CN114605541A - 一种抗4-1bb纳米抗体、编码基因及应用 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种抗4‑1BB纳米抗体、编码基因及应用。该抗4‑1BB纳米抗体能够与4‑1BB高效、特异性地结合，兼具纳米抗体的优势与免疫系统共刺激信号转导能力，由于可以获得完整的抗体序列，纳米抗体能够通过体外重组表达从而高质量、稳定的生产，具有广泛的应用前景。

Description

一种抗4-1BB纳米抗体、编码基因及应用
技术领域
本发明属于生物医学或生物制药技术领域，涉及一种抗4-1BB纳米抗体、编码基因及应用。
背景技术
多种证据明确证明，一定程度的免疫反应常存在于人和动物中。在癌症和感染性疾病患者中，免疫系统的细胞组分能识别突变或者感染细胞表达的抗原，诸如癌胚抗原的分化或突变的基因产物(1,2)。利用免疫调节机制诸如细胞因子，细菌产物，癌症疫苗以及获得性免疫治疗的疗法等可导致肿瘤在许多患者中的突变(3-5)。尽管存在这些反应，免疫治疗经常不能有效消除突变或者感染细胞。导致上述失败的原因可分为以下三种主要类型：(i)免疫细胞的识别受损，由于抗原的可变表达或I类主要组织相容性复合体(MHCⅠ)的表达降低所导致(6)；(ii)免疫抑制性微环境，由免疫抑制细胞分泌抑制性细胞因子(例如，TGF-β等)所导致(7)；(iii)由于缺乏共刺激分子在突变或者感染细胞上的表达而产生的肿瘤免疫原性差(8)，其导致不能有效刺激T细胞。对于抗原识别和免疫效应功能的发挥，增强免疫反应的可能策略是通过辅助分子提供共刺激信号来启动和维持抗原特异性T细胞的持续性杀伤和监控功能。
4-1BB(CD137,Tnsfr9)蛋白是CD8+T细胞等多种免疫细胞上表达的共刺激受体，属于TNF受体(TNFR)超家族成员，由肿瘤坏死因子受体超家族成员9(TNFRSF9)基因编码。与其他TNFR相同，依赖胞内TRAF超家族蛋白向下游传递信号。4-1BB蛋白介导的ERK、NF-κB等信号通路能够促进T细胞，特别是CD8+T细胞的分化、增殖、细胞因子的产生并维持其免疫功能(9)。因此4-1BB可作为潜在的肿瘤免疫治疗靶标，增强T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。目前已有4-1BB的单克隆抗体处于临床试验阶段，包括Urelumab、Utomilumab等。
1993年，自然杂志报道了一种存在于羊驼外周血的特殊的天然轻链缺失抗体(10)，与传统抗体不同，这类抗体仅由两条重链组成，只有一个重链可变区(VariableDomain of Heavy Chain Antibody，VHH)和两个常规的CH2与CH3区。经单克隆表达纯化后的VHH可在体外单独稳定存在，被称为单域抗体(SdAb)或纳米抗体。纳米抗体的分子量仅为15kD，是传统抗体分子量的1/10，但具有完整的抗原识别能力。由于纳米抗体的结构微小且与抗原结合能力完整，因此具有高亲和力、高特异性、强穿透性、易于改造和表达等优点。此外，由于可以获得完整的抗体序列，纳米抗体能够通过体外重组表达从而高质量、稳定的生产。
参考文献：
1.Rosenberg SA,Progress in human tumour immunology andimmunotherapy.Nature.2001May 17；411(6835):380-4.
2.Van Der Bruggen P,et al.Tumor-specific shared antigenic peptidesrecognized by human T cells.Immunol Rev.2002Oct；188:51-64.
3.Rosenberg SA.Interleukin-2and the development of immunotherapy forthe treatment of patients with cancer.Cancer J Sci Am.2000Feb；6Suppl 1:S2-7.
4.Bassi P.BCG(Bacillus of Calmette Guerin)therapy of high-risksuperficial bladder cancer.Surg Oncol.2002Jun；11(1-2):77-83.
5.Antonia S,et al.Current developments of immunotherapy in theclinic.Curr Opin Immunol.2004Apr；16(2):130-6.
6.Gu SS,et al.Therapeutically Increasing MHC-I Expression PotentiatesImmune Checkpoint Blockade.Cancer Discov.2021Jun；11(6):1524-1541.
7.Yang L,et al.TGF-beta and immune cells:an important regulatory axisin the tumor microenvironment and progression.Trends Immunol.2010Jun；31(6):220-7.
8.Dong H,et al.B7-H1,a third member of the B7 family,co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10secretion.Nat Med.1999Dec；5(12):1365-9.
9.Chester C et al.Immunotherapy targeting 4-1BB:mechanisticrationale,clinical results,and future strategies.Blood.2018Jan 4；131(1):49-57.
10.Hamers-Casterman C,et al.Naturally occurring antibodies devoid oflight chains.Nature.1993Jun 3；363(6428):446-8.
发明内容
针对上述问题与不足，本申请提供一种工艺简单、成本低、特异靶向4-1BB的纳米抗体，可用于检测和制药领域。
本发明为了解决上述问题，提供的技术方案之一为：提供一种抗4-1BB纳米抗体，是如下a)或b)的蛋白：
a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b)在序列表中序列1的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与特异性识别4-1BB相关的由a)衍生的蛋白质。
优选的，所述由a)衍生的蛋白质为序列2-33所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
具体的，本发明的抗4-1BB纳米抗体，其序列相似性＞82.98％。根据氨基酸序列的相似性将33条序列分为6组，具体如下。
第一组包括24个序列，分别为：
P1-1A、P1-1F、P1-7D、P1-1C、P1-10B、P2-2E、P2-8A、P2-9H、P2-10H、P2-9C、P2-3D、P2-7F、P2-3F、P1-6H、P2-3C、P1-1G、P1-8B、P2-2H、P2-8G、P1-1B、P2-4B、P1-4F、P2-11D、P2-12G，分别对应序列表中序列1-24。其编码基因，分别对应序列表中序列34-57。
第二组包括2个序列，分别为：P2-7D、P1-4B，分别对应序列表中序列25和26。其编码基因，分别对应序列表中序列58和59。
第三组包括3个序列，分别为：P1-1E、P1-12H、P2-11H，分别对应序列表中序列27-29。其编码基因，分别对应序列表中序列60-62。
第四组包括1个序列，为P2-5A对应序列表中序列30。其编码基因，对应序列表中序列63。
第五组包括1个序列，为P2-10F对应序列表中序列31。其编码基因，对应序列表中序列64。
第六组包括2个序列，分别为：P1-2F、P2-1D，分别对应序列表中序列32和33。其编码基因，分别对应序列表中序列65和66。
将抗4-1BB纳米抗体进行一些修饰和改造，例如进行人源化、PEG化或其他改造以提高其活性。
对此纳米抗体的CDR区域进行突变修饰，例如取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸，以提高其亲和力。
优选的，本发明的抗4-1BB纳米抗体还包括SP34-LC区域和SP34-HC区域，这两段区域共同组成CD3-Fab，CD3-Fab与抗4-1BB纳米抗体的融合构建，一方面促进纳米抗体的表达产量、另一方面提供TCR主要刺激信号，为后续T细胞活化验证提供帮助。本发明的抗4-1BB纳米抗体通过(G4S)3连接肽连接到SP34-LC的C端，形成以CD3-Fab为骨架的融合抗体结构。该结构有利于验证本发明的抗4-1BB纳米抗体的独特优势，并且在验证中以CD3-Fab为对照组说明了本发明的抗4-1BB纳米抗体的辅助功能特性。SP34-LC区域的氨基酸序列，对应序列表中序列67，其编码基因为对应序列表中序列70。(G4S)3连接肽区域的氨基酸序列，对应序列表中序列68，其编码基因为对应序列表中序列71。SP34-HC区域的氨基酸序列，对应序列表中序列69，其编码基因为对应序列表中序列72。
将抗4-1BB纳米抗体进行一些修饰和改造，例如进行人源化、PEG化或其他改造以提高其活性。
对此纳米抗体的CDR区域进行突变修饰，例如取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸，以提高其亲和力。本发明为了解决上述问题，提供的技术方案之二为：提供该抗4-1BB纳米抗体的编码基因。
优选的，所述编码基因是如下1)或2)或3)的基因：
1)其核苷酸序列是序列表中序列34；
2)在严格条件下与序列34限定的DNA片段杂交且编码与特异性识别4-1BB相关蛋白的DNA分子；
3)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性，且编码与特异性识别4-1BB相关蛋白的DNA分子。
优选的，2)或3)中的基因，其核苷酸序列是序列表中序列35-66。
本发明为了解决上述问题，提供的技术方案之三为：提供含有该编码基因的重组表达载体或者重组菌株。
本发明为了解决上述问题，提供的技术方案之四为：提供该抗4-1BB纳米抗体，在制备预防或治疗肿瘤、免疫缺陷疾病以及感染性疾病等药物中的应用。
实施本发明，具有如下有益效果：本发明提供的抗4-1BB纳米抗体能够与4-1BB高效、特异性地结合，亲和力高达0.79nM，由于可以获得完整的抗体序列，纳米抗体能够通过体外重组表达从而高质量、稳定的生产，具有广泛的应用前景。
本发明的上述应用中，包括如下中的至少一种：
(1)直接应用于4-1BB抗原特异性结合，例如以4-1BB为靶点的肿瘤抗原特异性识别与杀伤；
(2)在本发明所述4-1BB纳米抗体上连接效应分子，例如化学小分子药物、细胞因子、毒性分子或放射性同位素，用于医药领域；
(3)以所述4-1BB纳米抗体作为药物递送载体，定点靶向肿瘤等抗原部位，以实现定点特异性治疗；
(4)在本发明所述4-1BB纳米抗体上添加化学发光基团或荧光分子，以制备特异性探针；
(5)将发明所述4-1BB纳米抗体用于免疫系统增强疗效，例如CAR-T，TCR-T，CAR-NK，CAR-DC等，用于免疫治疗领域。
附图说明
图1 4-1BB抗原蛋白SDS-PAGE鉴定结果；
图2羊驼抗4-1BB血清效价检测结果；
图3羊驼PBMC总RNA琼脂糖凝胶电泳结果；
图4阳性菌落PCR琼脂糖凝胶电泳结果；
图5一轮阳性菌落酶联免疫吸附实验结果，包括图5a～5q；
图6二轮阳性菌落酶联免疫吸附实验结果，包括图6a～6d；
图7抗4-1BB纳米抗体序列相似性示意图，包括图7a～7e，图7a显示出了所列实施例中序列的相似性，图7b～7e显示出了组间序列的相似性；
图8CD3/4-1BB融合抗体的ELISA检测结果，包括图8a和8b,其中图8a为CD3/4-1BB融合抗体和对照CD3抗体与靶抗原4-1BB抗原结合能力检测结果，图8b为CD3/4-1BB融合抗体和对照CD3抗体与不相关抗原CD28结合能力检测结果；
图9 CD3/4-1BB融合抗体与K562细胞表面受体的结合实验结果，包括图9a和9b，其中图9a为CD3/4-1BB融合抗体和对照CD3抗体与靶细胞K562/4-1BB的结合能力检测结果，图9b为CD3/4-1BB融合抗体和对照CD3抗体与不相关细胞K562/CD28的结合能力检测结果；
图10 CD3/4-1BB融合抗体对人PBMC的活化结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案进行详细的说明，但是所述实施例的说明，仅仅是本发明的一部分实施例，其中大部分并不仅限于此。
由于单克隆抗体的筛选及获得技术难度大且成本高，因此我们将4-1BB免疫羊驼并获得其纳米抗体文库，通过噬菌体展示库技术，筛选获得高亲和力纳米抗体。本抗体可应用于肿瘤、免疫缺陷疾病和感染性疾病的免疫治疗，并通过酶联吸附反应等对4-1BB蛋白进行定性和定量测定。
尽管4-1BB蛋白是肿瘤免疫疗法的潜在靶点，现有的单克隆抗体在临床试验中呈现出了肝毒性、疲劳、发热等不良反应，而安全性较高的Utomilumab对受体的激动活性则较低。因此开发新的4-1BB靶向抗体药物具有积极意义，并为后续单独用药或药物联用提供新的思路。相比于常规抗体，本发明所述4-1BB纳米抗体的优势有：
(1)分子量小，可穿透血脑屏障，增强病灶特异性渗透，从而提升靶向杀伤抗原的效果；
(2)在原核或真核系统中表达高；
(3)稳定性好，特异性强，亲和力高；
(4)不会对人体引起免疫原性反应。
本发明所述抗4-1BB纳米抗体的应用优势在于生物医药研发(基因工程药物研发、ADC药物研发)；临床体外诊断(胶体金法、酶联免疫吸附法、电化学发光法)；肿瘤研究、免疫学治疗研究等基础研究，以及探针等特异性靶向识别与杀伤等方面的应用。
实施例1 4-1BB蛋白的表达及纯化
1.1载体构建
以真核表达载体pFuse构建4-1BB-Fc融合蛋白，将4-1BB和人IgG1 Fc通过PCR方式串联起来，完整分子包括4-1BB分泌信号肽、4-1BB胞外结构域、凝血酶切位点、IEGRMD短肽、人IgG1铰链区以及CH2和CH3结构域。将4-1BB-Fc基因采用NcoI和NheI双酶切后使用T4 DNA连接酶克隆至pFuse载体，或者采用同源重组试剂盒构建载体。
1.2真核表达
接种1.5×106/mL 293F细胞于500mL摇瓶200mL培养基中。37℃，165rpm，5％CO2浓度的摇床培养箱中振摇培养24h，24h后进行细胞计数，将细胞密度调整至3×106/mL，将上述1.1步骤所构建的质粒加200μg于10mL opti-MEM轻柔混匀后室温静置5min，加入500μL(1:2.5)PEI 40000于10mL opti-MEM轻柔混匀后室温静置5min，混合质粒和PEI混合液，轻柔混匀后室温静置20min。将上述混合液逐滴加入200mL 293F细胞培养液中，滴加的同时轻柔摇晃培养瓶，混合均匀后放入摇床，转染72h。转染结束后，100g离心5min，取上清液，向培养瓶中补加100mL培养基重新悬浮培养后3000rpm离心5min，取上清液。混合两次细胞上清液。
1.3蛋白纯化
取上述1.2步骤的细胞上清液400mL，15000rpm，4℃离心30min，收取上清液，0.45μm滤膜过滤，置于冰上备用。取3mL(20％乙醇/Protein G 1:1)Protein G于层析柱内，用Binding buffer冲洗3次后，使用垫片压住resin表面。用20mL Binding buffer平衡Protein G柱。每10mL上样一次，使样品匀速(约0.5mL/min)通过Protein G柱。40mLBinding buffer匀速(约1mL/min)清洗Protein G柱。首先在洗脱管收集管中加入10％洗脱液体积的Buffer，柱中加入Elution buffer(5mL洗脱一次，直到无法定量蛋白浓度)洗脱4次。使用Amicon Ultra-15离心过滤器对收集的蛋白样品进行浓缩，4℃离心机3000rpm离心20分钟，并使用nanodrop测蛋白浓度。
将蛋白样品进行缓冲液置换。放入透析袋(加超纯水微波炉煮十分钟)中，4℃，4L透析液(转子搅拌透析)，每4小时换一次液。两次换液后，收集透析袋内全部蛋白液体，4℃，8000rpm，15分钟离心，收集上清并定量。
首先进行酶切效率测试，取适量定量后的蛋白溶液，浓度稀释为1mg/mL，每管取100μL蛋白样品。加Thrombin(凝血酶)，浓度从10IU/mg开始，2倍稀释(使用透析液)，共10个梯度。设置不加Thrombin的对照组。室温振荡16小时。SDS-PAGE检测酶切效果。确定合适Thrombin酶切浓度，将剩余蛋白样品全部酶切。室温振荡16小时。SDS-PAGE检测大体系酶切效果。
将凝血酶酶切后蛋白样品缓慢匀速通过Protein G层析柱，并按照上述洗脱方法进行洗脱，并用SDS-PAGE进行检测，直至样品中没有Fc，4-1BB ECD纯度大于90％为佳。
浓缩除标签后的4-1BB ECD蛋白至1mg/mL，并取样进行SDS-PAGE进行最终鉴定(4-1BB ECD-Fc分子量约为44.8KD，由于真核表达的糖基化作用，还原型SDS-PAGE最终表现应为50-65KD，Fc分子量约为30KD)，结果如图1所示。
实施例2抗4-1BB纳米抗体噬菌体展示文库的构建及筛选
2.1羊驼的免疫
选取健康成年羊驼一只，标记耳号。将4-1BB蛋白与弗氏佐剂按1:1的比例混合均匀，4℃保存。在羊驼颈部淋巴结附近分左右两侧注射，每侧分2点，每次注射0.4mL混合佐剂抗原。免疫后观察半小时，确认羊驼状态良好且无不良反应。每2周免疫一次，一共进行7次免疫。第6、7次免疫后间隔5-7天，颈部静脉采集羊驼外周血，用于噬菌体展示文库构建。
2.2羊驼来源的淋巴细胞分离
在15mL离心管中加入3mL细胞分离液，缓慢加入3mL血样。离心机25℃预冷，400g离心30min，观察血样分离情况。使用200μL移液器小心吸取中间棉状上层免疫细胞至新的15mL离心管中，上层血清转移至新离心管后-80℃保存。向含免疫细胞的离心管中加入10mL室温PBS缓冲液，25℃，400g离心20min，去除上清液。每管加入5mL室温PBS缓冲液，25℃，400g离心20min，计数，去上清液。根据细胞计数结果使用RNAiso Plus溶解分离得到的淋巴细胞，得到溶解液，-80℃保存。
2.3羊驼血清效价检测
抗原包被酶标板(2μg/mL，100μL/孔)，4℃过夜。弃抗原溶液，并用200μL PBST溶液(1×PBS加0.05％Tween20，下同)冲洗酶标板三次，每次5分钟。使用200μL封闭液(2％BSAin PBST)封闭酶标板，室温，1.5小时。弃封闭液，并用200μL PBST溶液冲洗酶标板三次，每次5分钟。使用封闭液对各批次血清进行梯度稀释，并向酶标板对应孔中加入100μL相应的血清，室温孵育2小时。弃血清，并用200μL PBST溶液冲洗酶标板4次，每次5分钟。向每个孔中加入检测抗体(山羊抗美洲驼IgG，偶联HRP，1:10000稀释于封闭液中，100μL/孔)室温，1小时。弃检测抗体，并用200μL PBST溶液冲洗酶标板4次，每次5分钟。向每孔加入100μL TMB底物溶液，显色2-3分钟。向每孔加入100μL反应终止液。30分钟内使用酶标仪测定450nm处吸光值。阳性孔标准：免疫血清样品OD450值大于未免疫血清3倍且读值大于0.5，结果如图2所示。
2.4RNA提取
将Trizol保存的外周血淋巴细胞转移至1.5mL离心管中，加入1/5体积的氯仿混匀，室温静置5min，4℃，12000g离心15min。小心移取上清液至新的离心管中，加入0.5-1倍体积的异丙醇，室温静置10min，4℃，12000g离心10min。使用Trizol保存的外周血淋巴细胞等体积的75％乙醇清洗沉淀，4℃，7500g离心5min后，溶解于适量RNase-Free的水中，合并所有样品，即为提取得到的总RNA。羊驼PBMC总RNA琼脂糖凝胶电泳结果如图3所示。
2.5反转录合成cDNA
使用Takara反转录试剂盒对获得的总RNA进行反转录。将上述总RNA样品分为两份，一份使用试剂盒内的Oligo dT Primer作为引物，另一份用试剂盒内的Random 6-mers作为引物，按照反转录试剂盒说明书将上一步得到的总RNA反转录成cDNA，分别保存到2个离心管中。
2.6抗体可变区基因扩增
将反转录得到的cDNA作为模板，使用Taq DNA Polymerase Hot Start酶进行两轮PCR扩增反应。
第一轮反应条件和程序为：
使用Taq DNA Polymerase Hot Start酶进行PCR扩增，为了确定最佳模板使用量，分别使用1μL、2μL、3μL、4μL、5μL的oligo dT Primer和random 6-mer的cDNA作为模板，按照下表配置PCR反应体系：
Figure BDA0003231124390000061
按照下表配置并进行PCR反应：
Figure BDA0003231124390000062
(1)反应结束后，取20μLPCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，最终选取电泳结果中目的条带单一且片段大小为600bp的模板量为最佳模板量，将所有cDNA按照此模板量并使用相同条件进行PCR反应；
(2)将所有PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，并切胶回收目的片段大小在600bp左右的条带；
(3)将所有一轮PCR纯化回收产物收集至一个离心管中，即为第一轮PCR扩增产物，-20℃保存。
第二轮反应条件和程序为：
将第一轮PCR扩增产物作为模板进行第二轮PCR反应，为了确定最佳模板使用量，分别使用0.5μL、1μL、2μL、3μL、4μL作为模板，按照下表配置PCR反应体系：
Figure BDA0003231124390000063
Figure BDA0003231124390000071
按照下表配置并进行PCR反应：
Figure BDA0003231124390000072
(1)反应结束后，取20μL PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，最终选取电泳结果中目的条带单一且片段大小为600bp的模板量为最佳模板量，将已获得的第一轮PCR扩增产物的约1/5体积共288个反应按照此模板量并使用2.5第一轮扩增相同条件进行PCR反应后使用通用型DNA纯化回收试剂盒对PCR反应液进行DNA纯化；
(2)将回收产物收集至一个离心管中，即为第二轮PCR扩增产物，同时取2μL用核酸浓度测量仪检测回收产物的浓度并记录，其余产物-20℃保存。
2.7载体构建
(1)使用pADL-10b作为噬菌体质粒载体，用BglI分别酶切10μg pADL-10b载体和5μg第二轮PCR扩增产物，37℃孵育4h；
(2)使用DNA回收纯化试剂盒对pADL-10b载体和第二轮PCR扩增产物进行纯化，4℃保存。
2.8连接
(1)载体和片段进行连接，按照下表配制连接反应体系：
Figure BDA0003231124390000073
(2)将连接反应4℃过夜(约16h)孵育；
(3)使用通用型DNA纯化回收试剂盒纯化连接反应液，检测回收产物的浓度，4℃保存。
2.9验证连接产物转化率
(1)取一支50μL的SS320感受态细胞在冰上放置5-10min融化；
(2)加入100ng连接产物，转移到已经预冷好的间距1mm的电转杯中，在电转仪中设定参数：1800V，1mm后，点击按钮点击转化；
(3)等待电转完成后立即加入37℃预热好的SOC培养液1mL，混匀后37℃，200rpm摇菌复苏1h；
(4)从1mL复苏后的菌液中取100μL进行10倍梯度稀释并涂板，根据稀释倍数和单菌落数计算每个反应能获得的转化菌落数目，即为连接产物的转化效率；
(5)同时随机挑选48个单克隆菌进行菌落PCR，PCR产物有在500bp左右的单一条带认为是阳性克隆，由此估算单克隆阳性率，结果如图4所示。
2.10细菌文库构建
(1)取25组100ng连接体系按上述方法使用25管感受态细胞进行电转反应；
(2)37℃复苏1h后从中取100μL进行10梯度稀释后涂板，37℃过夜培养；
(3)收集剩下所有菌液并均匀涂布到5个245mm方形培养板(2×YT含有100μg/mLAmp，2％glucose，2％agarose)中，37℃培养过夜；
(4)根据稀释倍数和单菌落数计算所有反应能获得的转化菌落数目，即为细菌文库的库容量；
(5)同时从梯度稀释板中随机挑选48个单克隆进行菌落PCR，验证细菌文库的克隆阳性率；
(6)将过夜培养的245mm方形培养板菌落使用2×YT液体培养基刮下，置于50mL离心管，测量其OD600值，添加终浓度20％甘油-80℃保存。
2.11噬箘体文库制备
根据细菌文库的OD600计算在100mL 2×YT液体培养基需要加入的细菌文库体积，据计算结果接种细菌文库到100mL 2×YT液体培养基(含有10μg/μL Tet和100μg/μL Amp)中，37℃，250rpm培养直至OD600为0.5-0.55。根据辅助噬菌体效价，按照1：20(细菌个数：噬箘体数)的比例加入辅助噬菌体，37℃，250rpm孵育30-60min。加入终浓度为50μg/mL和200μM的IPTG，30℃，250rpm过夜培养。将过夜培养的菌液4℃，8000rpm离心10min，然后将离心后的上清液转移到新的50mL离心管中。加入1/4的预冷PEG/NaCl储存液，混合均匀，冰上静置孵育30min。4℃，8000rpm离心10min后，弃上清，倒置控干2min。加入5mL PBS重悬至新的离心管，4℃，8000rpm离心10min。离心后转移上清至新的离心管中，再次加入1/4体积的预冷PEG/NaCl储存液，混合均匀，冰上孵育10min。4℃，8000rpm，10min离心，弃上清，用1mL PBS重悬后，8000rpm离心10min，转移上清至新的离心管，-80℃保存，即为纯化后的噬菌体文库。
2.12阳性噬菌体库筛选
第一轮筛选：从-80℃冰箱中取出筛选抗原，冰上放置解冻；将筛选抗原4-1BB及负筛抗原CD28分别包被免疫管(50μg/管，包被液为PBS，2mL/管)，其中负筛抗原包被两个免疫管，一管做负筛，一管做对照，4℃缓慢旋转包被过夜。将过夜包被的免疫管中的液体弃掉，加入2mL PBS缓冲液室温清洗免疫管3次，每次旋转5min。加入2mL封闭液(3％脱脂奶粉)溶液，室温旋转封闭2h。先将封闭后的负筛免疫管中液体丢弃，并加入2mL PBST缓冲液室温清洗免疫管3次，每次旋转5min。弃掉负筛免疫管中的清洗液，加入2mL PBS，按照下列公式计算并加入制备的噬菌体文库104μL作为第一轮筛选输入噬菌体文库，室温旋转孵育1h：
Figure BDA0003231124390000081
其中，V为加入的噬菌体体积(单位μL)，Tlibrary为噬菌体效价；
将包被抗原4-1BB和对照抗原CD28的免疫管内封闭液弃掉，加入2mL PBST(1×PBS加0.1％Tween20，下同)缓冲液室温清洗免疫管3次，每次旋转5min。将免疫管内液体弃掉，将负筛孵育结束后的噬菌体溶液均分成分别加入这两个免疫管中，室温旋转孵育1h；弃掉免疫管中的液体，加入2mL PBST缓冲液室温清洗免疫管20次，每次旋转5min。将免疫管内液体弃掉，尽量去除残余液体，加入1mL 0.25mg/mL Trypsin溶液，室温旋转洗脱30min。加入10μL 10％AEBSF终止洗脱，将免疫管中的溶液转移至新的1.5mL离心管中，即为第一轮筛选噬菌体洗脱液。
第一轮噬菌体洗脱液效价检测：将-80℃冰箱保存的SS320菌株在2×YT固体培养基(Tet抗性)进行单菌落划线，37℃过夜培养(4℃保存一周)，从单菌落板上挑取一个单菌落到5mL含有10μg/mL Tet的2×YT培养基，37℃过夜培养。取过夜培养菌液500μL转接到含5mL含有10μg/mL Tet的2×YT液体培养基中，37℃，250rpm培养约45min-60min后至OD600为0.5-0.55。取第一轮噬菌体洗脱液10μL在1.5mL离心管中10倍梯度稀释，共稀释10个梯度，即将第一轮噬菌体洗脱液取10μL稀释至100μL，再从中取10μL稀释至100μL，依次类推，共稀释12个梯度至10-10，振荡混匀。在每个稀释离心管中加入90μL的SS320菌液，混匀后37℃孵育30min，从每个稀释离心管中取5μL滴加到2×YT固体培养基(Amp)中，37℃倒置过夜培养。统计可以明显区分单菌落的稀释度的平板上的单菌落数量，并按照下面公式计算每毫升菌体溶液中噬菌粒的数量，即噬菌体文库效价：
T(pfu/ml)＝N×D×400
其中，T为噬菌体效价(单位pfu/mL)，D为稀释倍数，N为相应稀释倍数上单菌落个数。
第一轮噬菌体洗脱液的扩增：预先将-80℃冰箱保存的SS320菌株在2×YT固体培养基(Tet抗性)进行单菌落划线，37℃过夜培养(4℃保存一周)，从单菌落板上挑取一个单菌落到5mL含有10μg/mL Tet的2×YT培养基，37℃过夜培养。取过夜培养菌液500μL转接到含5mL含有10μg/mL Tet的2×YT液体培养基中，37℃，250rpm培养约45min-60min后至OD600值为0.5-0.55。加入500μL第一轮筛选后得到的噬菌体洗脱液至OD600为0.5-0.55的菌液中(剩余的洗脱液4℃保存)。37℃，250rpm继续培养30min。将全部菌液均匀涂布到含有100μg/mLAmp和2％葡萄糖的2％琼脂糖的245mm方形培养基平板中，37℃过夜培养。取过夜培养的方形板，在培养板表面加入6mL 2×YT液体培养基(含10μg/mL Tet)，用涂布棒轻轻将方形板菌落刮下并将菌液收集至15mL离心管中，即为扩增后的细菌子文库，同时使用分光光度计测量菌液OD600值，即为洗脱液细菌文库OD600值，加入终浓度为20％的甘油，即为第一轮细菌文库。将洗脱液细菌文库根据下面公式计算出相应菌液量，转接至100mL 2×YT液体培养基中(含10μg/mL Tet和100μg/mLAmp)，使初始OD600为0.1：
Figure BDA0003231124390000091
其中，V为转接菌液的体积(单位μL)，OD600为构建的洗脱液细菌文库的OD600。
37℃，250rpm培养直至菌液OD600达到0.5-0.55。按照下面公式计算并加入辅助噬菌体M13K07以使细菌个数：噬菌体数＝1∶20：
Figure BDA0003231124390000092
其中，V为加入辅助噬菌体的体积(单位mL)，Thelper-phage为使用的辅助噬菌体效价，OD600为菌液的OD600值；
37℃，250rpm继续培养30min；分别加入终浓度为50μg/mL Kana和终浓度为0.2μMIPTG，30℃，250rpm过夜培养。
第一轮噬菌体纯化：将过夜培养的菌液转移至新的50mL离心管中4000rpm，4℃离心10min。将离心后的上清液转移至新的50mL离心管中，加入1/4体积的4℃预冷的20％PEG/2.5M NaCl，充分混匀后冰上放置30min。4000rpm，4℃离心20min，弃上清，并在纸上倒置2min。加入1mLPBS重悬沉淀，将重悬液移至新的1.5mL离心管，13000rpm，4℃离心20min。将离心后的上清转移至新的1.5mL离心管，加入1/4体积预冷的20％PEG/2.5MNaCl溶液，混匀后冰上放置10min。13000rpm，4℃离心10min，弃上清，加入1mL PBS重悬沉淀，13000rpm，4℃离心2min，将上清转移到新的1.5mL离心管中，即为第一轮筛选噬菌体子文库，100μL/管分装，长期-80℃保存，短期(1-2周)可于-20℃放置保存。一轮筛选噬菌体子文库效价检测，方法同上。
第二轮筛选：筛选方法同上，输入噬菌体为第一轮筛选得到噬菌体子文库，作为第二轮筛选输入噬菌体文库，得到第二轮筛选噬菌体洗脱液。
第二轮噬菌体洗脱液效价检测、洗脱液的扩增、纯化、筛选噬菌体子文库效价检测，方法同上。
单克隆ELISA检测：预先将-80℃冰箱保存的SS320菌株在2×YT固体培养基(Tet抗性)进行单菌落划线，37℃过夜培养(4℃保存一周)，从单菌落板上挑取一个单菌落到5mL含有10μg/mLTet的2×YT培养基，37℃过夜培养。取过夜培养菌液500μL转接到5mL含有10μg/mLTet的2×YT液体培养基中，37℃，250rpm培养45min-60min后至OD600值为0.5-0.55。取第二轮筛选后噬菌体洗脱液10μL，在1.5mL离心管中10倍梯度稀释，共稀释12个梯度，振荡混匀。每个稀释离心管中加入90μL OD600值为0.5-0.55的菌液，混合均匀。37℃，250rpm继续培养30min。将菌液均匀涂布到含有100μg/mLAmp的固体培养基平板，37℃过夜培养。从过夜培养后的培养基平板中随机挑取单克隆菌落于无菌96孔细胞培养板(P1-P2)中，每孔加入100μL 2×YT培养基(含有100μg/mL Amp和10μg/mL Tet)，37℃过夜静置培养。取过夜培养的菌液2μL转接至每孔250μL 2×YT液体培养基(含有100μg/mLAmp和10μg/mL Tet)的新96孔细胞培养板中，37℃静置培养3h，将转接前过夜培养的菌液4℃保存。按照下面公式计算并每孔加入辅助噬菌体M13K07以使细菌个数：噬菌体数＝1∶20：
Figure BDA0003231124390000101
其中，V为加入辅助噬菌体的体积(单位mL)，Thelper-phaqe为使用的辅助噬菌体效价。
37℃孵育30min，加入终浓度为50μg/mL的Kana和0.2μM的IPTG，30℃静置过夜培养。将过夜培养后的96孔培养板4℃，4000rpm离心10min，4℃保存备用。将筛选抗原4-1BB及负筛抗原CD28分别包被酶标板(1ng/μL，包被液为pH 9.4的CBS，100μL/孔)，同时平行包被BSA作对照，4℃包被过夜。将过夜包被的酶标板内液体弃掉，每孔加入200μL PBS缓冲液，室温清洗酶标板3次，每次10min。每孔加入200μL封闭液(3％BSA in PBST)封闭酶标板，室温封闭1h。弃封闭液，每孔加入200μL PBST(1×PBS加0.1％Tween20，下同)缓冲液，室温清洗酶标板3次，每次10min。每孔加入120μL 3％BSA后再加入80μL离心后的上清液，室温孵育2h。弃掉酶标板内液体，每孔加入200μL PBST缓冲液洗涤3次，每次10min。每孔加入M13BacteriophageAntibody(HRP)，Mouse Mab，1：8000稀释于封闭液中，100μL/孔，室温孵育1h。弃掉ELISA板内液体，每孔加入200μL PBST缓冲液洗涤3次，每次10min。每孔加入100μLTMB单组份显色液避光显色2-3min，每孔加入100μL1M HCl终止，用酶标仪读取OD450值，记录并保存。一次验证以负筛抗原4-1BB、BSA做阴性对照，以OD600≥0.6136为阳性克隆范围。结果使用GraphPad Prism处理，如图5a～5i所示。
阳性克隆ELISA二次验证：为了排除假阳性结果，将初步认定为阳性的克隆进行ELISA二次验证，方法同上，二次验证只做负筛抗原CD28对照，不做BSA对照。测序结果具有代表性的阳性单克隆二次验证，以OD600≥0.6037为阳性克隆范围。结果使用GraphPadPrism处理，结果如图6a～6b所示。
实施例3测序
3.1阳性克隆测序
根据ELISA检测数据和二次验证数据选定阳性单克隆。
从单克隆ELISA检测板中取阳性克隆菌液5μL接种至2mL 2×YT培养基(含有100μg/mL Amp和10μg/mL Tet)，37℃，250rpm培养直至OD600至0.8-1.0(约6-8h)，取1mL菌液测序，其余菌液4℃保存。
3.2序列分析
经测序的序列使用GENtle软件进行序列比对分析，并使用GENtle软件将抗体序列翻译成氨基酸。结果如图7a～7e，其中图7a显示出所列实施例中总序列相似性，图7b～7e显示出组间序列相似性。
实施例4 CD3/4-1BB融合抗体的表达和纯化
4.1载体构建
以真核表达载体pFuse构建SP34-HC和SP34-LC-4-1BB(Nanobody)融合蛋白。对于SP34-HC，完整分子包括IL2分泌信号肽和SP-34-VH和SP-34-CH1；对于SP34-LC-4-1BB(Nanobody)的构建，将SP34-LC和抗4-1BB纳米抗体通过PCR方式串联起来，完整分子包括IL2分泌信号肽、SP34-LC、(G4S)3连接肽、抗4-1BB纳米抗体。将SP34-HC或者不同的SP34-LC-4-1BB(Nanobody)基因采用EcoRI和XhoI双酶切后使用T4 DNA连接酶克隆至pFuse载体，或者采用同源重组试剂盒构建载体。
4.2真核表达
接种1.5×106/mL 293F细胞于250mL摇瓶50mL培养基中。37℃，165rpm，5％CO2浓度的摇床培养箱中振摇培养24h，24h后进行细胞计数，将细胞密度调整至3×106/mL，将上述4.1步骤所构建的质粒SP34-HC和SP34-LC-4-1BB(Nanobody)(25μg:25μg)于5mL opti-MEM轻柔混匀后室温静置5min，加入125μL(1:2.5)PEI 40000于10mL opti-MEM轻柔混匀后室温静置5min，混合质粒和PEI混合液，轻柔混匀后室温静置20min。将上述混合液逐滴加入50mL 293F细胞培养液中，滴加的同时轻柔摇晃培养瓶，混合均匀后放入摇床，转染72h。转染结束后，100g离心5min，取上清液，向培养瓶中补加50mL培养基重新悬浮培养后3000rpm离心5min，取上清液。混合两次细胞上清液。
4.3蛋白纯化
取上述1.2步骤的细胞上清液50mL，15000rpm，4℃离心30min，收取上清液，0.45μm滤膜过滤，置于冰上备用。取3mL(20％乙醇/Protein G 1:1)Protein G于层析柱内，用Binding buffer冲洗3次后，使用垫片压住resin表面。用20mL Binding buffer平衡Protein G柱。每10mL上样一次，使样品匀速(约0.5mL/min)通过Protein G柱。40mLBinding buffer匀速(约1mL/min)清洗Protein G柱。首先在洗脱管收集管中加入10％洗脱液体积的Buffer，柱中加入Elution buffer(5mL洗脱一次，直到无法定量蛋白浓度)洗脱4次。使用Amicon Ultra-15离心过滤器对收集的蛋白样品进行浓缩，4℃离心机3000rpm离心20分钟，并使用nanodrop测蛋白浓度。
实施例5 CD3/4-1BB融合抗体与4-1BB抗原的结合能力验证
5.1实验开始前，各试剂均应平衡至室温；试剂或样品配制时，均需充分混匀，并尽量避免起泡。
5.2包被：用包被液4℃过夜包被4-1BB抗原(10ug/mL)，分为四组，每组两个平行，一个空白对照。同时包被一个阴性对照组，以抗原CD28(10ug/mL)包被阴性对照组。
5.3封闭：每孔加封闭液200uL，37℃封闭1h。
5.4加样：分别设空白孔、待测样品孔。所有样品均用封闭液稀释。首先配置150uL(两个平行)的200nM的4-1BB抗体(使用封闭液稀释抗体)，从每个平行组200nM抗体中取30uL，加入到120uL的下一孔稀释液中(5倍稀释)。以200nM为起始浓度5倍梯度稀释，7孔(100uL/孔)，空白对照孔只加封闭液。盖上酶标板，37℃孵育90分钟(室温2h)。
5.5孵育二抗：先弃去液体(在纸上用力拍干)，用200uL/孔PBST洗涤重复3次，每次放水平摇床3-5min。每孔加入HRP-Anti kappa light chain antibody二抗100μl，加上覆膜，37℃温育1h。
5.6显色：弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每孔加显色底物TMB 100μl，酶标板加上覆膜37℃避光孵育。每孔加终止液2M H2SO4 50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色。立即用酶标仪在450nm波长测量各孔OD值。应提前打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序。
5.7依据OD值绘制标准曲线，结果如图8a和8b所示。实验组有明显的抗原结合能力，与对照组有显著差异。
实施例6 CD3/4-1BB融合抗体与K562/4-1BB细胞的结合实验
6.1实验组做两个平行100μL/孔，阴性对照组做两个平行。按蛋白浓度梯度把每组分为7个点。阳性细胞K652/4-1BB cells:(0.3million/孔)，每组7孔；阴性细胞K562/CD28cells：(0.3million/孔)，每组7孔。
6.2蛋白浓度梯度稀释：在96孔板中，将4-1BB蛋白稀释到200nM的初始浓度，五倍梯度稀释分别为(200nM、40nM、8nM、1.6nM、320pM、64pM、12.8pM)。等待处理好细胞后，向细胞中加入100uL已经做好浓度梯度稀释的抗体。
6.3将K562细胞计数，调整每孔细胞量为3×105将细胞放入U型孔板,离心去上清，加入200μL FACS重悬细胞，离心去上清。
6.4将步骤2稀释的蛋白按照100μL/组,加入不同的K562细胞中，放冰上孵育2h后，加入FACS清洗掉多余的游离抗体，离心去掉上清。
6.5加入稀释好的Goat anti-human kappa-AF467 100μL，吹打重悬细胞置于冰上孵育1h.之后离心去掉上清。加入200μL FACS，清洗掉多余的游离抗体，离心去掉上清，再用200μLFACS缓冲液重悬细胞。
6.6流式检测：流式检测数据使用GraphPad Prism处理，结果如图9a和9b所示。实验组有明显的细胞表面抗原结合能力，与对照组有显著差异。
实施例7 CD3/4-1BB融合抗体对人PBMC的活化能力验证
7.1本轮实验使用PBMC进行活化，实验均为两组平行，每组均设置空白对照，CD3-Fab作为阴性对照。
7.2细胞计数，调整PBMC细胞密度为1×106/mL，48孔板每孔2.5mL；
7.3 CD3/4-1BB融合抗体：配置激活剂浓度梯度，三个梯度，两个平行，每孔加入50nM、5nM、0.5nM和0nM CD3/4-1BB抗体，100μL/孔。
7.4按浓度每孔加入细胞体积1/10抗体(20μL)，加入CD3/4-1BB抗体。
7.5 37℃培养48h后离心1000rpm离心5min，进行流式CD25/CD69染色，结果如图10所示。实验组有明显的T细胞活化能力，与对照组有显著差异。
以上文字及附图对本发明进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述具体实施方式仅起到示意作用，不具有限制性。
本发明根据序列相似性比对结果，以组间相似性＞93％将筛选出的33条序列分为6组，每组选出代表性序列进行功能验证：(1)4-1BB抗原结合能力检测；(2)细胞表面抗原结合能力检测；(3)T细胞活化能力检测。本发明设计的抗4-1BB纳米抗体以CD3-Fab为骨架，因此抗体功能验证实验以CD3-Fab作为阴性对照。本发明设计的抗4-1BB纳米抗体有较好的4-1BB抗原结合能力、细胞表面抗原结合能力以及对人PBMC细胞的活化能力，并且与CD3-Fab阴性对照组有明显差异。
以上实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
序列表
<110> 北京大学深圳研究生院
<120> 一种抗4-1BB纳米抗体、编码基因及应用
<130>
<160> 72
<210> 1
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Ile Ser Ser Leu
20 25 30
Arg Val Ile Ala Trp Tyr Arg Gln Gly Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu
35 40 45
Val Ala Trp Ile Ala Trp Asp Asp Ile Ala His Tyr Val Asp Ser Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Ile Trp Arg Asp Asn Thr Lys Lys Thr Thr Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Leu Glu Asp Thr Asp Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Ser Gly Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 2
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Asn Ile Phe Ser Ile
20 25 30
Arg Val Met Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu
35 40 45
Val Ala Trp Phe Ala Trp Asp Asn Ile Ala His Tyr Ala Asp Ser Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Lys Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Leu Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Ser Gly Asp Ser Trp Gly Pro Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 3
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Met Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ile Phe Ser Ser
20 25 30
Gln Pro Met Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu
35 40 45
Val Ala Trp Ile Ala Trp Asp Asn Ile Ala His Tyr Thr Asp Ser Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Lys Thr Thr Trp
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Leu Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Gly Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 4
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Met Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Ile Phe Ser Ile
20 25 30
Arg Val Trp Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu
35 40 45
Val Ala Trp Phe Ala Trp Asp Asn Ile Ala His Tyr Thr Asp Ser Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Lys Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Leu Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
<210> 5
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Met Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Asn Ile Phe Ser Ile
20 25 30
Arg Val Trp Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu
35 40 45
Val Ala Trp Phe Ala Trp Asp Asn Ile Ala His Tyr Thr Asp Ser Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Lys Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Leu Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
<210> 6
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Met Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Ile Phe Ser Ile
20 25 30
Arg Val Trp Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu
35 40 45
Val Ala Trp Phe Ala Trp Asp Asn Ile Ala His Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Lys Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Leu Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
<210> 7
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Met Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Ile Phe Ser Ile
20 25 30
Arg Val Trp Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu
35 40 45
Val Ala Trp Phe Ala Trp Asp Asn Ile Ala His Tyr Thr Asp Ser Ala
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
<210> 8
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Met Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Ile Phe Ser Ile
20 25 30
Arg Val Trp Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu
35 40 45
Val Ala Trp Phe Ala Trp Asp Asn Ile Ala His Tyr Thr Asn Ser Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Lys Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Leu Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
<210> 9
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Met Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Ile Phe Ser Ile
20 25 30
Arg Val Trp Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu
35 40 45
Val Ala Trp Phe Ala Trp Asp Asn Ile Ala His Tyr Thr Asp Ser Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Lys Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Leu Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
<210> 10
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 10
Met Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Ile Phe Ser Ile
20 25 30
Arg Val Trp Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu
35 40 45
Val Ala Trp Phe Ala Trp Asp Asn Ile Ala His Tyr Thr Asp Ser Ala
50 55 60
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100 105 110
<210> 11
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 11
Met Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Ile Phe Ser Ile
20 25 30
Arg Val Trp Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu
35 40 45
Val Ala Trp Phe Ala Trp Asp Asn Ile Ala His Tyr Thr Asp Ser Ala
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
<210> 12
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 12
Met Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Ile Phe Ser Ile
20 25 30
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50 55 60
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100 105 110
<210> 13
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 13
Met Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Ile Phe Asp Ile
20 25 30
Arg Ile Met Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu
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Val Ala Trp Ile Ala Trp Asp Asn Val Ala His Tyr Gly Asp Ser Ala
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
<210> 14
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 14
Met Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Ile Phe Ser Ile
20 25 30
Arg Val Met Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu
35 40 45
Val Ala Trp Phe Ala Trp Asp Asn Ile Ala His Tyr Ala Asp Ser Ala
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100 105 110
<210> 15
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 15
Met Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Ile Phe Ser Ile
20 25 30
Arg Val Met Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu
35 40 45
Val Ala Trp Ile Ala Trp Asp Asn Val Val His Tyr Gly Asp Ser Ala
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Leu Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
<210> 16
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 16
Met Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Ile Phe Asp Ile
20 25 30
Arg Val Ile Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Thr Gly Lys Gln Arg Glu Leu
35 40 45
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65 70 75 80
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<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 17
Met Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Ile Ser Ser Ile
20 25 30
Arg Val Ile Ser Trp Tyr Arg Gln Gly Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu
35 40 45
Val Ala Trp Ile Ala Trp Asp Asn Ile Ala His Tyr Val Asp Ser Ala
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
<210> 18
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 18
Met Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Ile Ser Ser Ile
20 25 30
Arg Val Ile Ser Trp Tyr Arg Gln Gly Ser Gly Lys Gln Arg Glu Leu
35 40 45
Val Ala Trp Phe Ala Trp Asp Asn Val Ala His Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
<210> 19
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 19
Met Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Ile Phe Asn Ile
20 25 30
Arg Val Arg Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu
35 40 45
Val Ala Trp Ile Ala Trp Asp Asn Val Ala His Tyr Ala Asp Ser Ala
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65 70 75 80
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100 105 110
<210> 20
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 20
Met Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Ile Phe Asn Ile
20 25 30
His Val Ser Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu
35 40 45
Val Ala Trp Ile Ala Trp Asp Asn Val Ala His Tyr Ala Asp Ser Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Asn Lys Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Asn Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
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<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 21
Met Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Ile Phe Ser Ile
20 25 30
His Val Ser Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu
35 40 45
Val Ala Trp Ile Ala Trp Asp Asn Val Ala His Tyr Ala Asp Ser Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Lys Thr Thr Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Leu Glu Asp Thr Ala Ala Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
<210> 22
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 22
Met Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Pro Gly Asn Ile Ser Ser Leu
20 25 30
Arg Val Ile Ala Trp Tyr Arg Gln Gly Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu
35 40 45
Val Ala Trp Ile Ala Trp Asp Asp Ile Ala His Tyr Val Asp Ser Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Ile Trp Arg Asp Asn Thr Lys Lys Thr Thr Tyr
65 70 75 80
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100 105 110
<210> 23
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 23
Met Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Ile Ser Ser Leu
20 25 30
His Val Ile Ala Trp Tyr Arg Gln Gly Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu
35 40 45
Val Ala Trp Ile Ala Trp Asp Asp Ile Ala His Tyr Val Asp Ser Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Ile Trp Arg Asp Asn Thr Lys Lys Thr Thr Tyr
65 70 75 80
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100 105 110
<210> 24
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 24
Met Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Ile Phe Ser Ile
20 25 30
Arg Val Ser Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu
35 40 45
Val Ala Trp Ile Ala Trp Asp Asn Ile Ala His Tyr Ala Asp Ser Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Lys Thr Ala Tyr
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
<210> 25
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 25
Met Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile
20 25 30
Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu
35 40 45
Val Ala Met Ile Asn Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val
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100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 26
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 26
Met Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile
20 25 30
Asn Arg Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu
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Val Ala Met Ile Asn Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val
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65 70 75 80
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Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 27
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 27
Met Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile
20 25 30
Tyr Ala Met Val Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Phe
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Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 28
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 28
Met Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile
20 25 30
Tyr Ala Met Val Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Phe
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50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Thr Tyr
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 29
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 29
Met Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile
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Val Ala Ser Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Thr Tyr
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100 105 110
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<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 30
Met Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser
20 25 30
Tyr Ala Ser Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ala Gly Ile Asn Ser Asp Ser Gly Arg Met Ser Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Gln
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Ile Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Thr His Ser Gly Trp Ser Arg Leu Asp Tyr Ile Arg Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 31
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 31
Met Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile
20 25 30
Tyr Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Val
35 40 45
Val Ala Leu Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Val Tyr Gly Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Ala Leu Gly Gly Trp Glu Asn Gly Lys Tyr Lys Tyr Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 32
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 32
Met Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Val Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser
20 25 30
Tyr Ala Val Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Pro Arg Glu Leu
35 40 45
Val Ala Val Ile Ser Ser Glu Gly Thr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Phe Gly Gly Arg Ser Ser Met Gly Thr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 33
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 33
Met Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser
20 25 30
Tyr Ala Val Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Pro Arg Glu Leu
35 40 45
Val Ala Val Ile Ser Ser Glu Gly Thr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Phe Gly Gly Arg Ser Ser Met Gly Thr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 34
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
ATGGCGGTGC AGCTGGTGGA GTCTGGGGGA GGCTTGGTGC AGCCTGGGGG GTCTCTGAGA 60
CTCTCCTGTG CAGCCTCTGG AAACATCAGC AGTTTACGTG TCATCGCCTG GTACCGCCAG 120
GGTCCAGGGA AGCAGCGCGA GTTGGTCGCA TGGATTGCCT GGGATGATAT AGCGCACTAT 180
GTAGACTCTG CGAAGGGCCG ATTCGCCATC TGGAGAGACA ATACCAAGAA AACGACGTAT 240
CTGCAAATGA ACAGCCTGAA ATTAGAGGAT ACGGATGTCT ATTACTGTAA TTCAGGGGAT 300
TCCTGGGGCC AGGGGACCCA GGTCACCGTC TCCTCA 336
<210> 35
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
ATGGCGGTGC AGCTGGTGGA GTCTGGGGGA GGCTTGGTGC AGCCTGGGGG GTCTCTGAGA 60
CTCTCCTGTG CAGTCTCTGG AAACATCTTC AGTATACGTG TCATGTCCTG GTACCGCCAG 120
GCTCCAGGGA AGCAGCGCGA GTTGGTCGCA TGGTTTGCCT GGGATAATAT AGCGCACTAT 180
GCAGACTCCG CGAAGGGCCG ATTCACCATC TCCAGAGACA ATACCAAGAA GACGTTGTAT 240
CTGCAAATGA ACAGCCTGAA ATTAGAGGAT ACGGCCGTCT ATTACTGTAA TTCCGGGGAT 300
TCCTGGGGCC CGGGGACCCA GGTCACCGTC TCCTCA 336
<210> 36
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
ATGGCGGTGC AGCTGGTGGA GTCTGGGGGA GGCTTGGTGC AGCCTGGGGG GTCTCTGAGA 60
CTCACCTGTG CAGCCTCTGG AGACATCTTC AGTAGCCAAC CCATGTCCTG GTACCGCCAG 120
GCTCCAGGGA AGCGGCGCGA CTTGGTCGCA TGGATTGCCT GGGATAATAT AGCGCACTAC 180
ACAGACTCCG CGAAGGGCCG ATTCACCATC TCCAGAGACA ATACCAAGAA GACGACGTGG 240
CTGCAAATGA ACAGCCTGAA ATTAGAGGAT ACGGCCGTCT ATTACTGTGC TTCCGGGGAT 300
TCCTGGGGCC AGGGGACCCA GGTCACCGTC TCCTCA 336
<210> 37
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
ATGGCGGTGC AGCTGGTGGA GTCTGGGGGA GGCTTGGTGC AGCCTGGGGG GTCTCTGAGA 60
CTCTCCTGTG CAGCCTCTGG AAACATCTTC AGTATACGTG TCTGGTCCTG GTACCGCCAG 120
GCTCCAGGGA AGCAGCGCGA GTTGGTCGCA TGGTTTGCCT GGGATAATAT AGCGCACTAT 180
ACAGACTCCG CGAAGGGCCG ATTCACCATC TCCAGAGACA ATACCAAGAA GACGCTGTAT 240
CTGCAAATGA ACAGCCTGAA ATTAGAGGAT ACGGCCGTCT ATTACTGTAA TTCCGAAGAT 300
TCCTGGGGCC AGGGGACCCA GGTCACCGTC TCCTCA 336
<210> 38
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
ATGGCGGTGC AGCTGGTGGA GTCTGGGGGA GGCTTGGTGC AGCCTGGGGG GTCTCTGAGA 60
CTCTCCTGTG TAGCCTCTGG AAACATCTTC AGTATACGTG TCTGGTCCTG GTACCGCCAG 120
GCTCCAGGGA AGCAGCGCGA GTTGGTCGCA TGGTTTGCCT GGGATAATAT AGCGCACTAT 180
ACAGACTCCG CGAAGGGCCG ATTCACCATC TCCAGAGACA ATACCAAGAA GACGCTGTAT 240
CTGCAAATGA ACAGCCTGAA ATTAGAGGAT ACGGCCGTCT ATTACTGTAA TTCCGAAGAT 300
TCCTGGGGCC AGGGGACCCA GGTCACCGTC TCCTCA 336
<210> 39
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
ATGGCGGTGC AGCTGGTGGA GTCTGGGGGA GGCTTGGTGC AGCCTGGGGG GTCTCTGAGA 60
CTCTCCTGTG CAGCCTCTGG AAACATCTTC AGTATACGTG TCTGGTCCTG GTACCGCCAG 120
GCTCCAGGGA AGCAGCGCGA GTTGGTCGCA TGGTTTGCCT GGGATAATAT AGCGCACTAT 180
ACAGACTCCG TGAAGGGCCG ATTCACCATC TCCAGAGACA ATACCAAGAA GACGCTGTAT 240
CTGCAAATGA ACAGCCTGAA ATTAGAGGAT ACGGCCGTCT ATTACTGTAA TTCCGAAGAT 300
TCCTGGGGCC AGGGGACCCA GGTCACCGTC TCCTCA 336
<210> 40
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
ATGGCGGTGC AGCTGGTGGA GTCTGGGGGA GGCTTGGTGC AGCCTGGGGG GTCTCTGAGA 60
CTCTCCTGTG CAGCCTCTGG AAACATCTTC AGTATACGTG TCTGGTCCTG GTACCGCCAG 120
GCTCCAGGGA AGCAGCGCGA GTTGGTCGCA TGGTTTGCCT GGGATAATAT AGCGCACTAT 180
ACAGACTCCG CGAAGGGCCG ATTCGCCATC TCCAGAGACA ATACCAAGAA GACGCTGTAT 240
CTGCAAATGA ACAGCCTGAA ATTAGAGGAT ACGGCCGTCT ATTACTGTAA TTCCGAAGAT 300
TCCTGGGGCC AGGGGACCCA GGTCACCGTC TCCTCA 336
<210> 41
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
ATGGCGGTGC AGCTGGTGGA GTCTGGGGGA GGCTTGGTGC AGCCTGGGGG GTCTCTGAGA 60
CTCTCCTGTG CAGCCTCTGG AAACATCTTC AGTATACGTG TCTGGTCCTG GTACCGCCAG 120
GCTCCAGGGA AGCAGCGCGA GTTGGTCGCA TGGTTTGCCT GGGATAATAT AGCGCACTAT 180
ACAAACTCCG CGAAGGGCCG ATTCACCATC TCCAGAGACA ATACCAAGAA GACGCTGTAT 240
CTGCAAATGA ACAGCCTGAA ATTAGAGGAT ACGGCCGTCT ATTACTGTAA TTCCGAAGAT 300
TCCTGGGGCC AGGGGACCCA GGTCACCGTC TCCTCA 336
<210> 42
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
ATGGCGGTGC AGCTGGTGGA GTCTGGGGGA GGCTTGGTGC AGCCTGGGGG GTCTCTGAGA 60
CTCTCCTGTG CAGCCTCTGG AAACATCTTC AGTATACGTG TCTGGTCCTG GTACCGCCAG 120
GCTCCAGGGA AGCAGCGCGA GTTGGTCGCA TGGTTTGCCT GGGATAATAT AGCGCACTAT 180
ACAGACTCCG CGAAGGGCCG ATTCACCATC TCCAGAGACA ATACCAAGAA GACGCTGTAT 240
CTGCAAATGG ACAGCCTGAA ATTAGAGGAT ACGGCCGTCT ATTACTGTAA TTCCGAAGAT 300
TCCTGGGGCC AGGGGACCCA GGTCACCGTC TCCTCA 336
<210> 43
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
ATGGCGGTGC AGCTGGTGGA GTCTGGGGGA GGCTTGGTGC AGCCTGGGGG GTCTCTGAGA 60
CTCTCCTGTG CAGCCTCTGG AAACATCTTC AGTATACGTG TCTGGTCCTG GTACCGCCAG 120
GCTCCAGGGA AGCAGCGCGA GTTGGTCGCA TGGTTTGCCT GGGATAATAT AGCGCACTAT 180
ACAGACTCCG CGAAGGGCCG ATCCACCATC TCCAGAGACA ATACCAAGAA GACGCTGTAT 240
CTGCAAATGA ACAGCCTGAA ATTAGAGGAT ACGGCCGTCT ATTACTGTAA TTCCGAAGAT 300
TCCTGGGGCC AGGGGACCCA GGTCACCGTC TCCTCA 336
<210> 44
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
ATGGCGGTGC AGCTGGTGGA GTCTGGGGGA GGCTTGGTGC AGCCTGGGGG GTCTCTGAGA 60
CTCTCCTGTG CAGCCTCTGG AAACATCTTC AGTATACGTG TCTGGTCCTG GTACCGCCAG 120
GCTCCAGGGA AGCAGCGCGA GTTGGTCGCA TGGTTTGCCT GGGATAATAT AGCGCACTAT 180
ACAGACTCCG CGAAGGGCCG ATTCACCATC TCCAGAGACA ATACCAAGAA GACGCTGTAT 240
CTGCAAGTGA ACAGCCTGAA ATTAGAGGAT ACGGCCGTCT ATTACTGTAA TTCCGAAGAT 300
TCCTGGGGCC AGGGGACCCA GGTCACCGTC TCCTCA 336
<210> 45
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
ATGGCGGTGC AGCTGGTGGA GTCTGGGGGA GGCTTGGTGC AGCCTGGGGG GTCTCTGAGA 60
CTCTCCTGTG CAGCCTCTGG AAACATCTTC AGTATACGTG TCTGGTCCTG GTACCGCCAG 120
GCTCCAGGGA AGCAGCGCGA GTTGGTCGCA TGGTTTGCCT GGGATAATAT AGCGCACTAT 180
ACAGACTCCG CGAAGGGCCG ATTCACCATC TCCAGAGACA ATACCAAGAA GACGATGTAT 240
CTGCAAATGA ACAGCCTGAA ATTAGAGGAT ACGGCCGTCT ATTATTGTAA TTCCGGAGAT 300
TCCTGGGGCC AGGGGACCCA GGTCACCGTC TCCTCA 336
<210> 46
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
ATGGCGGTGC AGCTGGTGGA GTCTGGGGGA GGCTTGGTGC AGCCTGGGGG GTCTCTGAGA 60
CTCTCCTGTG CAGCCTCTGG AAACATCTTC GATATACGTA TCATGTCCTG GTACCGCCAG 120
GCTCCAGGGA AGCAGCGCGA CTTGGTCGCA TGGATTGCCT GGGATAATGT AGCGCACTAT 180
GGAGACTCCG CGAAGGGCCG ATTCACCATC TCCAGAGACA ATACCAAGAA GACGTGGTAT 240
CTGCAAATGA ACAGCCTGAA GTTAGAGGAT ACGGCCGTCT ATTACTGTAA TTCCGGGGAT 300
TCCTGGGGCC AGGGGACCCA GGTCACCGTC TCCTCA 336
<210> 47
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
ATGGCGGTGC AGCTGGTGGA GTCTGGGGGA GGCTTGGTGC AGCCTGGGGG GTCTCTGAGA 60
CTCTCCTGTG CAGCCTCTGG AAACATCTTC AGTATACGTG TCATGTCCTG GTACCGCCAG 120
GCTCCAGGGA AGCAGCGCGA GTTGGTCGCA TGGTTTGCCT GGGATAATAT AGCGCACTAT 180
GCAGACTCCG CGAAGGGCCG ATTCACCATC TCCAGAGACA ATACCAAGAA GACGTTGTAT 240
CTGCAAATGA ACAGCCTGAA ATTAGAGGAT ACGGCCGTCT ATTACTGTAA TTCCGGGGAT 300
TCCTGGGGCC CGGGGACCCA GGTCACCGTC TCCTCA 336
<210> 48
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
ATGGCGGTGC AGCTGGTGGA GTCTGGGGGA GGCTTGGTGC AGCCTGGGGG GTCTCTGAGA 60
CTCTCCTGTG CAGCCTCTGG AAACATCTTC AGTATACGTG TCATGTCCTG GTACCGCCAG 120
GCTCCAGGGA AGCAGCGCGA GTTGGTCGCA TGGATTGCCT GGGATAACGT AGTGCACTAT 180
GGAGACTCTG CGAAGGGCCG ATTCACCATG TCCAGAGACA ATACCAAGAA GACGGCGTAT 240
CTGCAAATGA ACAGTCTGAA ATTAGAGGAT ACGGCCGTCT ATTACTGTAA TTCCGGGGAT 300
TCCTGGGGCC AGGGGACCCA GGTCACCGTC TCCTCA 336
<210> 49
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
ATGGCGGTGC AGCTGGTGGA GTCTGGGGGA GGCTTGGTGC AGCCTGGGGG GTCTCTGAGA 60
CTCTCCTGTG CAGCCTCTGG AAACATCTTC GATATACGTG TCATCTCCTG GTACCGCCAG 120
GCTACAGGGA AGCAGCGCGA GTTGGTCGCA TGGATTGCCT GGGATAATGT AGCGCACTAT 180
GTAGACTCCG CGAAGGGCCG ATTCACCATC TCCAGAGACA ATACCAAGAA GACGACGTAT 240
CTGCAAATGA ACAGCCTGAA ATTAGAGGAT ACGGCCGTCT ATTATTGTAA TTCCGGGGAT 300
TCCTGGGGCC AGGGGACCCA GGTCACCGTC TCCTCA 336
<210> 50
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
ATGGCGGTGC AGCTGGTGGA GTCTGGGGGA GGCTTGGTGC AGCCTGGGGG GTCTCTGAGA 60
CTCTCCTGTG CAGCCTCTGG AAACATCAGC AGTATACGTG TCATCTCCTG GTACCGCCAG 120
GGTCCAGGGA AGCAGCGCGA GTTGGTCGCA TGGATTGCCT GGGATAATAT AGCGCACTAT 180
GTAGACTCTG CGAAGGGCCG ATTCACCATC TCCAGAGACA ATACCAAGAA GACGACGTAT 240
CTGCAAATGA ACAGCCTGAA ATTAGAGGAT ACGGATGTCT ATTACTGTAA TTCAGGGGAT 300
TCCTGGGGCC AGGGGACCCA GGTCACCGTC TCCTCA 336
<210> 51
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
ATGGCGGTGC AGCTGGTGGA GTCTGGGGGA GGCTTGGTGC AGCCTGGGGG GTCTCTGAGA 60
CTCTCCTGTG CAGCCTCTGG AAACATCAGC AGTATACGTG TCATCTCCTG GTACCGCCAG 120
GGTTCAGGGA AGCAGCGCGA GTTGGTCGCA TGGTTTGCCT GGGATAATGT AGCGCACTAT 180
GTAGACTCTG TGAAGGGCCG ATTCACCATC TCCAGAGACA ATACCAAGAA GACGACGTAT 240
CTGCAAATGA ACAGCCTGAA ATTAGAGGAT ACGGATGTCT ATTACTGTAA TTCAGGGGAT 300
TCCTGGGGCC AGGGGACCCA GGTCACCGTC TCCTCA 336
<210> 52
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
ATGGCGGTGC AGCTGGTGGA GTCTGGGGGA GGCTTGGTGC AGCCTGGGGG GTCTCTGAGA 60
CTCTCCTGTG CAGCCTCTGG AAACATCTTC AATATACGTG TCAGGTCCTG GTACCGCCAG 120
GCTCCAGGGA AGCAGCGCGA GTTGGTCGCA TGGATTGCCT GGGATAATGT AGCGCACTAT 180
GCAGACTCCG CGAAGGGCCG ATTCACCATC TCCAGAGACA ATACCAAGAA GACGATGTAT 240
CTGCAAATGA ACAGCCTGAA ATTAGAGGAT ACGGCCGTCT ATTACTGTAA TTCCGAAGAT 300
TCCTGGGGCC AGGGGACCCA GGTCACCGTC TCCTCA 336
<210> 53
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
ATGGCGGTGC AGCTGGTGGA GTCTGGGGGA GGCTCGGTGC AGCCTGGGGG GTCTCTGAGA 60
CTCTCCTGTG CAGCCTCTGG AAACATCTTC AATATACATG TCAGCGCCTG GTACCGCCAG 120
GCTCCAGGGA AGCAGCGCGA GTTGGTCGCA TGGATTGCCT GGGATAATGT AGCGCACTAT 180
GCAGACTCCG CGAAGGGCCG ATTCACCATC TCCAGAGACA ATACCAACAA GACGGCGTAT 240
CTGCAAATGA ACAGCCTGAA CGTAGAGGAT ACGGCCGTCT ATTACTGTAA TTCCGGGGAT 300
ATTTGGGGCC AGGGGACCCA GGTCACCGTC TCCTCA 336
<210> 54
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
ATGGCGGTGC AGCTGGTGGA GTCTGGGGGA GGGTTGGTGC AGCCTGGGGG GTCCCTGAGA 60
CTCTCCTGTG CAGCCTCTGG AAATATCTTC AGTATACATG TCAGCGCCTG GTACCGCCAG 120
GCTCCAGGGA AGCAGCGCGA GTTGGTCGCA TGGATTGCCT GGGATAATGT AGCGCACTAT 180
GCAGACTCCG CGAAGGGCCG ATTCACCATC TCCAGAGACA ATACCAAGAA GACGACGTAT 240
CTGCAAATGA ACAGTTTGAA ATTAGAGGAT ACGGCCGCAT ATTACTGTAA TTCCGGGGAT 300
TTTTGGGGCC AGGGGACCCA GGTCACCGTC TCCTCA 336
<210> 55
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
ATGGCGGTGC AGCTGGTGGA GTCTGGGGGA GGCTTGGTGC AGCCTGGGGG GTCTCTGAGA 60
CTCTCCTGTG CAGCCCCTGG AAACATCAGC AGTTTACGTG TCATCGCCTG GTACCGCCAG 120
GGTCCAGGGA AGCAGCGCGA GTTGGTCGCA TGGATTGCCT GGGATGATAT AGCGCACTAT 180
GTAGACTCTG CGAAGGGCCG ATTCGCCATC TGGAGAGACA ATACCAAGAA AACGACGTAT 240
CTGCAAATGA ACAGCCTGAA ATTAGAGGAT ACGGATGTCT ATTACTGTAA TTCAGGGGAT 300
TCCTGGGGCC AGGGGACCCA GGTCACCGTC TCCTCA 336
<210> 56
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
ATGGCGGTGC AGCTGGTGGA GTCTGGGGGA GGCTTGGTGC AGTCTGGGGG GTCTCTGAGA 60
CTCTCCTGTG CAGCCTCTGG AAACATCAGC AGTTTACATG TCATCGCCTG GTACCGCCAG 120
GGTCCAGGGA AGCAGCGCGA GTTGGTCGCA TGGATTGCCT GGGATGATAT AGCGCACTAT 180
GTAGACTCTG CGAAGGGCCG ATTCGCCATC TGGAGAGACA ATACCAAGAA AACGACGTAT 240
CTGCAAATGA ACAGCCTGAA ATTAGAGGAT ACGGATGTCT ATTACTGTAA TTCAGGGGAT 300
TCCTGGGGCC AGGGGACCCA GGTCACCGTC TCCTCA 336
<210> 57
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 57
ATGGCGGTGC AGCTGGTGGA GTCTGGGGGA GGCTTGGTGC AGCCTGGGGG GTCTCTGAGA 60
CTCTCCTGTG CAGCCTCTGG AAACATCTTC AGTATACGTG TCAGCGCCTG GTACCGCCAG 120
GCTCCAGGGA AGCAGCGCGA GTTGGTCGCA TGGATTGCCT GGGATAATAT AGCGCACTAT 180
GCAGACTCCG CGAAGGGCCG ATTCACCATC TCCAGAGACA ATACCAAGAA GACGGCGTAT 240
CTGCAAATGA ACAGCCTGAA ATTAGAGGAT ACGGCCGTCT ATTACTGTAA TTCCGGGGAT 300
TCCTGGGGCC AGGGGACCCA GGTCACCGTC TCCTCA 336
<210> 58
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 58
ATGGCGGTGC AGCTGGTGGA GTCTGGGGGA GGCTTGGTGC AGCCTGGGGG GTCTCTGAGA 60
CTCTCCTGTG CAGCCTCTGG AAGCATCTTC AGTATCGATC GCATGGGCTG GTACCGCCAG 120
GCTCCAGGGA AGCAGCGCGA GTTGGTCGCA ATGATTAATA GTAGTGGTGG CACATACTAT 180
CTAGACTCCG TGAAGGGCCG ATTCACCATC TCCAGAGACA ACGCCAAGAT TGCGATGTAT 240
CTGCAAATGA ACAGCCTGAA ATCTGAGGAC ACGGCCGTCT ATTATTGCCA TTATTGGATA 300
TCACACGAAA TGAACTACTG GGGCAAAGGG ACCCAGGTCA CCGTCTCCTC A 351
<210> 59
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 59
ATGGCGGTGC AGCTGGTGGA GTCTGGGGGA GGCTTGGTGC AGCCTGGGGG GTCTCTGAGA 60
CTCTCCTGTG CAGCCTCTGG AAGCATCTTC AGTATCAATC GCATGGGCTG GTACCGCCAG 120
GCTCCAGGGA AGCAGCGCGA GTTGGTCGCA ATGATTAATA GTAGTGGTGG CACATATTAT 180
GTAGACTCCG TGAAGGGCCG ATTCACCATC TCCAGAGACA ACGCCAAGAT TGCGATTGAT 240
CTGCAAACGA ACAGCCTGAA ACCTGAGGAC ACGGCCGTCT ATTATTGTCA TTGTTGGGTA 300
TCACACGAAA TGAACTACTG GGGCAAAGGG ACCCAGGTCA CCGTCTCCTC A 351
<210> 60
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 60
ATGGCGGTGC AGCTGGTGGA GTCTGGGGGA GGCTTGGTGC AGCCTGGGGG GTCTCTGAGA 60
CTCTCCTGTG CAGCCTCTGG AAGCATCTTC AGTATCTATG CCATGGTCTG GTACCGCCAG 120
GCTCCAGGGA AGCAGCGCGA CTTCGTCGCA TCTATTACTA GTGGTGGTAG CACAATCTAT 180
GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ATTCACCATC TCCAGAGACA ACGCCAAGAA CACGACATAT 240
CTGCAAATGA ACAGCCTGAA ACCTGAGGAC ACGGCCGTCT ATTACTGTAA TTCCTTAGGT 300
AGCTGGGATG GAGAGAGATA TGAGTATGAC TACTGGGGCC AGGGGACCCA GGTCACCGTC 360
TCCTCA 366
<210> 61
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 61
ATGGCGGTGC AGCTGGTGGA GTCTGGGGGA GGCTTGGTGC AGCCTGGGGG GTCTCTGAGA 60
CTCTCCTGTG CAGCCTCTGG AAGCATCTTC AGTATCTATG CCATGGTCTG GTACCGCCAG 120
GCTCCAGGGA AGCAGCGCGA CTTCGTCGCA TCTATTACTA GTGGTGGTAG CACAATCTAT 180
GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ATTCACCATC TCCAGAGACA ACGCCAAGAA CACGACATAT 240
CTGCAAATGA ACAGCCTGAA ACCTGAGGAC ACGGCCGTCT ATCACTGTAA TTCCTTAGGT 300
AGCTGGGATG GAGAGAGATA TGAGTATGAC TACTGGGGCC AGGGGACCCA GGTCACCGTC 360
TCCTCA 366
<210> 62
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 62
ATGGCGGTGC AGCTGGTGGA GTCTGGGGGA GGCTTGGTGC AGCCTGGGGG GTCTCTGAGA 60
CTCTCCTGTG CAGCCTCTGG AAGCATCTTC AGTATCTATG CCATGGCCTG GTACCGCCAG 120
GCTCCAGGGA AGCAGCGCGA CTTCGTCGCA TCTATTACTA GTGGTGGTAG CACAATCTAT 180
GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ATTCACCATC TCCAGAGACA ACGCCAAGAA CACGACATAT 240
CTGCAAATGA ACAGCCTGAA ACCTGAGGAC ACGGCCGTCT ATTACTGTAA TTCCTTAGGT 300
AGCTGGGATG GAGAGAGATA TGAGTATGAC TACTGGGGCC AGGGGACCCA GGTCACCGTC 360
TCCTCA 366
<210> 63
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 63
ATGGCGGTGC AGCTGGTGGA GTCTGGGGGA GGCTTGGTGC AGCCTGGGGG GTCTCTGAGA 60
CTCTCCTGTG CAGCCTCTGG ATTCACCTTC AGTAGCTATG CCTCGAGCTG GGTCCGCCAG 120
GCTCCAGGGA AGGGGCTCGA GTGGGTCGCA GGTATTAATA GTGATAGTGG TAGGATGAGC 180
TATGCAGACT CCGTGAAGGG CCGATTCACC ATCTCCAGAG ACAACGCCAA GAACACGCAG 240
TATTTACAAA TGATCAGCCT GAAATCTGAG GACACGGCCG TGTATTACTG TGCGACACAT 300
TCGGGCTGGT CCCGCCTAGA TTATATTCGC TACTGGGGCC AGGGGACCCA GGTCACCGTC 360
TCCTCA 366
<210> 64
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 64
ATGGCGGTGC AGCTGGTGGA GTCTGGGGGA GGCTTGGTGC AGCCTGGGGG GTCTCTGAGA 60
CTCTCCTGTG CAGCCTCTGG AAGCATCTTC AGTATCTATG CCATGGGCTG GTACCGCCAG 120
GCTCCAGGGA AGCAGCGTGA GGTGGTCGCA CTCATTACTA GTGGTGGTAG CACAGTCTAT 180
GGAGACTCCG TGAAGGGCCG ATTCACCATC TCCAGAGACA ACGCCAAGAA CACGGTGTAT 240
CTACAAATGA ACAGCCTGAA ACCTGAGGAC ACGGCCGTCT ATTACTGTAA TGCGTTGGGG 300
GGGTGGGAGA ATGGTAAATA CAAGTATGAC TATTGGGGCC AGGGGACCCA GGTCACCGTC 360
TCCTCA 366
<210> 65
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 65
ATGGCGGTGC AGCTGGTGGA GTCTGGGGGA GGCTTGGTTC AGCCTGGGGG GTCTGTGAGA 60
CTCTCCTGTG CAGCCTCTGG AAGCATCTTC AGTAGTTATG CCGTGGCCTG GTACCGCCAG 120
GCTCCAGGGA AGCCTCGCGA GTTGGTCGCA GTTATTAGTA GTGAAGGTAC CACACGCTAT 180
GCAGATTCCG TGAAGGGCCG ATTCACCATC TCCAGAGACA ACGCCAAGAA CACGGTGTAC 240
CTGCAAATGA ACAGCCTGAA ACCTGAGGAC ACGGCCGTCT ATTACTGCTT TGGAGGTAGA 300
AGCTCCATGG GTACCTGGGG CCAGGGGACC CAGGTCACCG TCTCCTCA 348
<210> 66
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 66
ATGGCGGTGC AGCTGGTGGA GTCTGGGGGA GGCTTGGTGC AGCCTGGGGG GTCTCTAAGA 60
CTCTCCTGTG CAGCCTCTGG AAGCATCTTC AGTAGTTATG CCGTGGCCTG GTACCGCCAG 120
GCTCCAGGGA AGCCTCGCGA GTTGGTCGCA GTTATTAGTA GTGAAGGTAC CACACGCTAT 180
GCAGATTCCG TGAAGGGCCG ATTCACCATC TCCAGAGACA ACGCCAAGAA CACGGTGTAC 240
CTGCAAATGA ACAGCCTGAA ACCTGAGGAC ACGGCCGTCT ATTACTGCTT TGGAGGTAGA 300
AGCTCCATGG GTACCTGGGG CCAGGGGACC CAGGTCACCG TCTCCTCA 348
<210> 67
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 67
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Asp His Leu Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Lys Arg Thr
100 105 110
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
115 120 125
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
130 135 140
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
145 150 155 160
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
180 185 190
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
195 200 205
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 68
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 68
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 69
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 69
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
115 120 125
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
130 135 140
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
145 150 155 160
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
165 170 175
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
180 185 190
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
195 200 205
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
210 215 220
Pro Lys Ser Cys
225
<210> 70
<211> 651
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 70
CAAGCTGTTG TGACCCAAGA ACCGAGTCTG ACCGTGTCTC CGGGCGGCAC CGTTACGCTG 60
ACCTGTCGCT CCTCTACCGG CGCAGTCACC ACGAGCAACT ATGCAAATTG GGTGCAGCAA 120
AAACCGGATC ATCTGTTTCG TGGCCTGATT GGCGGTACGA ACAAACGTGC GCCGGGGACC 180
CCGGCACGTT TTTCGGGCAG CCTGCTGGGC GATAAAGCAG CACTGACCAT CAGTGGTGCG 240
CAGCCGGAAG ATGAAGCAGA ATATTACTGC GCTCTGTGGT ATAGCAACCT GTGGGTCTTT 300
GGCGGTGGCA CGAAACTGAC CGTTCTGAAA CGAACTGTGG CTGCACCATC TGTCTTCATC 360
TTCCCGCCAT CTGATGAGCA GTTGAAATCT GGAACTGCCT CTGTCGTGTG CCTGCTGAAT 420
AACTTCTATC CCAGAGAGGC CAAAGTACAG TGGAAGGTGG ATAACGCCCT CCAATCGGGT 480
AACTCCCAGG AGAGTGTCAC AGAGCAGGAC AGCAAGGACA GCACCTACAG CCTCAGCAGC 540
ACCCTGACGC TGAGCAAAGC AGACTACGAG AAACACAAAG TCTACGCCTG CGAAGTCACC 600
CATCAGGGCC TGTCCTCGCC CGTCACAAAG AGCTTCAACA GGGGAGAGTG T 651
<210> 71
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 71
GGTGGAGGCG GTTCAGGCGG AGGTGGCTCT GGCGGTGGCG GATCC 45
<210> 72
<211> 684
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 72
GAAGTCCAGC TGGTTGAATC TGGTGGCGGT CTGGTTCAAC CGGGCGGTTC GCTGAAACTG 60
AGCTGCGCAG CTTCTGGCTT TACGTTCAAC ACCTATGCGA TGAATTGGGT TCGCCAGGCC 120
TCAGGCAAAG GTCTGGAATG GGTCGCTCGT ATTCGCTCGA AATATAACAA TTACGCAACC 180
TATTACGCTG ATAGCGTGAA AGACCGTTTC ACCATCAGTC GCGATGACTC CAAAAACACG 240
CTGTATCTGC AAATGAATAG CCTGAAAACG GAAGATACCG CGGTCTATTA CTGCGTGCGT 300
CATGGCAACT TTGGTAATTC TTATGTGAGC TGGTTCGCCT ACTGGGGCCA GGGTACGCTG 360
GTTACCGTCA GCTCTGCTAG CACCAAGGGC CCATCGGTCT TCCCCCTGGC ACCCTCCTCC 420
AAGAGCACCT CTGGGGGCAC AGCGGCCCTG GGCTGCCTGG TCAAGGACTA CTTCCCCGAA 480
CCGGTGACGG TGTCGTGGAA CTCAGGCGCC CTGACCAGCG GCGTGCACAC CTTCCCGGCT 540
GTCCTACAGT CCTCAGGACT CTACTCCCTC AGCAGCGTGG TGACTGTGCC CTCTAGCAGC 600
TTGGGCACCC AGACCTACAT CTGCAACGTG AATCACAAGC CCAGCAACAC CAAGGTGGAC 660
AAGAAAGTTG AGCCCAAATC TTGT 684

Claims (8)

1.一种抗4-1BB纳米抗体，是如下a)或b)的蛋白：
a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b)在序列表中序列1的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与特异性识别4-1BB相关的由a)衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的抗4-1BB纳米抗体，其特征在于，所述由a)衍生的蛋白质为序列2-33所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
3.权利要求1所述抗4-1BB纳米抗体的编码基因。
4.根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因是如下1)或2)或3)的基因：
1)其核苷酸序列是序列表中序列34；
2)在严格条件下与序列34限定的DNA片段杂交且编码与特异性识别4-1BB相关蛋白的DNA分子；
3)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性，且编码与特异性识别4-1BB相关蛋白的DNA分子。
5.根据权利要求4所述的编码基因，其特征在于，2)或3)中的基因，其核苷酸序列是序列表中序列35-66。
6.含有权利要求3-5所述编码基因的重组表达载体。
7.包有权利要求3-5所述编码基因的重组菌株。
8.权利要求1或2所述抗4-1BB纳米抗体，在制备预防或治疗肿瘤、免疫缺陷疾病和感染性疾病等药物中的应用。
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