CN114588266A - Commd9对原发性bcs诊治功能产品应用及其药盒或试剂盒 - Google Patents

Commd9对原发性bcs诊治功能产品应用及其药盒或试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药产品技术领域，涉及COMMD9对原发性BCS诊治功能产品应用，具体为基于COMMD9基因罕见突变及其下游信号通路PI3K‑Akt对原发性布加综合征（Budd‑Chiari syndrome,BCS）诊断的应用及治疗功能产品。本发明研究通过对原发性BCS患者的血液样本行全外显深度测序，发现COMMD9基因发生了罕见突变，人脐静脉内皮细胞、人肝窦状腺内皮细胞和人脑微血管内皮细胞中COMMD9表达水平升高，且其功能与血管生长发育密切相关。COMMD9可通过下游PI3K‑Akt通路介导血管内皮细胞迁移和成管功能改变导致原发性BCS的发生，上述信号通路的研究有望为原发性BCS的诊断供理论基础和实验依据。

Description

COMMD9对原发性BCS诊治功能产品应用及其药盒或试剂盒
技术领域
本发明涉及医药产品技术领域，涉及COMMD9对原发性BCS诊治功能产品应用，更具体地，基于COMMD9及其下游信号通路PI3K-Akt对原发性布加综合征诊断的应用。
背景技术
布加综合征（Budd-Chiari syndrome, BCS）是我国较常见的一种肝脏血管病变，以肝静脉和 / 或其开口以上的下腔静脉狭窄、闭塞为特征，常引起消化道大出血、顽固性腹水、肝肾衰竭等严重并发症。按照病因，BCS分为原发性和继发性；根据病变部位，分为肝静脉型、下腔静脉型和混合型。我国BCS以原发性为主，其起病和进展隐匿，病变程度复杂。多数患者以严重并发症为主诉就诊，无法做到早诊断、早治疗，进一步增加了致命风险。在原发性BCS的致病机制方面，更是缺乏代表性研究成果。因此，探索原发性BCS的病因，研究其关键致病因素并阐明分子机制，同时建立高灵敏的早期检测手段，是改善原发性BCS预后的关键，也是肝脏领域研究的热点之一。
越来越多的研究表明BCS与基因突变密切相关。欧美国家报道最多的是JAK2基因V617F突变和CALR基因突变，两者约占发病人数的35%-50%。值得注意的是，我国原发性BCS患者并无CALR基因突变，JAK2基因的突变率也很低，约为2.4-4.7 %。上述研究表明，我国与欧美国家人群的原发性BCS在致病基因和病理机制方面存在明显差异。因此，依据国内大样本原发性BCS患者进行基因测序研究，找出我国原发性BCS的突变基因和致病机制显得至关重要，可为原发性BCS的临床筛查提供新的分子靶点，有望提高该疾病临床诊断的准确性。
COMMD9基因编码的蛋白质是“铜代谢Murr1结构域”蛋白家族成员，该家族蛋白主要参与炎症调控、铜代谢稳态、核内体分选、钠代谢平衡、肿瘤发生和缺氧调节等重要的细胞功能；也有研究表明，COMMD蛋白家族成员可参与泛素化蛋白质修饰；敲除Commd9小鼠具有胚胎致死性，且COMMD9可通过调控Notch通路介导的核内体分选引起小鼠主动脉和左心室发育异常，表明其功能与心脏、动脉血管系统发育密切相关。然而，现有研究和技术对于COMMD9在以静脉血管系统病变为主的原发性BCS发生发展中的精确作用机制还不明确，以至于缺乏与COMMD9可能相关的疾病的研究诊断手段。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术没有明确COMMD9在原发性BCS中的精确作用机制，通过研究原发性BCS和COMMD9的关系，明确了COMMD9基因的非同义突变比例更低和对其编码蛋白的功能丧失不耐受率分值更高，且COMMD9在血管内皮细胞迁移和成管中发挥重要作用，以期为原发性BCS的早期检测、诊断及预后提供新方法。
本发明的首要目的是提供COMMD9对原发性BCS诊治功能产品应用。
本发明的第二个目的是提供国内原发性BCS患者诊治的专用药盒或试剂盒。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
本发明首先提供一种COMMD9对原发性BCS诊治功能产品应用，所述功能产品含有敲低COMMD9的功能应用。
本发明在原发性BCS血液样本全外显深度测序中的突变基因研究中，发现COMMD9基因的罕见突变是原发性BCS的关键致病因素。
本发明进一步研究结果表明，COMMD9在人脐静脉内皮细胞（HUVEC）、人肝窦状腺内皮细胞（HHSEC）和人脑微血管内皮细胞（HBMEC）中的蛋白表达水平更高。
优选的，所述敲低COMMD9的功能应用包括敲低COMMD9使得脐静脉内皮细胞（HUVEC）和肝窦状腺内皮细胞（HHSEC）的迁移和成管能力显著减弱方面的功能。
优选的，所述敲低COMMD9的功能应用包括敲低commd9基因使得斑马鱼肠下静脉血管网新生血管减少和长度短缩方面的功能。
优选的，所述敲低COMMD9的功能应用包括脐静脉内皮细胞HUVEC中敲低COMMD9可引起PI3K-Akt信号通路的基因相应改变方面的功能。
此外，本发明还提供一种国内原发性BCS患者诊治的专用药盒或试剂盒，所述药盒或试剂盒包括专用于检测或敲低COMMD9的原发性BCS专用诊治物质。
具体的，上述原发性BCS专用诊治物质通过qPCR (A) 和蛋白免疫印迹 (B) 检测COMMD9表达水平。
具体的，上述原发性BCS专用诊治物质通过小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸敲低COMMD9。上述功能产品包括以下任一种：
（i）以COMMD9 / PI3K / Akt转录本为靶序列，且能够抑制COMMD9 / PI3K / Akt通路相关基因表达产物的表达或基因转录的小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸；
（ii）能表达或形成（i）中所述小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸构建体；
（iii）含有COMMD9 / PI3K / Akt互补序列，且能够在转入体内后形成抑制COMMD9/ PI3K / Akt基因表达产物的表达或基因转录的干扰分子的构建体；
（iv）抑制或敲除COMMD9 / PI3K / Akt基因序列后的免疫相关细胞、其分化细胞或构建体。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过对原发性BCS患者的血液样本行全外显深度测序，发现COMMD9基因发生了罕见突变，人脐静脉内皮细胞、人肝窦状腺内皮细胞和人脑微血管内皮细胞中COMMD9表达水平升高，且其功能与血管生长发育密切相关，改变commd9表达可引起斑马鱼肠系膜静脉血管网发育异常。COMMD9可通过下游PI3K-Akt通路介导血管内皮细胞迁移和成管功能改变导致原发性BCS的发生，上述信号通路的研究有望为原发性BCS的诊治提供理论基础和实验依据。
附图说明
图1全外显深度测序、数据质控和候选疾病相关基因筛选分析流程概述；
图2为运用主成分分析（PCA）和亲缘相关性分析（plink）对测序结果进行质控筛选。(A) 运用PCA方法筛除质量较差的基因突变序列数据，筛选出3个异常数值并将此离群结果剔除。(B) 运用plink方法筛除质量较差的基因突变序列数据，F系数数值分布评估杂合率后剔除18个个体的测序结果；
图3为运用罕见突变富集分析筛选原发性BCS血液样本全外显深度测序中的突变基因，结果显示有2037个基因具有罕见突变位点；
图4为运用STRING构建蛋白互作网络和ClusterOne挖掘基因簇方法筛选上述测序结果中发生罕见突变基因的功能作用，显示COMMD9基因高度保守，其罕见突变与生物学功能密切相关。(A) 运用STRING和2037个具有罕见突变位点的基因构建蛋白互作网络。(B)Cluster 2基因簇（红色框内）的功能丧失不耐受率（Probability of being loss-of-function intolerant, pLI）分值显著更高。(C) COMMD9是Cluster 2基因簇中的重要一员（红色框内）。(D) Cluster 2基因簇的非同义突变（Nonsynonymous mutations, NSM）比例更低，** p <0.01，Student’s t检验；
图5显示与血管平滑肌细胞（HASMC）和淋巴细胞（HLEC）相比，COMMD9在人脐静脉内皮细胞（HUVEC）、人肝窦状腺内皮细胞（HHSEC）和人脑微血管内皮细胞（HBMEC）中的蛋白表达水平更高 (A)，COMMD9在5种人类血管细胞中表达量的统计分析 (B)；
图6显示COMMD9靶向siRNA使COMMD9表达沉默。(A-B) 在用COMMD9靶向siRNA（siRNA-1, siRNA-1）或对照siRNA（siNC）瞬时转染的HUVEC细胞中，通过qPCR (A) 和蛋白免疫印迹 (B) 检测COMMD9表达水平。(C-D) 在用COMMD9靶向siRNA（siRNA-1, siRNA-1）或对照siRNA（siNC）瞬时转染的HHSEC细胞中，通过qPCR (C) 和蛋白免疫印迹 (D) 检测COMMD9表达水平，**** p <0.0001，Student’s t检验；
图7显示在HUVEC和HHSEC细胞中沉默COMMD9使其迁移和成管能力下降。(A-B) 敲低COMMD9抑制HUVEC和HHSEC细胞的迁移(A)，成功迁移的血管内皮细胞数量/比例的统计分析 (B)。(C-D) 敲低COMMD9抑制HUVEC细胞的成管 (C)，成管的血管内皮细胞管腔数量(No. meshes) 和伪足长度 (Tube length) 的统计分析 (D)。(E-F) 敲低COMMD9抑制HHSEC细胞的成管 (E)，成管的血管内皮细胞管腔数量 (No. meshes) 和伪足长度 (Tubelength) 的统计分析 (F)，* p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001，**** p <0.0001，Student’s t检验；
图8 Sanger测序显示斑马鱼受精卵经显微注射commd9-e3i3-MO后成功引起该基因的转录本第3外显子缺失突变，继而导致斑马鱼commd9表达沉默；
图9显示commd9低表达可导致斑马鱼肠下静脉血管网的新生血管抑制和长度缩短。(A-C) 碱性磷酸酶染色 (A) 和荧光成像 (B) 显示敲低commd9可导致斑马鱼肠下静脉血管网长度短缩，斑马鱼肠下静脉血管网长度统计 (C)。(D) 敲低commd9导致斑马鱼肠下静脉血管网长度短缩畸形比例呈浓度依赖性。(E-F) 敲低commd9的同时过表达其mRNA，对斑马鱼肠下静脉血管网长度短缩畸形起到挽救作用 (E)，斑马鱼肠下静脉血管网长度短缩畸形挽救比例统计 (F)，**** p <0.0001，Student’s t检验；
图10显示HUVEC细胞敲低COMMD9可引起PI3K-Akt信号通路的基因相应改变。(A-B)运用RNA-sequence分析筛选出HUVEC敲低COMMD9后的差异表达基因制作热图 (A) 和火山图 (B)，（|log 2 (FC)| value > 1.5 and P < 0.05）。(C) PI3K-Akt信号通路在KEGG通路富集分析中显著富集（红色框内）。(D) 在HUVEC细胞中敲低COMMD9后qPCR检测相关候选基因变化情况，* p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001，**** p <0.0001，Student’s t检验。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料，该研究得到了中山大学附属第五医院伦理委员会的批准，且所有患者都签署了知情同意书。
实施例1 COMMD9基因的罕见突变是原发性BCS的关键致病因素
1、实验过程
1.1、全外显子组文库制备和二代测序技术检测
血液样本采集自中山大学附属第五医院、徐州医科大学附属医院，其中包括696名健康人作为对照组，500名原发性BCS患者作为实验组，详细全外显深度测序、数据筛选质控和系统分析与疾病相关联的候选基因步骤可见图1。按照说明书操作，使用MagPure BuffyCoat DNA Midi KF试剂盒（Magen, 广州, 中国）从原发性BCS组和对照组患者的静脉血液样本（5 ml）中提取全基因组DNA。运用Segmentase（BGI, 深圳, 中国）对基因组DNA进行裁剪和片段化，生成长度为100-500bp的小DNA片段，经磁珠分选进一步富集得到长度为280-320bp的DNA片段。下一步，在上述DNA片段的末端3’端添加腺嘌呤以便将其连接到带有胸腺嘧啶的3’端相应适配器受体上，通过配体连接介导的聚合酶链式反应扩增DNA片段，并纯化后用于制备全外显子组文库。该文库运用MGIEasy Exome Capture V4 Probe Set（MGI, 深圳, 中国）进行微阵列杂交富集，然后行洗脱和捕获后扩增。最后，将上述文库产物置于Agilent 2100 Bioanalyzer分析仪中进行分析以确定富集水平，然后送至华大基因的MGIseq-2000平台仪器按“paired-end 100”测序策略行二代测序技术检测。
1.2、基因突变序列数据的筛选质控
按照相关数据库发布的筛选质控标准，参照人类基因组（hg19）相关基因序列，使用Burrows Wheeler Aligner调整测序结果数据，得到待分析的干净数据（clean reads）。下一步，运用picard工具去除PCR扩增产生的重复片段，重新设置局部插入和缺失突变的基因序列数据，校准基础质量分数，并用GATK HaplotypeCaller调整基因联合突变变异。其中，我们通过以下两种方法筛除质量较差的基因突变序列数据：（1）使用GATK工具包推荐的默认数据集和参数的变量质控分数重新校准（Variant Quality Score Recalibration（VQSR））方法进行筛选；（2）使用vcftools软件分析删除低质量测序结果和基因突变序列数据，相关参数设定如下：--remove-indels --remove-filtered-geno-all --minGQ 20 --minDP 30 --mac 3 --hwe 0.0001 --max-meanDP 500 --min-alleles 2 --max-alleles2。参数（max-missing-count）设定为总样本数的10 %，并去除10 %以上样本中缺失基因型的突变变异。
1.3、个体间的主成分和亲缘相关性分析
以1000个基因组数据库中汉族人群的所有遗传性基因突变位点为基础运用gcta64进行主成分分析（Principal component analysis, PCA），并将筛选标准定义为其第一和第二主成分的平均值在三个标准差以内。我们通过上述方法筛选出了3个异常数值并将此离群结果剔除（图2 A）。由于个体间的极端差异性（杂合率）可由DNA污染或高水平的近亲繁殖引起，为了减少上述因素对实验结果的分析造成误差，我们使用plink亲缘性分析计算数据的杂合率，并在进一步分析中保留F系数在总体人群平均值的三个标准差以内的样本。同时，plink亲缘性分析也被用来评估实验组和对照组个体间的相关性，通过将“rel-cutoff”定义为0.125，可删除具有一级和二级亲缘性的样本数据。上述筛选方法从原发性BCS组和对照组中剔除18个个体的测序结果（图2 B）。
1.4、单个突变变异和整个基因与疾病的关联性分析
我们从ESP6500、dbsnp414、1000个基因组东亚人群、Exome AggregationConsortium（ExAC）和Genome Aggregation Database（gnomAD）数据库中筛选出相关基因的罕见突变位点，将少数等位基因频率小于1 %的变异定义为罕见突变，并运用KGGseq软件检测基因的罕见突变与原发性BCS之间的相关性，我们将Bonferroni校正的外显子组范围显著性阈值定义为P值等于0.05 / (2 tests × 100252 variants)。
同时，使用SNP-set (Sequence) Kernel Association Test（SKAT）分析检测一组基因中罕见突变与二分类表型（表型性分类）之间的关联。SKAT分析使用KGGseq软件内置的SKAT模块进行，其中，软件的相关参数设定如下：--seq-mq 20 --seq-fs 60 --seq-qual30 --vcf-filter-in PASS,VQSRTrancheSNP95.00to97.00,VQSRTrancheSNP97.00to99.00--gty-qual 20.0 --gty-dp 30 --gty-af-ref 0.05 --gty-af-het 0.25 --gty-af-alt0.75 --hwe-case 0.01 --hwe-control 0.01 --db-gene refgene,gencode --db-scoredbnsfp,dbncfp_known --mendel-causing-predict best --regulatory-causing-predict all --db-filter 1kgeas201305,dbsnp141,ESP5400,exac.eas,gadexome.eas,gadgenome.eas --rare-allele-freq 0.01 --qqplot --var-assoc --skat-gene --phedisease1 --cov sex,age --skat-cutoff 2 --multiple-testing benfdr。我们将Bonferroni校正的外显子组范围显著性阈值定义为P值等于0.05 / (2 tests × 17427genes)。
我们进一步运用上述SKAT分析筛选出P值小于0.05的所有基因和Retrieval ofInteracting Genes / Proteins（STRING）数据库的检索工具建立与原发性BCS发病相关基因编码的蛋白-蛋白互作网络（PPI）。接着，利用ClusterOne算法将PPI网络分别分成不同的基因簇，并根据PPI网络的置信分数得出加权因子，其中，我们将上述基因簇的构建标准定义为至少包含5种蛋白质和其P值小于0.05。
1.5、基因簇的表达和功能分析
我们将从网络数据库中筛选出已报道的8个与BCS相关联的基因，和ExAC数据库中所有18225个可编码蛋白质的基因分别定义为1个基因簇，并计算根据ClusterOne算法得出的10个不同基因簇与上述2个基因簇中基因组的功能丧失不耐受率（Probabilities ofbeing intolerant to loss-of-function mutations, pLI），同时，运用Student’s t检验评估不同基因簇间的pLI值是否存在差异，并将P值小于0.05定义为具有显著统计学差异。另一方面，我们对上述不同基因簇中基因组的非同义突变（non-synonymous variants,NSV）和同义突变（synonymous variants, SV）比例进行分析比较，及用Fisher’s exact检验评估不同基因簇间的NSV / SV是否存在差异。其中，NSV为可导致氨基酸改变的核苷酸变异，包括剪接、缺失、移码、插入或错义突变。
下一步，我们运用网络在线工具“g: Profiler”进行Gene Ontology（GO）和KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）通路富集分析基因簇中基因组的潜在生物学功能，其中，将P值小于0.05定义为具有显著统计学差异。同时，我们用小鼠基因组信息学数据库（Mouse Genome Informatics database, MGI）探索基因簇中基因与机体生物学表型的相关性。
2、实验结果
2.1、发明人将基因的罕见突变定义为等位基因频率小于1 %的变异，并从ESP6500、dbsnp414、1000个基因组东亚人群、ExAC和gnomAD数据库中筛选相关基因的罕见突变。在原发性BCS血液样本全外显深度测序中，运用罕见突变富集分析筛选结果为，如图3所示，显示有2037个基因具有罕见突变，其中包含有83669个罕见突变位点。本发明研究发现，国内原发性BCS的发生与基因的罕见突变密切相关。
2.2、为了进一步研究基因罕见突变对于生物学功能的潜在影响，同时明确原发性BCS的关键致病基因，我们运用在原发性BCS组中发生罕见突变的2037个基因构建了蛋白-蛋白互作网络（PPI），结果显示原发性BCS组中包含有1692个功能蛋白及8923种相互作用联系（PPI富集P值小于0.0001）。并通过ClusterOne算法计算不同基因簇中基因组的功能丧失不耐受率（pLI）和非同义突变（NSV）比例，如图4所示，显示Cluster2中基因的pLI分值显著更高（P值小于0.05），且非同义突变比例更低（P值小于0.05）。上述结果显示Cluster2中的基因在突变变异和生物学进化中是保守的，其发挥的生物学功能作用非常重要。我们进一步检索小鼠基因组信息学数据库（MGI）发现Cluster2中的COMMD9基因与血管系统发育密切相关，考虑国内原发性BCS的关键致病因素是COMMD9基因的罕见突变。
实施例2 COMMD9在人脐静脉内皮细胞（HUVEC）、人肝窦状腺内皮细胞（HHSEC）和人脑微血管内皮细胞（HBMEC）中的蛋白表达水平更高
1、实验过程
蛋白质免疫印迹
使用RIPA裂解缓冲液和蛋白酶 / 磷酸酶抑制剂混合物制备全细胞裂解液。使用BCA测定法（Beyotime Biotechnology，上海，中国）测定蛋白质浓度。通过5-20 % SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质，并转移到PVDF膜上进行检测。本研究使用了以下一抗：抗COMMD9（bs-8180R；Bioss，北京，中国），抗β-actin（#4970；Cell Signaling Technology，MA，USA）的特异性抗体。
2、实验结果
图5给出了具体的测试统计结果，相对于血管平滑肌细胞（HASMC）和淋巴细胞（HLEC），脐静脉内皮细胞（HUVEC）、人肝窦状腺内皮细胞（HHSEC）和人脑微血管内皮细胞（HBMEC）中的COMMD9的蛋白表达水平明显更高。
实施例3 COMMD9靶向siRNA使COMMD9表达沉默
1、实验过程
1.1、构建siRNA和细胞转染
用购买自GeneCopoeia（Rockville，Maryland，USA）的小干扰RNA（siRNA）和Invitrogen（Carlsbad，California，USA）的转染试剂Lipofectamine®3000来转染细胞以建立COMMD9敲低的血管内皮细胞系，再通过qRT-PCR和蛋白质免疫印迹评估RNA干扰的效率。
1.2、荧光实时定量PCR
使用E.Z.N.A.®试剂盒提取了本研究中使用的细胞系总RNA，使用All-in-OneTMqPCR Mix（GeneCopoeiaTM，Rockville，Maryland，USA）进行荧光实时定量PCR分析基因表达。通过Bio-Rad CFX96进行检测，并使用Bio-Rad管理软件（Bio-Rad，Hercules，CA）进行分析。将基因表达水平用管家基因GAPDH的表达水平进行标准化，并且每个样品评估了三次。COMMD9（引物序列：Forward 5’-AGCTTTTCCAGTTCAGCCCTT-3’; Reverse 5’-AGGGTTTGTCTCCGCATAGG-3’）、GAPDH（引物序列：Forward 5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’;Reverse 5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’）引物购自GeneCopoeia Inc.（GeneCopoeiaTM，Rockville，Maryland，USA）。
余同实施例2。
2、实验结果
在用COMMD9靶向siRNA（siRNA-1, siRNA-1）或对照siRNA（siNC）瞬时转染的HUVEC细胞中，通过qPCR (图6 A) 和蛋白免疫印迹 (图6 B) 检测COMMD9表达水平。在用COMMD9靶向siRNA（siRNA-1, siRNA-1）或对照siRNA（siNC）瞬时转染的HHSEC细胞中，通过qPCR(图6 C) 和蛋白免疫印迹 (图6 D) 检测COMMD9表达水平，**** p <0.0001，Student’s t检验。
实施例4 沉默COMMD9使HUVEC和HHSEC细胞迁移和成管能力下降
1、实验过程
1.1、细胞迁移测定
用Transwell小室（Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ）进行细胞迁移实验。将含有2×104血管内皮细胞的300 ul无血清ECM细胞悬液接种在Transwell的上室中，并将700 ul含有10 % FBS的培养基添加到下室中。迁移穿过膜的细胞被固定并染色后，光学显微镜下随机计数三个视野。
1.2、细胞成管测定
取50 ul Matrigel胶铺于预冷的96孔板，厚约0.5 mm，置于37 ℃ CO2培养箱中作用1小时，待其凝固后备用。将培养的内皮细胞消化后以1×104 / 孔重悬于100 ul不含FBS的 ECM 培养基，并接种在上述96孔板。24小时后于光学显微镜下随机取3个视野，计数毛细血管管腔数和伪足长度。
余同实施例3。
2、实验结果
敲低COMMD9抑制HUVEC和HHSEC细胞的迁移 (图7 A)，成功迁移的血管内皮细胞数量/比例的统计分析 (图7 B)。
敲低COMMD9抑制HUVEC细胞的成管 (图7 C)，成管的血管内皮细胞管腔数量 (No.meshes) 和伪足长度 (Tube length) 的统计分析 (图7 D)。
敲低COMMD9抑制HHSEC细胞的成管 (图7 E)，成管的血管内皮细胞管腔数量 (No.meshes) 和伪足长度 (Tube length) 的统计分析 (图7 F)，* p <0.05，** p <0.01，***p <0.001，**** p <0.0001，Student’s t检验。
实施例5 commd9低表达可导致斑马鱼肠下静脉血管网的新生血管抑制和长度缩短
1、实验过程
1.1、斑马鱼胚胎中沉默commd9表达
在斑马鱼受精卵1-4胞期经压力注射器（PLI-100A Pico-liter Microinjector，Warner Instruments，USA）行显微注射（1 nl）购买自Gene Tools（Oregon，USA）的吗啉基修饰的寡核苷酸序列，用于阻断commd9 mRNA的剪接修饰，继而引起受精后36小时该基因的转录本第3外显子缺失突变以建立commd9敲低的斑马鱼。此外，显微注射上述吗啉基修饰的寡核苷酸序列和购买自Ribobio（广州，中国）的commd9基因体外转录mRNA，以观察能否挽回commd9低表达引起的斑马鱼血管表型改变。72小时后于激光共聚焦显微镜下观察斑马鱼幼虫的相应血管生长发育情况。其中，靶向commd9基因的吗啉基修饰的寡核苷酸序列：5’-TAGACTGAAGAGGCATCTACCTGTT-3’，对照组吗啉基修饰的寡核苷酸序列：5’-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA-3’；EGFP 特异性标记血管内皮细胞的转基因斑马鱼（fli1:EGFP）y1购买自中国斑马鱼中心（China Zebrafish Resource Center，CZRC）。
1.2、Sanger测序
使用TRIzol试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA）提纯经受精卵显微注射后48小时的斑马鱼幼虫的总RNA，使用HiScript II Reverse Transcriptase试剂（Vazyme，南京，中国）将RNA逆转录为单链cDNA。然后使用commd9特异性引物扩增进行Sanger测序分析，引物序列如下：Forward 5’-GCTCCGTCTAAAGATGCTGTTCGGC-3’; Reverse 5’-ACAGACAGGTTGGCACAGCCATACG-3’）。
1.3、斑马鱼肠下静脉血管网碱性磷酸酶染色
取经受精卵显微注射后72小时的斑马鱼幼虫，用4 %的多聚甲醛置于4 ℃冰箱中固定过夜，然后用甲醇置于-20 ℃冰箱中脱水处理2小时。下一步用蛋白酶K（10mg / ml）在室温下消化3分钟后，将幼虫置于4 %的多聚甲醛在室温下重新固定1小时。最后用购买自Solarbio（北京，中国）的碱性磷酸酶染色缓冲液在室温下孵育20分钟，经硝基四氮唑蓝 /5-溴-4-氯-3'-吲哚基磷酸盐（NBT / BCIP）染色20分钟后于光学显微镜下观察肠下静脉血管网生长发育情况。
1.4、斑马鱼血管生成观察和分析
取经受精卵显微注射后6小时的斑马鱼幼虫，用购买自Sigma Aldrich（MI，USA）的1-苯基-2-硫脲（PTU）孵育以抑制幼虫的色素沉着。72小时后，将上述幼虫固定在1 %的低熔点琼脂糖中，运用激光共聚焦显微镜观察斑马鱼幼虫的相应血管生长发育情况，及ImageJ软件检测计算其肠下静脉血管网长度。
2、实验结果
Sanger测序结果显示斑马鱼受精卵经显微注射吗啉基修饰的寡核苷酸序列后，成功引起commd9基因的转录本第3外显子缺失突变，继而建立commd9敲低的斑马鱼（图8）。
碱性磷酸酶染色 (图9 A) 和荧光成像 (图9 B) 显示敲低commd9可导致斑马鱼肠下静脉血管网长度短缩，斑马鱼肠下静脉血管网长度统计 (图9 C)。
(图9 D) 敲低commd9导致斑马鱼肠下静脉血管网长度短缩畸形比例呈浓度依赖性。
敲低commd9的同时过表达其mRNA，对斑马鱼肠下静脉血管网长度短缩畸形起到挽救作用 (图9 E)，斑马鱼肠下静脉血管网长度短缩畸形挽救比例统计 (图9 F)，**** p <0.0001，Student’s t检验。
实施例6 血管内皮细胞HUVEC敲低COMMD9引起PI3K-Akt信号通路的基因相应改变
1、实验过程
RNA测序（RNA-seq）
使用TRIzol试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA）提纯总细胞RNA。然后使用每组样品构建RNA-seq链特异性文库，并使用NuGEN Ovation RNA-Seq系统进行测序。将每个基因的计数标准化后导入FPKM（每百万碱基对转录片段的每千碱基碱基片段数）值。将|log2FC|≥ 1.5，倍数变化，* p <0.05定义为有表达差异，并分别使用阴性和载体对照进行标准化。从GO和KEGG通路数据库（https://david.ncifcrf.gov/）下载了生物过程基因本体的基因用于分析不同信号通路。
2、实验结果
运用RNA-sequence分析筛选出HUVEC敲低COMMD9后的差异表达基因制作热图 (图10 A) 和火山图 (图10 B)，（|log 2 (FC)| value > 1.5 and P < 0.05）。(图10 C)PI3K-Akt信号通路在GO和KEGG通路富集分析中显著富集（红色框内）。(图10 D) 在HUVEC细胞中敲低COMMD9后qPCR检测相关候选基因变化情况，* p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001，**** p <0.0001，Student’s t检验。

Claims (7)

1.一种COMMD9对原发性BCS诊治功能产品应用，所述功能产品含有敲低COMMD9的功能应用。
2.根据权利要求1所述的COMMD9对原发性BCS诊治功能产品应用，其特征在于，所述敲低COMMD9的功能应用包括敲低COMMD9使得脐静脉内皮细胞（HUVEC）和肝窦状腺内皮细胞（HHSEC）的迁移和成管能力显著减弱方面的功能。
3.根据权利要求1所述的COMMD9对原发性BCS诊治功能产品应用，其特征在于，所述敲低COMMD9的功能应用包括敲低commd9基因使得斑马鱼肠下静脉血管网新生血管减少和长度短缩方面的功能。
4.根据权利要求1所述的COMMD9对原发性BCS诊治功能产品应用，其特征在于，所述敲低COMMD9的功能应用包括脐静脉内皮细胞HUVEC中敲低COMMD9可引起PI3K-Akt信号通路的基因相应改变方面的功能。
5.一种国内原发性BCS患者诊治的专用药盒或试剂盒，其特征在于，应用如权利要求1～4任一项所述的COMMD9对原发性BCS诊治功能产品应用，所述药盒或试剂盒包括专用于检测或敲低COMMD9的原发性BCS专用诊治物质。
6.根据权利要求5所述的国内原发性BCS患者诊治的专用药盒或试剂盒，其特征在于，所述原发性BCS专用诊治物质通过qPCR (A) 和蛋白免疫印迹 (B) 检测COMMD9表达水平。
7.根据权利要求5所述的国内原发性BCS患者诊治的专用药盒或试剂盒，其特征在于，原发性BCS专用诊治物质通过小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸敲低COMMD9，包括以下任一种：
（i）以COMMD9 / PI3K / Akt转录本为靶序列，且能够抑制COMMD9 / PI3K / Akt通路相关基因表达产物的表达或基因转录的小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸；
（ii）能表达或形成（i）中所述小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸构建体；
（iii）含有COMMD9 / PI3K / Akt互补序列，且能够在转入体内后形成抑制COMMD9 /PI3K / Akt基因表达产物的表达或基因转录的干扰分子的构建体；
（iv）抑制或敲除COMMD9 / PI3K / Akt基因序列后的免疫相关细胞、其分化细胞或构建体。
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LAULUMAA.S,ET AL: "Commander Complex—A Multifaceted Operator in Intracellular Signaling and Cargo", 《CELLS》 *
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