的扩散系数。
实施方案16.如实施方案1所述的方法，其中与所述一种或多种RBM20聚集体和/或所述RBM20多肽相关的所述特征包括所述一种或多种RBM20聚集体的稳定性以及所述一种或多种RBM20聚集体的溶解或尺寸减小。
实施方案17.如实施方案1所述的方法，其中与所述一种或多种RBM20聚集体和/或所述RBM20多肽相关的所述特征包括所述一种或多种RBM20聚集体的表面积、所述一种或多种RBM20聚集体的球形度、所述一种或多种RBM20聚集体的流动性以及所述一种或多种RBM20聚集体的固化。
实施方案18.如实施方案1-17中任一项所述的方法，其中所述RBM20多肽为野生型RBM20多肽。
实施方案19.如实施方案1-17中任一项所述的方法，其中所述RBM20多肽为突变体RBM20多肽。
实施方案20.如实施方案19所述的方法，其中所述突变体RBM20多肽包含内在无序区(IDR)中的突变。
实施方案21.如实施方案19或20所述的方法，其中所述突变体RBM20多肽包含RS富集区中的突变。
实施方案22.如实施方案19-21中任一项所述的方法，其中所述突变体RBM20多肽包含以下位置中的一者或多者中的突变：精氨酸634、丝氨酸635、精氨酸636、丝氨酸637以及脯氨酸638。
实施方案23.如实施方案22所述的方法，其中所述突变体RBM20多肽包含以下突变中的一者或多者：R636S、R636C、R636H、R634Q、S637G、P638L、S635A、S635E以及S637E。
实施方案24.如实施方案19所述的方法，其中所述突变体RBM20多肽包含以下突变中的一者或多者：E913K、R716Q以及V535L。
实施方案25.如实施方案1-24中任一项所述的方法，其中所述RBM20多肽在所述细胞中异源表达。
实施方案26.如实施方案1-24中任一项所述的方法，其中所述RBM20多肽在所述细胞中同源表达。
实施方案27.如实施方案1-26中任一项所述的方法，其中所述细胞为心脏细胞类型的模型。
实施方案28.如实施方案1-27中任一项所述的方法，其中所述细胞为心肌细胞。
实施方案29.如实施方案27或28所述的方法，其中所述细胞为大鼠H9C2细胞。
实施方案30.如实施方案27或28所述的方法，其中所述细胞为人AC-16细胞、源自患者的心肌细胞、分化为心肌细胞的人诱导多能干细胞或分化为心肌细胞的干细胞。
实施方案31.如实施方案1-26中任一项所述的方法，其中所述细胞选自由以下组成的组：HeLa细胞、U2OS细胞、人胚胎肾细胞、人诱导多能干细胞以及干细胞。
实施方案32.如实施方案1-31中任一项所述的方法，其中所述细胞对于编码所述RBM20多肽的等位基因来说为纯合的。
实施方案33.如实施方案1-31中任一项所述的方法，其中所述细胞对于编码所述RBM20多肽的等位基因来说为杂合的。
实施方案34.如实施方案1-33中任一项所述的方法，其中所述参考包含包含与对照剂混合的所述细胞的所述组合物的等分试样。
实施方案35.如实施方案1-34中任一项所述的方法，所述方法还包括对所述组合物或所述细胞的至少一部分进行成像。
实施方案36.如实施方案1-35中任一项所述的方法，其中所述方法还包括测定所述细胞的一种或多种细胞特征。
实施方案37.如实施方案1-36中任一项所述的方法，所述方法还包括使所述组合物或所述细胞的至少一部分与固定剂接触。
实施方案38.如实施方案1-37中任一项所述的方法，所述方法还包括使所述组合物或所述细胞的至少一部分与染色剂接触。
实施方案39.如实施方案1-38中任一项所述的方法，所述方法还包括使用第二基于细胞的测定对所鉴定的化合物进行评估。
实施方案40.如实施方案1-39中任一项所述的方法，所述方法还包括使用体外测定对所鉴定的化合物进行评估。
实施方案41.一种鉴定使细胞的细胞质中包含RBM20多肽的聚集体(“RBM20聚集体”)的尺寸和/或数目减小的化合物的方法，所述方法包括：(a)测定接受所述化合物的所述细胞的至少一部分所述细胞质中的所述RBM20聚集体的尺寸和/或数目；以及(b)将所述RBM20聚集体的尺寸和/或数目与参考进行比较，从而鉴定使所述细胞的所述细胞质中所述RBM20聚集体的尺寸和/或数目减小的化合物。
实施方案42.如实施方案41所述的方法，其中所述化合物使RBM20聚集体的数目减少。
实施方案43.如实施方案41或42所述的方法，其中所述化合物使RBM20聚集体的尺寸减小。
实施方案44.一种鉴定阻止细胞的细胞质中一种或多种包含RBM20多肽的聚集体(“RBM20聚集体”)的形成或生长的化合物的方法，所述方法包括：(a)将所述化合物与包含所述细胞的组合物合并，其中(i)所述细胞包含所述一种或多种RBM20聚集体，和/或(ii)在所述化合物接触所述组合物后形成所述一种或多种RBM20聚集体；以及(b)获得对所述细胞的至少一部分所述细胞质中所述一种或多种RBM20聚集体的尺寸和/或数目的第一次测量；以及(c)将所述第一次测量与参考进行比较，从而鉴定阻止所述细胞的所述细胞质中所述一种或多种RBM20聚集体的形成或生长的化合物。
实施方案45.如实施方案44所述的方法，其中所述参考包含包含与对照剂混合的所述细胞的所述组合物的等分试样。
实施方案46.如实施方案44所述的方法，其中所述参考为对所述细胞的至少一部分所述细胞质中所述一种或多种RBM20聚集体的尺寸和/或数目的第二次测量，并且其中所述第二次测量在与所述第一次测量不同的时间进行。
实施方案47.如实施方案44-46中任一项所述的方法，所述方法还包括使所述细胞经受有助于所述一种或多种RBM20聚集体形成的条件。
实施方案48.一种鉴定使细胞的细胞质中RBM20多肽的量减少的化合物的方法，所述方法包括：(a)将所述化合物与包含所述细胞的组合物合并；(b)获得对所述细胞的至少一部分所述细胞质中所述RBM20多肽的量的第一次测量；以及(c)将所述第一次测量与参考进行比较，从而鉴定使所述细胞的所述细胞质中所述RBM20多肽的量减少的化合物。
实施方案49.如实施方案48所述的方法，其中所述参考包含包含与对照剂混合的所述细胞的所述组合物的等分试样。
实施方案50.如实施方案49所述的方法，其中所述参考为对所述细胞的至少一部分所述细胞质中所述RBM20多肽的量的第二次测量，并且其中所述第二次测量在与所述第一次测量不同的时间进行。
实施方案51.一种鉴定调节与一种或多种包含RBM20多肽的聚集体(“RBM20聚集体”)相关的特征的化合物的方法，所述方法包括：(a)将所述化合物与包含所述一种或多种RBM20聚集体的溶液以及额外聚集体溶液混合；以及(b)测定与所述一种或多种RBM20聚集体相关的所述特征，其中与参考相比，所述特征的调节表明所述化合物调节与所述一种或多种RBM20聚集体相关的所述特征。
实施方案52.一种鉴定调节与一种或多种包含RBM20多肽的聚集体(“RBM20聚集体”)和/或RBM20多肽相关的特征的化合物的方法，所述方法包括：(a)在存在所述化合物的情况下将一种剂与包含所述RBM20多肽的溶液合并，其中所述剂能够使得所述一种或多种RBM20聚集体形成，并且在所述剂接触所述溶液后形成所述一种或多种RBM20聚集体；以及(b)测定与所述一种或多种RBM20聚集体和/或所述RBM20多肽相关的所述特征，其中与参考相比，所述特征的调节表明所述化合物调节与所述一种或多种RBM20聚集体和/或所述RBM20多肽相关的所述特征。
实施方案53.如实施方案51或52所述的方法，其中与所述一种或多种RBM20聚集体和/或所述RBM20多肽相关的所述特征是基于以下中的任何一者或多者：(i)所述一种或多种RBM20聚集体的数目；(ii)所述一种或多种RBM20聚集体的组成；(iii)所述一种或多种RBM20聚集体的尺寸；(iv)所述一种或多种RBM20聚集体的稳定性；(v)所述一种或多种RBM20聚集体的溶解或尺寸减小；(vi)所述一种或多种RBM20聚集体的表面积；(vii)所述一种或多种RBM20聚集体的球形度；(viii)所述一种或多种RBM20聚集体的流动性；(ix)所述一种或多种RBM20聚集体的固化；(x)不在所述一种或多种RBM20聚集体中的所述RBM20多肽的量；(xi)所述RBM20多肽在所述一种或多种RBM20聚集体中的分配；以及(xii)所述RBM20多肽的聚集。
实施方案54.一种鉴定调节用于包含RBM20多肽的聚集体(“RBM20聚集体”)的生物分子的分配的化合物的方法，所述方法包括：(a)将所述化合物与包含细胞的组合物混合，其中(i)所述细胞包含所述RBM20聚集体，和/或(ii)所述化合物接触所述组合物后在所述细胞中形成所述RBM20聚集体；以及(b)测定用于所述RBM20聚集体的所述生物分子的分配。
实施方案55.如权利要求54所述的方法，其中所述生物分子为非RBM20多肽。
实施方案56.如权利要求54所述的方法，其中所述生物分子为野生型RBM20多肽。
实施方案57.如权利要求54-56中任一项的方法，其中包含所述RBM20多肽的所述RBM20聚集体包含突变体RBM20多肽。
实施方案58.一种鉴定可用于治疗RBM20相关疾病的化合物的方法，所述方法包括根据实施方案1-57所述的方法中的任一者来鉴定化合物。
实施方案59.如实施方案58所述的方法，其中所述RBM20相关疾病为心肌病。
实施方案60.如实施方案59所述的方法，其中所述心肌病为扩张型心肌病。
实施例
实施例1
此实施例展示经过工程化以表达荧光标记的野生型RBM20或具有单点突变的荧光标记的RBM20突变体的细胞的荧光成像分析。使用瞬时转染对HeLa和U2OS(人骨骨肉瘤上皮细胞)细胞进行工程化，以表达与Dendra2标记连接的野生型人RBM20多肽或与Dendra2标记连接的突变体RBM20。转染后，对细胞进行孵育以允许RBM20多肽表达。使用具有60x油浸物镜的DeltaVision宽视野解卷积系统捕获细胞和/或细胞部分的荧光图像。
在用野生型RBM20多肽转染的HeLa细胞中，在细胞核中观察到RBM20聚集体(图1A)。在用R636S RBM20多肽转染的HeLa细胞中，仅在细胞质中观察到RBM20聚集体(图1B)。图1A和图1B的图像在虚线框中的样子对应于以聚集体为特征的放大视图。
在用野生型RBM20多肽转染的U2OS细胞中，在细胞核中观察到RBM20聚集体(图2A)。在用R636S RBM20多肽转染的U2OS细胞中，仅在细胞质中观察到RBM20聚集体(图2B)。图2A和图2B的图像在虚线框中的样子对应于以聚集体为特征的放大视图。
如上所述，使额外的RBM20多肽突变体(即R636C和R636H)在U2OS细胞中表达并且进行了评价。如图3A-3D所示，在用野生型RBM20多肽转染的U2OS细胞中，主要在细胞核中观察到RBM20聚集体(图3A)，并且在用RBM20突变体多肽转染的U2OS细胞中，仅在细胞质中观察到RBM20聚集体(图3B，R636S RBM20；图3C，R636C RBM20；图3D，R636H RBM20)。图3A-3C的图像在虚线框中的样子对应于以聚集体为特征的放大视图。
实施例2
此实施例展示经过工程化以表达荧光标记的野生型RBM20多肽或在富含RS的结构域中具有单点突变的各种荧光标记的RBM20突变体多肽的心肌细胞(即H9C2，来自胚胎心脏的大鼠成肌细胞)的荧光成像分析。使用瞬时转染对H9C2细胞进行工程化，以表达与Dendra2标记连接的野生型RBM20多肽或与Dendra2标记连接的突变体RBM20多肽(R636S、R636C、R636H、R634Q、S635A、S637G、P638L)。转染后，对细胞进行孵育以允许RBM20多肽表达。使用具有60x油浸物镜的DeltaVision宽视野解卷积系统捕获细胞和/或细胞部分的荧光图像。
如图4A-4H所示，在用野生型RBM20多肽转染的H9C2细胞中，主要在细胞核中观察到RBM20聚集体(图4A)，并且在用RBM20突变体多肽转染的H9C2细胞中，仅在细胞质中观察到RBM20聚集体(图4B，R636S RBM20；图4C，R636C RBM20；图4D，R636H RBM20；图4E，R634QRBM20；图4F，S635A RBM20；图4G，S637G RBM20；图4H，P638L RBM20)。
实施例3
此实施例展示经过工程化以表达荧光标记的野生型RBM20的各种U2OS细胞的荧光成像分析。使用瞬时转染对U2OS细胞进行工程化，以表达与Dendra2标记连接的野生型人RBM20多肽。转染后，对细胞进行孵育以允许RBM20多肽表达。使用具有60x油浸物镜的DeltaVision宽视野解卷积系统捕获细胞和/或细胞部分的荧光图像。
在U2OS细胞中，观察到野生型RBM20多肽的持续表达可使得细胞核与细胞质两者中形成RBM20聚集体。如图5A和5B所示，一些U2OS细胞具有主要位于细胞核中的RBM20聚集体(图5A)，并且一些U2OS细胞具有位于细胞核与细胞质两者中的RBM20聚集体(图5B)。图5A的图像在虚线框中的样子对应于以聚集体为特征的放大视图。
实施例4
此实施例展示用于鉴定调节与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征的化合物的测定。使用瞬时转染对H9C2细胞进行工程化，以表达与Dendra2标记连接的突变体R636S RBM20多肽。转染后，对细胞进行孵育以允许RBM20多肽表达。将H9C2细胞与选自对照(DMSO)、硫辛酰胺(30μM)、米托蒽醌(20μM)或JQ1(10μM)的化合物混合，然后孵育2小时，然后捕获荧光图像。使用具有60x油浸物镜的DeltaVision宽视野解卷积系统捕获细胞和/或细胞部分的荧光图像。
图6A-6D中示出了用化合物和参考物处理的H9C2细胞的图像。使用这些图像，可测定与参考相比与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征的调节。
实施例5
此实施例展示经过工程化以表达荧光标记的野生型RBM20的H9C2细胞的荧光成像分析。使用瞬时转染对H9C2细胞进行工程化，以表达与Dendra2标记连接的野生型人RBM20多肽。转染后，对细胞进行孵育以允许RBM20多肽表达，并且历经一定时间过程捕获荧光图像。使用具有40x油浸物镜的DeltaVision宽视野解卷积系统捕获细胞和/或细胞部分的荧光图像。
在H9C2细胞中，在较早的时间点观察到野生型RBM20多肽的表达使得在细胞核中形成RBM20聚集体(图8A)。在稍后的时间点，观察到细胞核中的RBM20聚集体的量增加，并且RBM20多肽的持续表达使得在细胞质中形成RBM20聚集体(图8B)。此时间过程研究表明，野生型RBM20多肽的表达增加可使得细胞核饱和，这则使得形成细胞质野生型RBM20聚集体。
实施例6
此实施例展示可用于进一步评估RBM20细胞系统，包括用于评估RBM20多肽定位、聚集体形成以及聚集体特性的各种细胞模型系统。
使用瞬时转染对H9C2细胞进行工程化，以表达与Dendra2标记和C端的核定位信号(NLS)连接的突变体R636S RBM20多肽，或在没有NLS的情况下表达与Dendra2标记连接的突变体R636S RBM20多肽。转染后，对细胞进行孵育以允许RBM20多肽表达。然后将细胞固定并且用DAPI染色以可视化细胞核。使用具有60x油浸物镜的DeltaVision宽视野解卷积系统捕获细胞和/或细胞部分的荧光图像。
如图9所示，向突变体R636S RBM20多肽添加NLS(上图)拯救了突变体R636S RBM20多肽的核定位，因为没有NLS的突变体R636RBM20多肽仅定位于细胞质中(下图)。
使用瞬时转染对H9C2细胞进行工程化，以表达与Dendra2标记连接的磷酸模拟突变体RBM20多肽(R636S、S635E、S637E)。如实施例4中，也使用瞬时转染对H9C2细胞进行工程化，以表达与Dendra2标记连接的突变体R636S RBM20多肽。转染后，对细胞进行孵育以允许RBM20多肽表达。使用具有40x油浸物镜的DeltaVision宽视野解卷积系统捕获细胞和/或细胞部分的荧光图像。
如图10所示，磷酸模拟突变体(R636S、S635E、S637E)未拯救突变体R636S RBM20多肽的核定位。
使用瞬时转染对H9C2细胞进行工程化，以表达与Dendra2标记连接的野生型RBM20多肽的截短/切除形式。具体来说，所研究的RBM20多肽的形式为富含亮氨酸的结构域缺失(结构域跨越氨基酸56-151)、富含谷氨酸的结构域缺失(结构域跨越氨基酸839-945)、锌指1和锌指2缺失(锌指1跨越氨基酸394-440；锌指2跨越氨基酸1133-1200)、RNA识别基序缺失(RRM；结构域跨越氨基酸517-598)以及富含丝氨酸-精氨酸的结构域缺失(SR；结构域跨越氨基酸613-673)。转染后，对细胞进行孵育以允许RBM20多肽表达。使用具有60x油浸物镜的DeltaVision宽视野解卷积系统捕获细胞和/或细胞部分的荧光图像。
如图11所示，锌指的缺失使得多肽在细胞核中的扩散增加，RRM的缺失使得细胞核RBM20聚集体显著更大和更圆，并且SR结构域的缺失使得仅形成细胞质RBM20聚集体。富含SR的结构域缺失的发现暗示富含SR的结构域在RMB20细胞核输入中的作用。锌指1和锌指2缺失的发现暗示锌指在调节RMB20细胞核聚集体中的作用。RRM缺失的发现暗示RNA结合在抑制细胞核中的聚集中的作用。为了进一步研究RRM缺失模型，测量了RRM缺失RBM20聚集体的融合，并且观察到聚集体的融合发生在不到50毫秒的时间内，表明聚集体的液体样性质(数据未显示)。
实施例7
此实施例展示杂合野生型/突变体RBM20多肽细胞系以及对RBM20聚集体形成和组成的影响。
使用瞬时转染(双重转染)对第一H9C2细胞系统进行工程化，以表达与mCherry标记连接的突变体R636S RBM20多肽的拷贝以及与Dendra2标记连接的野生型RBM20多肽的拷贝。使用瞬时转染(双重转染)对第二H9C2细胞系统进行工程化，以表达与mCherry标记连接的突变体R636S RBM20多肽的拷贝以及HIV-1的核输出信号序列(NES；核酸序列，ctgccccccctggagcgcctgaccctg(SEQ ID NO:2)；氨基酸序列LPPLERLTL(SEQ ID NO:3))的拷贝。与Dendra2标记连接的多肽用作对照。使用瞬时转染对第三H9C2细胞系统进行工程化，以表达与mCherry标记连接的突变体R636S RBM20多肽的拷贝。使用瞬时转染对第四H9C2细胞系统进行工程化，以表达与Dendra2标记连接的野生型RBM20多肽的拷贝。单一转染细胞系统用作突变体和野生型RBM20多肽定位对照，以及通道漂白对照。转染后，对细胞进行孵育以允许RBM20多肽表达。使用具有40x油浸物镜的DeltaVision宽视野解卷积系统捕获细胞和/或细胞部分的荧光图像。
如图12A-12D所示，杂合RBM20多肽H9C2细胞显示形成含有突变体和野生型RBM20多肽两者的细胞质RMB20聚集体，因此证实突变体RBM20多肽的存在可导致野生型RBM20多肽的错误定位。作为对照，突变体R636S RBM20多肽不将NES隔离至细胞质RMB20聚集体中(图12A下图)。图12B中提供了针对图12A中的图像的插图，并且图12D中提供了针对图12C中的图像的插图。
实施例8
此实施例展示经过工程化以表达荧光标记的野生型RBM20多肽或在富含RS的结构域外的结构域中具有单点突变的各种荧光标记的RBM20突变体多肽的心肌细胞(即H9C2，来自胚胎心脏的大鼠成肌细胞)的荧光成像分析。具体来说，使用瞬时转染对H9C2细胞进行工程化，以表达与Dendra2标记连接的野生型RBM20多肽或与Dendra2标记连接的突变体RBM20多肽(E913K、R716Q或V535L)。转染后，对细胞进行孵育以允许RBM20多肽表达。使用具有60x油浸物镜的DeltaVision宽视野解卷积系统捕获细胞和/或细胞部分的荧光图像。
E913K(位于富含E的结构域中)与R716Q(位于富含RS的结构域与富含E的结构域之间)都代表家族性RBM20多肽突变。V535L突变位于RPM结构域中，并且代表偶然性RBM20多肽突变。如图13A-13D所示，在用野生型RBM20多肽转染的H9C2细胞中，主要在细胞核中观察到RBM20聚集体(图13A)，并且在用所提到的RBM20突变体多肽转染的H9C2细胞中，存在细胞核和细胞质聚集体的混合表型(图13B，E913K RBM20；图13C，R716Q RBM20；图13D，V535LRBM20)。
实施例9
此实施例展示用于针对在RBM20聚集体中共定位的分子组分进行评估的荧光成像分析。对细胞进行工程化以表达荧光标记的野生型RBM20多肽或荧光标记的RBM20 R636S突变体多肽。转染后，对细胞进行孵育以允许RBM20多肽表达。对某些细胞进行DAPI染色以可视化细胞核。然后针对靶标(诸如DDX3X(应激颗粒涉及的一种蛋白质))对细胞进行免疫荧光(IF)技术。使用DeltaVision宽视野解卷积系统捕获细胞和/或细胞部分的荧光图像。在用于RBM20标记的通道处，并且在IF分析的情况下在标记抗体的通道处，捕获含有野生型与突变体RBM20的细胞两者的图像。
如图14所示，DDX3X不与野生型细胞系统中的RBM20聚集体共定位，并且DDX3X与突变体RBM20细胞系统中的细胞质RBM20聚集体共定位。针对DDX5和TDP43的IF染色进行了类似实验，所述实验都显示出在突变体RBM20细胞系统中与细胞质RBM20聚集体共定位而在野生型细胞系统中不与细胞质RBM20聚集体共定位的相似结果；然而，与DDX3X相比，它们在突变体RBM20聚集体中的分配要低得多(数据未显示)。
还针对旁粒蛋白PSPC1、SFPQ以及NONO的IF染色进行了类似实验。如由图15可见，仅野生型RBM20多肽而非突变体RBM20多肽分配至由PSPC1标记的旁粒中。野生型RBM20多肽而非突变体RBM20多肽还类似地分配至由SFPQ和NONO标记的旁粒中(数据未显示)。
还对核蛋白PTBP1、SRRM1、U2AF65以及SC35的IF染色进行了类似实验。如由图16可见，测试的核蛋白仅在野生型细胞系统中与RBM20聚集体共定位，而在R636S突变体RBM20细胞系统中不与细胞质RBM20聚集体共定位。
还使用除RBM20外的标记的蛋白质组分开发了类似测定系统。具体来说，对第一细胞系统进行工程化以表达mCherry标记的野生型RBM20多肽和GFP标记的DDX3X。对第二细胞系统进行工程化以表达mCherry标记的R636S突变体RBM20多肽和GFP标记的DDX3X。转染后，对细胞进行孵育以允许RBM20多肽表达。对某些细胞进行DAPI染色。然后针对另一靶标(诸如G3BP1(应激颗粒涉及的一种蛋白质))对细胞进行免疫荧光(IF)技术。使用DeltaVision宽视野解卷积系统捕获细胞和/或细胞部分的荧光图像。在用于RBM20标记的通道、在用于DDX3X标记的通道并且在用于对G3BP1具特异性的标记抗体的通道捕获含有野生型与突变体RBM20两者的细胞的图像。
如图17所示，DDX3X与突变体RBM20细胞系统中的细胞质RBM20聚集体共定位。此外，应激颗粒标记物G3BP1与突变体RBM20细胞系统中的细胞质RBM20聚集体共定位。
实施例10
此实施例展示用诱导型野生型和R636S突变体RBM20多肽转染的H9C2细胞(来自胚胎心脏的大鼠成肌细胞)的细胞毒性分析。
在TetON控制下，对H9C2细胞进行工程化以诱导表达与Dendra2标记连接的野生型RBM20多肽，或与Dendra2标记连接的R636S突变体RBM20多肽。使用DeltaVision宽视野解卷积系统捕获细胞和/或细胞部分的荧光和DIC图像。如由图18可见，诱导后约24小时，约90％的被诱导表达野生型RBM20多肽的H9C2细胞显示核聚集体，而那些被诱导表达R636S突变体RBM20多肽的细胞显示细胞质聚集体。还使用H9C2细胞裂解物通过蛋白质印迹验证RBM20表达(数据未显示)。
对于细胞毒性分析，将非诱导细胞以每孔约1,500个细胞的量接种至96孔板中。将
Figure BDA0003548733440000911
NucLight快速红色试剂(细胞可渗透DNA染色剂)添加至每个孔中用于活细胞核标记(T0)。在添加核染料后一天以6μg/mL的最终浓度添加多西环素，以诱导蛋白质表达，或不添加作为对照。从T0开始，使用
Figure BDA0003548733440000912
活细胞分析系统进行活细胞的实时定量，然后每两小时进行一次，直到第3天(T3)结束。针对T0的核染料信号对随时间推移的核染料信号进行归一化。
如由图19A可见，携带野生型或R636S突变体RBM20质粒的非诱导H9C2细胞随时间推移的细胞生长没有太大差异。与非诱导细胞相比，H9C2细胞中的野生型RBM20多肽表达也不影响细胞增殖(图19B)。R636S突变体RBM20多肽表达影响细胞增殖(图19C)，并且与表达野生型RBM20多肽的H9C2细胞相比，这些H9C2细胞显示出较慢的生长(图19D)。
还使用RealTime-GloTM膜联蛋白V细胞凋亡和坏死测定(Promega)通过实时细胞凋亡监测来测试细胞毒性。在细胞凋亡期间，磷脂酰丝氨酸(PS)暴露在细胞膜的外叶上，其可由膜联蛋白V荧光素酶融合蛋白结合，从而产生发光(RLU)信号。
将上述非诱导H29C细胞接种至96孔板中。立即添加多西环素以诱导蛋白质表达，或不添加作为对照。多西环素诱导(或不诱导)后24小时，在有或没有细胞凋亡诱导剂星形孢菌素(STS)的情况下，将细胞凋亡测定试剂添加到每个孔中(T0)。然后监测发光40小时。如由图20A-20E可见，R636S突变体RBM20多肽的表达使H9C2细胞中的基础细胞凋亡增加(参见低STS应激或无STS应激情况下的图20A-20C)；而在高STS应激下(参见图20D和20E)，与表达野生型RBM20的细胞相比，进一步诱导R636S突变体RBM20表达不具有更高的细胞凋亡。
使用DeltaVision广域解卷积系统捕获的H29C细胞(未经STS应激处理)的荧光和DIC图像进一步验证了细胞细胞凋亡。如由图21可见，被诱导表达野生型或R636S突变体RBM20多肽的H29C细胞均显示随时间推移诱导的细胞凋亡；然而，与表达野生型RBM20多肽的那些相比，在被诱导表达R636S突变体RBM20多肽的H29C细胞中观察到更多的漂浮细胞(即细胞凋亡细胞)。
实施例11
此实施例展示用于映射H29C细胞中突变体RBM20聚集体的组分的测定。
在TetON控制下，对H9C2细胞进行工程化以诱导表达与Dendra2标记连接的野生型RBM20多肽(用作对照)，或与Dendra2标记连接的R636S突变体RBM20多肽。用最终浓度为4μg/mL的多西环素诱导细胞。诱导后一天，将细胞固定并且添加针对测试蛋白质(约100种测试蛋白质)的抗体(约200种抗体)用于IF染色。还用DAPI对细胞进行染色。使用DeltaVision宽视野解卷积系统捕获细胞和/或细胞部分的荧光图像。
图22示出了与细胞质R636S突变体RBM20聚集体共定位的应激颗粒蛋白elF3e，表明elF3e分配至细胞质中的R636S突变体RBM20聚集体中。在所有评价的蛋白质中，有30种显示分配至R636S突变体RBM20聚集体中，其中许多为应激颗粒蛋白。
实施例12
此实施例展示用于筛选调节与一种或多种RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的特征的化合物的测定。使用瞬时转染对H9C2细胞进行工程化，以表达与Dendra2标记连接的突变体R636S RBM20多肽。转染后，对细胞进行孵育以允许RBM20多肽表达约16小时。将H9C2细胞接种至384孔板中，并且与对照(DMSO)或20μM测试化合物混合，然后孵育24小时，然后固定、染色(例如用DAPI)并且捕获荧光图像。未用突变体R636S RBM20多肽转染的H9C2细胞用作对照。对每种化合物运行三次重复试验。使用DeltaVision宽视野解卷积系统捕获细胞和/或细胞部分的荧光图像。
图23中示出了用石胆酸、二盐酸奎纳克林以及参考物(DMSO)处理的H9C2细胞的图像。未转染的H9C2细胞用作对照。图23表明石胆酸能够使细胞质突变体R636S RBM20聚集体减少，而二盐酸奎纳克林使细胞质突变体R636S RBM20聚集体增加。图24A-24E表明化合物雷公藤内酯(PG490)(图24A)、BIO(图24B)、优普色替(GSK2141795)(图24C)、茴香霉素(图24D)以及WS6(图24E)都能够使细胞质突变体R636S RBM20聚集体减少。它们的下调水平在各图下以Z评分表示。
序列表
<110> 露点治疗公司(Dewpoint Therapeutics, Inc.)
<120> 用于鉴定调节与RBM20聚集体和/或RBM20多肽相关的一种或多种特征的化合物的组合物、系统以及方法
<130> 185992000240
<140> 尚未分配
<141> 同时随同提交
<150> US 63/074,985
<151> 2020-09-04
<150> US 62/902,309
<151> 2019-09-18
<160> 3
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 1227
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Met Val Leu Ala Ala Ala Met Ser Gln Asp Ala Asp Pro Ser Gly Pro
1 5 10 15
Glu Gln Pro Asp Arg Val Ala Cys Ser Val Pro Gly Ala Arg Ala Ser
20 25 30
Pro Ala Pro Ser Gly Pro Arg Gly Met Gln Gln Pro Pro Pro Pro Pro
35 40 45
Gln Pro Pro Pro Pro Pro Gln Ala Gly Leu Pro Gln Ile Ile Gln Asn
50 55 60
Ala Ala Lys Leu Leu Asp Lys Asn Pro Phe Ser Val Ser Asn Pro Asn
65 70 75 80
Pro Leu Leu Pro Ser Pro Ala Ser Leu Gln Leu Ala Gln Leu Gln Ala
85 90 95
Gln Leu Thr Leu His Arg Leu Lys Leu Ala Gln Thr Ala Val Thr Asn
100 105 110
Asn Thr Ala Ala Ala Thr Val Leu Asn Gln Val Leu Ser Lys Val Ala
115 120 125
Met Ser Gln Pro Leu Phe Asn Gln Leu Arg His Pro Ser Val Ile Thr
130 135 140
Gly Pro His Gly His Ala Gly Val Pro Gln His Ala Ala Ala Ile Pro
145 150 155 160
Ser Thr Arg Phe Pro Ser Asn Ala Ile Ala Phe Ser Pro Pro Ser Gln
165 170 175
Thr Arg Gly Pro Gly Pro Ser Met Asn Leu Pro Asn Gln Pro Pro Ser
180 185 190
Ala Met Val Met His Pro Phe Thr Gly Val Met Pro Gln Thr Pro Gly
195 200 205
Gln Pro Ala Val Ile Leu Gly Ile Gly Lys Thr Gly Pro Ala Pro Ala
210 215 220
Thr Ala Gly Phe Tyr Glu Tyr Gly Lys Ala Ser Ser Gly Gln Thr Tyr
225 230 235 240
Gly Pro Glu Thr Asp Gly Gln Pro Gly Phe Leu Pro Ser Ser Ala Ser
245 250 255
Thr Ser Gly Ser Val Thr Tyr Glu Gly His Tyr Ser His Thr Gly Gln
260 265 270
Asp Gly Gln Ala Ala Phe Ser Lys Asp Phe Tyr Gly Pro Asn Ser Gln
275 280 285
Gly Ser His Val Ala Ser Gly Phe Pro Ala Glu Gln Ala Gly Gly Leu
290 295 300
Lys Ser Glu Val Gly Pro Leu Leu Gln Gly Thr Asn Ser Gln Trp Glu
305 310 315 320
Ser Pro His Gly Phe Ser Gly Gln Ser Lys Pro Asp Leu Thr Ala Gly
325 330 335
Pro Met Trp Pro Pro Pro His Asn Gln Pro Tyr Glu Leu Tyr Asp Pro
340 345 350
Glu Glu Pro Thr Ser Asp Arg Thr Pro Pro Ser Phe Gly Gly Arg Leu
355 360 365
Asn Asn Ser Lys Gln Gly Phe Ile Gly Ala Gly Arg Arg Ala Lys Glu
370 375 380
Asp Gln Ala Leu Leu Ser Val Arg Pro Leu Gln Ala His Glu Leu Asn
385 390 395 400
Asp Phe His Gly Val Ala Pro Leu His Leu Pro His Ile Cys Ser Ile
405 410 415
Cys Asp Lys Lys Val Phe Asp Leu Lys Asp Trp Glu Leu His Val Lys
420 425 430
Gly Lys Leu His Ala Gln Lys Cys Leu Val Phe Ser Glu Asn Ala Gly
435 440 445
Ile Arg Cys Ile Leu Gly Ser Ala Glu Gly Thr Leu Cys Ala Ser Pro
450 455 460
Asn Ser Thr Ala Val Tyr Asn Pro Ala Gly Asn Glu Asp Tyr Ala Ser
465 470 475 480
Asn Leu Gly Thr Ser Tyr Val Pro Ile Pro Ala Arg Ser Phe Thr Gln
485 490 495
Ser Ser Pro Thr Phe Pro Leu Ala Ser Val Gly Thr Thr Phe Ala Gln
500 505 510
Arg Lys Gly Ala Gly Arg Val Val His Ile Cys Asn Leu Pro Glu Gly
515 520 525
Ser Cys Thr Glu Asn Asp Val Ile Asn Leu Gly Leu Pro Phe Gly Lys
530 535 540
Val Thr Asn Tyr Ile Leu Met Lys Ser Thr Asn Gln Ala Phe Leu Glu
545 550 555 560
Met Ala Tyr Thr Glu Ala Ala Gln Ala Met Val Gln Tyr Tyr Gln Glu
565 570 575
Lys Ser Ala Val Ile Asn Gly Glu Lys Leu Leu Ile Arg Met Ser Lys
580 585 590
Arg Tyr Lys Glu Leu Gln Leu Lys Lys Pro Gly Lys Ala Val Ala Ala
595 600 605
Ile Ile Gln Asp Ile His Ser Gln Arg Glu Arg Asp Met Phe Arg Glu
610 615 620
Ala Asp Arg Tyr Gly Pro Glu Arg Pro Arg Ser Arg Ser Pro Val Ser
625 630 635 640
Arg Ser Leu Ser Pro Arg Ser His Thr Pro Ser Phe Thr Ser Cys Ser
645 650 655
Ser Ser His Ser Pro Pro Gly Pro Ser Arg Ala Asp Trp Gly Asn Gly
660 665 670
Arg Asp Ser Trp Glu His Ser Pro Tyr Ala Arg Arg Glu Glu Glu Arg
675 680 685
Asp Pro Ala Pro Trp Arg Asp Asn Gly Asp Asp Lys Arg Asp Arg Met
690 695 700
Asp Pro Trp Ala His Asp Arg Lys His His Pro Arg Gln Leu Asp Lys
705 710 715 720
Ala Glu Leu Asp Glu Arg Pro Glu Gly Gly Arg Pro His Arg Glu Lys
725 730 735
Tyr Pro Arg Ser Gly Ser Pro Asn Leu Pro His Ser Val Ser Ser Tyr
740 745 750
Lys Ser Arg Glu Asp Gly Tyr Tyr Arg Lys Glu Pro Lys Ala Lys Trp
755 760 765
Asp Lys Tyr Leu Lys Gln Gln Gln Asp Ala Pro Gly Arg Ser Arg Arg
770 775 780
Lys Asp Glu Ala Arg Leu Arg Glu Ser Arg His Pro His Pro Asp Asp
785 790 795 800
Ser Gly Lys Glu Asp Gly Leu Gly Pro Lys Val Thr Arg Ala Pro Glu
805 810 815
Gly Ala Lys Ala Lys Gln Asn Glu Lys Asn Lys Thr Lys Arg Thr Asp
820 825 830
Arg Asp Gln Glu Gly Ala Asp Asp Arg Lys Glu Asn Thr Met Ala Glu
835 840 845
Asn Glu Ala Gly Lys Glu Glu Gln Glu Gly Met Glu Glu Ser Pro Gln
850 855 860
Ser Val Gly Arg Gln Glu Lys Glu Ala Glu Phe Ser Asp Pro Glu Asn
865 870 875 880
Thr Arg Thr Lys Lys Glu Gln Asp Trp Glu Ser Glu Ser Glu Ala Glu
885 890 895
Gly Glu Ser Trp Tyr Pro Thr Asn Met Glu Glu Leu Val Thr Val Asp
900 905 910
Glu Val Gly Glu Glu Glu Asp Phe Ile Val Glu Pro Asp Ile Pro Glu
915 920 925
Leu Glu Glu Ile Val Pro Ile Asp Gln Lys Asp Lys Ile Cys Pro Glu
930 935 940
Thr Cys Leu Cys Val Thr Thr Thr Leu Asp Leu Asp Leu Ala Gln Asp
945 950 955 960
Phe Pro Lys Glu Gly Val Lys Ala Val Gly Asn Gly Ala Ala Glu Ile
965 970 975
Ser Leu Lys Ser Pro Arg Glu Leu Pro Ser Ala Ser Thr Ser Cys Pro
980 985 990
Ser Asp Met Asp Val Glu Met Pro Gly Leu Asn Leu Asp Ala Glu Arg
995 1000 1005
Lys Pro Ala Glu Ser Glu Thr Gly Leu Ser Leu Glu Asp Ser Asp Cys
1010 1015 1020
Tyr Glu Lys Glu Ala Lys Gly Val Glu Ser Ser Asp Val His Pro Ala
1025 1030 1035 1040
Pro Thr Val Gln Gln Met Ser Ser Pro Lys Pro Ala Glu Glu Arg Ala
1045 1050 1055
Arg Gln Pro Ser Pro Phe Val Asp Asp Cys Lys Thr Arg Gly Thr Pro
1060 1065 1070
Glu Asp Gly Ala Cys Glu Gly Ser Pro Leu Glu Glu Lys Ala Ser Pro
1075 1080 1085
Pro Ile Glu Thr Asp Leu Gln Asn Gln Ala Cys Gln Glu Val Leu Thr
1090 1095 1100
Pro Glu Asn Ser Arg Tyr Val Glu Met Lys Ser Leu Glu Val Arg Ser
1105 1110 1115 1120
Pro Glu Tyr Thr Glu Val Glu Leu Lys Gln Pro Leu Ser Leu Pro Ser
1125 1130 1135
Trp Glu Pro Glu Asp Val Phe Ser Glu Leu Ser Ile Pro Leu Gly Val
1140 1145 1150
Glu Phe Val Val Pro Arg Thr Gly Phe Tyr Cys Lys Leu Cys Gly Leu
1155 1160 1165
Phe Tyr Thr Ser Glu Glu Thr Ala Lys Met Ser His Cys Arg Ser Ala
1170 1175 1180
Val His Tyr Arg Asn Leu Gln Lys Tyr Leu Ser Gln Leu Ala Glu Glu
1185 1190 1195 1200
Gly Leu Lys Glu Thr Glu Gly Ala Asp Ser Pro Arg Pro Glu Asp Ser
1205 1210 1215
Gly Ile Val Pro Arg Phe Glu Arg Lys Lys Leu
1220 1225
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 2
ctgccccccc tggagcgcct gaccctg 27
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 3
Leu Pro Pro Leu Glu Arg Leu Thr Leu
1 5

Claims (60)

1.一种鉴定调节与细胞的细胞质中的一种或多种包含RBM20多肽的聚集体(“RBM20聚集体”)和/或细胞的细胞质中的RBM20多肽相关的特征的化合物的方法，所述方法包括：
(a)将所述化合物与包含所述细胞的组合物混合，
其中(i)所述细胞包含所述一种或多种RBM20聚集体，和/或(ii)在所述化合物接触所述组合物后，在所述细胞中形成所述一种或多种RBM20聚集体；以及
(b)测定与所述一种或多种RBM20聚集体和/或所述RBM20多肽相关的所述特征，
其中与参考相比，所述特征的调节表明所述化合物调节与所述一种或多种RBM20聚集体和/或所述RBM20多肽相关的所述特征。
2.如权利要求1所述的方法，其中与所述一种或多种RBM20聚集体和/或所述RBM20多肽相关的所述特征是基于以下中的任何一者或多者：
(i)所述一种或多种RBM20聚集体的定位；
(ii)所述一种或多种RBM20聚集体和/或所述RBM20多肽的分布；
(iii)所述一种或多种RBM20聚集体的数目；
(iv)所述一种或多种RBM20聚集体的尺寸；
(v)所述一种或多种RBM20聚集体与参考聚集体的量的比率；
(vi)与所述一种或多种RBM20聚集体相关的功能活性；
(vii)所述一种或多种RBM20聚集体的组成；
(viii)所述一种或多种RBM20聚集体与生物分子的共定位；
(ix)所述一种或多种RBM20聚集体的组分的扩散系数；
(x)所述一种或多种RBM20聚集体的稳定性；
(xi)所述一种或多种RBM20聚集体的溶解或尺寸减小；
(xii)所述一种或多种RBM20聚集体的表面积；
(xiii)所述一种或多种RBM20聚集体的球形度；
(xiv)所述一种或多种RBM20聚集体的流动性；
(xv)所述一种或多种RBM20聚集体的固化；
(xvi)所述RBM20多肽的定位；
(xvii)所述RBM20多肽或其前体的量；
(xviii)所述RBM20多肽在所述一种或多种RBM20聚集体中的聚集体分配；
(xix)与所述RBM20多肽相关的功能活性；
(xx)所述RBM20多肽的聚集；
(xxi)所述RBM20多肽的翻译后修饰状态；以及
(xxii)RBM20多肽降解产物的量。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述特征的调节是基于所述细胞的细胞质中所述一种或多种RBM20聚集体的数目的减少。
4.如权利要求2或3所述的方法，其中所述特征的调节是基于所述细胞的细胞质中所述RBM20多肽或其前体的量的减少。
5.如权利要求2-4中任一项所述的方法，其中所述特征的调节是基于所述细胞的细胞质中所述一种或多种RBM20聚集体的溶解或尺寸减小。
6.如权利要求2-5中任一项所述的方法，其中所述特征的调节是基于与所述细胞的细胞质中的所述一种或多种RBM20聚集体和/或所述RBM20多肽相关的功能活性的降低。
7.如权利要求1所述的方法，其中与所述一种或多种RBM20聚集体和/或所述RBM20多肽相关的所述特征包括所述一种或多种RBM20聚集体的定位、所述一种或多种RBM20聚集体和/或所述RBM20多肽的分布、所述一种或多种RBM20聚集体的数目、所述一种或多种RBM20聚集体的尺寸以及一种或多种RBM20聚集体与参考聚集体的量的比率。
8.如权利要求1所述的方法，其中与所述一种或多种RBM20聚集体和/或所述RBM20多肽相关的所述特征包括所述一种或多种RBM20聚集体的组成，以及所述一种或多种RBM20聚集体与生物分子的共定位。
9.如权利要求7或8所述的方法，其中与所述一种或多种RBM20聚集体和/或所述RBM20多肽相关的所述特征还包括与所述一种或多种RBM20聚集体相关的功能活性。
10.如权利要求1所述的方法，其中与所述一种或多种RBM20聚集体和/或所述RBM20多肽相关的所述特征包括所述一种或多种RBM20聚集体的稳定性、所述一种或多种RBM20聚集体的溶解或尺寸减小以及所述一种或多种RBM20聚集体的表面积。
11.如权利要求1所述的方法，其中与所述一种或多种RBM20聚集体和/或所述RBM20多肽相关的所述特征包括所述一种或多种RBM20聚集体的球形度、所述一种或多种RBM20聚集体的流动性以及所述一种或多种RBM20聚集体的固化。
12.如权利要求1所述的方法，其中与所述一种或多种RBM20聚集体和/或所述RBM20多肽相关的所述特征包括所述RBM20多肽的定位以及所述RBM20多肽或其前体的量。
13.如权利要求12所述的方法，其中与所述一种或多种RBM20聚集体和/或所述RBM20多肽相关的所述特征还包括所述RBM20多肽的翻译后修饰状态。
14.如权利要求12或13所述的方法，其中与所述一种或多种RBM20聚集体和/或所述RBM20多肽相关的所述特征还包括与所述RBM20多肽相关的功能活性。
15.如权利要求1所述的方法，其中与所述一种或多种RBM20聚集体和/或所述RBM20多肽相关的所述特征包括所述一种或多种RBM20聚集体与生物分子的共定位以及所述一种或多种RBM20聚集体的组分的扩散系数。
16.如权利要求1所述的方法，其中与所述一种或多种RBM20聚集体和/或所述RBM20多肽相关的所述特征包括所述一种或多种RBM20聚集体的稳定性以及所述一种或多种RBM20聚集体的溶解或尺寸减小。
17.如权利要求1所述的方法，其中与所述一种或多种RBM20聚集体和/或所述RBM20多肽相关的所述特征包括所述一种或多种RBM20聚集体的表面积、所述一种或多种RBM20聚集体的球形度、所述一种或多种RBM20聚集体的流动性以及所述一种或多种RBM20聚集体的固化。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述RBM20多肽为野生型RBM20多肽。
19.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述RBM20多肽为突变体RBM20多肽。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述突变体RBM20多肽包含内在无序区(IDR)中的突变。
21.如权利要求19或20所述的方法，其中所述突变体RBM20多肽包含RS富集区中的突变。
22.如权利要求19-21中任一项所述的方法，其中所述突变体RBM20多肽包含以下位置中的一者或多者中的突变：精氨酸634、丝氨酸635、精氨酸636、丝氨酸637以及脯氨酸638。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述突变体RBM20多肽包含以下突变中的一者或多者：R636S、R636C、R636H、R634Q、S637G、P638L、S635A、S635E以及S637E。
24.如权利要求19所述的方法，其中所述突变体RBM20多肽包含以下突变中的一者或多者：E913K、R716Q以及V535L。
25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述RBM20多肽在所述细胞中异源表达。
26.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述RBM20多肽在所述细胞中同源表达。
27.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述细胞为心脏细胞类型的模型。
28.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述细胞为心肌细胞。
29.如权利要求27或28所述的方法，其中所述细胞为大鼠H9C2细胞。
30.如权利要求27或28所述的方法，其中所述细胞为人AC-16细胞、源自患者的心肌细胞、分化为心肌细胞的人诱导多能干细胞或分化为心肌细胞的干细胞。
31.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述细胞选自由以下组成的组：HeLa细胞、U2OS细胞、人胚胎肾细胞、人诱导多能干细胞以及干细胞。
32.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述细胞对于编码所述RBM20多肽的等位基因来说为纯合的。
33.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述细胞对于编码所述RBM20多肽的等位基因来说为杂合的。
34.如权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述参考包含包含与对照剂混合的所述细胞的所述组合物的等分试样。
35.如权利要求1-34中任一项所述的方法，所述方法还包括对所述组合物或所述细胞的至少一部分进行成像。
36.如权利要求1-35中任一项所述的方法，其中所述方法还包括测定所述细胞的一种或多种细胞特征。
37.如权利要求1-36中任一项所述的方法，所述方法还包括使所述组合物或所述细胞的至少一部分与固定剂接触。
38.如权利要求1-37中任一项所述的方法，所述方法还包括使所述组合物或所述细胞的至少一部分与染色剂接触。
39.如权利要求1-38中任一项所述的方法，所述方法还包括使用第二基于细胞的测定对所鉴定的化合物进行评估。
40.如权利要求1-39中任一项所述的方法，所述方法还包括使用体外测定对所鉴定的化合物进行评估。
41.一种鉴定使细胞的细胞质中包含RBM20多肽的聚集体(“RBM20聚集体”)的尺寸和/或数目减小的化合物的方法，所述方法包括：
(a)测定接受所述化合物的所述细胞的至少一部分所述细胞质中的所述RBM20聚集体的尺寸和/或数目；以及
(b)将所述RBM20聚集体的尺寸和/或数目与参考进行比较，从而鉴定使所述细胞的细胞质中的所述RBM20聚集体的尺寸和/或数目减小的化合物。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述化合物使RBM20聚集体的数目减小。
43.如权利要求41或42所述的方法，其中所述化合物使RBM20聚集体的尺寸减小。
44.一种鉴定阻止细胞的细胞质中一种或多种包含RBM20多肽的聚集体(“RBM20聚集体”)的形成或生长的化合物的方法，所述方法包括：
(a)将所述化合物与包含所述细胞的组合物合并，
其中(i)所述细胞包含所述一种或多种RBM20聚集体，和/或(ii)在所述化合物接触所述组合物后形成所述一种或多种RBM20聚集体；以及
(b)获得对所述细胞的至少一部分所述细胞质中的所述一种或多种RBM20聚集体的尺寸和/或数目的第一次测量；以及
(c)将所述第一次测量与参考进行比较，从而鉴定阻止所述细胞的细胞质中所述一种或多种RBM20聚集体的形成或生长的化合物。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述参考包含包含与对照剂混合的所述细胞的所述组合物的等分试样。
46.如权利要求44所述的方法，其中所述参考为对所述细胞的至少一部分所述细胞质中所述一种或多种RBM20聚集体的尺寸和/或数目的第二次测量，并且其中所述第二次测量在与所述第一次测量不同的时间进行。
47.如权利要求44-46中任一项所述的方法，所述方法还包括使所述细胞经受有助于所述一种或多种RBM20聚集体形成的条件。
48.一种鉴定使细胞的细胞质中的RBM20多肽的量降低的化合物的方法，所述方法包括：
(a)将所述化合物与包含所述细胞的组合物合并；以及
(b)获得对所述细胞的至少一部分所述细胞质中的所述RBM20多肽的量的第一次测量；以及
(c)将所述第一次测量与参考进行比较，从而鉴定使所述细胞的细胞质中的所述RBM20多肽的量降低的化合物。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述参考包含包含与对照剂混合的所述细胞的所述组合物的等分试样。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述参考为对所述细胞的至少一部分所述细胞质中的所述RBM20多肽的量的第二次测量，并且其中所述第二次测量在与所述第一次测量不同的时间进行。
51.一种鉴定调节与一种或多种包含RBM20多肽的聚集体(“RBM20聚集体”)相关的特征的化合物的方法，所述方法包括：
(a)将所述化合物与包含所述一种或多种RBM20聚集体的溶液以及额外聚集体溶液混合；以及
(b)测定与所述一种或多种RBM20聚集体相关的所述特征，
其中与参考相比，所述特征的调节表明所述化合物调节与所述一种或多种RBM20聚集体相关的所述特征。
52.一种鉴定调节与一种或多种包含RBM20多肽的聚集体(“RBM20聚集体”)和/或所述RBM20多肽相关的特征的化合物的方法，所述方法包括：
(a)在存在所述化合物的情况下将试剂与包含所述RBM20多肽的溶液合并，
其中所述剂能够使得所述一种或多种RBM20聚集体形成，并且在所述剂接触所述溶液后形成所述一种或多种RBM20聚集体；以及
(b)测定与所述一种或多种RBM20聚集体和/或所述RBM20多肽相关的所述特征，
其中与参考相比，所述特征的调节表明所述化合物调节与所述一种或多种RBM20聚集体和/或所述RBM20多肽相关的所述特征。
53.如权利要求51或52所述的方法，其中与所述一种或多种RBM20聚集体和/或所述RBM20多肽相关的所述特征是基于以下中的任何一者或多者：
(i)所述一种或多种RBM20聚集体的数目；
(ii)所述一种或多种RBM20聚集体的组成；
(iii)所述一种或多种RBM20聚集体的尺寸；
(iv)所述一种或多种RBM20聚集体的稳定性；
(v)所述一种或多种RBM20聚集体的溶解或尺寸减小；
(vi)所述一种或多种RBM20聚集体的表面积；
(vii)所述一种或多种RBM20聚集体的球形度；
(viii)所述一种或多种RBM20聚集体的流动性；
(ix)所述一种或多种RBM20聚集体的固化；
(x)不在所述一种或多种RBM20聚集体中的所述RBM20多肽的量；
(xi)所述RBM20多肽在所述一种或多种RBM20聚集体中的分配；以及
(xii)所述RBM20多肽的聚集。
54.一种鉴定调节用于包含RBM20多肽的聚集体(“RBM20聚集体”)的生物分子的分配的化合物的方法，所述方法包括：
(a)将所述化合物与包含细胞的组合物混合，
其中(i)所述细胞包含所述RBM20聚集体，和/或(ii)在所述化合物接触所述组合物后，在所述细胞中形成所述RBM20聚集体；以及
(b)测定用于所述RBM20聚集体的所述生物分子的分配。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述生物分子为非RBM20多肽。
56.如权利要求54所述的方法，其中所述生物分子为野生型RBM20多肽。
57.如权利要求54-56中任一项的方法，其中包含所述RBM20多肽的所述RBM20聚集体包含突变体RBM20多肽。
58.一种鉴定可用于治疗RBM20相关疾病的化合物的方法，所述方法包括根据权利要求1-57所述的方法中的任一者来鉴定化合物。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述RBM20相关疾病为心肌病。
60.如权利要求59所述的方法，其中所述心肌病为扩张型心肌病。
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