CN114657214B - 一种自发性肾阴虚Ptgds基因敲除大鼠模型的构建方法 - Google Patents

一种自发性肾阴虚Ptgds基因敲除大鼠模型的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种自发性肾阴虚Ptgds基因敲除大鼠模型的构建方法，包括以下步骤：1)设计靶序列Ptgds‑sgRNA1/2；2)纯化Cas9mRNA、Ptgds‑sgRNA1/2；3)利用CRISPR/Cas9系统，将Ptgds基因内的序列片段进行靶向敲除；4)将纯化的Cas9mRNA、Ptgds‑sgRNA1/2和Ptgds敲除基因注射到大鼠胚胎得到新生大鼠；5)鉴定选择出杂合子大鼠；6)进一步与野生大鼠进行多代繁殖得到Ptgds基因敲除大鼠模型。本发明具有基因修饰精确性高，靶向性特异、实验周期短的优点，开发出可靠且稳定的基因工程模型，为更年期综合征相关疾病的治疗作用奠定基础。

Description

一种自发性肾阴虚Ptgds基因敲除大鼠模型的构建方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种自发性肾阴虚Ptgds基因敲除大鼠模型的构建方法。
背景技术
围绝经期一般指的是妇女卵巢内卵泡耗竭后的自然绝经状态，并出现围绕“脑-肾-生殖”轴的各种症状表型，如潮热(或血管舒缩症状)，慢性肾脏疾病，心血管疾病，神经退行性疾病等，这些躯体或精神心理症状被称为围绝经期综合征。长期研究显示，围绝经期综合征与慢性肾脏疾病的发展过程密切相关，从中医辩证角度来看，围绝经期诸证从肾虚立论，多以肾阴虚为主，典型以潮热，肥胖，中枢退行性症状为主，是由于妇女进入49岁左右，肾气渐虚，天癸的作用也伴随消失，冲任脉趋向虚衰，养阴之精血减少，易出现阴虚之症，行经停止，逐渐丧失生育能力。因此有《素问》曰“七七任脉虚，太冲脉衰少，天癸竭，地道不通，故形坏而无子也”。
现有研究显示，更年期模型大鼠中，雌激素耗竭会减弱脂肪细胞转运作用，前列腺素D2合酶(prostaglandin D2 synthase，Ptgds)在肾脏的表达增加，在子宫和下丘脑中表达降低，继而削弱了肾脂质的代谢功能，级联性地出现了更年期肾阴虚典型的潮热，体重增加，血糖升高，脂质代谢异常等肾脏代谢障碍的症状。实验数据进一步证实，上游雌激素β受体(ERβ)耗竭激活了肾Ptgds的过表达，从而导致肾脂质代谢失衡，降低了Ptgds向下丘脑的转运，并可能继续加速中枢神经系统功能的退化，在实验中出现了学习能力下降，记忆力衰退等典型的中枢退行性症状。
Ptgds属于非谷胱甘肽依赖型脂质运载蛋白型PGD合成酶，是脂质运载蛋白家族的单体成员，是由189个氨基酸残基组成的约26kDa的蛋白质，它包含一个信号序列(aa 1-24)和一个同时作为催化位点和疏水分子转运蛋白(aa 40-187)的脂质运载蛋白区域。Ptgds主要定位于细胞的高尔基体，核膜或分泌至细胞外区域，主要在大脑，中枢神经系统，前列腺，子宫和肾脏中表达，具有催化前列腺素D2(prostaglandin D2，PGD2)合成和转运亲脂物质的作用，Ptgds可将PGH2催化转化为PGD2，从而影响睡眠和体温。另外，Ptgds的激活还可以影响脂质代谢转变，例如花生四烯酸、α-亚麻酸(ala)和环氧合酶(cox)途径中的二十烷类代谢。尿中分泌的Ptgds在肾小球和肾小球环合成，由于其低分子量和阴离子特性，Ptgds比血清白蛋白更容易通过肾小球毛细血管壁，能更准确地反映肾小球通透性的变化，是肾脏疾病诊断的关键标志物。
为了进行更年期肾阴虚的相关研究，一般通过手术摘除雌性大鼠的双侧卵巢来制备动物模型，这是因为大鼠垂体-肾上腺功能发达，应激反应灵敏，尤其适于应激反应、垂体、肾上腺素和卵巢等内分泌实验研究；但是大鼠模型构建存在以下问题：耗时过长，模型动物饲养困难，故急需一种高效稳定的方法构建动物模型，目前，通常采用构建和繁殖基因敲除来解决这个问题，但是现有技术只有Ptgds基因敲除(Ptgds-/-)小鼠模型的报道，关于大鼠Ptgds-/-敲除模型尚无相关报道。
发明内容
针对现有大鼠基因敲除模型构建存在的技术问题，本发明提供一种自发性肾阴虚Ptgds基因敲除大鼠模型的构建方法，具有基因修饰精确性高，靶向性特异、实验周期短的优点，开发出可靠且稳定的基因工程模型，为更年期综合征相关疾病的治疗作用奠定基础。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种自发性肾阴虚Ptgds基因敲除大鼠模型的构建方法，包括以下步骤：
1)在Ptgds基因位点设计两个靶序列，分别为Ptgds-sgRNA1和Ptgds-sgRNA2；
2)通过体外转录获得纯化Cas9mRNA、Ptgds-sgRNA1和Ptgds-sgRNA2；
3)利用CRISPR/Cas9系统，将Ptgds基因内长度为2944bp的序列片段进行靶向敲除，得到Ptgds敲除后基因；
4)将纯化好的Cas9mRNA、Ptgds-sgRNA1、Ptgds-sgRNA2和Ptgds敲除后基因共同注射到大鼠胚胎中，注射后将胚胎移植到代孕受体大鼠的输卵管内，得到新生大鼠；
5)对新生大鼠进行基因鉴定选择出杂合子大鼠；
6)杂合子大鼠与野生大鼠进行多代繁殖、基因鉴定得到纯合子大鼠，即Ptgds基因敲除大鼠模型。
进一步的，所述步骤1)中，Ptgds-sgRNA1的核苷酸序列如序列表SEQ ID：1所示；Ptgds-sgRNA2的核苷酸序列如序列表SEQ ID：2所示。
进一步的，所述步骤3)中，序列片段包括内含子序列片段和外显子序列片段。
所述步骤3)中，内含子序列片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID：3所示；外显子序列片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID：4所示。
进一步的，所述步骤5)和步骤6)中的基因鉴定包括：
S1)从新生大鼠中提取基因组DNA；
S2)以获取的基因组DNA为模板，使用特异性引物进行PCR扩增得到扩增产物；
S3)利用琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳检测；
S4)根据电泳结果鉴定出杂合子大鼠或纯合子大鼠。
进一步的，所述步骤S2)中，特异性引物包括引物Ptgds-L-S、引物Ptgds-L-A、引物Ptgds-R-S和引物Ptgds-R-A，对应的核苷酸序列依次如序列表SEQ ID：5、序列表SEQ ID：6、SEQ ID：7和SEQ ID：8所示。
进一步的，所述步骤S2)中，PCR扩增的反应体系为：模板DNA 500ng/μl、2.5μl；引物Ptgds-L-S、引物Ptgds-L-A、引物Ptgds-R-S和引物Ptgds-R-A均为10μmol/L、2.5μl；10×buffer5ul；dNTP 2.5mmol/L、5ul；Eazy-taq 0.5μl；补充水至50μl；
PCR扩增的反应条件为：预变性98℃2min；变性98℃20s×30；退火55℃20s×30；延伸72℃10s×30；末段延伸72℃5min；降温16℃2min。
进一步的，所述步骤6)具体包括：
6.1)将步骤5)选出的杂合子大鼠作为F0代杂合子大鼠，并与野生型大鼠进行合笼，将得到的子代进行基因鉴定，选出的杂合子大鼠作为F1代大鼠；
6.2)将F1代大鼠继续与野生型大鼠进行合笼，将得到的子代进行基因鉴定，选出的杂合子大鼠作为F2代大鼠；
6.3)将F2代大鼠进行群内自交产生的大鼠作为F3代大鼠，进行基因鉴定选出的纯合子大鼠，即为Ptgds基因敲除大鼠模型。
本发明的有益效果是：
1、本发明提供CRISPR/Cas9技术基因，构建出Ptgds基因敲除大鼠模型，具有修饰精确性高，靶向性特异，实验周期短且无物种限制等的优点。
2、本发明提供的在基因敲除大鼠模型的构建时，针对Ptgds基因剪接体Ptgds-201的1号外显子上及7号外显子的非编码区制造切口，通过NHEJ修复途径，将2个切口直接连接，同时删除两个切口之间的序列(即全部编码序列)，从而实现Ptgds基因的敲除；在将通过体外转录获得的纯化Cas9mRNA、sgRNA，共同注射到SD大鼠胚胎中，注射后将胚胎移植到代孕受体大鼠的输卵管内，经繁殖得到Ptgds基因敲除大鼠模型，为进一步研究大鼠自发性更年期肾阴虚模型的影响提供可靠而稳定的基因工程模型，为阐明更年期综合征相关疾病的治疗作用等工作奠定基础。
3、本发明是基于CRISPR/Cas9技术应用于大鼠Ptgds基因的靶向敲除，构建Ptgds基因敲除(Ptgds-/-)大鼠模型，产生自发性肾阴虚症状；通过繁殖、PCR鉴定和病理指标检测，可进一步应用于药效学评价，该模型可为研究围绝经期肾阴虚症状提供可靠而稳定的基因工程模型，并为围绝经期综合征机制探索和相关药物治疗作用评价方面奠定基础。
附图说明
图1为SD大鼠Ptgds基因Cas9靶向敲除策略示意图；
图2为Ptgds基因敲除大鼠表型PCR鉴定结果L-A&L-S；
图3为Ptgds基因敲除大鼠表型PCR鉴定结果R-A/L-S；
图4为Ptgds基因敲除大鼠模型繁殖传代示意图；
图5为Ptgds基因敲除大鼠8月龄体重结果；
图6为Ptgds基因敲除大鼠脏器指数结果；
图7为Ptgds基因敲除大鼠尾温测定结果；
图8为Ptgds基因敲除大鼠红外热成像结果；
图9为Ptgds基因敲除大鼠血清生化测定结果；
图10为Ptgds基因敲除大鼠肾脏功能ELISA结果；
图11为Ptgds基因敲除大鼠其他性腺相关脏器功能ELISA结果；
图12为Ptgds基因敲除大鼠Morris水迷宫测定结果。
具体实施方式
现结合附图以及实施例对本发明提供模型构建方法进行说明。
本发明提供的自发性肾阴虚Ptgds基因敲除大鼠模型的构建方法，包括以下步骤：
1)在Ptgds基因位点设计两个靶序列，分别为Ptgds-sgRNA1和Ptgds-sgRNA2；
2)通过体外转录获得纯化Cas9mRNA、Ptgds-sgRNA1和Ptgds-sgRNA2；
3)利用CRISPR/Cas9系统，将Ptgds基因内长度为2944bp的序列片段进行靶向敲除，得到Ptgds敲除后基因；
4)将纯化好的Cas9mRNA、Ptgds-sgRNA1、Ptgds-sgRNA2和Ptgds敲除后基因共同注射到大鼠胚胎中，注射后将胚胎移植到代孕受体大鼠的输卵管内，得到新生大鼠；
5)对新生大鼠进行基因鉴定选择出杂合子大鼠；
6)杂合子大鼠与野生大鼠进行多代繁殖、基因鉴定得到纯合子大鼠，即Ptgds基因敲除大鼠模型。
本发明步骤1)中，Ptgds-sgRNA1的核苷酸序列如序列表SEQ ID：1所示；Ptgds-sgRNA2的核苷酸序列如序列表SEQ ID：2所示。
本发明步骤3)中，序列片段包括内含子序列片段和外显子序列片段。
本发明步骤3)中，内含子序列片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID：3所示；外显子序列片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID：4所示。
本发明步骤5)和步骤6)中的基因鉴定包括：
S1)从新生大鼠中提取基因组DNA；
S2)以获取的基因组DNA为模板，使用特异性引物进行PCR扩增得到扩增产物；
S3)利用琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳检测；
S4)根据电泳结果鉴定出杂合子大鼠或纯合子大鼠。
本发明步骤S2)中，特异性引物包括引物Ptgds-L-S、引物Ptgds-L-A、引物Ptgds-R-S和引物Ptgds-R-A，对应的核苷酸序列依次如序列表SEQ ID：5、序列表SEQ ID：6、SEQID：7和SEQ ID：8所示。
本发明所述步骤S2)中，PCR扩增的反应体系为：模板DNA 500ng/μl、2.5μl；引物Ptgds-L-S、引物Ptgds-L-A、引物Ptgds-R-S和引物Ptgds-R-A均为10μmol/L、2.5μl；10×buffer5ul；dNTP 2.5mmol/L、5ul；Eazy-taq 0.5μl；补充水至50μl；
PCR扩增的反应条件为：预变性98℃2min；变性98℃20s×30；退火55℃20s×30；延伸72℃10s×30；末段延伸72℃5min；降温16℃2min。
本发明步骤6)具体包括：
6.1)将步骤5)选出的杂合子大鼠作为F0代杂合子大鼠，并与野生型大鼠进行合笼，将得到的子代进行基因鉴定，选出的杂合子大鼠作为F1代大鼠；
6.2)将F1代大鼠继续与野生型大鼠进行合笼，将得到的子代进行基因鉴定，选出的杂合子大鼠作为F2代大鼠；
6.3)将F2代大鼠进行群内自交产生的大鼠作为F3代大鼠，进行基因鉴定选出的纯合子大鼠，即为Ptgds基因敲除大鼠模型。
实施例
下面以具体的实例说明大鼠模型的构建方法。
1、SD大鼠Ptgds基因信息
本实施例构建的大鼠Ptgds基因，位于SD大鼠第3号染色体，只有1种转录本：Ptgds-201。
因此，本实施例以Ptgds-201转录本为对象构建模型。
2、SD大鼠Ptgds蛋白信息
参见图2和图3，本实施例提供的SD大鼠Ptgds蛋白结构域和SD大鼠Ptgds蛋白表达谱。
3、大鼠敲除模型构建思路
用大鼠Ptgds基因特异sgRNA(single-guide RNA)介导Cas9核酸酶切割DNA出现特定的DSBs(Double-Stranded Breaks)，并将该基因全部编码序列删除，
参见图1，实施时，即在剪接体Ptgds-201的1号外显子上及7号外显子的非编码区制造切口，通过NHEJ(Non-homologous end Joining)修复途径，将2个切口直接连接，同时删除两个切口之间的序列(即全部编码序列)，即在Ptgds Exon1-exon7两侧分别设计以NGG结尾的靶点，预期将两个靶点间序列敲除，从而实现Ptgds基因的敲除。
(1)guideRNA(gRNA)设计
本实施例中，在Ptgds基因位点设计两个靶序列，分别为Ptgds-sgRNA1和Ptgds-sgRNA2；
Ptgds-sgRNA1：
反向互补序列(Re):
Ptgds-sgRNA2：
反向互补序列Re:
上述序列中，方框中的几个基因为PAM识别位点，用于识别切割位置的靶序列，通过Ptgds-sgRNA1、Ptgds-sgRNA2和CAS9蛋白一起注射到受精卵中，一起作用将PTGDS基因删除，形成的大鼠模型。
(2)基因序列及guideRNA信息
利用CRISPR/Cas9系统，将Ptgds基因(2935bp，大写)关联的内含子序列片段(15bp,小写加粗下划线)，Ptgds基因1号外显子与7号外显子之间的序列片段(2929bp,大写加粗下划线)，即将长度共为2944bp的序列片段进行靶向敲除。
4、gRNA的设计、体外转录和纯化
通过序列比对设计出gRNA，由于是大片段删除基因，每处欲切割的靶点位置设计2条gRNA，但是各位点只采用一个gRNA，优先使用脱靶评分较高的gRNA，即选择脱靶概率低的sgRNA；另一条备用，当评分较高的gRNA无法作用时，采用备选的gRNA对基因进行敲除。
以sgRNA-Vector为模板PCR扩增出sgRNA的DNA片段，然后胶回收作为sgRNA体外转录的模板，再经过sgRNA体外转录与纯化回收，分装保存于-80℃冰箱备用。
5、显微注射
将纯化好的sgRNA、Cas9-mRNA共同注射到SD大鼠胚胎中，注射后将胚胎移植到代孕受体大鼠的输卵管内，得到新生小鼠。
6、基因敲除大鼠繁殖
胚胎移植后21天得到新生大鼠，出生2周左右完成基因型鉴定。
(1)大鼠基因型鉴定
通过基因型鉴定，分析新生大鼠的基因分型。将出生14d左右的大鼠，采用剪趾法编号并进行基因型鉴定。
(2)大鼠基因型鉴定的方法
第一步：基因组DNA提取
(1)消化
大鼠出生约一周内，剪取0.5cm大鼠脚趾，放入1.5ml EP管中，稍离心后加入500μl、0.5μl蛋白酶K(浓度：20mg/ml，溶解在pH7.4、20mmol/L Tris和1mmol/CaCl2中，50％甘油缓冲液，-20℃保存)，混匀55℃水浴消化过夜；
裂解液配方为：由100mmol/L Tris pH8.0、5mmol/L EDTA pH8.0、0.5％ SDS和NaCl1.17g/100ml组成。
(2)异丙醇沉淀抽提DNA：
1)从水浴锅中取出离心管，在室温静置10-15min，使样品温度降至室温，将离心管颠倒混匀，离心转速13000rpm，室温离心15min。
2)吸取400μl上清至另一个新的离心管中。加入等体积的异丙醇，立即温和地上下翻转，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀，室温下12000rpm离心10min，弃上清。
3)往离心管中加入700μl冰冷的75％乙醇漂洗，温和地上下翻转混匀。12000rpm，室温离心5min，将上清液全部吸除。
4)将离心管倒置在吸水纸上，以吸干乙醇。风干后用无菌ddH2O,50μl溶解DNA，55℃溶解2h(如不立即使用，-20℃保存)。
5)检测DNA的浓度，取100-200ng的DNA用做PCR模板。
第二步：以获取的基因组DNA为模板，使用特异性引物进行PCR扩增得到扩增产物；
针对靶点上下游约200～300bp区域分别设计正反向PCR引物。
(1)引物信息参见表1。
表1特异性引物结果
/>
(2)PCR扩增
本实施例中，PCR扩增反应体系和反应条件参见表2。
表2 PCR扩增反应体系和反应条件
(3)利用琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳检测；
1)制备3％琼脂糖凝胶
称取1.5g琼脂糖置于锥形瓶中，加入50ml 1×TAE缓冲液(TAE缓冲液是由三羟甲基氨基甲烷(Tris base)、乙酸(acetic acid)和乙二胺四乙酸(EDTA)组成的缓冲液)，瓶口倒扣小烧杯。微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀，即成3.0％琼脂糖凝胶液。
2)胶板制备
取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净，晾干，放入制胶玻璃板。取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好，形成模子。将内槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层。室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中。添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止。
3)加样
在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X。用10μl微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。(注意：加样前要先记下加样的顺序)。
4)电泳
加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压60-100V，样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动。电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳。
5)电泳完毕后，取出凝胶，用含有0.5μg/ml的溴化乙锭1×TAE溶液染色约20min，再用清水漂洗10min。
6)观察照相
在紫外灯下观察，DNA存在则显示出红色荧光条带，采用凝胶成像系统拍照保存。
第三步：大鼠鉴定及判别
根据电泳结果鉴定出杂合子大鼠或纯合子大鼠。
PCR扩增结果判断依据：阴性(WT)Ptgds+/+是一条带：609bp(L-S和L-A之间序列长度)；杂合子(HZ)Ptgds+/-含有两条带，分别为609bp和786bp(野生型敲除2944bp后剩余序列长度)；纯合子(HO)Ptgds-/-是一条带：786bp。
本实施例中，选择8个样本(分别记为D33～D42)，采用上述方法得到Ptgds基因敲除大鼠，其中PCR扩增的电泳结果如图2和图3所示。图2为L-A&L-S(609bp)；图3为R-A/L-S(786bp)。
表3 Ptgds基因敲除大鼠表型判定结果
根据图2和图3的电泳结果，得到表3的判定结果。8个样本中，阴性(WT)为2个，杂合子(HZ)为3个，纯合子(HO)为3个。
将上述鉴定结果为杂合子(Ptgds+/-)的大鼠作为F0代杂合子大鼠进行繁殖。
将F0代大鼠与野生型SD大鼠进行合笼，将子代鉴定得到的杂合子大鼠作为F1代大鼠；F1代大鼠继续与野生型SD大鼠进行合笼，将子代鉴定得到的杂合子大鼠作为F2代大鼠；然后将F2代大鼠群内自交产生的大鼠作为F3代，其中的纯合子大鼠(Ptgds-/-)即为Ptgds基因敲除大鼠模型。每代的繁殖过程中，对于子代均通过上述的基因鉴定方法对Ptgds基因敲除大鼠表型进行判定。
F1-F3繁殖传代历时16个月。F0代产生杂合子大鼠2只(雌2)，野生型8只(雌3，雄5)；F1代产生杂合子大鼠2只(雌1，雄1)，野生型9只(雌4，雄5)；F2代产生杂合子大鼠5只(雌3，雄2)，野生型5只(雌2，雄3)，F3代繁育子鼠33只，出现纯合子4只(雌2，雄2，纯合率约为12.12％)，杂合子19只(雌12，雄7)，野生型9只(雌5，雄4)。繁殖过程中，F3代成年鼠死亡2只，死亡率约为6.06％。F3代Ptgds野生型(-/-，9只)：杂合型(+/-，19只)：纯合型(+/+，4只)比例约为2.25：4.75：1。
7、围绝经期肾阴虚指标测定
围绝经期肾阴虚是因肾阴不足，失于滋养，虚热内扰所表现的证候，临床主要表现为头晕耳鸣、失眠多梦、五心烦热、腰膝酸痛、潮热盗汗等。大量实验研究表明围绝经期肾阴虚与下丘脑-垂体-性腺轴功能紊乱相关，主要表现为体重异常、潮热指数增加、肾功能减退、血糖异常、脂质代谢紊乱、与下丘脑-垂体-性腺轴相关的内分泌激素水平紊乱(雌激素、甲状腺激素、肾上腺皮质激素等)。
因此对不同表型Ptgds基因敲除大鼠的“下丘脑-垂体-性腺轴”相关指标进行测定，结果以SPSS软件进行单因素方差统计分析，p<0.05说明组间有显著的统计学差异。
(1)体重及脏器指数测定
进入围绝经期的妇女由于体内雌激素迅速耗竭，会出现脂肪代谢紊乱诱发的体重异常增长现象。而围绝经期的肾阴虚型患者体内脏器也会出现典型的退行性改变。因此，本研究将大鼠体质量和脏器指数作为基因敲除大鼠出现围绝经期脂肪代谢紊乱和脏器退行性变化初步评价的外部指标。
由于该类型大鼠寿命与野生型大鼠相比较短(12～14月龄)，因此选用三种表型8月龄Ptgds基因敲除未生育雌性大鼠(中年阶段，阴性、杂合型和纯合型)，以2％戊巴比妥钠溶液麻醉。分离大鼠大脑、子宫、肾脏和脾脏器官，生理盐水冲洗后滤纸吸干，称重并计算脏器指数(脏器指数％＝脏器重量/体质量×100％)。
结果如图5和图6所示。图5为8月龄体重示意图；图6为脏器指数示意图(*p<0.05，**p<0.01，NA：无统计学差异)。
参见图5和图6可知，纯合型大鼠较杂合型和野生型大鼠具有显著的体重增加趋势；从脏器指数变化趋势来看，纯合型大鼠肾、脾、子宫和大脑的脏器指数呈现明显的退行性变化。
(2)红外热成像尾温测定
施行双侧卵巢切除术一周后的大鼠，其尾部血流量增加并呈现短暂性突越，尾部皮肤温度与尾部血流量成正比，出现典型的围绝经期潮热症状。因此，可通过实时测定大鼠尾部温度来评价潮热严重程度，并对药物治疗潮热症状的有效性进行评价。
大鼠固定于固定器内，大鼠尾尖部固定于测定台表面，以红外热成像仪测定6h内大鼠尾巴距根部约2cm位置的皮肤温度。以温度记录仪记录数据，每5min为间隔进行数据采样。将前15min的温度均值作为基线值。大鼠在固定器内状态稳定后，记录温度值，并进行温度变化评价(数据点15个，评价点6个，实验室温度25±2℃，测定时间9：00～12：00)。
结果如图7和图8所示。图7为尾温测定结果；图8为红外热成像结果。(*p<0.05，**p<0.01，NA：无统计学差异)
由图7和图8可知，杂合型和纯合型大鼠尾部温度显著高于野生型大鼠(p<0.01)；而相较杂合型大鼠，纯合型大鼠具有更显著的潮热表现。
(3)肾脏、胰腺、甲状腺和子宫功能测定
由于肾阴虚与下丘脑-垂体-性腺轴的功能亢进有关，因此首先对性腺相关的脏器(肾脏、胰腺、甲状腺和子宫)功能进行测定。
取大鼠血清样本，以酶法测定血液生化指标，评价肾脏包括：白蛋白(ALB)、尿酸(UA)、尿素(UREA)、血糖(GLU)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和肌酐(CREA)。
采用酶联免疫法(ELISA)测定肾脏、胰腺、甲状腺和子宫腺体分泌功能指标，包括：肾脏、子宫ERβ、血清促肾上腺皮质激素(ACTH)、皮质酮(CORT)、胰岛素(INS)、环磷酸腺苷(cAMP)和促甲状腺素(TSH)。
测定结果参见图9-11。图9为血清生化测定结果；图10为肾脏功能ELISA结果；图11为其他性腺相关脏器功能ELISA结果。(*p<0.05，**p<0.01，NA：无统计学差异。
参见图9的血液生化检测结果表明，杂合型和纯合型大鼠较野生型大鼠肾功及血脂指标出现了异常，表明两种类型大鼠可能出现肾脏损伤及脂代谢紊乱；肾脏功能Na+-K+-ATP酶、ACTH、CORT、免疫cAMP和甲状腺TSH指标的异常升高进一步表明，杂合型和纯合型大鼠出现了肾阴虚典型的肾脏功能异常及内分泌腺体功能亢进的症状；而与野生型大鼠相比，杂合型和纯合型大鼠子宫ERβ水平的降低则说明了大鼠的卵巢分泌功能出现了退化现象，与子宫脏器指数降低结果一致，说明Ptgds基因敲除大鼠可以模拟大鼠围绝经期子宫卵巢衰退的情况；而杂合型和纯合型大鼠胰岛素水平的异常升高则可反映围绝经期因胰岛素抵抗出现的血糖异常升高，脂质代谢紊乱的情况。
(4)Morris水迷宫测定
由于围绝经期肾阴虚病人在临床会表现出如记忆力衰退、老年痴呆等典型的中枢性退行性病变症状。因此，采用Morris水迷宫方法对Ptgds基因敲除大鼠的记忆力及学习能力进行评测。实验Morris水迷宫系统中进行，系统包括直径为白色塑料水池(直径130厘米，高50厘米，内置PVC圆柱形逃生平台)，自动摄像机和图像跟踪处理软件。
在测试前进行为期5天的定位航行训练，即将每只大鼠(头顶黄色染料染色)头朝池壁于随机象限点轻托放入钛粉染白水中(23±2℃)，释放瞬间开始计时，当大鼠接触逃生平台并停留至少3秒时，计时停止。当老鼠找到平台时，可在上面停留10秒；若老鼠在90秒内找不到平台，则引导其登上平台并适应10秒。正式实验开始后，将原逃生平台撤走，将第二象限作为固定入水象限，并记录在规定时间内大鼠的逃逸潜伏期、游泳运动距离和穿越平台次数，以此评价大鼠的学习记忆能力，结果参见图12所示。
参见图12可知，与野生型大鼠相比，杂合型和纯合型大鼠逃逸潜伏期和游泳路程大幅度的上升，穿越平台次数明显降低，纯合型大鼠表现尤其明显(p<0.01)，说明杂合型和纯合型大鼠学习记忆能力水平显著低于正常大鼠。
综上所述，本发明是基于CRISPR/Cas9技术应用于大鼠Ptgds基因的靶向敲除，以此构建Ptgds-/-大鼠模型，产生自发性肾阴虚症状。通过繁殖、PCR鉴定和病理指标检测，可进一步应用于药效学评价。该模型可为研究围绝经期肾阴虚症状提供可靠而稳定的基因工程模型，并为围绝经期综合征机制探索和相关药物治疗作用评价方面奠定基础。
上述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 陕西中医药大学
<120> 一种自发性肾阴虚Ptgds基因敲除大鼠模型的构建方法
<141> 2022-02-25
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ccacgttgct ggcctcaggc tca 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
ccaaagcaag tcagacctcg gct 23
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
tgcccacgtt gctgg 15
<210> 9
<211> 2929
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
cctcaggctc agacacctgc tctactccaa gcaaatggct gctcttccaa tgctgtggac 60
cgggctggtc ctcttgggtc tcttgggatt tccacagacc ccagcccagg gccatgacac 120
agtgcagccc aactttcaac aagacaaggt gagagggtcc cctaccccac acccgaggaa 180
acagaaacct caggtcagag ccaggctttc tctcacaaga gagggtgcgt tgggcgctgt 240
cagccatggg agctgtctgg aaccgcgctg gcacacagcc tggttggtcc acctgactcc 300
gccaggaatg tggctctgat acccacttta ccggaagagt agactggggc gagcactggg 360
acaaagacgg gagctcaaca tcctggggaa ggaaggggtc aatgaggcaa tgagccagcc 420
tactagagag agagaggggc gtggatgcta ccagaacctg tgtgtgggag gagtcagagt 480
agggaaggcc agcccactag ggtctgccca tgaggggcgc atggtgcaga cccgggcatc 540
cactggtcac agttcctggg gcgctggtac agcgcgggcc tcgcctccaa ttcaagctgg 600
ttccgggaga agaaagagct actgtttatg tgccagacag tggtagctcc ctccacagaa 660
ggcggcctca acctcacctc taccttccta aggtgagaca agggggtgtg gcaagtttcg 720
ggacagaagg ccccacaacc ctgtctgggg gacatcctgg ggcttgttcc cttacatcag 780
gggtaatcta cccacaggaa aaaccagtgt gagaccaagg tgatggtact gcagccggca 840
ggggttcccg gacagtacac ctacaacagc ccccgtgagt gagccacttc cttatctggg 900
taaattctga ggtaaatgct ggcagactgt gcagccccct gtcccaaaag gtggggataa 960
tggtcacacc acaagggtca gtcatccaag accagacctg attgtgaatc tgcctcaggc 1020
acacagggct acctctctcc agggactttg gcctctctga aacccagcca cattcttcca 1080
ggcccctttc ctgtccaaat gaaatttccc agtactctgc tgcccaagtg ggtcacatac 1140
aggcattccc caaatcctac ccacatttca tagctcctat ccaagtacct ctttccatgc 1200
ctcacctgat ctatggattc ccaccagaac cctatttcct tggccttcct gctatattgt 1260
aactcagcct gatgatttct tgagtctaag tgttttctgc cctctcccca agattcatgg 1320
tttggagtta gtgttcagga aggaagctag agattgggtg gtggccaccc aggggagcac 1380
agggaaagaa gccaaagcag gggtggagga ggaaggcctg agaccctccc cacagagaag 1440
cccacaaagg ccaccccctc caagcagagg gagatagtga tgtgggagcc acatgtctta 1500
atcagtgtca tttcttgggt tcccagactg gggcagcttc cactccctct cagtggtaga 1560
aaccgactac gatgagtacg cgttcctgtt cagcaagggc accaagggcc caggccagga 1620
cttccgcatg gccaccctct acagtaggta tcccagccca caggcccacg cacagggcag 1680
atgcctgagg ttggaaacag accaaggcct aacccagagg acagtaacga aggtgtgtgg 1740
gggcagggcg agggcttttc acctcctgac accggcccct tctttatcta ccaggcagag 1800
cccagcttct gaaggaggaa ctgaaggaga aattcatcac ctttagcaag gaccagggcc 1860
tcacagagga ggacattgtt ttcctgcccc aaccgggtga gggaggctaa gctgctgagg 1920
agggaattag tgcagattag tgcagcctgt ggactgggga gagtgtggcc gcctactagt 1980
ccaggggctc caaggaaaga aatggaggtg tcagtctgtc ccgacagtac ctcgacctgc 2040
agcccccttt attgggaacc ctcttcctgg tggacacctc gctgccctgt ctgccagccc 2100
cctagctagg gatttagggg cactaacaga tggagaaaga caccttttat gttttaaaga 2160
acagattgga gcaggagtgg gatggagtct gaagtgtggg gctcagcctt ggggaggctt 2220
cgtaaagtcc agggagaaga caaagtcctg gtgactgtgg gtctaagcct gatactgact 2280
acttccctgg gcttctttct caacagataa gtgcattcaa gagtaaacac aggtgagaga 2340
agtcagtcac aggtaacaca tggtaagtgc catttactca ctcaacataa gaccactgag 2400
tgctcatgtg accacggagt gcgggctggg gtggggggga tgcagctgcc caaggactgt 2460
ccaagtgaga cagccagaga gaaaggacag ttccaattcc agtggcagga atagagctga 2520
tggccaaggg ttcatgggag aaggataaca gcaatgggaa gggaccgccc catgaagccc 2580
atcctgcaaa atgagtctcc aaggaaccag aatggacaag atcgggaagg gactggtggc 2640
cagggatgga catggcgagt cagagggctg gctcctcacc tgtgctgttg actgagactc 2700
tgagaccata ggccctggag ggatacccta ggaggccctg gccggaagtg ttgtttgggc 2760
cccactgggc tcagggtgct gccctcatca ctgatggctc ttgttcttct gtgcaggtga 2820
tgtggcctca ggactcccgt gctctgtcac tcttgagacc caagccctgg ctccccaaag 2880
accttctccg ccctccagct ttgccttggt ggagaaataa aatccaaag 2929
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
gcaggtctta gccataggtg 20
<210> 6
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
tttctgtttc ctcgggtg 18
<210> 7
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
gatggctctt gttcttctgt g 21
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
ccttccaact ttattgccta at 22

Claims (8)

1.一种自发性肾阴虚Ptgds基因敲除大鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)在Ptgds基因位点设计两个靶序列，分别为Ptgds-sgRNA1和Ptgds-sgRNA2；
2)通过体外转录获得纯化Cas9mRNA、Ptgds-sgRNA1和Ptgds-sgRNA2；
3)利用CRISPR/Cas9系统，将Ptgds基因内长度为2944bp的序列片段进行靶向敲除，得到Ptgds敲除后基因；
4)将纯化好的Cas9mRNA、Ptgds-sgRNA1、Ptgds-sgRNA2和Ptgds敲除后基因共同注射到大鼠胚胎中，注射后将胚胎移植到代孕受体大鼠的输卵管内，得到新生大鼠；
5)对新生大鼠进行基因鉴定选择出杂合子大鼠；
6)杂合子大鼠与野生大鼠进行多代繁殖，对每代得到的子鼠进行基因鉴定直至基因鉴出纯合子大鼠，即Ptgds基因敲除大鼠模型。
2.根据权利要求1所述的自发性肾阴虚Ptgds基因敲除大鼠模型的构建方法，其特征在于，所述步骤1)中，Ptgds-sgRNA1的核苷酸序列如序列表SEQ ID：1所示；Ptgds-sgRNA2的核苷酸序列如序列表SEQ ID：2所示。
3.根据权利要求2所述的自发性肾阴虚Ptgds基因敲除大鼠模型的构建方法，其特征在于，所述步骤3)中，序列片段包括内含子序列片段和外显子序列片段。
4.根据权利要求3所述的自发性肾阴虚Ptgds基因敲除大鼠模型的构建方法，其特征在于，所述步骤3)中，内含子序列片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID：3所示；外显子序列片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID：4所示。
5.根据权利要求4所述的自发性肾阴虚Ptgds基因敲除大鼠模型的构建方法，其特征在于，所述步骤5)中的基因鉴定和步骤6)中的基因鉴定均包括以下步骤：
S1)从新生大鼠中提取基因组DNA；
S2)以获取的基因组DNA为模板，使用特异性引物进行PCR扩增得到扩增产物；
S3)利用琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳检测；
S4)根据电泳结果鉴定出杂合子大鼠或纯合子大鼠。
6.根据权利要求5所述的自发性肾阴虚Ptgds基因敲除大鼠模型的构建方法，其特征在于，所述步骤S2)中，特异性引物包括引物Ptgds-L-S、引物Ptgds-L-A、引物Ptgds-R-S和引物Ptgds-R-A，对应的核苷酸序列依次如序列表SEQ ID：5、序列表SEQ ID：6、SEQ ID：7和SEQID：8所示。
7.根据权利要求6所述的自发性肾阴虚Ptgds基因敲除大鼠模型的构建方法，其特征在于，所述步骤S2)中，PCR扩增的反应体系为：模板DNA 500ng/μl、2.5μl；引物Ptgds-L-S、引物Ptgds-L-A、引物Ptgds-R-S和引物Ptgds-R-A均为10μmol/L、2.5μl；10×buffer 5ul；dNTP 2.5mmol/L、5ul；Eazy-taq 0.5μl；补充水至50μl；
PCR扩增的反应条件为：预变性98℃2min；变性98℃20s×30；退火55℃20s×30；延伸72℃10s×30；末段延伸72℃5min；降温16℃2min。
8.根据权利要求7所述的自发性肾阴虚Ptgds基因敲除大鼠模型的构建方法，其特征在于，所述步骤6)具体包括：
6.1)将步骤5)选出的杂合子大鼠作为F0代杂合子大鼠，并与野生型大鼠进行合笼，将得到的子代进行基因鉴定，选出的杂合子大鼠作为F1代大鼠；
6.2)将F1代大鼠继续与野生型大鼠进行合笼，将得到的子代进行基因鉴定，选出的杂合子大鼠作为F2代大鼠；
6.3)将F2代大鼠进行群内自交产生的大鼠作为F3代大鼠，进行基因鉴定选出的纯合子大鼠，即为Ptgds基因敲除大鼠模型。
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