CN114574477A - 一种细胞迁移双向调控方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种细胞迁移双向调控方法，利用微纳体声波谐振器产生的GHz波段的高频超声在液体中衰减产生的声流体现象实现对金纳米棒的细胞导入及声流体和金纳米棒共同作用下对细胞双向迁移的调控。在声流体的作用下，利用不同生物分子修饰的金纳米棒均可以在几分钟内大量的进入细胞甚至细胞核中；结合金纳米棒抑制细胞迁移和声流体有利于促进细胞迁移的相反作用，可以在特定的条件下实现对细胞迁移运动的抑制或者促进的双向调控。基于微纳压电体声波谐振器的微米尺寸，其产生的声流体范围与谐振器大小相匹配，因此可以通过缩小谐振器尺寸，缩小声流体的作用范围，实现对细胞定区域的金纳米棒导入以及迁移作用调控。

Description

一种细胞迁移双向调控方法
技术领域
本发明涉及一种细胞迁移双向调控方法，特别地涉及一种基于金纳米棒和声流体的细胞迁移双向调控的方法。
背景技术
细胞机械运动对于一系列生理、发育及疾病相关过程至关重要。以可控的方式调节细胞运动能够纠正因细胞迁移不当而引起的生理缺陷和疾病。细胞机械运动是一个复杂的过程，从形态极化开始，并进一步由细胞膜下方的肌动蛋白丝的局部组装驱动产生的延伸状的突起引导，完成一个定向的迁移过程。一般认为，肌动蛋白丝的动态组装和分解是细胞机械运动的马达，通常可以通过生化试剂、刚度调节、纳米结构以及机械剪切力来调节。而金纳米棒作为一种棒状的纳米结构，发现其能通过抑制肌动蛋白细胞骨架的组装进而改变细胞刚度实现对细胞迁移抑制的影响。
为了充分利用金纳米棒在细胞迁移方面的作用，有效的细胞内递送是先决条件。在各种细胞递送方式中，流体剪切力更具无创性，其主要通过增加磷脂双分子层的不连续性，进而增加细胞膜的通透性，实现细胞外物质的细胞内递送，并且对递送的物质类型没有限制。首先，基于微流控的微流体—药物导入装置，是片上实验室及单细胞物质递送的潜在工具。通过制造不同形状、尺寸及微结构的流道，使液体在其中流动时产生速度突变，进而对流道内的细胞施加流体剪切力的作用，实现细胞膜通透性的改变以及外界物质的导入，并且不会对细胞的生物活性产生影响。
上述流体剪切力通常是在物理结构的阻碍下以被动的方式产生，而对既定的物理结构难以实现对流体剪切力的连续性调节。相反，超声波是一种主动的形成流体的方式，它主要依靠由超声振动驱动流体产生的流体剪切力产生的膜暂时性破坏增强细胞膜的通透性实现对外源物质的细胞导入。低频超声通常会结合微泡使用，超声触发的微泡空化、微泡震动等会在附近的细胞膜上施加剪切力的作用，进而实现对细胞膜通透性的调节。为了减少基于气泡的方法中所需的特殊造影剂以及气泡定位性差的影响，开发了基于声辐射力或者声流体作用的无气泡的细胞开孔方法。利用超声换能器、叉指电极等产生的超声波(KHz-MHz)在传播过程中，会有声辐射力或者声辐射力泄露产生的声流体效应作用与细胞膜表面，进而增强细胞膜的通透性使得外界物质可以加速进入细胞内部。
目前已有的药物导入方式，无法同时实现单细胞导入以及大范围细胞导入。与此同时，现有的对细胞迁移运动进行调控的手段更趋向于单向的调控，而无法利用同一种手段实现可控的双向调控，使得应用平台的适用范围有限。因此，一种聚焦范围可调、可控的实现细胞迁移方向调控的手段亟待提出，使其在药物导入、细胞迁移调控方面有更广阔的应用空间，同时也可以实现多功能集成的治疗平台。
发明内容
为了解决现有技术中的问题，本发明提供一种细胞迁移双向调控方法，解决现有技术中细胞迁移运动进行调控的手段更趋向于单向的调控，而无法利用同一种手段实现可控的双向调控，使得应用平台的适用范围有限的问题。
为了能使以上问题得到改善，我们选取了微纳压电体声波谐振器—一种基于标准的微纳机电系统流程制造的超声谐振器，在金纳米棒细胞导入及对细胞的迁移运动影响方面进行了实验探究。微纳机电系统是尺寸在毫米甚至微米尺寸的独立系统，以硅为主要材料，融合了光刻、腐蚀、微加工和精密机械加工等制造技术的电子机械器件。该器件体积小、质量轻、性能稳定并且具有优异的集成潜能，在生化传感、气体传感、微米尺寸粒子筛选等方面具有广泛的应用潜力。我们选取的谐振器能够产生GHz波段的特超声，该频段超声波在液体中传播时会产生迅速衰减，并驱动液体流动产生涡旋，即声流体效应。当声流体受到固体表面阻碍时，会由于速度突变而在接触面产生剪切力的作用，这样会使得细胞一直处于剪切力的作用下。本发明开发了一种高效快速的金纳米棒导入手段，同时结合金纳米棒和声流体的双重作用，实现了对细胞迁移的双向调控，为搭建多功能集成的疾病治疗平台奠定基础。
本发明的技术方案如下:
本发明提出了一种利用声流体现象和金纳米棒实现细胞双向迁移的调控方法，该方法是利用能产生GHz波段特超声的微纳压电体声波谐振器产生的声流体效应实现金纳米棒的细胞导入，后续二者结合实现对细胞迁移的双向调控。
本发明的方法通过调整谐振器的工作时间，对声流体的工作时间进行调整。声流体的合适强度范围应为：进入细胞的金纳米棒不会产生团聚，并且便于使用荧光显微镜的方式对导入细胞的额金纳米棒进行观测。
本发明的方法通过调整声流体、纳米棒(与细胞共孵育导入)、声流体与金纳米棒共同作用、金纳米棒(与细胞共孵育导入)-声流体依次作用的不同作用方法，实现对细胞迁移方向的双向调控。
本发明的方法中谐振器产生的声流体范围与谐振器大小相匹配，可以通过改变谐振器尺寸实现不同范围内细胞的金纳米棒导入或者迁移方向调控。
具体说明如下：该实验选用微纳压电体声波谐振器和金纳米棒，选用任意贴壁细胞。利用生物兼容性高的有机聚合物制作腔体，该腔体主要用来盛放液体，并且控制细胞与谐振器之间的距离。
(1)利用生物分子(具有细胞靶性或非靶性)对金纳米棒表面进行修饰，增强金纳米棒的生物兼容性。
(2)将细胞稀释至0.5×105—1×105浓度，培养在盖玻片表面，盖玻片放入培养皿中，并在所有样品中加入相同体积的完全培养基，之后放入培养箱中培养至细胞完全贴壁；
(3)将样品培养皿中的完全培养基吸去，并用磷酸缓冲液对细胞进行冲洗；
调整谐振器工作时间，重复进行以下实验筛选使金纳米棒大量进入细胞并且不会影响细胞活性的条件为最优条件：
(4)将腔体放置于器件上方，并且中心对齐；在腔体中加满金纳米棒溶液，之后将培养有细胞的载玻片放置在腔体上方，细胞与谐振器相对，并且轻轻按压，使载玻片与腔体紧密结合没有缝隙，同时保证腔体内没有气泡；
(5)打开信号发生器，谐振器会即刻作用产生声流体；声流体受到腔体上方盖玻片阻碍时会产生速度突变，进而有剪切力产生，作用于细胞；
(6)经过持续设置时间的声流体刺激后，对作用后的细胞利用显微镜观察、拍照，对得到的细胞图片进行金纳米棒发光分析，利用发光强度对导入的金纳米棒量对比，挑选金纳米棒不会产生团聚并且对后续观察没有影响的导入时间。
(7)观察完毕后，将细胞放入培养箱中继续培养两天；
(8)结合(6)和(7)中细胞观察及细胞生长状态，确定最优的金纳米棒导入时间。
在确定了金纳米棒导入时间之后，利用划痕实验对细胞在不同作用方法下的迁移能力进行评估。划痕实验是一种简捷的测定细胞迁移运动和修复类似体外伤口愈合的模型。利用微量枪头或硬物在培养的单层贴壁细胞中心区域划线，以去除中央部分的细胞，然后继续培养至实验设定时间后取出，观察周边细胞的迁移能力。
(9)重复上述1—3的实验步骤。
(10)完成细胞准备之后，对细胞进行不同的方式刺激：
A.声流体刺激：重复上述步骤4—5。尤其的，在步骤(4)的操作过程中，将腔体内的金纳米棒溶液换为完全培养基；在声流体对细胞持续刺激至设定时间后，使用微量枪头对细胞中心区域划痕，再将细胞放入培养箱中继续培养，每隔24小时利用显微镜对其生长情况进行观察拍照；
B.金纳米棒(与细胞共孵育导入)：重复上述步骤4—5。尤其的，在步骤(5)的操作过程中，信号发生器不开启，没有声流体产生。在使用金纳米棒与细胞共孵育至设定时间后，使用微量枪头对细胞中心区域划痕，再将细胞放入培养箱中继续培养，每隔24小时利用显微镜对其生长情况进行观察拍照；
C.声流体与金纳米棒共同作用：重复上述步骤4—5。在声流体与金纳米棒共同作用至设定时间后，使用微量枪头对细胞中心区域划痕，再将细胞放入培养箱中继续培养，每隔24小时利用显微镜对其生长情况进行观察拍照；
D.金纳米棒(与细胞共孵育导入)-声流体依次作用：首先重复上述操作B，培养24小时之后，利用显微镜对细胞的生长情况进行观察拍照；之后重复上述操作A，特别地，在步骤A的操作过程中，要将谐振器对准划痕处细胞刺激至设定时间，并且不需要进行划痕步骤。完成以上操作用，将细胞放入培养箱中继续培养，每隔24小时利用显微镜对其生长情况进行观察拍照；
E.没有任何刺激：使用微量枪头对细胞生长中心区域划痕，之后将细胞放入培养箱中继续培养，每隔24小时利用显微镜对其生长情况进行观察拍照。
上述有机聚合物优选为聚二甲基硅氧烷或聚甲基丙烯酸甲酯。
对于实现不同范围内细胞的金纳米棒导入或者迁移方向调控，可以首先使用仿真软件COMSOL multiphysics进行仿真预估；该软件是一款大型的高级数值仿真软件，其优势在于多物理场的耦合，可以使复杂的物理现象再计算机上完美呈现；在该软件中，可以使用结构力学模块，并结合选取的谐振器制作参数(各物理层的材料及厚度，器件大小)对其震动进行仿真。
关于声流体作用范围与谐振器尺寸大小的关系，将谐振器震动与流体场耦合，可以仿真出在本实验系统中声流体可调控的范围。因此，可以根据目标区域的大小要求，选择大小相匹配的谐振器，重复步骤1-10，便可以实现不同范围内细胞的金纳米棒导入及细胞迁移方向的调控。
本发明优点和优异效果：本发明提供了一种基于GHz特超声产生的声流体现象加速金纳米棒进入细胞并且实现对细胞迁移运动的双向调控的方法。GHz特超声在液体中传播过程中会产生快速的能量衰减，驱动液体产生微涡旋，即声流体现象。当声流体受到长有细胞的盖玻片阻碍时，会由于速度突变产生剪切力作用与细胞。细胞在流体剪切力的作用下会产生细胞膜通透性变化、细胞骨架重组以及细胞刚度变化，促进金纳米棒进入细胞，以及对细胞的迁移能力进行调控，从而达到实验目的。
本发明的优势：一、细胞在声流体产生的流体剪切力作用可以实现金纳米棒的高效快速递送；二、在声流体的作用下，细胞可以在没有外部药物接入的情况下加速其迁移运动；三、在声流体和金纳米棒不同的刺激下，可以对细胞的迁移运动实现促进或者抑制的不同方向调控；四、基于微纳压电体声波谐振器的不同微米尺寸，可以通过控制谐振器大小控制声流体作用范围，实现对不同范围细胞的金纳米棒导入或者迁移运动调控。
附图说明
图1：利用声流体实现金纳米棒导入以及细胞迁移运动调控实验系统图；
图2：金纳米棒表面修饰示意图；
图3：不同刺激方法下细胞迁移运动结果图；
图4：谐振器产生的声流体仿真图；
图5：声流体实现金纳米棒细胞导入的范围结果图；
其中：1-微纳压电体声波谐振器；2-声流体；3-贴壁生长的细胞；4-盖玻片；5-金纳米棒；6-有机聚合物制成的腔体；7-信号发生器；8-功率放大器；9-稳压电源；10-声流体范围。
具体实施方式
下面将结合本发明的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
本发明实施例中，选用了人体宫颈癌细胞系海拉细胞(可以选用任意贴壁细胞替换)。该实施例中的系统图如图1所示，所使用的微纳压电体声波谐振器1频率为1.58GHz。谐振器的信号激励系统主要由三个部分成：信号发生器7、功率放大器8以及稳压电源9。由信号发生器7产生频率为1.58GHz的正弦信号，信号经过功率放大器8放大之后，输入谐振器1；其中稳压电源9为功率放大器8供电。利用聚二甲基硅氧烷制作腔体6，腔体中装满液体，其中5表示不同修饰的金纳米棒。
为了增强海拉细胞的贴壁能力，实验中选取了使用多聚赖氨酸包被的盖玻片4进行细胞培养；
1.使用不同分子量的巯基聚乙二醇荧光素(SH-PEG1K-FITC,SH-PEG2K-FITC,SH-PEG8K-FITC，不具备生物靶向性)以及巯基多肽荧光素(SH-RGD-FITC，具有细胞膜靶向性)对金纳米棒进行修饰(图2)，以增强金纳米棒的生物兼容性，及在荧光素的定位下，便于使用荧光显微镜对金纳米棒进行观察。
2.细胞稀释至1×105个/mL，并培养在盖玻片表面，盖玻片放入培养皿中，并在所有样品中加入相同体积的完全培养基，之后放入培养箱中培养至细胞完全贴壁；
3.将细胞已有的培养液吸去，利用磷酸缓冲液对细胞冲洗三次；
4.将腔体放置于器件上方，并且中心对齐；在腔体中加满修饰好的金纳米棒溶液，之后将培养有细胞的盖玻片放置在腔体上方，细胞与谐振器相对，并且轻轻按压，使载玻片与腔体紧密结合没有缝隙，同时保证腔体内没有气泡；
5.之后对谐振器1施加交流信号。如图1所示，谐振器1会在交流信号激励下振动产生GHz波段的特超声，声波在液体中传播时产生的能量衰减会驱动液体运动产生微涡旋2，即声流体。该声流体作用于细胞至设定时间。在经过持续设置时间的声流体刺激后，对作用后的细胞利用荧光显微镜进行观察、拍照，并对得到的细胞图片进行荧光强度和反射场强度分析，从而对金纳米棒进入细胞的量进行对比；
首先选取使用SH-PEG1K-FITC分子修饰的金纳米棒重复步骤2-6，通过对进入细胞的金纳米棒在荧光场和反射场的发光强度对比，对金纳米棒的量进行了估计。统计结果如表1所示。在声流体作用2分钟至10分钟时，金纳米棒在荧光场和反射场的发光强度都呈现持续增加的趋势，这也说明随着声流体作用时间的增加进入细胞的金纳米棒的数量逐渐增多。当声流体作用至15分钟时，金纳米棒在反射场的强度还是呈现增加的状态，但是在荧光场中发光强度出现了降低。这意味着金纳米棒在细胞内部出现团聚而对其荧光强度产生了影响。因此，为了便于在荧光场中对金纳米棒进行观察，选取了10分钟的声流体作用时间。
表1：不同时间下进入细胞的金纳米棒在荧光场和反射场的发光强度统计
Figure BDA0003522810150000061
在确定了谐振器作用时间为10分钟之后，重复步骤2-6，并对不同修饰的金纳米棒进入细胞的量进行统计。如表2所示，通过荧光强度对比发现，相较于依赖于细胞内吞作用的共孵育的导入手段，不同修饰的金纳米棒在声流体的作用下进入细胞的量都大大增加。
故此表明声流体是一种高效的可用于外界纳米材料细胞导入的物理手段。
表2：在声流体的作用下进入细胞内的不同修饰的金纳米棒的荧光强度统计
金纳米棒@PEG<sub>8K</sub> 金纳米棒@PEG<sub>2K</sub> 金纳米棒@PEG<sub>1K</sub> 金纳米棒@RGD
声流体 16.66617 47.34967 71.991 124.877
共孵育导入 2.4406 14.77 15.15725 29.382
6.结合以上实验结果，选取了10分钟的声流体作用时间以及SH-RGD-FITC修饰的金纳米棒，结合划痕实验对细胞在不同作用方法下的迁移能力进行了评估。
7.重复上述2—3的实验步骤。
8.完成细胞准备之后，对活细胞进行细胞核染色，便于后期使用荧光显微镜对细胞进行观察。
之后对细胞进行不同的方式刺激：
A.声流体刺激：重复上述步骤4—5。在步骤4的操作中，将腔体内的金纳米棒溶液换位完全培养基；在声流体对细胞持续作用10分钟后，使用200ul的移液枪头对细胞中心区域进行划痕，再将细胞放入培养箱中继续培养，每隔24小时利用显微镜对其生长情况进行观察拍照；
B.金纳米棒(与细胞共孵育导入)：重复上述步骤4—5。尤其的，在步骤5的操作过程中，信号发生器不开启，没有声流体产生。在使用金纳米棒与细胞共孵育10分钟后，使用200ul的移液枪头对细胞中心区域划痕，再将细胞放入培养箱中继续培养，每隔24小时利用显微镜对其生长情况进行观察拍照；
C.声流体与金纳米棒共同作用：重复上述步骤4—5。在声流体与金纳米棒共同作用至设定时间后，使用200ul的移液枪头对细胞中心区域划痕，再将细胞放入培养箱中继续培养，每隔24小时利用显微镜对其生长情况进行观察拍照；
D.金纳米棒(与细胞共孵育导入)-声流体依次作用：首先重复上述操作B，培养24小时之后，利用显微镜对细胞的生长情况进行观察拍照；之后重复上述操作A，特别地，在步骤A的操作过程中，要将谐振器对准划痕处细胞刺激10分钟，并且不需要进行划痕步骤。完成以上操作用，将细胞放入培养箱中继续培养，每隔24小时利用显微镜对其生长情况进行观察拍照；
E.没有任何刺激：使用200ul的移液枪头对细胞生长中心区域划痕，之后将细胞放入培养箱中继续培养，每隔24小时利用显微镜对其生长情况进行观察拍照。
图3是在这几种不同刺激下，细胞的划痕实验结果图。首先，在没有任何刺激下，细胞会保持一个正常的生长状态，细胞逐渐向划痕处生长，在培养至48小时时，细胞趋向于填满划痕。细胞在只有声流体刺激时，细胞向划痕处的生长速度更快，在培养至48小时的时候，划痕已经被细胞完全填满。因此声流体会加快细胞的迁移速度。细胞在只有金纳米棒刺激的时候，细胞在培养48小时之后仍然没有向划痕处迁移的迹象，这也说明了金纳米棒本身对细胞的迁移运动由抑制作用。当细胞受到声流体和金纳米棒的共同刺激时，细胞在培养48小时之后，会有细胞向划痕处生长，但是并不明显。这种现象表明声流体促进细胞迁移和金纳米棒抑制细胞迁移的作用产生了中和，而由于金纳米棒在声流体的作用下相较于共孵育的方式进入细胞内部的量更多，更大程度的中和了声流体对细胞迁移运动的促进作用，因此细胞在这种刺激下整体呈现为迁移抑制。当细胞依次受到金纳米棒刺激和声流体刺激时，细胞的迁移作用先受到抑制，而后续在受到声流体作用后，细胞重新开始向划痕出生长，说明金纳米棒对细胞迁移产生的抑制作用在声流体的作用下得到了修复。依据实验结果总结来看，声流体能够加速细胞的迁移运动，而金纳米棒会抑制细胞的迁移运动，通过调整这两种方法对细胞的刺激顺序，可以使细胞的迁移运动得到有效可控的调控。
图4是该实施例中所使用的微纳压电谐振器1所产生的声流体仿真图。图中2表示声波在液体中传播时驱动流体产生的微涡旋，即声流体，其中箭头的方向表示液体流动的方向。当涡旋受到固体表面阻碍时，液体速度会产生突变，并且在固体表面产生流体剪切力作用于细胞3上，并且有能力对细胞膜的通透性产生影响，促进金纳米棒进入到细胞内部，实现金纳米棒的细胞导入，同时实现流体机械力对细胞的迁移能力的调控。在该实例中所使用的谐振器应不限于此一种，应包括能够驱使液体产生微涡旋的声学谐振器件。
对于声流体的作用范围，其于谐振器尺寸相匹配。如图4所示，本实施例中选取的谐振器1开始产生声流体对细胞施加激励时，其产生的声流体范围10决定了经受刺激的细胞范围。如图5所示，利用金纳米棒在声流体作用下的细胞导入范围对该声流体的作用范围进行了表征。只有椭圆内部的细胞实现了在声流体介导下的金纳米棒导入，这也说明了声流体的作用范围即为椭圆区域，其尺寸也与仿真图中的声流体范围10相匹配，直径在1毫米左右。因此可以通过调整谐振器的尺寸大小实现不同范围内细胞的金纳米棒导入或者迁移方向调控。

Claims (7)

1.一种细胞迁移双向调控方法，其特征在于，使用能产生GHz波段特超声的微纳压电体声波谐振器产生的声流体效应实现金纳米棒的细胞导入，后续二者结合实现对细胞迁移的双向调控。
2.根据权利要求1所述细胞迁移双向调控方法，其特征在于，通过调整所述谐振器的工作时间，对声流体的工作时间进行调整；声流体的合适强度范围应为：保证使生长在盖玻片上的细胞不脱壁，保持正常的生长状态，并且便于使用荧光显微镜的方式对导入细胞的金纳米棒进行观测。
3.根据权利要求1所述细胞迁移双向调控方法，其特征在于，通过调整声流体、金纳米棒、声流体与金纳米棒共同作用、金纳米棒-声流体依次作用的不同作用方法，实现对细胞迁移方向的双向调控。
4.根据权利要求1所述细胞迁移双向调控方法，其特征在于，通过改变谐振器的尺寸，实现不同范围内细胞的金纳米棒导入，或者迁移方向调控。
5.根据权利要求1所述细胞迁移双向调控方法，其特征在于，具体采用如下步骤：利用生物兼容性高的有机聚合物制作腔体，该腔体主要用来盛放液体，并且控制细胞与谐振器之间的距离；
(1)利用生物分子对金纳米棒表面进行修饰，增强金纳米棒的生物兼容性；
(2)将细胞稀释至0.5×105—1×105浓度，培养在盖玻片表面，盖玻片放入培养皿中，并在所有样品中加入相同体积的完全培养基，之后放入培养箱中培养至细胞完全贴壁；
(3)将样品培养皿中的完全培养基吸去，并用磷酸缓冲液对细胞进行冲洗；
调整谐振器工作时间，重复进行以下实验筛选使金纳米棒大量进入细胞并且不会影响细胞活性的条件为最优条件：
(4)将腔体放置于器件上方，并且中心对齐；在腔体中加满金纳米棒溶液，之后将培养有细胞的载玻片放置在腔体上方，细胞与谐振器相对，并且轻轻按压，使载玻片与腔体紧密结合没有缝隙，同时保证腔体内没有气泡；
(5)打开信号发生器，谐振器会即刻作用产生声流体；声流体受到腔体上方盖玻片阻碍时会产生速度突变，进而有剪切力产生，作用于细胞；
(6)经过持续设置时间的声流体刺激后，对作用后的细胞利用显微镜观察、拍照，对得到的细胞图片进行金纳米棒发光分析，利用发光强度对导入的金纳米棒量对比，挑选不会对观察产生影响的导入时间；
(7)观察完毕后，将细胞放入培养箱中继续培养两天；
(8)结合(6)和(7)中细胞观察及细胞生长状态，确定最优的金纳米棒导入时间；
在确定了金纳米棒导入时间之后，利用划痕实验对细胞在不同作用方法下的迁移能力进行评估；划痕实验是一种简捷的测定细胞迁移运动和修复类似体外伤口愈合的模型，利用微量枪头或硬物在培养的单层贴壁细胞中心区域划线，以去除中央部分的细胞，然后继续培养至实验设定时间后取出，观察周边细胞的迁移能力；
(9)重复上述1—3的实验步骤；
(10)完成细胞准备之后，对细胞进行不同的方式刺激：
A.声流体刺激：重复上述步骤4—5；尤其的，在步骤(4)的操作过程中，将腔体内的金纳米棒溶液换为完全培养基；在声流体对细胞持续刺激至设定时间后，使用微量枪头对细胞中心区域划痕，再将细胞放入培养箱中继续培养，每隔24小时利用显微镜对其生长情况进行观察拍照；
B.金纳米棒(与细胞共孵育导入)：重复上述步骤4—5；尤其的，在步骤(5)的操作过程中，信号发生器不开启，没有声流体产生；在使用金纳米棒与细胞共孵育至设定时间后，使用微量枪头对细胞中心区域划痕，再将细胞放入培养箱中继续培养，每隔24小时利用显微镜对其生长情况进行观察拍照；
C.声流体与金纳米棒共同作用：重复上述步骤4—5；在声流体与金纳米棒共同作用至设定时间后，使用微量枪头对细胞中心区域划痕，再将细胞放入培养箱中继续培养，每隔24小时利用显微镜对其生长情况进行观察拍照；
D.金纳米棒(与细胞共孵育导入)-声流体依次作用：首先重复上述操作B，培养24小时之后，利用显微镜对细胞的生长情况进行观察拍照；之后重复上述操作A，特别地，在步骤A的操作过程中，要将谐振器对准划痕处细胞刺激至设定时间，并且不需要进行划痕步骤。完成以上操作用，将细胞放入培养箱中继续培养，每隔24小时利用显微镜对其生长情况进行观察拍照；
E.没有任何刺激：使用微量枪头对细胞生长中心区域划痕，之后将细胞放入培养箱中继续培养，每隔24小时利用显微镜对其生长情况进行观察拍照。
6.根据权利要求5所述细胞迁移双向调控方法，其特征在于，有机聚合物采用具有高生物兼容性的有机聚合物。
7.根据权利要求6所述细胞迁移双向调控方法，其特征在于，有机聚合物采用聚二甲基硅氧烷或聚甲基丙烯酸甲酯。
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