CN114577885A - 一种检测重组组合抗体含量比例、电荷异质性和/或等电点的方法 - Google Patents

一种检测重组组合抗体含量比例、电荷异质性和/或等电点的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种检测重组组合抗体(MabPair)的含量比例、电荷异质性和/或等电点的方法，包括以下步骤：1)取重组组合抗体作为供试品；2)使用供试品配制用于全柱成像毛细管等电聚焦(iCIEF)检测的分析样品混合液，通过iCIEF系统进行检测，实时采集等电聚焦图谱；3)根据步骤2)中的等电聚焦图谱，计算待分析重组组合抗体中单抗的含量比例、电荷异质性和/或等电点。本发明所使用的方法具有检测效率高、分离效果好、重复性优、稳定性强、成本低等优点，并且可实现组合抗体中两个单抗的完全分离，适用于重组组合抗体的含量比例计算和质量控制。

Description

一种检测重组组合抗体含量比例、电荷异质性和/或等电点的 方法
技术领域
本发明属于生物制品分离分析领域，具体涉及一种全柱成像毛细管等电聚焦(iCIEF)测定重组组合抗体(MabPair)中两种单抗的含量比例、两种单抗各自电荷异质性和/或等电点(pI)的方法。
背景技术
近年来，随着DNA重组技术的成熟和快速发展以及工业化大规模细胞培养技术瓶颈的突破，重组蛋白类药物尤其治疗性单克隆抗体药物用于治疗肿瘤及自身免疫性疾病已成为生物医药领域研发的热点之一。
哺乳动物细胞表达的单抗产品多存在翻译后修饰现象，如糖基化修饰、脱氨基、脱酰胺、氧化、焦谷氨酸化等。重组单抗产品多属于糖蛋白，其糖基化和糖结构与其体内稳定性密切相关，关键位点的脱酰胺、氧化等翻译后修饰可能会影响产品的生物学活性。在生产过程中，宿主细胞、培养基组成、培养条件、培养环境和蛋白质结构以及分离纯化工艺都可能会影响重组单抗产品的多种翻译后修饰水平。
治疗性单抗类生物药物因多种翻译后修饰水平及糖基化的差异，产生多种电荷异质体，每种电荷异质体对重组单抗药物的理化性质和药理作用可能起到不同的作用。主要体现在重组组合单抗药物的电荷异质性及分布、稳定性、溶解性、免疫原性、体内外生物学活性、体内药代动力学等方面。
为保障重组组合抗体类生物药物临床治疗的有效性和稳定性，须评估产品的异质性，并将不同生产批次产品的异质性控制在合理的范围内，确保各种异质体的含量符合一定的标准，从而保证重组组合抗体类药物质量和产品疗效的一致性和均一性。
由于重组组合单抗药物异质体的分子量、分子结构非常接近，传统的电荷异质性分析方法，如平板凝胶等电聚焦方法无法有效区分微小差异的电荷异质体，因而不适用于分析组合抗体药物分子电荷异质体的组成和含量。
全柱成像毛细管等电聚焦电泳技术[Capillary Isoelectric Focusing-WholeColumn Imaging Detection，CIEF-WCID(iCIEF)]是一种将毛细管等电聚焦电泳与全柱成像技术相结合的新型等电聚焦系统，它结合了毛细管电泳自动分离检测、可定量分析和成像技术的双重优势。当样品进行等电聚焦时，CMOS或CCD作为成像检测技术，可以对整个聚焦分离通道聚焦过程进行实时监控和记录。这一过程中无须移动样品，直接进行检测。该方法使得分析结果不受敏感因素干扰，提高了重组组合抗体药物电荷异质性分析的准确性和稳定性。通常能在几分钟内完成测定，所需时间大大缩短，可实现高通量检测。
iCIEF是基于等电点的差异进行蛋白质分离的高分辨率分离技术。它通过将带有两性基团的样品、载体两性电解质和添加剂的混合物注入毛细管内，载体两性电解质在电场作用下在毛细管内从阳极到阴极端建立由小到大的均匀pH梯度，带不同电荷的蛋白异质体根据其等电点的不同在两性电解质pH梯度中进行迁移聚焦，当毛细管内载体两性电解质pH值与该组分的pI相同时，该组分的净电荷为零，溶质分子便完成聚焦不再迁移，形成明显的区带，使组合抗体样品中各电荷异质体组分得到有效聚焦分离。全柱聚焦过程采用紫外或荧光检测器实时监测，并进行电荷异质体定量分析。
全柱成像毛细管等电聚焦技术(iCIEF)克服了传统平板等电聚焦方法操作复杂、稳定性差、无法实现自动化和无法准确测定电荷异质体含量及等电点等缺点。iCIEF具有高效、快速、操作简单、分离精度高和定量分析能力强等优势。尽管应用iCIEF技术进行重组蛋白药物电荷异质性的研究有文献报道，但针对上述糖基化的MabPair组合抗体药物，应用iCIEF技术进行电荷异质性分析及质量控制的研究未见报道。MabPair与普通双抗和单抗相比，其质控更为复杂，MabPair含有2个不同的抗体分子组分，每一个抗体组分的电荷异质性均需进行质控，且组合抗体组分的含量也需进行质控。对分析方法和技术提出了更高的要求，分析方法需要对每一个抗体组分完全分离的同时，又要保障每个抗体组分的分离度。传统的分析技术如IEX-HPLC，HIC均不能实现MabPair中两个单抗组分同时进行电荷异质性、组分含量等多个指标的准确质控。
因此，针对MabPair类组合抗体开发高效、稳定、准确的iCIEF技术用于组合抗体的比例计算、电荷异质性快速评估、质量控制，是非常具有价值和应用前景的分析技术。
发明内容
鉴于传统的电荷异质性分析技术存在的缺陷，本发明提供了一种全柱成像毛细管等电聚焦法测定重组组合抗体(MabPair)的比例含量、电荷异质性及等电点的方法。以阴极为毛细管电泳仪器样品检测的入口端，以阳极为出口端；选择合适的等电点标记物，计算目标峰pI值；采用合适的积分软件(Empower等)进行图谱积分，得到组合抗体中各单抗比例含量及各单抗组分电荷异质性(酸区、主峰、碱区)。
具体地，本发明提供一种检测重组组合抗体的含量比例、电荷异质性和/或等电点的方法，其包括以下步骤：
1)取重组组合抗体作为供试品；
2)使用供试品配制用于全柱成像毛细管等电聚焦(iCIEF)检测的分析样品混合液，通过iCIEF系统进行检测，实时采集等电聚焦图谱；
3)根据步骤2)中的等电聚焦图谱，计算待分析重组组合抗体中单抗的含量比例、电荷异质性和/或等电点。
本发明中的重组组合抗体可以是由同一细胞株采用同一生产工艺生产，含有预定比例含量的两种单抗组合产物；优选地，所述分析样品混合液中组合抗体的蛋白终浓度为0.1-1mg/ml。
在一个具体实施方式中，重组组合抗体优选肿瘤治疗类单抗组合，特别是免疫治疗性单抗组合；具体优选含有预定比例的重组抗人PD-1抗体(简称aPD-1)和抗人CTLA-4单抗(简称aCTLA-4)的两种单克隆组合抗体(MabPair)。还可以优选恶性血液肿瘤治疗类单抗组合，具体优选含有预定比例的重组抗人CD20单抗(简称aCD20)和抗人CD37单抗(简称aCD37)的两种单克隆组合抗体(MabPair)，并均由同一细胞株采用同一生产工艺进行生产。
在一个具体实施方式中，在步骤1)中，若样品盐浓度较高影响检测结果，则需浓缩脱盐处理；具体地，若重组组合抗体样品处理后所含盐浓度>15mM，则进行超滤浓缩脱盐处理后作为供试品。
优选地，样品如需浓缩脱盐，浓缩柱为Millipore 10kDa超滤离心管，所述的浓缩蛋白溶液浓度为2-10mg/ml，优选10mg/ml(溶剂为PB缓冲液)。
在一个具体实施方式中，在步骤2)中，所述分析样品混合液包含供试品、载体两性电解质和凝胶载体基质；优选地，所述分析样品混合液还包含助溶剂和/或等电点标记物。
载体两性电解质是指包含多种既可充当酸又可充当碱的两性组分溶液。载体两性电解质pH梯度的形成及蛋白区带的聚焦受溶液中载体两性电解质物质浓度的影响。载体两性电解质浓度越高，毛细管柱内邻近位点之间的pH差异越小，使得pH梯度在使用高浓度两性电解质时更平稳。
在一个具体实施方式中，步骤2)中的载体两性电解质由一种或两种以上两性电解质组成，优选由两种两性电解质组成；更优选地，所述载体两性电解质由比例25％-75％的pH 3-10和比例75％-25％的pH 8-10.5两性电解质组成；更优选地，所述载体两性电解质在分析样品混合液中的体积含量为2％-5％。
优选地，所述载体两性电解质包括：AESlyte、Pharmalyte、Servalyt系列中的一种或多种，优选的所述载体两性电解质是Pharmalyte 8-10.5和Pharmalyte 3-10的两种组合；更优选地，Pharmalyte 8-10.5的体积比例为75％～10％、Pharmalyte 3-10的体积比为25％～90％。
进一步优选所述Pharmalyte 3-10的体积比为25％～75％，Pharmalyte 8-10.5的体积比例为75％～25％；进一步所述的Pharmalyte 3-10和Pharmalyte 8-10.5体积比为25％:75％、50％:50％或75％:25％，聚焦分离效果较佳。
本发明在分析两种单克隆组合抗体比例含量、电荷异质性及等电点时，使用不同pH范围PharmalyteTM组合的载体两性电解质，即Pharmalyte 8-10.5与Pharmalyte 3-10的组合物，较单独使用，不仅可以有效降低载体两性电解质成分自身280nm背景紫外吸收，还可以提高检测分析电荷异质体的分离度。从而有效提高检测重组组合抗体药物电荷异质性及等电点的灵敏度、分离度和稳定性。且Pharmalyte单一使用检测时，组合抗体中两种单抗样品各电荷异质体的分离效果不稳定，两种单抗不易完全分离，无法稳定准确进行电荷异质性评价和质控。
在一个具体实施方式中，步骤2)中的凝胶载体基质为甲基纤维素(MC)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)或葡聚糖中的一种或更多种，优选为羟丙基甲基纤维素，因其优良的分子性质和稳定性以及低紫外吸收；更优选地，所述凝胶载体基质在分析样品混合液中的体积含量为0.25％-0.45％。
在一个具体实施方式中，步骤2)中的助溶剂是尿素、甲酰胺、甘油、山梨醇、丙二醇、两性离子和中性表面活性剂中的一种或多种，优选为尿素；更优选地，所述助溶剂在分析样品混合液中的终浓度为0.5-4mol/L。
由于等电聚焦在100μm内径、有效长度5cm的毛细管中进行，聚焦体积极小使得聚焦过程蛋白异质体根据pI的不同而聚集局部浓度较高，同时聚焦结束时各异质体的pI与载体两性电解质的pH一致，电荷被中和，导致聚焦使得各异质体的溶解度下降，聚焦区带内容易发生蛋白聚集沉淀，致使电流中断，影响蛋白聚焦。并且由于蛋白沉淀会在聚焦过程中出现沉淀峰(极窄的高信号峰或尖峰)，影响样品的分离效果。因此，本发明在样品中加入一定浓度的助溶剂来提高组合抗体的溶解度和稳定性，避免聚焦过程中蛋白沉淀，提升等电聚焦检测的灵敏度和准确度。具体的，所述的助溶剂为尿素，且最佳尿素的浓度需通过优化评估选择，过高浓度会使蛋白质变性，过低浓度不能有效改善疏水和氢键作用力来增加蛋白的溶解度；优选的，所述的尿素是先用0.35％的HPMC溶解后形成的尿素溶液，尿素溶液加入到样品混合溶液中的终浓度为0.5-6mol/L，更优选的，所述尿素终浓度为1-4mol/L。
在一个具体实施方式中，步骤2)中的等电点标记物是已知pI的化学或多肽类小分子等电点标记物，优选范围为pI 4.0至pI 10.0；更优选pI 6.14和pI 6.61中的一种与pI9.46和pI 9.77中的一种组合使用；若采用荧光检测模式，将所述pI 9.46替换为pI 9.50。更优选地，样品混合液所用等电点标记物为pI 6.14和pI 9.46(荧光Mr对应9.50)。保证待检组合抗体样品各电荷异质体等电点位于Mr标示范围内，且使Mr有较好的线性，从而保证检测结果准确、稳定、可重复。
在一个具体实施方式中，在步骤2)中，所述分析样品混合液上样于等电聚焦毛细管中；优选地，所述等电聚焦毛细管为氟碳(FC)内涂层、内径100μm、有效分离长度5cm的卡盒或毛细管柱。优选地，包括毛细管Cartridge(ProteinSimple公司)和毛细管柱(AES公司)。
在一个具体实施方式中，在步骤2)中，将所述分析样品混合液上样于等电聚焦毛细管中，由自动进样器根据预设程序冲洗和活化毛细管并采用合适的方式进样。毛细管等电聚焦检测以阴极为样品检测的入口端、以阳极为出口端，阴极液为100mM NaOH(含0.1％HPMC)、阳极液为80mM H3PO4(含0.1％HPMC)。
在一个具体实施方式中，在步骤2)中，iCIEF分析样品处理后分析样品混合液中所含组合抗体蛋白终浓度为0.1-1mg/ml。更优选地，处理后样品混合液中组合抗体蛋白终浓度为0.5mg/ml。
在一个具体实施方式中，步骤2)中的毛细管温度为10-30℃。
在一个具体实施方式中，步骤2)中所采用的聚焦电压和时间为1.5kV维持1min然后3kV维持5-11min；优选1.5kV维持1min然后3kV维持6-7min。上述参数可使组合抗体各电荷异质体得到有效分离，且组合抗体中两种单抗组分完全分离。
在一个具体实施方式中，步骤2)中图谱检测采用紫外吸收检测器(检测波长280nm)或荧光检测器，优选地，光源为氘灯或者LED。
在一个具体实施方式中，在步骤3)中，检测组合抗体中各电荷异质体含量的方法，按色谱面积归一化法，计算组合抗体中两种单抗比例含量及两组单抗分别积分并分别报告两种单抗组分各自的主峰、酸区、碱区面积百分比。
在一个具体实施方式中，在步骤3)中，检测组合抗体中各电荷异质体及等电点的方法，分析软件以等电点Mr的pI值为标准作线性回归，根据样品的相对piexl值计算输出两种单抗各电荷异质体的pI值。
在本发明的另一方面，提供了不同占比的pH 8-10.5和pH 3-10载体两性电解质的组合物，待检供试品中添加适量的助溶剂溶液，采用筛选优化的聚焦分离条件，可有效提高组合抗体中各单抗组分电荷异质体的分离效果。该方法具有分离效果好、准确度高、重复性优、重现性强、成本低等优势，适用于复杂的重组蛋白及重组组合抗体药物的产品评估及质量控制。
本发明具有以下的优势及有益效果：
1、提供了一种全柱成像毛细管等电聚焦(iCIEF)法测定重组组合抗体(MabPair)的比例含量、电荷异质性及等电点的方法。取待检供试品加入适量的尿素溶液、1％HPMC溶液，再加入不同体积比的Pharmalyte 3-10和Pharmalyte 8-10.5载体两性电解质，并结合优化的聚焦分离条件，可实现MabPair组合抗体中各单抗组分电荷异质体的有效分离和含量计算，且保证了pH梯度的稳定性，有效提高检测的准确性和一致性。具有耗时短、效率高、分辨率高、重现性好，样品用量少等诸多优势。
2、采用优化的，Pharmalyte 3-10和Pharmalyte 8-10.5一定体积比的载体两性电解质，可实现MabPair组合抗体中两种单抗组分的有效分离，用于两种单抗的比例含量计算及各自电荷异质体的准确质控。
3、使用紫外Mr pI 6.14和pI 9.46或者荧光Mr pI 6.14和pI 9.50等电点标记物，保证待检组合抗体各组分电荷异质体均位于等电点标记物pI范围内，且pI Mr具有较好的线性，确保检测结果的准确性、稳定性和重现性；
4、提供了一种全柱成像毛细管等电聚焦(iCIEF)法测定重组组合抗体(MabPair)各单抗组分含量、电荷异质性及等电点的方法，方法适用性强，可用于组合抗体药物的质量控制、稳定性研究以及翻译后修饰的表征研究等，并建立相应MabPair药物产品的质量标准。
附图说明
图1为aPD-1和aCTLA-4组合抗体在AESlyte HR3-10：AESlyte HR8-10.5＝1:3组合载体两性电解质条件下的全柱成像毛细管等电聚焦图谱；其中aPD-1位于pI 7.0-8.4之间，aCTLA-4位于pI 8.4-9.3之间(下同)；图中Mr为等电点标记物(下同)；
图2为aPD-1和aCTLA-4组合抗体在样品处理后蛋白终浓度0.5mg/ml及Pharmalyte3-10：Pharmalyte 8-10.5＝1:3组合载体两性电解质条件下聚焦7min时的全柱成像毛细管等电聚焦图谱；
图3为aPD-1和aCTLA-4组合抗体在样品处理后蛋白终浓度0.25mg/ml及Pharmalyte3-10:Pharmalyte 8-10.5＝1:3时的全柱成像毛细管等电聚焦图谱；
图4为aPD-1和aCTLA-4组合抗体在样品处理后蛋白终浓度0.1mg/ml及Pharmalyte3-10:Pharmalyte 8-10.5＝1:3时的全柱成像毛细管等电聚焦图谱；
图5为aPD-1和aCTLA-4组合抗体在样品处理后蛋白终浓度0.5mg/ml及Pharmalyte3-10:Pharmalyte 8-10.5＝1:3，聚焦11min时的全柱成像毛细管等电聚焦图谱；
图6为aPD-1和aCTLA-4组合抗体在样品处理后含终浓度0.5M Urea及Pharmalyte3-10:Pharmalyte 8-10.5＝1:3时的全柱成像毛细管等电聚焦图谱；
图7为aPD-1和aCTLA-4组合抗体在样品处理后含终浓度0.8M Urea及Pharmalyte3-10:Pharmalyte 8-10.5＝1:3时的全柱成像毛细管等电聚焦图谱；
图8为aPD-1和aCTLA-4组合抗体在样品处理后含终浓度1M Urea及Pharmalyte3-10:Pharmalyte 8-10.5＝1:3时的全柱成像毛细管等电聚焦图谱；
图9为aPD-1和aCTLA-4组合抗体在样品处理后含终浓度2M Urea及Pharmalyte3-10:Pharmalyte 8-10.5＝1:3时的全柱成像毛细管等电聚焦图谱；
图10为aPD-1和aCTLA-4组合抗体在Pharmalyte 3-10：Pharmalyte 8-10.5＝3:1组合载体两性电解质、尿素终浓度1M时的全柱成像毛细管等电聚焦图谱；
图11为混标Marker(pI：5.19、7.00、7.05、7.90、9.33)在Pharmalyte3-10单一两性电解质中聚焦的线性关系图；
图12为混标Marker(pI：5.19、7.00、7.05、7.90、9.33)在Pharmalyte 3-10:Pharmalyte8-10.5＝1:3组合两性电解质中聚焦的线性关系图；
图13为aPD-1和aCTLA-4组合抗体在最优分离条件下的全柱成像毛细管等电聚焦图谱；
图14为aPD-1和aCTLA-4组合抗体在最优分离条件下的全柱成像毛细管等电聚焦重复性验证叠加图谱；
图15为aPD-1和aCTLA-4组合抗体在最优分离条件下的全柱成像毛细管等电聚焦重现性验证叠加图谱；
图16为aCD20和aCD37组合抗体在最优分离条件下的全柱成像毛细管等电聚焦图谱；
图17为aCD20和aCD37组合抗体在最优分离条件下的全柱成像毛细管等电聚焦重复性验证叠加图谱；
图18为aCD20和aCD37组合抗体在最优分离条件下的全柱成像毛细管等电聚焦重现性验证叠加图谱。
具体实施方式
术语
本说明书中提及的所有公布、专利和专利申请都以引用的方式并入本文，所述引用的程度就如同已特定地和个别地指示将各个别公布、专利或专利申请以引用的方式并入本文。
在下文详细描述本发明前，应理解本发明不限于本文中描述的特定方法学、方案和试剂，因为这些可以变化。还应理解本文中使用的术语仅为了描述具体实施方案，而并不意图限制本发明的范围。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域中普通技术人员通常的理解具有相同的含义。
本文所公开的某些实施方案包含了数值范围，并且本发明的某些方面可采用范围的方式描述。除非另有说明，应当理解数值范围或者以范围描述的方式仅是出于简洁、便利的目的，并不应当认为是对本发明的范围的严格限定。因此，采用范围方式的描述应当被认为具体地公开了所有可能的子范围以及在该范围内的所有可能的具体数值点，正如这些子范围和数值点在本文中已经明确写出。不论所述数值的宽窄，上述原则均同等适用。当采用范围描述时，该范围包括范围的端点。
本文中的术语“抗体”可以包含完整抗体(例如全长单克隆抗体)及其任何抗原结合片段(即抗原结合部分)或其单链，还可以包含在完整抗体或其抗原结合片段或其单链的基础上进行改造(例如连接其他肽段、功能单位重排等)而形成的具有抗原特异性结合能力的产物。
本文中的术语“重组组合抗体”是由同一细胞株采用同一生产工艺生产，含有预定比例含量的两种单抗组合产物。例如可以是中国专利(申请号：CN201780043870.9)中所述的抗体混合物。
本文中的术语“MabPair”可以是包含两种并且不超过两种主要抗体种类的抗体混合物。可以在已经引入了编码两种不同IgG抗体(即，两条不同重链和两条不同轻链)的DNA的宿主细胞系(如上文所定义)中制备MabPair。也可以在已经引入了编码两种不同IgG抗体的DNA的细胞群中制备MabPair，其中克隆宿主细胞系不是从引入了所述DNA的细胞中纯化的。这种情况的一个实例可以包括将编码两种不同IgG抗体的DNA瞬时转染到例如293或ExpiCHO细胞中，以及随后从转染细胞的细胞上清液中获得由所述细胞产生的抗体。由多于一种宿主细胞系制备的两种抗体的混合物不是如本文所述的MabPair。此外，从两个单独的细胞群制备的两种抗体的混合物(其中编码一种抗体的DNA已经被引入一个细胞群中，并且编码另一种抗体的DNA已被引入另一个细胞群中)也不是如本文所述的MabPair。
如本文所述，抗体混合物情境中的“主要种类”的抗体是构成混合物中的抗体总量的至少10％的特定抗体种类；抗体混合物中的“次要种类”的抗体占抗体混合物中抗体总量的少于10％。
实施例
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
实施例使用的重组aPD-1和aCTLA-4组合抗体采用同一细胞株同一生产工艺进行生产制备。经细胞培养表达和分离纯化后制得。所得aPD-1和aCTLA-4组合抗体样品，蛋白浓度为5-25mg/ml，SEC-HPLC纯度＞95.0％；
aCD20和aCD37组合抗体采用同一细胞株同一生产工艺进行生产制备，经分离纯化制得，aCD20和aCD37组合抗体样品，蛋白浓度为2-26mg/ml，SEC-HPLC纯度＞95.0％。
实施例1：iCIEF测定重组aPD-1和aCTLA-4组合抗体电荷异质性
1)组合抗体样品不处理或浓缩脱盐处理
若供试品溶液所含盐浓度不影响检测，则直接取供试品溶液；若供试品为高盐样品应进行脱盐处理，步骤：取400μg组合抗体样品，加入到10kDa超滤离心柱(Millipore公司)，12000×g离心10min，弃废液；加入450μl 20mM的PB缓冲液(pH6.5)，12000×g离心10min，取出浓缩柱管，将样品倒转入一个新的干净的离心管中，3000×g离心3min，收集预处理的样品，蛋白含量约为10mg/ml，得到浓缩供试品溶液。
2)样品混合液制备
将步骤1)的组合抗体溶液供试品与表1中各组分按配比进行混合，制备待检样品混合液。
表1 aPD-1和aCTLA-4组合抗体样品混合液配比
组分 加入量
1％HPMC 70μl(终浓度0.35％)；
AESlyte HR3-10或GE Pharmalyte3-10 2μl；
AESlyte HR8-10.5或GE Pharmalyte8-10.5 6μl；
Marker pI 6.61 0.5μl
Marker pI 9.46 0.5μl
供试品 100μg(终浓度0.5mg/ml)
ddH<sub>2</sub>O 终体积至200μL
3)将步骤2)中样品混合液置于iCE仪器进样器上样检测
采用全柱成像毛细管等电聚焦系统(ProteinSimple，Maurice C.或AES，CEInfinite)检测，聚焦时间为7min(聚焦程序：1.5kV-1min，3kV-6min)，样品室温度设置10℃。
4)结果分析
通过紫外吸收检测器(检测波长280nm)记录步骤3)中所检测的等电聚焦图谱。检测结果如图1(AESlyte HR3-10、AESlyte HR8-10.5组合两性电解质)和图2(Pharmalyte 3-10、Pharmalyte 8-10.5组合两性电解质)所示，不同系列同比例配比的两性电解质，组合抗体iCIEF聚焦图谱一致，分离效果均较好，但均出现aPD-1主峰析出现象。依据使用方便程度，选用Pharmalyte系列两性电解质开展进一步研究工作。
实施例2：iCIEF测定重组aPD-1和aCTLA-4组合抗体电荷异质性
1)如需脱盐，采用与实施例1中相同的方法对组合抗体样品进行浓缩脱盐，得到脱盐浓缩供试品；
2)将步骤1的aPD-1和aCTLA-4组合抗体供试品，按照表2中的样品量(100ug、50μg、20μg)分别与表2中各组分按配比进行混合，制备待检样品混合液；
3)采用与实施例1相同的方法，检测并记录组合抗体样品等电聚焦图谱。
表2 aPD-1和aCTLA-4组合抗体不同蛋白量(浓度)样品混合液配比
Figure BDA0002810310470000101
4)结果分析
采用与实施例1相同的方法，通过紫外吸收检测器记录步骤3)中所检测的等电聚焦图谱。检测结果如图2(蛋白终浓度0.5mg/ml)、图3(蛋白终浓度0.25mg/ml)和图4(蛋白终浓度0.1mg/ml)。图2和图3均出现aPD-1主峰析出现象；图4未出现蛋白析出现象但灵敏度偏低。为保障检测灵敏度不宜采用降低上样蛋白浓度的方式改善aPD-1主峰析出现象。故采用上样蛋白终浓度0.5mg/ml条件作进一步优化。
实施例3：iCIEF测定重组aPD-1和aCTLA-4组合抗体电荷异质性
1)采用与实施例1中相同的方法对组合抗体样品进行浓缩脱盐，得浓缩溶液；
2)将步骤1的aPD-1和aCTLA-4组合抗体供试品按照表3中各组分按配比进行混合，制备待检样品混合液；
3)采用与实施例1相同的方法，但不同的聚焦时间，检测并记录组合抗体全柱成像毛细管等电聚焦图谱。
表3 aPD-1和aCTLA-4组合抗体样品混合液配比
1％HPMC： 70μl(终浓度0.35％)；
GE Pharmalyte 3-10： 2μl；
GE Pharmalyte 8-10.5： 6μl；
Marker pI 6.61 0.5μl
Marker pI 9.46或Marker pI 9.77 0.5μl
供试品 100μg(终浓度0.5mg/ml)
ddH<sub>2</sub>O 终体积至200μl
4)结果分析
采用与实施例1相同的方法，但不同的聚焦时间，通过紫外吸收检测器(检测波长280nm)记录步骤3)中所检测的等电聚焦图谱。检测结果如图2(聚焦7min)、图5(聚焦11min)。同样条件下聚焦7min和11min分离效果均较好，图谱无差异，说明聚焦时间7-11min时分离效果与峰容量均较好。为防止长时间聚焦产生焦耳热可能致使峰型变化，聚焦7min为最佳条件。
实施例4：iCIEF测定重组aPD-1和aCTLA-4组合抗体电荷异质性
1)如需脱盐，采用与实施例1中相同的方法对组合抗体样品进行浓缩脱盐，得脱盐浓缩供试品；
2)将步骤1的aPD-1和aCTLA-4组合抗体供试品按照表4-表7中各组分配比进行混合，制备待检样品混合液；
3)采用与实施例1相同的方法，检测并记录组合抗体样品全柱成像毛细管等电聚焦图谱。
表4 aPD-1和aCTLA-4组合抗体含终浓度0.5M尿素混合液配比
Figure BDA0002810310470000111
Figure BDA0002810310470000121
表5 aPD-1和aCTLA-4组合抗体含终浓度0.8M尿素混合液配比
组分 加入量(μl)
10M尿素+0.35％HPMC： 16μl(终浓度0.8M Urea)；
1％HPMC： 64.4μl(终浓度0.35％)；
GE Pharmalyte 3-10： 2μl；
GE Pharmalyte 8-10.5： 6μl；
Marker pI 6.61 0.5μl
Marker pI 9.77 0.5μl
供试品 100μg(终浓度0.5mg/ml)
ddH<sub>2</sub>O 终体积至200μl
表6 aPD-1和aCTLA-4组合抗体含终浓度1M尿素混合液配比
组分 加入量(μl)
10M尿素+0.35％HPMC： 20μl(终浓度1M Urea)；
1％HPMC： 63μl(终浓度0.35％)；
GE Pharmalyte 3-10： 2μl；
GE Pharmalyte 8-10.5： 6μl；
Marker pI 6.61 0.5μl
Marker pI 9.46 0.5μl
供试品 100μg(终浓度0.5mg/ml)
ddH<sub>2</sub>O 终体积至200μl
表7 aPD-1和aCTLA-4组合抗体含终浓度2M尿素混合液配比
组分 加入量(μl)
10M尿素+0.35％HPMC： 40μl(终浓度2M Urea)；
1％HPMC： 56μl(终浓度0.35％)；
GE Pharmalyte 3-10： 2μl；
GE Pharmalyte 8-10.5： 6μl；
Marker pI 6.61 0.5μl
Marker pI 9.77 0.5μl
供试品 100μg(终浓度0.5mg/ml)
ddH<sub>2</sub>O 终体积至200μl
4)结果分析
采用与实施例1相同的方法，样品处理含不同终浓度的尿素溶液，通过紫外吸收检测器记录步骤3)中所检测的等电聚焦图谱。检测结果如图6(终浓度0.5M Urea)、图7(终浓度0.8M Urea)、图8(终浓度1M Urea)、图9(终浓度2M Urea)所示。在相同聚焦条件下含终浓度0.5M-2M Urea处理样品，其电荷异质体的分离效果较好、峰容量较高，aPD-1均未出现主峰析出现象。含终浓度1M Urea时各电荷异质体的分离效果最好、峰灵敏度较高，为最佳。
实施例5：iCIEF测定重组aPD-1和aCTLA-4组合抗体电荷异质性
1)如需脱盐，采用与实施例1中相同的方法对组合抗体样品进行浓缩脱盐，得脱盐浓缩供试品；
2)将步骤1的aPD-1和aCTLA-4组合抗体供试品按照表8(同实施例4中表6)和表9中各组分配比进行混合，制备待检样品混合液；
3)采用与实施例1相同的方法，检测并记录组合抗体样品全柱成像毛细管等电聚焦图谱。
表8 aPD-1和aCTLA-4组合抗体混合液配比(Pharmalyte 3-10：8-10.5＝25％:75％)
组分 加入量(μl)
10M尿素+0.35％HPMC： 20μl(终浓度1M Urea)；
1％HPMC： 63μl(终浓度0.35％)；
GE Pharmalyte 3-10： 2μl；
GE Pharmalyte 8-10.5： 6μl；
Marker pI 6.61 0.5μl
Marker pI 9.46 0.5μl
供试品 100μg(终浓度0.5mg/ml)
ddH<sub>2</sub>O 终体积至200μl
表9 aPD-1和aCTLA-4组合抗体混合液配比(Pharmalyte 3-10:8-10.5＝75％:25％)
组分 加入量(μl)
10M尿素+0.35％HPMC： 20μl(终浓度1M Urea)；
1％HPMC： 63μl(终浓度0.35％)；
GE Pharmalyte 3-10： 6μl；
GE Pharmalyte 8-10.5： 2μl；
Marker pI 6.61 0.5μl
Marker pI 9.46 0.5μl
供试品 100μg(终浓度0.5mg/ml)
ddH<sub>2</sub>O 终体积至200μl
4)结果分析
采用与实施例1相同的方法，但不同的两性电解质比例，采用紫外吸收检测器记录步骤3)中所检测的等电聚焦图谱。检测结果如图8(Pharmalyte 3-10:Pharmalyte 8-10.5＝25％:75％)、图10(Pharmalyte 3-10:Pharmalyte 8-10.5＝75％:25％)。等电聚焦分离图谱无明显差异，说明采用不同比例的两性电解质时分离效果与峰容量均较好，但Pharmalyte 3-10:Pharmalyte 8-10.5＝75％:25％条件下聚焦图谱稳定性略差，因此为保障聚焦图谱中各峰的分离度和稳定性，选择Pharmalyte 3-10:Pharmalyte 8-10.5＝25％:75％为最佳配比分析条件。
实施例6：iCIEF测定pI混标Marker线性关系
1)取混标Marker按照表10和表11中各组分配比进行混合，制备待检混标Marker混合液；
2)采用与实施例1相同的方法，检测并记录混标Marker全柱成像毛细管等电聚焦图谱。
表10在Pharmalyte3-10单一两性电解质中混标Marker iCIEF混合液配比
组分 加入量(μl)
1％HPMC： 70μl(终浓度0.35％)
GE Pharmalyte 3-10： 8μl；
pI混标Marker 2μl
ddH<sub>2</sub>O 终体积至200μl
表11在Pharmalyte3-10和Pharmalyte8-10.5组合两性电解质中混标MarkeriCIEF混合液配比
组分 加入量(μl)
1％HPMC： 70μl(终浓度0.35％)；
GE Pharmalyte 3-10： 2μl；
GE Pharmalyte 8-10.5： 6μl；
pI混标Marker 2μl
ddH<sub>2</sub>O 终体积至200μl
4)结果分析
混标Marker(pI：5.19、7.00、7.05、7.90、9.33)在单一两性电解质(如Pharmalyte3-10)中呈较好的线性关系(R2＝0.99)，如图11；但在组合两性电解质(如Pharmalyte 3-10:Pharmalyte8-10.5＝1:3组合)中线性较差(R2＝0.93)，如图12。为保障供试品pI测定的准确性，在使用组合两性电解质时应尽量选择与样品峰靠近的pI Marker，又要考虑酸区Marker与样品间留有一定的余地，以防Marker与样品重叠。因此，aPD-1和aCTLA-4组合抗体根据电荷异质体分布，合适的pI Marker组合为pI 6.14和pI 9.46。
实施例7：iCIEF测定重组aPD-1和aCTLA-4组合抗体电荷异质性及等电点方法的最优条件
1)如需脱盐，采用与实施例1中相同的方法对组合抗体样品进行浓缩脱盐，得脱盐浓缩供试品；
2)将步骤1的aPD-1和aCTLA-4组合抗体供试品按照表12中各组分按配比进行混合，制备待检样品混合液；
3)采用与实施例1相同的方法，检测并记录组合抗体样品全柱成像毛细管等电聚焦图谱。
表12 aPD-1和aCTLA-4组合抗体iCIEF分析最优条件混合液配比
组分 加入量(μl)
10M尿素+0.35％HPMC： 20μl(终浓度1M Urea)；
1％HPMC： 63μl(终浓度0.35％)；
GE Pharmalyte 3-10： 2μl；
GE Pharmalyte 8-10.5： 6μl；
Marker pI 6.14 0.5μl
Marker pI 9.46 0.5μl
供试品(批号20180201) 100μg(终浓度0.5mg/ml)
ddH<sub>2</sub>O 终体积至200μl
4)结果分析
检测图谱如图13所示。电荷异质性及等电点结果见表13。组合抗体样品各电荷异质体分离效果、峰容量高，电荷异质体含量及等电点分布结果稳定、准确。
表13 aPD-1和aCTLA-4组合抗体iCIEF电荷异质性及等电点结果
Figure BDA0002810310470000151
高效液相疏水色谱(HIC)分析是组合抗体产品中各组分含量比例测定的常用分析技术，其具有稳定、准确等特点，但HIC仅能进行组分含量比例的测定，不能用于电荷异质性的质控。本发明发现iCIEF能够同时进行MabPair中组分含量比例测定和电荷异质性的质控，采用iCIEF进行组分含量比例测定与HIC结果对比，见表14。
表14 aPD-1和aCTLA-4组合抗体含量比例测定iCIEF和HIC对比结果
Figure BDA0002810310470000152
Figure BDA0002810310470000161
组分含量比例测定iCIEF与HIC结果无明显差异(＜2％)，说明iCIEF技术用于MabPair组分含量比例测定是准确、稳定的，并且分析时间iCIEF(＜10min)明显小于HIC(45min)，可节约分析时间提高检测效率。除此之外，更重要的是还可同时进行电荷异质性的质控。
实施例8：iCIEF测定重组aPD-1和aCTLA-4组合抗体电荷异质性及等电点方法的重复性验证
在本发明实施例7的iCIEF检测的条件下，处理3份aPD-1和aCTLA-4组合抗体样品(批次：20180201)进行重复性实验，检测图谱见图14，结果见表15，结果表明，本发明检测方法具有良好的重复性，满足产品质控要求。
表15 aPD-1和aCTLA-4组合抗体iCIEF重复性检测验证结果
Figure BDA0002810310470000162
实施例9：iCIEF测定重组aPD-1和aCTLA-4组合抗体电荷异质性及等电点方法的重现性验证
在本发明实施例7的iCIEF检测的条件下，处理3个不同批次的aPD-1和aCTLA-4组合抗体样品(批次：20191005、20190804、20190201)进行重现性实验，检测图谱见图15，结果见表16，结果表明，本发明检测方法具有良好的重现性，满足产品质控要求。
表16 aPD-1和aCTLA-4组合抗体iCIEF重现性检测验证结果
Figure BDA0002810310470000163
Figure BDA0002810310470000171
实施例10：iCIEF测定重组aCD20和aCD37组合抗体电荷异质性及等电点方法的最优条件
1)如需脱盐，采用与实施例1中相同的方法对组合抗体样品进行浓缩脱盐，得到脱盐浓缩供试品；
2)将步骤1的aCD20和aCD37组合抗体供试品按照表17中各组分按配比进行混合，制备待检样品混合液；
3)采用与实施例1相同的方法，检测并记录组合抗体样品全柱成像毛细管等电聚焦图谱。
表17 aCD20和aCD37组合抗体iCIEF分析最优条件混合液配比
组分 加入量(μl)
1％HPMC： 70μl(终浓度0.35％)；
GE Pharmalyte 3-10： 3μl；
GE Pharmalyte 8-10.5： 5μl；
Marker pI 6.14 0.5μl
Marker pI 9.50(荧光Mr) 0.5μl
精氨酸溶液(500mM) 4μl
供试品 40μg(终浓度0.2mg/ml)
ddH<sub>2</sub>O 终体积至200μl
4)结果分析
检测图谱如图16所示。电荷异质性及等电点结果见表18。组合抗体样品各电荷异质体分离效果较好、峰容量高，电荷异质体含量及等电点分布结果准确、稳定。
表18 aCD20和aCD37组合抗体iCIEF检测结果
Figure BDA0002810310470000172
实施例11：iCIEF测定重组aCD20和aCD37组合抗体电荷异质性及等电点方法的重复性验证
在本发明实施例10的iCIEF检测的条件下，处理3份aCD20和aCD37组合抗体样品(批次：20191203)进行重复性实验，检测图谱见图17，结果见表19，结果表明，本发明检测方法具有良好的重复性，满足产品质控要求。
表19 aCD20和aCD37组合抗体iCIEF重复性检测验证结果
Figure BDA0002810310470000181
实施例12：iCIEF测定重组aCD20和aCD37组合抗体电荷异质性及等电点方法的重现性验证
在本发明实施例10的iCIEF检测的条件下，处理3个不同批次的aCD20和aCD37组合抗体样品(批次：20191203S、20191203DS、20200301)进行重现性实验，检测图谱见图18，结果见表20，结果表明，本发明检测方法具有良好的重现性，满足产品质控要求。
表20 aCD20和aCD37组合抗体iCIEF重现性检测验证结果
Figure BDA0002810310470000182
以上是对本发明的优选实施方式的描述，而不是对本发明内容的限制。除了以上内容外，本领域技术人员在不脱离本发明原理的情况下，可以做出若干修改和替代，这些修改和替代也应视为本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.检测重组组合抗体(MabPair)的含量比例、电荷异质性和/或等电点的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)取重组组合抗体作为供试品；
2)使用供试品配制用于全柱成像毛细管等电聚焦(iCIEF)检测的分析样品混合液，通过iCIEF系统进行检测，实时采集等电聚焦图谱；
3)根据步骤2)中的等电聚焦图谱，计算待分析重组组合抗体中单抗的含量比例、电荷异质性和/或等电点。
2.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1)中的重组组合抗体是由同一细胞株采用同一生产工艺生产，含有预定比例含量的两种单抗组合产物；优选地，所述分析样品混合液中组合抗体的蛋白终浓度为0.1-1mg/ml。
3.如权利要求1或2所述方法，其特征在于，在步骤1)中，若重组组合抗体样品处理后所含盐浓度>15mM，则进行超滤浓缩脱盐处理后作为供试品。
4.如权利要求1或2所述方法，其特征在于，在步骤2)中，所述分析样品混合液包含供试品、载体两性电解质和凝胶载体基质；优选地，所述分析样品混合液还包含助溶剂和/或等电点标记物。
5.如权利要求4所述方法，其特征在于，步骤2)中的载体两性电解质由一种或两种以上两性电解质组成，优选由两种两性电解质组成；更优选地，所述载体两性电解质由比例25％-75％的pH 3-10和比例75％-25％的pH 8-10.5两性电解质组成；更优选地，所述载体两性电解质在分析样品混合液中的体积含量为2％-5％。
6.如权利要求4所述方法，其特征在于，步骤2)中的凝胶载体基质为甲基纤维素(MC)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)或葡聚糖中的一种或更多种，优选为羟丙基甲基纤维素；更优选地，所述凝胶载体基质在分析样品混合液中的体积含量为2.5％-4.5％。
7.如权利要求4所述方法，其特征在于，步骤2)中的助溶剂是尿素、甲酰胺、甘油、山梨醇、丙二醇、两性离子和中性表面活性剂中的一种或多种，优选为尿素；更优选地，所述助溶剂在分析样品混合液中的终浓度为0.5-4mol/L。
8.如权利要求4所述方法，其特征在于，步骤2)中的等电点标记物是已知pI的化学或多肽类小分子等电点标记物，优选范围为pI 4.0至pI 10.0；更优选pI 6.14和pI 6.61中的一种与pI 9.46和pI 9.77中的一种组合使用；若采用荧光检测模式，将所述pI 9.46替换为pI9.50。
9.如权利要求1或2所述方法，其特征在于，在步骤2)中，所述分析样品混合液上样于等电聚焦毛细管中；优选地，所述等电聚焦毛细管为FC内涂层、内径100μm、有效分离长度5cm的卡盒或毛细管柱。
10.如权利要求1或2所述方法，其特征在于，步骤2)中的毛细管温度为10-30℃；任选地，所采用的聚焦电压和时间为1.5kV维持1min然后3kV维持5-11min；任选地，图谱检测采用紫外吸收检测器或荧光检测器，优选地，光源为氘灯或者LED。
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