CN114574571A - 一种核苷酸衍生物及基因测序方法 - Google Patents

一种核苷酸衍生物及基因测序方法 Download PDF

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CN114574571A CN202210478585.2A CN202210478585A CN114574571A CN 114574571 A CN114574571 A CN 114574571A CN 202210478585 A CN202210478585 A CN 202210478585A CN 114574571 A CN114574571 A CN 114574571A
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卓少春
周蓉
冯越
赵晓飞
伍建
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Abstract

本发明涉及一种核苷酸衍生物及基因测序方法，包含如下组分：聚合酶、化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6、化合物7、化合物8，化合物1、化合物2、化合物3、化合物4各自独立的标记有荧光基团或可反应活性基团，且化合物4或不存在，化合物5、化合物6、化合物7、化合物8均是在3’位置处的羟基被保护基团修饰的核苷酸类似物，且所述保护基团能被切割脱离重新将3’‑OH裸露出来，并同时公开了利用该核苷酸衍生物进行基因测序的基因测序方法。该发明在SBS测序时，最终并入新合成链的碱基为天然碱基，没有“疤痕”残留，有利于提高测序读长和数据质量。

Description

一种核苷酸衍生物及基因测序方法
技术领域
本发明涉及基因测序领域，尤其是一种核苷酸衍生物及基因测序方法。
背景技术
基因测序是医学和生物学发现的重要推动力，随着基因测序技术的迅猛发展，高通量基因测序技术已深入生命科学的各个领域，高通量基因测序采用克隆扩增和边合成边测序（SBS）的测序化学技术，可以实现了快速、准确的测序，经过近十年来的迅猛发展，已经深入到生命科学的各个领域，不仅有力地推动了基础研究的发展，在临床应用阶段也占据重要的角色。在目前最为流行的高通量基因测序平台中，为了测定碱基类型，将荧光染料标记的四种可逆终止核苷酸（Reversible Termination Nucleotide，NRT）加入反应体系，通常的，每个修饰NRT的荧光染料标记通过可切割链连接在碱基上，并在3’-OH端加以可切割的保护基团，不同的NRT会发出独特的荧光信号，该信号可用于确定DNA序列的顺序。目前修饰在NRT上的荧光染料标记通过可切割链连接在碱基上后，大多在洗脱过程中都会出现部分连接链化学结构残留在新合成核苷酸链上的现象，这些残留的化学键在很大程度上会影响新合成核苷酸链的柔韧性，导致碱基互补配对容易出错，保真性较低，还可能部分淬灭在下个循环上的荧光信号，从而影响测序读长和数据质量。
发明内容
针对现有的不足，本发明提供一种核苷酸衍生物及基因测序方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种核苷酸衍生物，包含如下组分：聚合酶、化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6、化合物7、化合物8；
其中所述化合物1、化合物2、化合物3、化合物4各自独立的标记有荧光基团或可反应活性基团，且化合物4或不存在，所述化合物1、化合物2、化合物3、化合物4各自独立的具备式（I）或式（II）结构：
Figure 566067DEST_PATH_IMAGE001
，
Figure 889732DEST_PATH_IMAGE002
；
所述化合物5、化合物6、化合物7、化合物8均是在3’位置处的羟基被保护基团修饰的核苷酸类似物，且所述保护基团能被切割脱离重新将3’-OH裸露出来，它们各自独立的具有式（III）的结构：
Figure 840108DEST_PATH_IMAGE003
：
其中，R1为不同的碱基，所述碱基为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶中的一种；
R2各自独立地为能够进行正交切割反应的保护基团；
R3各自独立地为氢、单磷酸基团、多磷酸基团中的一种；
R4，R5各自独立地为荧光基团和可反应活性基团中的一种，或不存在；
R6各自独立地为卤素、-H、-OH、N3和C2-C10柔性链中的一种；
X1，X2各自独立地为-O、-OH、-CH2、-CF2、-CCl2、-CFCl、-NH和-S中的一种;
L1，L2，L3各自独立地为连接基团和可切割连接基团中的一种，或不存在。
作为优选，所述碱基是以下任意一种结构的化合物：
Figure 173001DEST_PATH_IMAGE004
、
Figure 925056DEST_PATH_IMAGE005
、
Figure 685202DEST_PATH_IMAGE006
、
Figure 656962DEST_PATH_IMAGE007
、
Figure 527966DEST_PATH_IMAGE008
、
Figure 134528DEST_PATH_IMAGE009
、
Figure 65575DEST_PATH_IMAGE010
、
Figure 256122DEST_PATH_IMAGE011
、
Figure 727555DEST_PATH_IMAGE012
、
Figure 923044DEST_PATH_IMAGE013
、
Figure 290572DEST_PATH_IMAGE014
、
Figure 971345DEST_PATH_IMAGE015
。
作为优选，所述保护基团是能被聚合酶有效识别,能掺入生长中的DNA链中,并在每一轮SBS测序后能被切割脱离的3’-OH修饰基团，所述可切割连接基团是指链接5’磷酸或碱基的荧光基团、环境高敏荧光基团、能发出相同荧光信号的荧光基团或能够进行连接反应的可反应活性基团之间的任意一种小分子基团，
作为优选，所述能发出相同荧光信号的荧光基团是指在同一激发光源波长下能够发出和选用的环境高敏荧光染料一致或接近的发射波长的荧光，并被检测判断为同一荧光信号的非环境高敏荧光染料。
作为优选，所述保护基团是具有以下任意一种结构的基团：
Figure 184152DEST_PATH_IMAGE016
、
Figure 765306DEST_PATH_IMAGE017
、
Figure 38155DEST_PATH_IMAGE018
、
Figure 203295DEST_PATH_IMAGE019
、
Figure 219793DEST_PATH_IMAGE020
、
Figure 452191DEST_PATH_IMAGE021
、
Figure 161521DEST_PATH_IMAGE022
、
Figure 784263DEST_PATH_IMAGE023
、
Figure 371496DEST_PATH_IMAGE024
、
Figure 396084DEST_PATH_IMAGE025
、
Figure 276315DEST_PATH_IMAGE026
、
Figure 448670DEST_PATH_IMAGE027
。
作为优选，所述可切割连接基团是具有以下任意一种结构的基团：
Figure 305506DEST_PATH_IMAGE028
、
Figure 450179DEST_PATH_IMAGE029
、
Figure 501312DEST_PATH_IMAGE030
、
Figure 364225DEST_PATH_IMAGE031
）、
Figure 322954DEST_PATH_IMAGE032
、
Figure 835318DEST_PATH_IMAGE033
、
Figure 57352DEST_PATH_IMAGE034
、
Figure 141982DEST_PATH_IMAGE035
、
Figure 373244DEST_PATH_IMAGE036
；
其中，R1’，R2’各自独立地为卤素、-H、C1-C5脂肪链中的一种。
一种基因测序方法，其特征在于:包括如下步骤：
S1，分别制备前述任一项所述的化合物1、化合物2、化合物3、化合物4，化合物5、化合物6、化合物7、化合物8，且化合物1、化合物2、化合物3、化合物4各自独立的标记有荧光基团或可反应活性基团，且化合物4或不存在；所述化合物1、化合物2、化合物3、化合物4各自独立的具备式（I）或式（II）结构；所述化合物5、化合物6、化合物7、化合物8各自独立的具备式（III）结构：
Figure 725465DEST_PATH_IMAGE037
，
Figure 852821DEST_PATH_IMAGE038
，
Figure 690327DEST_PATH_IMAGE039
；
其中，R1为不同的碱基，所述碱基为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶中的一种；
R2各自独立地为能够进行正交切割反应的保护基团；
R3各自独立地为氢、单磷酸基团、多磷酸基团中的一种；
R4，R5各自独立地为荧光基团和可反应活性基团中的一种，或不存在；
R6各自独立地为卤素、-H、-OH、N3和C2-C10柔性链中的一种；
X1，X2各自独立地为-O、-OH、-CH2、-CF2、-CCl2、-CFCl、-NH和-S中的一种;
L1，L2，L3各自独立地为连接基团和可切割连接基团中的一种，或不存在
S2，将待测序的核酸模板链接于测试载体上，通过扩增形成待测核酸分子簇；
S3，将化合物1、化合物2、化合物3，或化合物1、化合物2、化合物3、化合物4和聚合酶同时加入S2体系中进行核苷酸聚合反应得一中间态复合体；
S4，洗去未反应的化合物1、化合物2、化合物3，或化合物1、化合物2、化合物3、化合物4维持S3的中间态复合体状态，并检测记录每个并入的核苷酸衍生物的荧光标记，判断DNA模板上对应位置的碱基；
S5，将化合物5、化合物6、化合物7、化合物8和聚合酶加入S4处理后的反应体系中进行核苷酸聚合反应；
S6，往S5反应后的体系中加入切割液洗去化合物5、化合物6、化合物7、化合物8中的可切割保护基团，移除溶液相并用缓冲液冲洗干净；
S7,洗去S6中反应后替换下来的化合物1、化合物2、化合物3，或化合物1、化合物2、化合物3、化合物4；
S8，重复步骤S3至S7一次或多次。
作为优选，所述化合物1、化合物2、化合物3、化合物4各自独立的具备式（Ia）或式（IIa）结构：
Figure 990859DEST_PATH_IMAGE040
，
Figure 731675DEST_PATH_IMAGE041
；
所述步骤S2中是将测序的核酸模板链接于测试载体上，通过扩增形成待测核酸分子簇，且L1各自独立地为连接基团或不存在。
作为优选，所述步骤S1中分别制备前述任一项所述的化合物1、化合物2、化合物3、化合物5、化合物6、化合物7、化合物8，所述化合物1、化合物2、化合物3各自独立的具备式（Ia）或式（IIa）结构：
Figure 29932DEST_PATH_IMAGE042
，
Figure 89155DEST_PATH_IMAGE043
，
其中；化合物1和化合物3标记有不同的荧光基团，且化合物3的荧光基团能发出和化合物1的荧光基团相同的荧光信号，化合物2标记有可反应活性基团，L1各自独立地为连接基团；
所述步骤S2中是将测序的核酸模板链接于测试载体上，通过扩增形成待测核酸分子簇，且L1各自独立地为连接基团；
所述步骤S3是将化合物1、化合物2、化合物3、聚合酶同时加入S2体系中进行核苷酸识别聚合反应；
所述步骤S4包括如下步骤：S4a，洗去未反应得化合物1、化合物2、化合物3，之后加入扫描缓冲液调节反应环境使得化合物3能够被激发发出荧光，检测并记录荧光信号；S4b，洗去扫描缓冲液，加入化合物1所标记荧光基团的活性基团，将该荧光基团引入化合物2中使得化合物2能发出荧光信号；S4c，调节反应环境，淬灭化合物3上荧光基团的荧光；S4d，加入扫描缓冲液，激发光源检测记录荧光信号，之后洗去扫描缓冲液。
作为优选，所述化合物1、化合物2、化合物4各自独立的具备式（Ia）或式（IIa）结构：化合物3具备式（Ib）或式（IIb）结构：
Figure 396640DEST_PATH_IMAGE044
，
Figure 21656DEST_PATH_IMAGE045
，
Figure 254929DEST_PATH_IMAGE046
，
Figure 801448DEST_PATH_IMAGE047
；
所述步骤S2中是将测序的核酸模板链接于测试载体上，通过扩增形成待测核酸分子簇，且L1各自独立地为连接基团。
本发明的有益效果在于：该发明提供一类核苷酸多磷酸衍生物，其第一特征是5’-端第一个磷酸基团上单个或多个OH，或第一，二个磷酸基团之间的O被其他基团取代（称之为X基团，如CH2、CF2、CCl2、CFCl、NH、S等），其第二特征是在核苷酸多磷酸衍生物的碱基或末端磷酸基团上标记有荧光基团或可反应活性基团，这类核苷酸多磷酸衍生物在进行SBS测序过程中，可以被DNA聚合酶识别并将其并入待测DNA链模板上，由于X基团的存在，不能正常形成磷酸二酯键，DNA链延长终止，此时核苷酸多磷酸衍生物和聚合酶以及核酸模板链形成一中间态复合体，通过检测每个并入的核苷酸衍生物的荧光标记并拍照存储图像来鉴别所述核酸链的3′端所并入的核苷酸衍生物，据此判断DNA模板上对应位置的碱基；拍照结束后，加入可以正常形成磷酸二酯键的3’-保护基团-dNTPs，竞争性的取代上述修饰有X基团的核苷酸多磷酸衍生物，完成这一轮SBS链增长，3’-保护基团确保每次只增长一个碱基，且每一轮SBS测序后3’-保护基团-dNTPs的保护基团可被切割生成天然的3’-OH-dNTPs，从而不影响下一轮SBS反应，最终并入新合成链的碱基为天然碱基，没有“疤痕”残留，有利于提高测序读长和数据质量。此外，本发明测序方法除了提供四色荧光和双色荧光SBS测序试剂和方法外，还提供单色荧光试剂和测序方法，测序仪仅需配备一个激发光源和一个相机，从而大大降低了测序仪的制造成本和体积，方便运输和携带，有利于测序仪往更广阔的的三四线城市医院和研究机构扩散，去中心化使用。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例对本发明作进一步说明，进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
本发明实施例一种核苷酸衍生物，包含如下组分：聚合酶、化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6、化合物7、化合物8；
其中所述化合物1、化合物2、化合物3、化合物4各自独立的标记有荧光基团或可反应活性基团，且化合物4或不存在，所述化合物1、化合物2、化合物3、化合物4各自独立的具备式（I）或式（II）结构：
Figure 647044DEST_PATH_IMAGE048
，
Figure 595409DEST_PATH_IMAGE049
；
所述化合物5、化合物6、化合物7、化合物8均是在3’位置处的羟基被保护基团修饰的核苷酸类似物，且所述保护基团能被切割脱离重新将3’-OH裸露出来，它们各自独立的具有式（III）的结构：
Figure 2513DEST_PATH_IMAGE050
：
其中，R1为不同的碱基，所述碱基为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶中的一种；
R2各自独立地为能够进行正交切割反应的保护基团；
R3各自独立地为氢、单磷酸基团、多磷酸基团中的一种，多磷酸基团是二磷酸基团、三磷酸基团、四磷酸基团或更多个磷酸基团中的任意一种；
R4，R5各自独立地为荧光基团和可反应活性基团中的一种，或不存在，即R4为能够发岀荧光信号的环境高敏荧光基团、能发出相同荧光信号的荧光基团、能够进行连接反应的可反应性基团，R5为能够发岀荧光信号的荧光基团或环境高敏荧光基团标记的可反应性基团或能发出相同荧光信号的荧光基团标记的可反应性基团；
R6各自独立地为卤素、-H、-OH、N3和C2-C10柔性链中的一种；
X1，X2各自独立地为-O、-OH、-CH2、-CF2、-CCl2、-CFCl、-NH和-S中的一种;
L1，L2，L3各自独立地为连接基团和可切割连接基团中的一种，或不存在。
在本发明实施例中，使用聚合酶来进行核苷酸聚合反应，聚合酶是指能够催化聚合反应的任何天然或非天然存在的酶或其他催化剂，包括各种已知的天然和改性的核酸聚合酶，例如DNA(脱氧核糖核酸，Desoxyribonucleic Acid)聚合酶、RNA（核糖核酸，Ribonucleic Acid）聚合酶以及逆转录酶。
聚合酶能够以RNA或单链DNA为模板合成新的DNA链，可根据实际需要，选择合适的聚合酶来进行核苷酸聚合反应，也可以选择多种聚合酶的混合来使用。
在本发明实施例中，使用DNA聚合酶进行核苷酸聚合反应（以下简称聚合酶M）。
本发明中各化合物分别为核苷酸A、（T/U）、C和G的衍生物，核苷酸是指核苷-5’-多磷酸化合物或其结构类似物，具有碱基互补配对能力，其可以通过核酸聚合酶掺入以延伸生长的核酸链，可以在一个或多个碱基、糖或磷酸基团上对核苷酸进行修饰，核苷酸可标记有荧光染料或可反应活性基团。
保护基团是能被聚合酶有效识别,能掺入生长中的DNA链中,并在每一轮SBS测序后能被切割脱离的3’-OH修饰基团，所述可切割连接基团是指链接5’磷酸或碱基的荧光基团、环境高敏荧光基团、能发出相同荧光信号的荧光基团、能够进行连接反应的可反应活性基团之间的任意一种小分子基团，所述能发出相同荧光信号的荧光基团是指在同一激发光源波长下能够发出和选用的环境高敏荧光染料一致或接近的发射波长的荧光，并被检测判断为同一荧光信号的非环境高敏荧光染料。保护基团可响应切割剂包括但不限于Na2S2O4）、THP)、TEC、DTT、弱酸、Pd（0）或光照射（例如紫外线照射）等的作用而去保护，保护基团包括但不限于以下几种：
Figure 36328DEST_PATH_IMAGE051
、
Figure 482352DEST_PATH_IMAGE052
、
Figure 488486DEST_PATH_IMAGE053
、
Figure 860299DEST_PATH_IMAGE054
、
Figure 381410DEST_PATH_IMAGE055
、
Figure 303230DEST_PATH_IMAGE056
、
Figure 226186DEST_PATH_IMAGE057
、
Figure 270366DEST_PATH_IMAGE058
、
Figure 983500DEST_PATH_IMAGE059
、
Figure 974590DEST_PATH_IMAGE060
、
Figure 17632DEST_PATH_IMAGE061
、
Figure 934511DEST_PATH_IMAGE062
。
在本发明实施例中核苷酸衍生物修饰有可切割链基团，可切割链基团是指响应于外部刺激（例如，酶、亲核/碱性试剂、还原剂、光照射、亲电/酸性试剂、有机金属和金属试剂或氧化剂）而可正交切割的（例如，可特异性切割）的链基团。在正交切割反应中，使用的切割剂包括但不限于Na2S2O4）、THP)、TEC、DTT、弱酸、Pd（0）或光照射（例如紫外线照射）等，所述可切割连接基团是具有以下任意一种结构的基团：
Figure 164635DEST_PATH_IMAGE063
、
Figure 959415DEST_PATH_IMAGE064
、
Figure 591385DEST_PATH_IMAGE065
、
Figure 873638DEST_PATH_IMAGE066
）、
Figure 856637DEST_PATH_IMAGE067
、
Figure 189530DEST_PATH_IMAGE068
、
Figure 676006DEST_PATH_IMAGE069
、
Figure 200266DEST_PATH_IMAGE070
、
Figure 404982DEST_PATH_IMAGE071
；
其中，R1’，R2’各自独立地为卤素、-H、C1-C5脂肪链中的一种。
所述可反应性基团是能够与携带有荧光基团的互补基团进行特异性正交连接反应的缀合物反应性基团。所述的正交连接反应的化学反应包括但不限于∶施陶丁格连接反应，铜离子催化的叠氮与炔基的环加成反因，环张力驱动的叠氮与炔基的环加成反应，地高辛与地高辛抗体间的结合反应，狄尔斯—阿尔德反应，Suzuki交叉偶联反应，疏基和疏基衍生物的二硫键形成反应，巯基与马来酰亚胺形成硫醚的反应，疏基和烯烃衍生物的光催化自由基加成反应，疏基和炔基衍生物的光催化自由基加成反应，磺酰氟交换反应，生物素与链霉亲和素之间的结合反应，氨基与活化酯之间的反应。
所述荧光基团则来自于如下任意一种或多种荧光染料：AF488、AF532、AF633、AF680、AF660、AF700、AF647、AF594、AF555、AF568、CY3、CY5、CY5.5、CY7、CY7.5、ROX、R6G、ATTO495、ATTO532、ATTO700、ATTO680、ATTO655、ATTO647N、ATTO594、ATTO Rho101、ATTO590、ATTO Thio12、FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CAL Fluor Orange 560、TAMRA、CAL Fluor Red 610、TEXAS RED、CAL Fluor Red635、iFluor488、iFluor514、iFluor532、iFluor546、iFluor555、iFluor568、iFluor590、iFluor610、iFluor633、iFluor647、iFluor680、iFluor700、iFluor710、Quasar705、Quasar670。
所述环境高敏荧光染料是能够快速响应环境的变化，如极性,pH，电压，光源和粘度等而改变发光颜色，荧光发射波长或强度的荧光染料。所述的正交连接反应的化学反应包括但不限于各种已知的广泛用于荧光探针、化学传感器、微环境变化检测、生物成像、分子开关和相分离可视化等领域的环境敏感荧光染料，所述环境高敏荧光染料包括但不局限于如下荧光染料：Cy-7、Dylight 800、IRDye 800、Alexa Fluor 790、HiLyte Fluor 750、Ovster 800、Rhodamine isothiocyanate、Texas Red derivatives、Alexa Fluor 680、DyLight 680、Cy5.5 NHS ester (~67O nm, Lumiprobe)、Alexa Fluor 546、DyLight 549、Oregon Green 514、Carboxylic Acid、pHrodoTM Red、6-Carboxynaphthofluorescein、7-Hydroxycoumarin-3-carboxylic acid、SNARFR-5F、SNARFB-4F、SNARFR-1、BCECF、CyPHER5E、HCyC-647、Square-650-pH、6-Carboxy-4,5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein。
一种基因测序方法，包括如下步骤：
S1，分别制备前述任一项所述的化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6、化合物7、化合物8，且化合物1、化合物2、化合物3、化合物4各自独立的标记有荧光基团或可反应活性基团，且化合物4或不存在；所述化合物1、化合物2、化合物3、化合物4各自独立的具备式（I）或式（II）结构；所述化合物5、化合物6、化合物7、化合物8各自独立的具备式（III）结构：
Figure 541565DEST_PATH_IMAGE072
，
Figure 882548DEST_PATH_IMAGE073
，
Figure 846218DEST_PATH_IMAGE074
；
其中，R1为不同的碱基，所述碱基为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶中的一种；
R2各自独立地为能够进行正交切割反应的保护基团；
R3各自独立地为氢、单磷酸基团、多磷酸基团中的一种；
R4，R5各自独立地为荧光基团和可反应活性基团中的一种，或不存在；
R6各自独立地为卤素、-H、-OH、N3和C2-C10柔性链中的一种；
X1，X2各自独立地为-O、-OH、-CH2、-CF2、-CCl2、-CFCl、-NH和-S中的一种;
L1，L2，L3各自独立地为连接基团和可切割连接基团中的一种，或不存在。
S2，将待测序的核酸模板链接于测试载体上，通过扩增形成待测核酸分子簇；
S3,将化合物1、化合物2、化合物3，或化合物1、化合物2、化合物3、化合物4和聚合酶同时加入S2体系中进行核苷酸聚合反应得一中间态复合体；
S4，洗去未反应的化合物1、化合物2、化合物3，或化合物1、化合物2、化合物3、化合物4维持S3的中间态复合体状态，并检测记录每个并入的核苷酸衍生物的荧光标记，判断DNA模板上对应位置的碱基；
S5，将化合物5、化合物6、化合物7、化合物8和聚合酶加入S4处理后的反应体中进行核苷酸聚合反应；
S6，往S5反应后的体系中加入切割液洗去化合物5、化合物6、化合物7、化合物8中的可切割保护基团，移除溶液相并用缓冲液冲洗干净；
S7,洗去S6中反应后替换下来的化合物1、化合物2、化合物3，或化合物1、化合物2、化合物3、化合物4；
S8，重复步骤S3至S7一次或多次。
根据不同测序需求，可以采用不同的方法来实现，各方法在在个别步骤中有所不同，它们的区别是：
第一种是在S1步骤中分别制备化合物1、化合物2、化合物3、化合物4，化合物5、化合物6、化合物7、化合物8，使化合物1、化合物2、化合物3、化合物4分别标记激发和发射波长均不同的荧光基团，也可以选择不制备化合物4，化合物1-4各自独立的具备式（Ia）或式（IIa）结构：
Figure 538231DEST_PATH_IMAGE075
，
Figure 416188DEST_PATH_IMAGE076
；
此时L1为各自独立地为连接基团或不存在，R4各自独立地为不同的荧光基团；
步骤S2中则是将待测序的核酸模板连接于测试载体上，通过扩增形成待测核酸分子簇，如将测序的核酸模板链接于芯片或微球上形成待测核酸分子簇；
步骤S3中各化合物和聚合酶M同时加入S2反应体系进行核苷酸聚合反应，聚合酶M能识别相应的化合物并将其任意一种并入生长的核酸链的3′端，由于X基团的存在，不能正常形成磷酸二酯键，链延长终止，此时化合物1、化合物2、化合物3、化合物4中的任意一种化合物和聚合酶M以及核酸模板链形成一中间态复合体；
步骤S4中洗去未反应的化合物1、化合物2、化合物3、化合物4，维持S3步骤的中间态复合体状态；检测每个并入的核苷酸衍生物的荧光标记并拍照存储图像来鉴别所述核酸链的3′端所并入的核苷酸衍生物，据此判断DNA模板上对应位置的碱基；
步骤S5中化合物5、化合物6、化合物7、化合物8能将S3步骤的中间态复合体中的化合物1、化合物2、化合物3、化合物4替换并形成磷酸二酯键达到链延长的目的，由于化合物5-8中R2可切割保护性基团的存在，每次链延长只有单个碱基掺入DNA链；
步骤S6中加入切割缓冲液脱去化合物5-8中的可切割保护性基团R2，移除溶液相用缓冲液冲洗干净，洗去替换下来的化合物1、化合物2、化合物3、化合物4，得到天然无疤痕的核苷酸，利于下一个碱基的掺入。
第二中方法则是在步骤S1中，分别制备化合物1、化合物2、化合物3、化合物5、化合物6、化合物7、化合物8，化合物1标记染料A；化合物2标记染料B；化合物3同时标记染料A和B，或者化合物3同时标记染料A和可反应活性基团，化合物1-3各自独立的具备式（Ib）或式（IIb）结构：
Figure 375791DEST_PATH_IMAGE077
，
Figure 540057DEST_PATH_IMAGE078
；
其中，L1各自独立地为连接基团；
步骤S2中是将待测序的核酸模板连接于测试载体上，通过扩增形成待测核酸分子簇，如将核算模板固定在芯片上，通过桥式扩增构建待测核酸分子簇；
步骤S3中聚合酶M能识别相应的化合物并将其任意一种并入生长的核酸链的3′端，由于5’-OH端β-CH2基团的存在，不能正常形成磷酸二酯键，链延长终止，此时化合物1-3中的任意一种和聚合酶M以及核酸模板链形成一中间态复合体；
步骤S4中若化合物3为携带一个荧光基团和一个活性基团（例如biotin）结构时，还需加入能和活性基团特异性结合的携带染料B的活性物质，例如水溶性染料B-链霉亲和素，结合反应后洗去多余物质；检测每个并入的核苷酸衍生物的荧光标记并拍照存储图像来鉴别所述核酸链的3′端所并入的核苷酸衍生物,此时，化合物1在滤光片通道1中能检测到荧光信号，在滤光片通道2中检测不到荧光信号（或信号很弱）；化合物2在滤光片通道1中检测不到荧光信号（或信号很弱），在滤光片通道2中能检测到荧光信号，化合物3在滤光片通道1和滤光片通道2中都能检测到荧光信号；可据此判断并入的核苷酸衍生物类别和DNA模板上对应位置的碱基。由于化合物4的缺失，在滤光片通道1和滤光片通道2中都检测不到荧光信号可据此判断待测DNA模板上对应位置的碱基；
其余步骤则和第一种方法相同。
第三种方法则是，在步骤S1中分别制备化合物1、化合物2、化合物3、化合物5、化合物6、化合物7、化合物8，化合物1标记染料A；化合物2标记可反应活性基团；化合物3标记染料B，染料B是环境高敏荧光基团，能发出与染料A相同荧光信号的荧光基团，化合物1、化合物2、化合物3各自独立的具备式（Ia）或式（IIa）结构：
Figure 453786DEST_PATH_IMAGE079
，
Figure 135434DEST_PATH_IMAGE080
，
其中，L1各自独立地为连接基团；
R4各自独立地为不存在、能够发岀荧光信号的环境高敏荧光基团、能发出相同荧光信号的荧光基团、能够进行连接反应的可反应性基团；
步骤S2中是将待测序的核酸模板连接于测试载体上，通过扩增形成待测核酸分子簇，如将核算模板固定在芯片上，通过桥式扩增构建第一核酸双链分子簇；
步骤S3则是将化合物1、化合物2、化合物3和聚合酶同时加入S2体系中进行核苷酸识别聚合反应，聚合酶M能识别相应的化合物并将其任意一种并入生长的核酸链的3′端，由于5’-OH端β-CH2基团的存在，不能正常形成磷酸二酯键，链延长终止。此时化合物1-3中的任意一种和聚合酶M以及核酸模板链形成一中间态复合体；
步骤S4则包括如下步骤：S4a，洗去未反应得化合物1、化合物2、化合物3，之后加入扫描缓冲液调节反应环境使得化合物3上标记的染料B能够被激发，染料B发出与染料A相同的荧光信号，检测荧光信号并通过拍照、存储图像来记录荧光信号；S4b，洗去扫描缓冲液，加入染料A标记的活性基团，该活性基团能够与化合物2上的可反应活性基团发生特异性结合反应，从而将荧光基团A引入化合物2，使其发出荧光信号；S4c，调节反应环境，淬灭化合物3上荧光基团的荧光，此变化对化合物1和化合物2没有影响，但是能够使化合物3上的环境高敏荧光基团荧光淬灭，检测不到荧光信号；S4d，加入扫描缓冲液，激发光源检测荧光信号并通过拍照、存储图像来记录荧光信号，之后洗去扫描缓冲液；
步骤S5中化合物5、化合物6、化合物7、化合物8能将S3步骤的中间态复合体中的化合物1、化合物2、化合物3替换并形成磷酸二酯键达到链延长的目的，由于化合物5-8中3’-OH可切割保护性基团的存在，每次链延长只有单个碱基掺入DNA链；
步骤S6中加入切割试剂THP对芯片进行处理，脱去化合物5、化合物6、化合物7、化合物8 3’-位置处的保护基团重新生成游离的3’-OH，同时洗去替换下来的化合物1、化合物2、化合物3，利于下一个碱基的掺入。
这样在每个循环测试步骤过程中两次拍照获得图像之后，对同一个位置的核酸双链分子簇的荧光信号进行比较，根据同一位置的DNA链在前后两张照片上的荧光信号变化可以识别出并入的核苷酸衍生物的化合物，相应的，可确定该DNA模板上对应位置上的碱基类型。
具体实施例1：化合物1、化合物2、化合物3、化合物4具有式Ia-1或式IIa-1结构：
Figure 218053DEST_PATH_IMAGE081
，
Figure 490903DEST_PATH_IMAGE082
；
化合物5、化合物6、化合物7、化合物8具有式IIIa结构：
Figure 157507DEST_PATH_IMAGE083
；
Base代表不同的碱基,本实施例中B分别为腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）或尿嘧啶（U）
Dye代表不同激发和发射波长的荧光染料,本实施例中Dye分别为AF532,Cy5,AF568,IF700，
Block为可切割保护性基团，本实施例中Block为N3或S-S-Et基团
具有式Ia-1的化合物1、化合物2、化合物3、化合物4的合成路线如下所示：
Figure 174005DEST_PATH_IMAGE084
；
具有式IIa-1的化合物1、化合物2、化合物3、化合物4的合成路线如下所示：
Figure 108200DEST_PATH_IMAGE085
；
具有式IIIa-1的化合物5、化合物6、化合物7、化合物8的合成路线如下所示：
Figure 551951DEST_PATH_IMAGE086
；
在其优选的实施例中化合物1、化合物2、化合物3、化合物4,化合物5、化合物6、化合物7、化合物8的具体结构，第一种方案是：
Figure 971431DEST_PATH_IMAGE087
，
Figure 791620DEST_PATH_IMAGE088
，
Figure 583252DEST_PATH_IMAGE089
，
Figure 463483DEST_PATH_IMAGE090
，
Figure 839101DEST_PATH_IMAGE091
，
Figure 400663DEST_PATH_IMAGE092
，
Figure 106189DEST_PATH_IMAGE093
，
Figure 891742DEST_PATH_IMAGE094
；
第二种方案是：
Figure 754656DEST_PATH_IMAGE095
，
Figure 916647DEST_PATH_IMAGE096
，
Figure 694590DEST_PATH_IMAGE097
，
Figure 916624DEST_PATH_IMAGE098
，
Figure 266834DEST_PATH_IMAGE099
，
Figure 966936DEST_PATH_IMAGE100
，
Figure 584737DEST_PATH_IMAGE101
，
Figure 977672DEST_PATH_IMAGE102
；
其基因测序方法如下∶
a)将待测DNA模板固定至芯片上，通过桥式扩增构建核酸双链分子簇；
b)将化合物1、化合物2、化合物3、化合物4和聚合酶M同时加入反应体系，进行核苷酸识别聚合反应，聚合酶M能识别相应的化合物并将其任意一种并入生长的核酸链的3′端，由于5’-OH端β-CH2基团的存在，不能正常形成磷酸二酯键，链延长终止。此时化合物1-4中的任意一种和聚合酶M以及核酸模板链形成一中间态复合体；
c)洗去未反应的化合物1、化合物2、化合物3、化合物4，维持步骤b的中间态复合体状态；检测每个并入的核苷酸衍生物的荧光标记并拍照存储图像来鉴别所述核酸链的3′端所并入的核苷酸衍生物；
d)将化合物5、化合物6、化合物7、化合物8和聚合酶同时加入以上核酸双链分子簇反应体系进行核苷酸聚合反应，此时，化合物5、化合物6、化合物7、化合物8能将b步骤的中间态复合体中的化合物1、化合物2、化合物3、化合物4替换并形成磷酸二酯键达到链延长的目的，由于化合物5-8中R2可切割保护性基团的存在，每次链延长只有单个碱基掺入DNA链。
e)加入切割缓冲液脱去化合物5-8中的3’-端保护性基团，移除溶液相用缓冲液冲洗干净，同时洗去替换下来的化合物1、化合物2、化合物3、化合物4，利于下一个碱基的掺入。
f)重复步骤a-e一次或多次。
具体实施例2：化合物1、化合物2、具备式（Ia）或式（IIa）的结构,化合物3（Ib）或式（IIb）的结构；化合物5、化合物6、化合物7、化合物8具备式（III）的结构，如化合物1、化合物2具有式Ia-1或式IIa-1结构：
Figure 815178DEST_PATH_IMAGE103
，
Figure 522234DEST_PATH_IMAGE104
，
化合物3具有式Ib-1或式IIb-1结构：
Figure 997472DEST_PATH_IMAGE105
，
Figure 561308DEST_PATH_IMAGE106
；
化合物5、化合物6、化合物7、化合物8具有式IIIa结构：
Figure 886110DEST_PATH_IMAGE107
，
Base代表不同的碱基,本实施例中B分别为腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）或尿嘧啶（U）。
Dye1和Dye2各自独立地为能发出不相同荧光信号的荧光基团，AG为能够进行连接反应的可反应性基团。
Block为可切割保护性基团，本实施例中Block为N3或S-S-Et基团。
化合物1、化合物2、化合物5、化合物6、化合物7、化合物8合成路线与具体实施例1中相同。
具有式Ib-1的化合物3的合成路线如下所示：
Figure 928015DEST_PATH_IMAGE108
，
具有式IIb-1的化合物3的合成路线如下所示：
Figure 520409DEST_PATH_IMAGE109
，
在其优选的实施例中化合物1、化合物2、化合物3、化合物5、化合物6、化合物7、化合物8的具体结构一种方案如下：
Figure 520726DEST_PATH_IMAGE110
，
Figure 67245DEST_PATH_IMAGE111
，
Figure 178420DEST_PATH_IMAGE112
，
Figure 628249DEST_PATH_IMAGE113
，
Figure 737151DEST_PATH_IMAGE114
，
Figure 770966DEST_PATH_IMAGE115
，
Figure 653209DEST_PATH_IMAGE116
；
在该种方案中化合物3还可以是如下结构：
Figure 721659DEST_PATH_IMAGE117
；
另一种方案是：
Figure 798200DEST_PATH_IMAGE118
,
Figure 319311DEST_PATH_IMAGE119
,
Figure 303447DEST_PATH_IMAGE120
,
Figure 727869DEST_PATH_IMAGE121
,
Figure 975310DEST_PATH_IMAGE122
,
Figure 186980DEST_PATH_IMAGE123
,
Figure 974808DEST_PATH_IMAGE124
;
在该种方案中化合物3还可以是如下结构：
Figure 454068DEST_PATH_IMAGE125
。
采用其进行基因测序的方法是如下步骤∶
g)将待测DNA模板固定至芯片上，通过桥式扩增构建核酸双链分子簇；
h)将化合物1、化合物2、化合物3和聚合酶M同时加入反应体系，进行核苷酸识别聚合反应，聚合酶M能识别相应的化合物并将其任意一种并入生长的核酸链的3′端，由于5’-OH端β-CH2基团的存在，不能正常形成磷酸二酯键，链延长终止。此时化合物1-3中的任意一种和聚合酶M以及核酸模板链形成一中间态复合体；
i)洗去未反应的化合物1、化合物2、化合物3，维持步骤b的中间态复合体状态(若化合物3为携带一个荧光基团和一个活性基团（例如biotin）结构时，还需加入能和活性基团特异性结合的携带第二种染料的活性物质（例如水溶性Cy5-链霉亲和素），结合反应后洗去多余物质)；检测每个并入的核苷酸衍生物的荧光标记并拍照存储图像来鉴别所述核酸链的3′端所并入的核苷酸衍生物,此时，化合物1在滤光片通道1中能检测到荧光信号，在滤光片通道2中检测不到荧光信号（或信号很弱）；化合物2在滤光片通道1中检测不到荧光信号（或信号很弱），在滤光片通道2中能检测到荧光信号，化合物3在滤光片通道1和滤光片通道2中都能检测到荧光信号；可据此判断并入的核苷酸衍生物类别和DNA模板上对应位置的碱基。由于化合物4（例如dGTP衍生物）的缺失，在滤光片通道1和滤光片通道2中都检测不到荧光信号可据此判断待测DNA模板上对应位置的碱基（例如胞嘧啶C）；
j)将化合物5、化合物6、化合物7、化合物8和聚合酶同时加入以上核酸双链分子簇反应体系进行核苷酸聚合反应，此时，化合物5、化合物6、化合物7、化合物8能将S3步骤的中间态复合体中的化合物1、化合物2、化合物3替换并形成磷酸二酯键达到链延长的目的，由于化合物5-8中R2可切割保护性基团的存在，每次链延长只有单个碱基掺入DNA链。
k)加入切割缓冲液脱去化合物5-8中的可切割保护性基团R2，移除溶液相，用缓冲液冲洗干净，同时洗去替换下来的化合物1、化合物2、化合物3，得到天然无疤痕的核苷酸，利于下一个碱基的掺入。
l)重复步骤a-e一次或多次。
具体实施例3：化合物1、化合物2、化合物3、化合物4具备式（Ia）或式（IIa）的结构；化合物5、化合物6、化合物7、化合物8具备式（III）的结构；如化合物1、化合物2、化合物3具有式Ia-2或式IIa-2结构：
Figure 669149DEST_PATH_IMAGE126
，
Figure 899273DEST_PATH_IMAGE127
，
化合物5、化合物6、化合物7、化合物8具有式IIIa结构：
Figure 694054DEST_PATH_IMAGE128
，
Base代表不同的碱基,实施例中B分别为腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）或尿嘧啶（U）
Dye代表环境敏感荧光染料或能发出相同荧光信号的荧光基团，
AG为能够进行连接反应的可反应性基团。
Block为可切割保护性基团，某些优选的实施方案中Block为N3或S-S-Et基团
具有式Ia-2的化合物1、化合物2、化合物3的合成路线如下所示：
Figure 815769DEST_PATH_IMAGE129
，具有式IIa-2的化合物1、化合物2、化合物3的合成路线如下所示：
Figure 405014DEST_PATH_IMAGE130
，
具有式IIIa-1的化合物5、化合物6、化合物7、化合物8的合成路线如下所示：
Figure 388013DEST_PATH_IMAGE131
，
在其优选的技术方案中，化合物1、化合物2、化合物3、化合物5、化合物6、化合物7、化合物8的结构一种为：
Figure 422703DEST_PATH_IMAGE132
，
Figure 705917DEST_PATH_IMAGE133
，
Figure 731642DEST_PATH_IMAGE134
，
Figure 139620DEST_PATH_IMAGE135
，
Figure 512089DEST_PATH_IMAGE136
，
Figure 118651DEST_PATH_IMAGE137
，
Figure 315277DEST_PATH_IMAGE138
；
另一种方案中的结构是：
Figure 741710DEST_PATH_IMAGE139
，
Figure 180520DEST_PATH_IMAGE140
，
Figure 641588DEST_PATH_IMAGE141
，
Figure 743536DEST_PATH_IMAGE142
，
Figure 922845DEST_PATH_IMAGE143
，
Figure 168275DEST_PATH_IMAGE144
，
Figure 483850DEST_PATH_IMAGE145
；
利用其进行基因测序的方法如下述步骤∶
m)将待测DNA模板固定至芯片上，通过桥式扩增构建核酸双链分子簇；
n)化合物1、化合物2、化合物3和聚合酶M同时加入反应体系，进行核苷酸识别聚合反应，聚合酶M能识别相应的化合物并将其任意一种并入生长的核酸链的3′端，由于5’-OH端β-CH2基团的存在，不能正常形成磷酸二酯键，链延长终止。此时化合物1-3中的任意一种和聚合酶M以及核酸模板链形成一中间态复合体；
o)洗去未反应的dNTPs，加入扫描缓冲液，调整pH值为6.8，以640nm光源为激发波长检测荧光信号，拍照，存储图像A；
p)洗去扫描缓冲液，加入水溶性Cy5-链霉亲和素，所述处理对化合物1和化合物3没有影响，同时Cy5-链霉亲和素能够特异性的与化合物2上Biotin结合，从而将荧光基团Cy5引入化合物2，使其发出荧光信号；
q)调整pH值为7.5，弱碱性环境对化合物2和化合物3没有影响，但是能够使化合物1上的HCyC-647荧光淬灭，640nm光源下检测不到荧光信号；
r)加入扫描缓冲液，以640nm光源为激发波长检测荧光信号，拍照，存储图像B；
s)洗去扫描缓冲液，将化合物5、化合物6、化合物7、化合物8和聚合酶同时加入以上核酸双链分子簇反应体系进行核苷酸聚合反应，此时，化合物5、化合物6、化合物7、化合物8能将b步骤的中间态复合体中的化合物1、化合物2、化合物3替换并形成磷酸二酯键达到链延长的目的，由于化合物5-8中3’-OH可切割保护性基团的存在，每次链延长只有单个碱基掺入DNA链。
t)加入切割试剂THP对芯片进行处理，脱去化合物5、化合物6、化合物7、化合物83’-位置处的保护基团重新生成游离的3’-OH，同时洗去替换下来的化合物1、化合物2、化合物3，利于下一个碱基的掺入。
u)重复进行步骤(b)-(h)；
v)在每个循环测试步骤过程中两次拍照获得的图像之后，对同一个位置的核酸双链分子簇的荧光信号进行比较，若在扫描图像A和扫描图像B中均有荧光信号，则并入的核苷酸衍生物的为化合物3（A碱基衍生物，Cy5标记），相应的，可确定该DNA模板上对应位置上的碱基为T；若在扫描图像A和扫描图像B中均无荧光信号，则并入的核苷酸衍生物的为化合物8（G碱基衍生物，无荧光标记，步骤b中缺失的化合物4所对接的碱基），相应的，可确定该DNA模板上对应位置上的碱基为C；若在扫描图像A中有信号，而扫描图像B中无荧光信号，则并入的核苷酸衍生物的为化合物1（T碱基，环境敏感染料HCyC647标记），相应的，可确定该DNA模板上对应位置上的碱基为A；若在扫描图像A中无信号，而扫描图像B中有荧光信号，则并入的核苷酸衍生物的为化合物2（C碱基，Biotin标记），相应的，可确定该DNA模板上对应位置上的碱基为T。如表1中所示，表1：实施例3检测结果及对应碱基。
Figure 22278DEST_PATH_IMAGE146
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种核苷酸衍生物，其特征在于：包含如下组分：聚合酶、化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6、化合物7、化合物8；
其中所述化合物1、化合物2、化合物3、化合物4各自独立的标记有荧光基团或可反应活性基团，且化合物4或不存在，所述化合物1、化合物2、化合物3、化合物4各自独立的具备式（I）或式（II）结构：
Figure 632096DEST_PATH_IMAGE001
，
Figure 50439DEST_PATH_IMAGE002
；
所述化合物5、化合物6、化合物7、化合物8均是在3’位置处的羟基被保护基团修饰的核苷酸类似物，且所述保护基团能被切割脱离重新将3’-OH裸露出来，它们各自独立的具有式（III）的结构：
Figure 280563DEST_PATH_IMAGE003
：
其中，R1为不同的碱基，所述碱基为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶中的一种；
R2各自独立地为能够进行正交切割反应的保护基团；
R3各自独立地为氢、单磷酸基团、多磷酸基团中的一种；
R4，R5各自独立地为荧光基团和可反应活性基团中的一种，或不存在；
R6各自独立地为卤素、-H、-OH、N3和C2-C10柔性链中的一种；
X1，X2各自独立地为-O、-OH、-CH2、-CF2、-CCl2、-CFCl、-NH和-S中的一种;
L1，L2，L3各自独立地为连接基团和可切割连接基团中的一种，或不存在。
2.根据权利要求1所述核苷酸衍生物，其特征在于：所述碱基是以下任意一种结构的化合物：
Figure 544186DEST_PATH_IMAGE004
、
Figure 441734DEST_PATH_IMAGE005
、
Figure 765400DEST_PATH_IMAGE006
、
Figure 341874DEST_PATH_IMAGE007
、
Figure 409188DEST_PATH_IMAGE008
、
Figure 895664DEST_PATH_IMAGE009
、
Figure 387300DEST_PATH_IMAGE010
、
Figure 451071DEST_PATH_IMAGE011
、
Figure 322075DEST_PATH_IMAGE012
、
Figure 663058DEST_PATH_IMAGE013
、
Figure 328526DEST_PATH_IMAGE014
、
Figure 879593DEST_PATH_IMAGE015
。
3.根据权利要求1所述核苷酸衍生物，其特征在于：所述保护基团是能被聚合酶有效识别,能掺入生长中的DNA链中,并在每一轮SBS测序后能被切割脱离的3’-OH修饰基团，所述可切割连接基团是指链接5’磷酸或碱基的荧光基团、高敏荧光基团、能发出相同荧光信号的荧光基团、能够进行连接反应的可反应活性基团之间的任意一种小分子基团。
4.根据权利要求3所述核苷酸衍生物，其特征在于:所述能发出相同荧光信号的荧光基团是指在同一激发光源波长下能够发出和选用的环境高敏荧光染料一致或接近的发射波长的荧光，并被检测判断为同一荧光信号的非环境高敏荧光染料。
5.根据权利要求3所述核苷酸衍生物，其特征在于：所述保护基团是具有以下任意一种结构的基团：
Figure 554288DEST_PATH_IMAGE016
、
Figure 15356DEST_PATH_IMAGE017
、
Figure 851725DEST_PATH_IMAGE018
、
Figure 765454DEST_PATH_IMAGE019
、
Figure 102895DEST_PATH_IMAGE020
、
Figure 884381DEST_PATH_IMAGE021
、
Figure 157231DEST_PATH_IMAGE022
、
Figure 151732DEST_PATH_IMAGE023
、
Figure 168229DEST_PATH_IMAGE024
、
Figure 72731DEST_PATH_IMAGE025
、
Figure 375537DEST_PATH_IMAGE026
、
Figure 998279DEST_PATH_IMAGE027
。
6.根据权利要求3所述核苷酸衍生物，其特征在于：所述可切割连接基团是具有以下任意一种结构的基团：
Figure 552888DEST_PATH_IMAGE028
、
Figure 702110DEST_PATH_IMAGE029
、
Figure 51183DEST_PATH_IMAGE030
、
Figure 20276DEST_PATH_IMAGE031
）、
Figure 378576DEST_PATH_IMAGE032
、
Figure 254741DEST_PATH_IMAGE033
、
Figure 40294DEST_PATH_IMAGE034
、
Figure 496683DEST_PATH_IMAGE035
、
Figure 127516DEST_PATH_IMAGE036
；
其中，R1’，R2’各自独立地为卤素、-H、C1-C5脂肪链中的一种。
7.一种基因测序方法，其特征在于:包括如下步骤：
S1，分别制备权利要求1-6任一项所述的化合物1、化合物2、化合物3、化合物4，化合物5、化合物6、化合物7、化合物8，且化合物1、化合物2、化合物3、化合物4各自独立的标记有荧光基团或可反应活性基团，且化合物4或不存在；所述化合物1、化合物2、化合物3、化合物4各自独立的具备式（I）或式（II）结构；所述化合物5、化合物6、化合物7、化合物8各自独立的具备式（III）结构：
Figure 251330DEST_PATH_IMAGE037
，
Figure 942205DEST_PATH_IMAGE038
，
Figure 761257DEST_PATH_IMAGE039
；
其中，R1为不同的碱基，所述碱基为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶中的一种；
R2各自独立地为能够进行正交切割反应的保护基团；
R3各自独立地为氢、单磷酸基团、多磷酸基团中的一种；
R4，R5各自独立地为荧光基团和可反应活性基团中的一种，或不存在；
R6各自独立地为卤素、-H、-OH、N3和C2-C10柔性链中的一种；
X1，X2各自独立地为-O、-OH、-CH2、-CF2、-CCl2、-CFCl、-NH和-S中的一种;
L1，L2，L3各自独立地为连接基团和可切割连接基团中的一种，或不存在
S2，将待测序的核酸模板链接于测试载体上，通过扩增形成待测核酸分子簇；
S3,将化合物1、化合物2、化合物3，或化合物1、化合物2、化合物3、化合物4和聚合酶同时加入S2体系中进行核苷酸聚合反应得一中间态复合体；
S4，洗去未反应的化合物1、化合物2、化合物3，或化合物1、化合物2、化合物3、化合物4维持S3的中间态复合体状态，并检测记录每个并入的核苷酸衍生物的荧光标记，判断DNA模板上对应位置的碱基；
S5，将化合物5、化合物6、化合物7、化合物8和聚合酶加入S4处理后的反应体系中进行核苷酸聚合反应；
S6，往S5反应后的体系中加入切割液洗去化合物5、化合物6、化合物7、化合物8中的可切割保护基团，移除溶液相并用缓冲液冲洗干净；
S7,洗去S6中反应后替换下来的化合物1、化合物2、化合物3，或化合物1、化合物2、化合物3、化合物4；
S8，重复步骤S3至S7一次或多次。
8.根据权利要求7所述基因测序方法，其特征在于：所述化合物1、化合物2、化合物3、各自独立的具备式（Ia）或式（IIa）结构：
Figure 585993DEST_PATH_IMAGE040
，
Figure 439680DEST_PATH_IMAGE041
；
所述步骤S2中是将测序的核酸模板链接于测试载体上，通过扩增形成待测核酸分子簇，且L1各自独立地为连接基团或不存在。
9.根据权利要求7所述基因测序方法，其特征在于：所述步骤S1中分别制备权利要求1-6任一项所述的化合物1、化合物2、化合物3、化合物5、化合物6、化合物7、化合物8，所述化合物1、化合物2、化合物3各自独立的具备式（Ia）或式（IIa）结构：
Figure 301456DEST_PATH_IMAGE042
，
Figure 732438DEST_PATH_IMAGE043
，
其中；化合物1和化合物3标记有不同的荧光基团，且化合物3的荧光基团能发出和化合物1的荧光基团相同的荧光信号，化合物2标记有可反应活性基团，L1各自独立地为连接基团；
所述步骤S2中是将核算模板固定在测试载体上，通过桥式扩增构建核酸分子簇；
所述步骤S3是将化合物1、化合物2、化合物3和聚合酶同时加入进行核苷酸识别聚合反应；
所述步骤S4包括如下步骤：S4a，洗去未反应的化合物1、化合物2、化合物3，之后加入扫描缓冲液调节反应环境使得化合物3能够被激发发出荧光，检测并记录荧光信号；S4b，洗去扫描缓冲液，加入化合物1所标记荧光基团的活性基团，将该荧光基团引入化合物2中使得化合物2能发出荧光信号；S4c，调节反应环境，淬灭化合物3上荧光基团的荧光；S4d，加入扫描缓冲液，激发光源检测记录荧光信号，之后洗去扫描缓冲液。
10.根据权利要求7所述基因测序方法，其特征在于：所述化合物1、化合物2、化合物4各自独立的具备式（Ia）或式（IIa）结构：化合物3具备式（Ib）或式（IIb）结构：
Figure 970652DEST_PATH_IMAGE044
，
Figure 675915DEST_PATH_IMAGE045
，
Figure 98807DEST_PATH_IMAGE046
，
Figure 892450DEST_PATH_IMAGE047
；
所述步骤S2中是将测序的核酸模板链接于测试载体上，通过扩增形成待测核酸分子簇，且L1各自独立地为连接基团。
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