CN114573689A - 连续纯化生物制药产品的系统和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物制药领域，并且具体地涉及一种连续纯化生物制药产品的系统，其包含(1)至少一个亲和层析主单元；(2)至少一个病毒灭活主单元；和(3)至少一个浓缩和/或换液主单元；在每个主单元的上游或下游各自独立地任选存在的一个或更多个缓冲体积；其中，每个缓冲体积配置至少一个重量传感器和/或至少一个液位传感器，所述重量传感器和液位传感器与管理系统通信连接；所述管理系统根据所述重量传感器和/或液位传感器的信号对所述纯化系统进行启动、继续和停止的控制；所述浓缩和/或换液单元是用于实施以连续操作进行的超滤或透析的单元，在所述浓缩和/或换液单元中，包含样品的流股的流动方向与滤出方向不同。

Description

连续纯化生物制药产品的系统和方法

技术领域

本发明涉及生物制药领域，并且具体地涉及一种连续流纯化工艺，纯化生物制药产品的系统。

背景技术

生物制药的靶分子通常为大分子，其生产过程较为复杂，包含多步纯化步骤及严格的清洁灭菌、除病毒流程。然而由于生物产品生产的复杂性，并且，为满足制药产品生产技术要求和监管规范，需要在生产过程中对多项指标进行检测和控制，不利于药品生产的连续化纯化生产，导致生产效率不高，产能不足，产品价格昂贵。

WO2020148119A1公开了将单克隆抗体的分批纯化工艺转化为连续纯化工艺的方法。其中抗体下游过程采用蛋白A(Protein A)亲和层析、阳离子交换层析、阴离子交换层析、病毒过滤和超滤/透析。Protein A亲和层析使用具有5根色谱柱的Bio SMB色谱法，可以生成连续的进料流和连续的洗脱液流。CEX采用并行批处理模式(parallel batch mode)，病毒过滤和超滤/透析均采用批处理模式(batch mode)。

CN106794424A公开了层析处理单元等与切向流过滤处理单元流体连通的连接系统使用的控制系统和方法。

发明内容

本发明提供一种进行连续纯化的纯化系统，其用于靶分子的连续、封闭和自动化纯化。

在一方面，本发明提供一种用于进行连续纯化的纯化系统，其包含

(1)至少一个亲和层析主单元，其中每个亲和层析主单元各自独立地包含一个或更多个亲和层析亚单元；

(2)至少一个病毒灭活主单元，其中病毒灭活主单元各自独立地包含一个或更多个病毒灭活亚单元；和

(3)至少一个浓缩和/或换液主单元，其中每个浓缩和/或换液主单元各自独立地包含一个或更多个浓缩和/或换液亚单元；

在每个主单元的上游或下游各自独立地任选存在的一个或更多个缓冲体积；每个所述主单元及缓冲体积之间通过可使料液流通的管路连接，

其中，每个缓冲体积配置至少一个重量传感器和/或至少一个液位传感器，所述重量传感器和液位传感器与管理系统通信连接；

所述管理系统根据所述重量传感器和/或液位传感器的信号对所述纯化系统进行启动、继续和停止的控制；

所述纯化系统纯化的靶分子是蛋白；

所述浓缩和/或换液单元是用于实施以连续操作进行的超滤或透析的单元，在所述浓缩和/或换液单元中，包含样品的流股的流动方向与滤出方向不同。

在另一方面，本发明提供一种纯化靶分子的方法，所述方法通过本发明的系统完成。

附图说明

图1为包含一个汇聚层的操作层示意图。

图2为单抗纯化系统示意图。

图3为在线目标蛋白定量检测系统组成示意图。

图4为在线目标蛋白定量检测系统组成示意图。

图5示出在线目标蛋白定量检测系统中流通池与系统其他装置的连接。

图6为在线目标蛋白定量检测系统中的流通池的结构示意图。

图7为图6中的A处放大图。

图8为在线HPLC装置示意图。

图9为存在一个汇聚层(阳离子交换层析主单元作为汇聚层)的纯化系统示意图。

图10为存在二个汇聚层(阳离子交换层析主单元作为汇聚层)的纯化系统示意图。

具体实施方式

以下将对本发明进一步详细说明，应理解，所述用语旨在描述目的，而非限制本发明。

一般术语和定义

除非另有说明，本文使用的所述技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员通常所理解的相同的含义。若存在矛盾，则以本申请提供的定义为准。当以范围、优选范围、或者优选的数值上限以及优选的数值下限的形式表述某个量、浓度或其他值或参数的时候，应当理解相当于具体揭示了通过将任意一对范围上限或优选数值与任意范围下限或优选数值结合起来的任何范围，而不考虑该范围是否具体揭示。除非另有说明，本文所列出的数值范围旨在包括范围的端点和该范围内的所有整数和分数(小数)。

除非文中另有说明，单数形式指代如“一种”、“该”，包含复数指代。表述“一种(个)或多种(个)”或者“至少一种(个)”可以表示1、2、3、4、5、6、7、8、9种(个)或更多种(个)。

术语“约”、“大约”当与数值变量并用时，通常指该变量的数值和该变量的所有数值在实验误差内(例如对于平均值95％的置信区间内)或在指定数值的±10％内，或更宽范围内。

术语“计量比”是将各种物质按一定的重量进行配比。

术语“任选”或“任选存在”是指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，该描述包括发生所述事件或情况和不发生所述事件或情况。

表述“包含”或与其同义的类似表述“包括”、“含有”和“具有”等是开放性的，不排除额外的未列举的元素、步骤或成分。表述“由…组成”排除未指明的任何元素、步骤或成分。表述“基本上由…组成”指范围限制在指定的元素、步骤或成分，加上任选存在的不会实质上影响所要求保护的主题的基本和新的特征的元素、步骤或成分。应当理解，表述“包含”涵盖表述“基本上由…组成”和“由…组成”。

在本文中可交换使用的术语“加工步骤”或“单元操作”指在纯化过程中使用一种或多种方法或装置以实现某种结果。可以用于纯化过程的加工步骤或单元操作的实例包括但不限于澄清、层析、病毒灭活、以及浓缩和/或换液。应当理解每个加工步骤或单元操作可以采用一个以上的步骤或方法或装置以实现该加工步骤或单元操作的预期结果。

术语“物料转换”广义地定义为特定物料在物理、化学或生物条件的影响下转换为另一种具有不同特性的物料。这种转换可以体现为物理性质的变化(例如熔化，溶解等)、化学性质的变化(例如化学反应，这样的反应可以是生物条件下进行的，例如酶催化的反应)或者作为混合物的物料在组成上发生变化(例如纯化过程)。其中，“物料”是指生产加工的对象，以及生产加工的产品。笼统地说，“物料”是指生产过程作用的物质对象，其涵盖的时间跨度为由生产过程初始(原料)至生产过程结束(最终产品)。

术语“批次生产”或“批次制造”表示相同的意义，并在本文中可以互换使用。批次生产是指以“批次工艺(batch process)”(也称为“批次处理(batch process)”、“间歇处理(batch process)”)或“批次操作(batch operation)”为特征的生产。

术语“连续生产”或“连续制造”或“连续纯化”(continuous manufacture,CM，或continuous purification)是指以连续工艺(continuous process)(也称为“连续处理(continuous process)”)或连续操作(continuous operation)为特征的生产或纯化。其中“连续”是指连续地将原料输入反应器，反应产物也连续地由反应器输出。在每一个时间点都同时有作为原料输入和作为产物输出的物料移动。“连续生产”或“连续制造”或“连续纯化”实现连续、封闭和自动化的进行靶分子的分离纯化，包括至少两个CM单元操作运行在时间上至少有一部分重叠。

连续制造可以在例如以下方面改进药品制造。例如，使用集成工艺，步骤减少，处理时间缩短；需要的设备占地面积较小；支持增强开发方法(例如，设计质量(QbD)和使用过程分析技术、使用数学模型)；对产品质量实时监控；并提供灵活的操作使得可以方便地进行工艺放大(scale-up)、工艺缩小(scale-down)和工艺外扩(scale-out)，以适应变化的供应需求。因此，采用连续制造进行药品生产被期望减少药品质量问题，降低制造成本，提高患者获得优质药物的机会。Novasep(法国Pompey)，Tarpon(马萨诸塞州伍斯特)，Semba(威斯康星州麦迪逊)和GE Healthcare(新泽西州皮斯卡塔韦)提供了几种商业化的连续层析系统，例如GE Healthcare的

PCC系统。Warikoo等人报道了

PCC系统与上游连续生物反应器整合，形成用亲和层析纯化单抗或重组酶的连续生物处理平台。

“仓对仓(bin to bin)”方式的连续制造是指通过在单个、断开的CM单元操作之间持续地进行物料转移，在工艺设计的较高维度(at a higher level of granularity)实现工艺链的连续操作。

本发明的连续制造方法指纯化靶分子的方法，其包括两个或更多个加工步骤(或单元操作)，从而来自一个加工步骤的产出直接流入方法中的下一加工步骤，没有中断和/或不需要在进行下一加工步骤之前收集来自加工步骤的整个体积的产出。在一优选实施方案中，两个或更多个加工步骤可以在它们的至少一部分持续时间中同时进行。换句话说，在连续方法的情况下，如本文所述，不必在下一加工步骤开始之前完成加工步骤，但是一部分样品移动通过加工步骤。术语“连续”还用于加工操作内的步骤，在这种情况下，在包括多个步骤的加工操作进行期间，样品连续流过进行加工操作所需的多个步骤。本文所述的这样的加工操作的一个实例是亲和层析步骤与浓缩和/或换液步骤。

本文所述的这样的加工操作的一个实例是抛光纯化操作，其包括以连续方式进行的多个步骤。在一特别具体的实例中，这样的加工操作包括CEX层析、阴离子交换/阳离子交换混合介质处理、AEX层析中的两个或更多个。

本文所述浓缩和/或换液步骤是指减少流体物料中的液体体积和/或交换缓冲体系。该步骤具体的作用是浓缩、换液或者浓缩和换液，可以由本领域技术人员根据步骤本身特性和/或工艺流程中与所述浓缩和/或换液步骤相邻的步骤的特性来判断。浓缩和/或换液步骤可以采取的方法例如有过滤和透析。过滤可以采用例如膜法(例如超滤)或凝胶过滤层析。过滤可以是切向流过滤(tangential flow filtration或cross flow filtration)或死端过滤(normal flow filtration或dead-end filtration)，优选地为切向流过滤，特别是单向切向流过滤(single-pass tangential flow filtration,SPTFF)。透析优选地为在位透析(in-line diafiltration,ILDF)。

如本文所述，连续方法还包括这样的方法，其中任何单一的单元操作中流体物质的输入或输出是不连续或间断的。这样的方法也可以称作“半连续”方法。例如，在本发明的一些实施方案中，单元操作(例如，结合和洗脱层析步骤)中的输入可以连续装载；但是输出可以间歇地收集，其中纯化过程中的其他单元操作是连续的。因此，在一些实施方案中，本文所述的方法和系统包括至少一个以批次操作进行的单元操作，而方法或系统中的其他单元操作可以以连续方式操作。

本文中的“缓冲体积”的作用在于实现连续工艺中物料分布的调节，提供缓冲以使物料以期望的流速在单元操作之间流动。缓冲体积可以是任何已知的形式，例如容器(比如缓冲罐、储液袋)，或可膨胀的管。应当理解，所述容器可以具备完全固定的形状，也可以是全部或部分可以发生形变的。

术语“缓冲罐”指在加工步骤之间或加工步骤内(例如，当单一的加工操作包括一个以上的步骤时)使用的任何容器或器皿或袋；其中来自一个步骤的产出流过缓冲罐至下一步。因此，缓冲罐不同于汇集罐，其并不意图盛放或收集来自步骤的整个体积的产出；而是取而代之使得来自一个步骤的产出能够连续流至下一步。

术语“单元”是指用于进行工艺技术步骤的装置或装置部分，或其以周期为单位的运行(operation cycle)。单元在纯化系统中能够实现特定功能。“单元”包括但不限于“主单元”和“亚单元”。“主单元”是指在一特定步骤中实现特定功能的装置或装置部分的集合，也可以理解为一个模块。主单元的实例包括但不限于层析主单元、浓缩和/或换液主单元、除病毒主单元，等。主单元之间通过流路相连接，以使物料在通过各个主单元的过程中，经历相应的工艺步骤。优选地，每个主单元以类似的补料速率同时运行，以便使生产时间最小化。“主单元”由一个或多个实现同类功能的“亚单元”组成。“亚单元”是指进行工艺技术步骤的装置或装置部分的一个周期的运行，也可以表述为一个运行周期。例如，任一亲和层析主单元可以包含一个或多个亲和层析亚单元，即一个或多个亲和层析柱各自独立地运行一个或多个周期。类似地，任一阳离子交换层析主单元、阴离子交换层析主单元或除病毒主单元可以包含一个或多个亚单元。“单元”的实施方式可以是已知能够实现期望的特定功能的装置。例如一个层析单元可以通过任何已知的层析装置实施，例如膜层析装置、层析柱，微珠、磁珠及其他固定相载体，多柱流动系统、流动床层析系统及其他层析系统，等。在一特定的实施方案中，一个层析亚单元是指一个层析柱或一个膜层析装置的一个运行周期，特别是以一个层析柱的一个运行周期。如本文使用的，单元具有一个或多个元件，元件选自工艺技术元件、服务技术元件、用于数据采集和处理的元件。

工艺技术元件(PTU,the process technology unit)包括用于进行步骤的元件，包括但不限于软管、过滤器、层析柱、容器等，其不与管理系统连接。

服务技术元件(the service technology unit,STU)包括单元的所有传感器和执行器。它们通过RIO与管理系统连接。STU的执行器可以是例如泵、阀，且传感器可以是例如UV测量、压力传感器或重量传感器等。

用于数据采集和处理的元件，在最简单的情况下是远程I/O、或局部智能，例如可编程逻辑控制(programmable logic control,PLC)或具有I/O层的基于PC的系统。在局部控制上执行单元的基本自动化。这两种系统变体在下文被称作RIO(registered input/output)。

术语“亚流”是指来自某一单元的向其相邻下游单元进行的物料输出形成的料流。其中，一个亚流是指某一亚单元向其相邻下游单元在时间上连续的一次物料输出形成的料流。例如，当亲和层析主单元为多柱位连续亲和层析设备时，其中任一层析柱的一个运行周期为一亲和层析亚单元，每一亲和层析亚单元的输出流作为下一步骤(相邻下游单元)的一个输入流。当存在多个亲和层析亚单元时，亲和层析主单元向相邻下游单元的输出流包含了多个亚流。对于其他类型的主单元(例如阳离子交换层析主单元)的输出流，也应如此理解。两个亚单元的输出流之间相互连续是指其中第一个亚单元的输出流结束时，第二个亚单元的输出流正好开始，即，两个亚单元的输出流之间在时间上是连续的，并且可以认为两个输出流共同形成一个连续的流。两个以上亚单元的输出流之间相互连续的情况也应作类似理解。两个亚单元的操作时间之间相互连续是指其中第一个亚单元的操作结束时，第二个亚单元的操作正好开始，即，两个亚单元的操作之间在时间上是连续的。两个以上亚单元的操作时间之间相互连续的情况也应作类似理解。在流过模式的层析主单元包含多个亚单元的情况下，假如其中两个或以上亚单元的操作时间之间是连续的，则可以理解所述两个或以上亚单元的输出流之间也应当是相互连续的。应当理解，在通常的连续流工艺中，缓冲体积向相邻下游单元的输出是完全连续的，其在本文中描述为仅包含一个亚流的输出流。

一个运行周期对应一定量的样品输入及该样品输出的过程，并且样品输入和样品输出的时间可以部分重叠、完全重叠或完全不重叠。例如以结合-洗脱模式进行层析，其中一个运行周期包含一次(即，一定量的)样品输入(结合)-样品输出(洗脱)的过程，在一个层析柱的一个运行周期中，样品输入和样品输出的时间部分重叠或完全不重叠，优选地完全不重叠。在一些情况下，例如以流过模式进行层析时，样品输入的时间和样品输出的时间分别是完全连续的，此时可以将特定时间长度指定为一个运行周期，所述特定时间长度对应于特定的样品输入量和/或特定的样品输出量，并且所述特定的样品输入量和/或特定的样品输出量对应于紧邻上游单元一个运行周期输出的产品量。也就是说，当划分这样的装置或装置部分的运行周期时，可以根据需要，将该装置或装置部分用于处理紧邻上游单元一个运行周期产生的样品并作为产品向下游输出的时间划分为一个运行周期。其中，用于处理紧邻上游单元一个运行周期产生的样品的时间包括接受样品(上样)的时间，因此所述运行周期开始的时间为开始接受紧邻上游单元一个运行周期产生的样品的时间。当特定主单元的样品输入的时间和样品输出的时间分别是完全连续的，该主单元的一个运行周期可以定义为用于处理紧邻上游主单元一个运行周期产生的样品并作为产品向下游输出的时间。在一些情况下一段时间(例如一个运行周期)的终点与另一段时间(例如另一运行周期)的起点为同一时间点，这样的情况不属于时间段的重叠，这样的情况也包含在所述“完全不重叠”的情况中。

应当理解，为了实现连续生产，对于特定装置或装置部分，两个或更多个运行周期之间可以部分重叠、完全重叠或完全不重叠，优选地部分重叠或完全不重叠。例如在一些实施方案中，所述以流穿模式进行层析的一个层析柱的特定运行周期中用于处理紧邻上游单元一个运行周期产生的样品的时间可以与另一运行周期(例如，上一运行周期)的所述将产品向下游输出的时间部分重叠或完全重叠，重叠的程度可以根据实现连续生产的需要来事先设定。在另一些实施方案中，所述以结合-洗脱模式进行层析的一个层析柱的特定运行周期与另一运行周期之间完全不重叠。为了实现连续生产，可以根据需要对特定主单元的多个亚单元的样品输入时间和/或样品输出时间进行统筹以实现该主单元样品输入时间的连续和/或样品输出时间的连续，或者，也可以根据需要借助缓冲体积，实现缓冲体积的紧邻上游主单元样品输出时间的连续和/或缓冲体积的紧邻下游主单元样品输入时间的连续。

应当理解，根据产品需求，或根据进样量，或根据纯化系统运行的时间长度，任一装置或装置部分可以任选地运行一个或多个运行周期，具体可以由管理系统进行控制。

在一实施方案中，任一进行工艺技术步骤的装置或装置部分(例如装置中的任一元件)的某个特定运行周期的长度均为可以测量、预期和控制的。

传统的抗体层析纯化步骤包括：(i)目标产物的浓缩和有害杂质的去除(捕获)，(ii)可选地，进一步去除大量杂质(enhance)，(iii)最后，去除剩余的痕量杂质和不需要的目标产物结构变体，例如目标产物的二聚体和多聚体(polish，“抛光”)。本文对于抗体层析纯化单元操作的讨论主要涉及亲和层析、离子交换层析，并且不排除任何已知可以用于纯化抗体的层析手段的使用，例如混合模式层析、疏水相互作用层析、尺寸排阻层析、羟基磷灰石层析，以及上述各种层析的任意组合。优选地，层析步骤选自亲和层析，离子交换层析及其组合。抗体的纯化还包括除病毒单元操作。除病毒单元操作可以采用已知的任意方法，只要其符合本发明的工艺设定的单元操作产品质量要求。除病毒单元操作的实例包括但不限于病毒灭活、除病毒过滤及其组合。

术语“工艺表征”是指对工艺进行表征的过程。其包括对参数进行测量、归类和评估。

术语“工艺设计空间”是指ICH Q8指南定义的设计空间。设计空间是指已证明可提供质量保证的输入变量(例如，材料属性)和过程参数的多维结合及相互作用。因此，设计空间由从过程表征研究中确定的重要和关键过程参数及其可接受范围来定义的。该定义本身不能由工艺设计者自行扩展，而是需要行业和监管机构来阐述。某种产品的设计空间必须经过监管评估和批准。建立设计空间的方法涉及工艺表征研究，并且总体上涉及三个关键步骤：1.进行风险分析以识别用于工艺表征的参数；2.使用DoE(design of experiments)试验设计来设计多变量的研究方案，以使研究能够获得适用于理解和定义设计空间的数据；3.执行研究方案并分析研究结果，以确定参数的重要性及其在建立设计空间中的作用，其中，评估参数对CQA的影响，基于统计学意义上显著影响CQA的工艺参数进行评价，并将确定对有CQA显著影响的工艺参数归类为CPP，并且计算重要和关键工艺参数的可接受范围，例如，通过估计的故障边缘的不确定性分析来确定参数的可接受范围。这些可接受的范围共同定义了设计空间。一般来说，可以通过放大/缩小数学模型来放大/缩小设计空间。

DoE一般用于查找仪器操作参数的范围，以了解样品制备的变化和方法精度的变化。

术语“表征范围”是指在工艺表征过程中检查的范围。“方法的可操作设计区间(method operable design range,MODR)”是指某一方法设计空间的中在监管允许的范围内可以改变的参数。

术语“质量源于设计(Quality by Design,QbD)”是指一种系统性的开发方法，它基于合理的科学和质量风险管理，从预定义的目标出发进行工艺设计，并强调对产品和过程的理解以及过程控制。QbD可促进制造工艺在批准的设计空间内的改进(例如使用PAT工具进行持续改进)，而无需进一步的法规审查，并可减少批准后的工艺变更申请。

术语“过程分析技术(Process Analytical Technologies,PAT)”被定义为：一个用于设计、分析、控制生产的体系，该体系通过实时测量原料、在制物料(in-processmaterials)及工艺的关键质量属性(critical quality attributes,CQA)和关键性能属性(critical performance attributes)，以保证最终产品质量(FDA PAT Guidance,2004)。PAT的概念是对设计空间的概念的补充。PAT的应用是QbD的一个组成部分，它基于对CQA的测量为工艺的反馈控制提供手段。

PAT框架的期望目标是设计和开发充分理解的工艺、在生产工艺结束时始终确保预设的质量。当达到以下情况时，认为工艺得到了充分理解：①识别和解释所有关键变化源；②变化可以通过工艺管理；③产品质量属性可以通过由所用原材料、工艺参数、生产、环境和其他条件建立的设计空间进行准确、可靠的预测。应用PAT可以获得对工艺的更根本性的了解，因此与传统生物制造相比有根本性的改进。例如，应用PAT可以帮助获得单变量或多变量统计过程控制(SPC或MSPC)模型。应当理解，仅仅通过改进分析技术并不能实现PAT，例如，对参数进行在线或在位检测并不意味实现PAT，因为其未识别和解释关键变化源，也没有为实现保证产品质量属性的在线控制提供帮助。QbD和PAT的预期目的仅为保证良好的产品质量，并且旨在开发可在更广泛的条件下运行的工艺。CQA的选择遵循同样的策略。然而采用PAT可能使CPP的选择和监测手段、控制策略相对于不采用PAT的情况发生变化，这样的变化是无法事先预期的。

术语“关键质量属性(CQA)”是一种物理、化学、生物学性质或特征，其应当在适当的限制，范围或分布内，以确保所需的产品质量。建立设计空间时，需要使现行生产质量控制程序始终如一地(有效地)达到关键质量属性范围。在设计空间内对工艺进行实施会让产品符合明确的CQA规范。

术语“关键工艺参数(critical process parameter,CPP)”是指工艺中显著影响CQA的工艺参数。

术语“检验结果偏差(out of specification,OOS)是指超标的检验结果，即，不符合法定质量标准或企业内控标准的检验结果。OOS是一种结果偏差，并且往往由生产操作引起的。为了工艺稳定性和确保产品质量，连续制造工艺一般需要预先考虑OOS的处理策略。OOS的处理一般包括执行相应的偏差分析(例如，是否是由于实验发生错误，如：实验不符合系统适应性或实验的接受标准(或不符合实验接受标准的一部份)，技术/仪器、原料是否存在异常)和偏差处理流程。

在位(in-line)检测又称为原位(in-situ)检测。在线(on-line)检测技术通常需要修改生物反应器以转移样品流。离线(off-line)或旁线(at-line)检测属于不连续分析方法，涉及取样或者样品前处理。一些文献将“在位”与“在线”统称为在线。相应地，在一些实施方案中，本发明描述的“在位”检测、“在位”设备和“在线”检测、“在线”设备均可以以“在位(in-line)”或“在线(on-line)”的方式实施。在一些特定的实施方案中，本发明描述的“在位”检测或“在位”设备以“在位”的方式实施。

“上游”是指在纯化系统中处在物料流通过程的靠前或上游位置；“下游”是指在纯化系统中处在物料流通过程的靠后或下游位置，在整个纯化系统的物料流通过程中。某个主单元或缓冲体积所处的位置为上游还是下游是相对的，以病毒灭活主单元为例，在一些实施方案中，亲和层析主单元位于病毒灭活主单元的上游，同时，浓缩和/或换液主单元位于病毒灭活主单元的下游。

某单元的“紧邻单元”是指在某个单元与其紧邻的单元之间除连接管路之外，没有其他的功能单元存在，紧邻单元可以是主单元也可以是缓冲体积；某主单元的“紧邻主单元”指在某个主单元与其紧邻主单元之间除连接管路和缓冲体积之外，没有其他的主单元存在；“紧邻上游主单元”指在某个主单元的上游与该主单元紧邻的主单元。

“重量传感器”指可以直接或间接感受到“缓冲体积”或“缓冲罐”的重量的传感器；“液位传感器”指可以直接或间接感受到“缓冲体积”或“缓冲罐”内液面高度或位置的传感器。

本发明的系统

在一方面，本发明提供一种用于进行连续纯化的纯化系统，其包含：

(1)至少一个亲和层析主单元，其中每个亲和层析主单元各自独立地包含一个或更多个亲和层析亚单元；

(2)至少一个病毒灭活主单元，其中病毒灭活主单元各自独立地包含一个或更多个病毒灭活亚单元；和

(3)至少一个浓缩和/或换液主单元，其中每个浓缩和/或换液主单元各自独立地包含一个或更多个浓缩和/或换液亚单元；

在每个主单元的上游或下游各自独立地任选存在的一个或更多个缓冲体积；每个所述主单元及缓冲体积之间通过可使料液流通的管路连接，

其中，每个缓冲体积配置至少一个重量传感器和/或至少一个液位传感器，所述重量传感器和液位传感器与管理系统通信连接；

所述管理系统根据所述重量传感器和/或液位传感器的信号对所述纯化系统进行启动、继续和停止的控制；

所述纯化系统纯化的靶分子是蛋白；

所述浓缩和/或主换液单元是用于实施以连续操作进行的超滤或透析的单元，在所述浓缩和/或换液主单元中，包含样品的流股的流动方向与滤出方向不同。

在一优选的实施方案中，所述纯化系统纯化的靶分子是蛋白，优选抗体，特别是单克隆抗体。在一实施方案中，所述亲和层析主单元依据靶分子的性质选自蛋白A亲和层析、蛋白G亲和层析、蛋白L亲和层析。在一具体的实施方案中，所述纯化系统纯化的靶分子是含有Fc片段的单抗。在另一具体的实施方案中，所述纯化系统纯化的靶分子是含有Fc片段的融合蛋白。

层析系统中的装置

1.概述

在一实施方案中，亲和层析主单元上游存在至少一个缓冲体积，并且任一主单元上游和下游均存在至少一个缓冲体积。

在一实施方案中，所述管理系统根据重量及液位信号来控制进行以下操作：

1.当亲和层析主单元上游的缓冲体积的重量传感器反馈值和/或液位传感器反馈值达到预设值时，纯化系统运行启动。在一优选的实施方案中，当亲和层析主单元上游的缓冲体积的重量传感器和液位传感器反馈值均达到预设值时，纯化系统运行启动。

2.当任一主单元上游的缓冲体积的重量传感器反馈值和/或液位传感器反馈值达到预设值时，启动该主单元运行。在一优选的实施方案中，当任一主单元上游的缓冲体积的重量传感器反馈值达到预设值时，启动该主单元运行。在另一优选的实施方案中，当任一主单元上游的缓冲体积的重量传感器和液位传感器反馈值均达到预设值时，启动该主单元运行。

3.当任一主单元上游的缓冲体积的重量传感器和/或液位传感器反馈值为下限值时，停止料液向该主单元转移，当单元操作完成后该主单元停止运行。在一优选的实施方案中，当任一主单元上游的缓冲体积的重量传感器和液位传感器反馈值均为下限值时，停止料液向该主单元转移，当单元操作完成后该主单元停止运行。在一实施方案中，当所述单元上游的缓冲体积的重量传感器反馈值再次到达2所述的预设值时，再次启动该主单元运行。

4.当任一主单元下游的缓冲体积的重量传感器和液位传感器反馈值均达到设定上限值时，该主单元停止运行。

在另一些方面，本发明还提供根据如前所述的用于进行连续纯化的纯化系统，其依次包含至少一个亲和层析主单元、至少一个病毒灭活主单元和至少一个浓缩和/或换液主单元；并且在至少一个所述亲和层析主单元的至少一个亲和层析亚单元目标料液流出所述亲和层析主单元之后，所述管理系统允许至少一个所述病毒灭活主单元的至少一个病毒灭活亚单元启动运行；在至少一个所述病毒灭活主单元的至少一个病毒灭活亚单元目标料液流出所述病毒灭活主单元之后，所述管理系统允许至少一个所述浓缩和/或换液主单元的至少一个浓缩和/或换液亚单元启动运行，并且所述管理系统允许所述亲和层析主单元的第一亚单元目标料液流出所述亲和层析主单元之后，所述病毒灭活主单元与所述亲和层析主单元运行时间至少一部分重叠；所述管理系统允许所述病毒灭活主单元的第一亚单元目标料液流出所述病毒灭活主单元之后，所述病毒灭活主单元与所述浓缩和/或换液主单元运行时间至少一部分重叠。

应当理解，当描述一个以上的单元的运行时间至少一部分重叠时，表示所述单元的运行时间之间在时间轴上出现重叠，并且并不限定所述一个以上的单元的运行在同一时间点开始或在同一时间点结束。在一实施方案中，表述“运行时间至少一部分重叠”表示某一单元的运行时间的约1％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％重叠。

在另一些方面，本发明还提供根据如前所述的用于进行连续纯化的纯化系统，在亲和层析主单元和浓缩和/或换液主单元之间，进一步包括至少一个阳离子交换层析主单元和/或至少一个阴离子交换层析主单元，所述阳离子交换层析主单元各自独立地包含一个或更多个阳离子交换层析亚单元，所述阴离子交换层析主单元各自独立地包含一个或更多个阴离子交换层析亚单元。

在另一些方面，本发明还提供根据如前所述的用于进行连续纯化的纯化系统，其依次包含：

(1)至少一个亲和层析主单元，其中每个亲和层析主单元各自独立地包含一个或更多个亲和层析亚单元；

(2)至少一个病毒灭活主单元，其中病毒灭活主单元各自独立地包含一个或更多个病毒灭活亚单元；

(3)至少一个阳离子交换层析主单元，所述阳离子交换层析主单元各自独立地包含一个或更多个阳离子交换层析亚单元；

(4)至少一个阴离子交换层析主单元，所述阴离子交换层析主单元各自独立地包含一个或更多个阴离子交换层析亚单元；和

(5)至少一个浓缩和/或换液主单元，其中每个浓缩和/或换液主单元各自独立地包含一个或更多个浓缩和/或换液亚单元。

在另一些方面，本发明还提供根据如前所述的用于进行连续纯化的纯化系统，在至少一个上游主单元的至少一个亚单元目标料液流出所述主单元之后，所述管理系统允许至少一个所述上游主单元的紧邻下游主单元的至少一个亚单元启动运行；并且所述管理系统允许任一所述上游主单元的第一亚单元目标料液流出所述上游主单元之后，所述上游主单元与其紧邻下游主单元运行时间至少一部分重叠。

在另一些方面，本发明还提供根据如前所述的用于进行连续纯化的纯化系统，所述连续纯化是连续、封闭、自动化的进行靶分子的分离纯化。

另外，本发明还提供一种用于靶分子的连续纯化方法，通过本发明的系统完成。其在一实施方案中，所述方法还包括使包含靶分子的澄清的细胞收获液(CCCF)流入如前所述的至少一个亲和层析主单元上游紧邻的缓冲体积，并使所述CCCF经如前所述的纯化系统分离纯化的步骤。

在一实施方案中，所述纯化系统包括在线目标蛋白定量检测系统。在线目标蛋白定量检测系统包含在位UV吸光度检测器、蛋白质浓度计算设备和蛋白质载量控制设备。在位UV吸光度检测器检测物料的紫外吸收值并将数据传送到蛋白质浓度计算设备。蛋白质浓度计算设备实时计算所述蛋白质浓度以及单位时间流经的目标蛋白总量；并将所述目标蛋白总量发送至蛋白质载量控制设备(DCS)。在线目标蛋白定量检测系统可以实时判断层析主单元的上样量，并控制层析主单元的上样终点，从而控制上样载量。

在位UV吸光度检测器是在线目标蛋白定量检测系统的一部分。

在一实施方案中，在所述纯化系统流通管道的相对于至少一个层析单元的上游和/或下游的位置，配置有一个或多个在位UV吸光度检测器，其与管理系统通信连接；

管理系统根据所述在位UV吸光度检测器在位检测的信号，来控制所述层析单元的上样(加载样品的过程)终点。

在一实施方案中，所述在位UV吸光度检测器在位检测层析单元的进料信号，其代表向所述层析单元的入口提供的进料物料的成分，和/或

所述在位UV吸光度检测器在位检测层析单元的流出物信号，其代表所述层析单元流出物的成分。

在一实施方案中，纯化系统流通管道的相对于至少一个层析主单元的上游配置有一个或多个在位UV吸光度检测器。

在一实施方案中，在位UV吸光度检测器包括：流通池，紫外线照射装置和光谱仪。流通池包括溶液流通道接口和光通道接口。所述溶液流通道接口与层析装置连接。光通道接口包括设置于所述流通池与物料流向垂直的方向两端的光通道第一接口和光通道第二接口，其分别与紫外线照射装置和光谱仪连接。光谱仪检测所述紫外线照射装置照射流经所述流通池的所述含目标蛋白的溶液的紫外线强度，并将紫外吸收值数据传送到蛋白质浓度计算设备。

在一实施方案中，纯化系统中的至少一个层析主单元包含多个亚单元。在一特别的实施方案中，至少一个层析主单元中，采用多柱位层析系统来实现多个亚单元；所述多柱位层析系统中的每个层析柱各自独立地处于以下状态之一：a.加载步骤、b.非加载步骤和c.静息状态。

任选地，在所述多柱位层析系统中，在至少一个层析单元的上游和下游的位置分别配置有一个或多个在位UV吸光度检测器，其与管理系统通信连接。管理系统根据所述在位UV吸光度检测器在位检测的信号，控制层析单元在所述状态a、b和c之间切换。

所述加载步骤是指层析柱填料与期望发生亲和结合的样品进行接触；

所述非加载步骤包括：洗脱结合在层析柱填料上的样品，并任选地包括以下步骤中的一个或多个：加载样品后洗涤非靶分子的杂质、洗脱样品后清洗层析柱、清洗层析柱后重新进行平衡；

所述静息状态是指没有样品与层析柱填料接触和/或层析柱与纯化系统流通管道的其他部分之间基本没有流体流通。

在一实施方案中，浓缩和/或换液步骤中不希望保留的液体或溶质在滤出方向上被去除。希望置换的液体或溶质在滤出方向上被加入到包含样品的流股(stream)中。包含样品的流股流向纯化系统流通管道的相对于浓缩和/或换液单元的下游方向。在一优选的实施方案中，所述浓缩和/或换液步骤为切向流过滤，特别是单向切向流过滤。在另一优选的实施方案中，所述浓缩和/或换液步骤为单向切向流过滤和/或在位透析。

在一实施方案中，所述管理系统包括用于数据处理的元件。

在一备选的实施方案中，纯化系统流通管道的相对于特定层析单元的上游和下游均配置有一个或多个在位UV吸光度检测器，管理系统通过如下方法控制层析单元的上样终点：管理系统使用所述进料信号和所述流出物信号来确定所述层析单元中的层析介质的结合状态，其包括使用所述进料信号和所述流出物信号来确定△信号和最大△信号，△信号是所述进料信号减去所述流出物信号，最大△信号是当所述流出物信号由于大致全部未结合组分已经经过所述层析单元中的层析介质这一事实而显示平稳期时所述进料信号减去所述流出物信号；

其中使用所述△信号来确定所述层析单元的穿透点和/或饱和点，所述穿透点和饱和点计算为所述最大△信号的相应的某一预定百分比；

达到穿透点和/或饱和点时，管理系统发出指令，结束上样操作。

在一实施方案中，管理系统根据层析单元中的层析介质的结合状态(例如所述柱是否达到穿透点和/或饱和点)和预先设置的算法发出指令，控制层析单元在所述状态a、b和c之间切换。

在另一实施方案中，所述纯化系统还包含一个或多个除病毒单元。在一具体的实施方案中，除病毒单元为除病毒过滤、病毒灭活或其组合。在一特别具体的实施方案中，病毒灭活的方式为低pH灭活。

在一实施方案中，所述除病毒单元配置有传感器，所述传感器与管理系统通信连接。在一具体的实施方案中，所述传感器选自pH传感器、电导传感器和料位传感器。

在一具体的实施方案中，所述缓冲体积是缓冲罐。

在一实施方案中，缓冲体积和/或除病毒单元还配置有其他传感器，优选地，所述其他传感器选自压力传感器、光学传感器及其组合。

在一实施方案中，管理系统还根据传感器的信号和预先设置的算法发出指令，控制物料在单元操作之间和/或在单元操作内部的流速。

在一实施方案中，特定主单元的运行启动后，根据管理系统的指令，物料由紧邻的上游缓冲体积或紧邻的上游主单元流入所述特定主单元，然后该主单元进行单元操作，并产生输出流；输出流根据管理系统的指令流入下游紧邻的缓冲体积或紧邻的下游主单元；特定主单元的单元操作结束时，输出流的产生停止。

在一特别具体的实施方案中，所述纯化系统中的亲和层析主单元、除病毒主单元、浓缩和/或换液主单元在纯化系统的流通管路中由上游至下游分布。

在另一具体的实施方案中，所述纯化系统中的进料物料为使用宿主细胞表达重组蛋白后，得到CCCF。在一特别具体的实施方案中，所述CCCF是细胞培养后经过至少包括离心和深层过滤的步骤得到的。

在一备选的实施方案中，所述纯化系统还包含一个或多个额外的层析主单元，所述层析选自混合模式层析、疏水相互作用层析、尺寸排阻层析、羟基磷灰石层析，以及上述各种层析的任意组合。

2.在线目标蛋白定量检测系统

本发明的在位UV吸光度检测装置配置于纯化系统中，目的在于提供一种在线目标蛋白定量检测系统，以实现在目标蛋白纯化的过程中，对目标蛋白进行在线定量检测以及根据检测结果控制所述目标蛋白的上样载量。

本发明的在线目标蛋白定量检测系统，包括：

流通池，包括溶液流通道接口和光通道接口，所述溶液流通道接口与层析装置连接，所述光通道接口与所述蛋白浓度检测计算装置连接；

层析装置，将含目标蛋白的溶液接入所述在线目标蛋白定量检测系统，并对流经的含目标蛋白的溶液进行蛋白分离，获得目标蛋白溶液；

蛋白浓度检测计算装置，对所述含目标蛋白溶液的浓度进行检测，并实时计算所述含目标蛋白的溶液中的蛋白总量；

蛋白质载量控制设备，与所述蛋白浓度检测计算装置和所述层析装置通信连接，根据所述蛋白总量控制所述层析装置的上样载量。

在一实施方案中，所述层析装置包括：

层析设备，与所述流通池的溶液流通道接口连接，将所述含目标蛋白的溶液接入所述在线目标蛋白定量检测系统；

至少一个层析柱，与所述流通池的溶液流通道接口连接，对流经的所述含目标蛋白的溶液进行蛋白分离，将所述含目标蛋白的溶液中的其他成分去除，获得目标蛋白溶液。

在一实施方案中，所述蛋白浓度检测计算装置包括：紫外线照射装置，与所述流通池的光通道接口连接，照射流经所述流通池的所述含目标蛋白的溶液；

光谱仪，与所述流通池的光通道接口连接，检测所述紫外线照射装置照射流经所述流通池的所述含目标蛋白的溶液的紫外线强度，并将紫外吸收值数据传送到蛋白质浓度计算设备；

蛋白质浓度计算设备，接收所述光谱仪的紫外吸收值数据，并根据预设的标定的标准曲线，实时计算所述蛋白质浓度以及单位时间流经流通池的目标蛋白总量；并将所述目标蛋白总量发送到所述蛋白质载量控制设备。

其中所述蛋白浓度检测计算装置中的蛋白质浓度计算设备和蛋白质载量控制设备被本发明的用于连续纯化的纯化系统中的管理系统包含。

其中所述流通池以及蛋白浓度检测计算装置中的紫外线照射装置和光谱仪及其之间的连接即本发明的纯化系统中的在位UV吸光度检测器。

在一实施方案中，所述蛋白质载量控制设备包括：

上样控制模块，将接收到的所述目标蛋白总量作为累计的上样量与预设的层析柱上样载量进行实时对比，并在所述累计的上样量与预设的所述层析柱上样载量相等时，控制所述层析设备停止上样；以及

选择调用模块，执行选择并调用所述预设的标定的标准曲线、UV调零信号、目标蛋白累计命令以及目标蛋白定量累计上限设定的控制操作。

在一实施方案中，所述蛋白质浓度计算设备为工控机；

在一实施方案中，所述蛋白质载量控制设备为DCS系统。

在一实施方案中，所述流通池的溶液流通道接口包括设置于所述流通池横向两端的溶液流入接口和溶液流出接口；所述光通道接口包括设置于所述流通池纵向两端的上端接口和下端接口，并且在所述流通池的中部具有供所述含目标蛋白的溶液通过的光径口；

所述流通池的溶液流入接口与所述层析设备连接，所述流通池的溶液流出接口与所述层析柱连接；所述上端接口与所述紫外线照射装置连接，所述下端接口与所述光谱仪连接。

在一实施方案中，所述的流通池为可变光程流通池；所述可变光程流通池的光程由调整所述光径口的大小调整；

所述光径口由所述流通池的中部设置的两根光纤的间距构成，所述两根光纤的间距为0.1mm至10mm。

在一实施方案中，所述上端接口和下端接口为光纤接口，所述两根光纤通过所述上端接口和下端接口与所述流通池连接，并且与所述上端接口连接的所述光纤与所述紫外线照射装置的发光光源连接；与所述下端接口连接的所述光纤与所述光谱仪连接。

在一实施方案中，所述光纤为抗紫外石英光纤，所述光纤的芯径为450微米；所述两根光纤通过SMA905接头与所述流通池连接。

在一实施方案中，所述紫外线照射装置的发光光源包括氙灯、氘灯、LED灯或者汞灯；所述紫外线照射装置的发光光源的发射光波长范围为200nm-400nm；

所述光谱仪包括：紫外光谱仪，紫外-可见光谱仪；所述光谱仪的吸光值范围为0-2AU。

在一实施方案中，所述紫外线照射装置的发射光波长范围为270nm-320nm；

所述光谱仪的吸光值范围为在0.05AU-1.6AU；

在一实施方案中，所述目标蛋白为单抗。

本发明的通过将在线目标蛋白定量检测系统设置包括：流通池，层析装置，蛋白浓度检测计算装置以及蛋白质载量控制设备。流通池包括溶液流通道接口和光通道接口，所述溶液流通道接口与层析装置连接，所述光通道接口与所述蛋白浓度检测计算装置连接；层析装置将含目标蛋白的溶液接入所述在线目标蛋白定量检测系统，并对流经的含目标蛋白的溶液进行蛋白分离，蛋白浓度检测计算装置对所述含目标蛋白的溶液的浓度进行检测，并实时计算所述含目标蛋白的溶液的蛋白总量；蛋白质载量控制设备与所述蛋白浓度检测计算装置通信连接，根据所述蛋白总量控制所述层析装置的上样载量，由此，实现了对目标蛋白进行在线定量检测以及根据检测结果控制所述目标蛋白的上样载量。此外，本发明采用的光谱仪性能更好，最短积分时间10微秒，响应更快，更加适合在线检测的需要，氘灯发光更稳定。本发明采用1个流通池实现了0.1-10mm的光程变化，结构更简单，可测量浓度范围更广。采用SMA-905接口为标准接口，适应性强；当料液通过流通池时，由于流过光纤狭缝中的料液很少，大部分从外部空间通过，不会造成阻力。多个装置间采用工业通信协议更稳定可靠；以及本发明提供更多在线控制功能。

3.在线HPLC装置

在线HPLC装置包含取样管路、样品环、六通阀、配置有泵和分析柱的HPLC，以及检测器，并且以泵推动样品在在线HPLC装置中的流动/停止。取样管路为在层析设备洗脱液出口管路上的支路，样品经取样管路进入六通阀中的样品环，然后又回到洗脱液出口管路中。在线HPLC装置向DCS发送信号并受DCS控制。当需要进样时，六通阀切换回路，由HPLC泵将样品环中的样品推入HPLC柱上。HPLC分析完成后，其结果传输至DCS系统中。当样品分析完成后，经数据处理和计算，然后根据结果由DCS系统切换相应的阀门，并根据合样标准指导合样。

在一实施方案中，所述在线HPLC装置的检测器为紫外可见吸收检测器，例如紫外吸收检测器或DAD检测器。

纯化系统中的层(level)

本发明的纯化系统的包括操作层和自动化层。

1.操作层

操作层包括所有工艺技术元件(PTU)和服务技术元件(STU)，例如所述多个层析主单元、任选存在的一个或多个浓缩和/或换液主单元、任选存在的一个或多个除病毒主单元、任选存在的一个或多个缓冲体积，以及单元中存在的软管、过滤器、层析柱、容器、传感器、泵、阀，等。

操作层包含按以下顺序连接的三个层：(1)原料输入层；(2)汇聚层；(3)产品输出层。

原料输入层根据供应需求向系统输入待层析的原料。应当理解，由于生物分子的常见生产过程是基于涉及使用活生物体或培养细胞的过程，这些过程比化学合成更难控制，生产得到的物料的预期均质性相对较低，因此不同时间点向纯化系统输入的原料之间的差异性相对较高。在用于表征物料属性的参数组成的空间中，不同时间点向纯化系统输入的原料的属性分布于多点。

一个汇聚层是指具备以下I和II所述特点的一个层析主单元：

I.物料：

(1)向汇聚层输入的物料已经经过至少一个纯化步骤，例如层析步骤，因此在用于表征物料属性的参数组成的空间中，不同时间点向汇聚层输入的物料的属性分散的程度相对于原料而言已经降低，在一个或多个维度(即，一个或多个参数)上经过了汇聚；并且(2)根据预先设定的参数要求，汇聚层将物料在(1)的基础上进行进一步汇聚，使得由汇聚层输出的物料在预先设定的一个或多个维度(即，一个或多个参数)上具备比向汇聚层输入的物料更高的汇聚性。汇聚层输出的物料包含原料含有的基本全部靶分子或其一部分。

II.纯化系统：

在汇聚层和汇聚层下游的层析主单元中，需要配置的层析亚单元的数目呈现出与汇聚层上游相比减少的趋势。

以N表示某一层析主单元中包括的层析亚单元数目，则在一实施方案中，所述使层析亚单元数目减少的趋势可以用下式(1)和/或(2)表示：

(1)N(汇聚层)≤N(汇聚层上游相邻层析主单元)；

(2)N(汇聚层下游相邻纯化主单元)≤N(汇聚层上游相邻层析主单元)；

其中所述汇聚层下游相邻纯化主单元是层析主单元、除病毒主单元或浓缩和/或换液主单元。

本发明的纯化系统中，至少一个汇聚层是由PAT反馈控制的(详见下文“PAT用于反馈控制”)。

产品输出层根据供应需求由纯化系统输出产品。本发明的纯化系统输出的产品在一些情况下，优选在大部分情况下，更优选地基本在每次输出时能够满足产品质量要求。在一些实施方案中，所述产品质量要求是指技术要求和监管规范对于该阶段的产品(例如原液、半成品或成品)规定的要求。

在一实施方案中，操作层包含一个原料输入层、至少一个汇聚层和一个产品输出层。在一实施方案中，操作层包含一个原料输入层、一个或二个汇聚层和一个产品输出层。

物料在进入汇聚层之前，可以经过级分合并，物料流出汇聚层中的层析单元之后，还可以任选地对物料进行进一步的级分合并。所述级分合并是指将特定属性符合一定要求的样品合并在一起。在一实施方案中，汇聚层对物料的汇聚作用是通过层析纯化和随后的级分合并来实现的。

汇聚层还起到调和步骤之间的工艺周期时间差异的作用。管理系统通过PAT，可以得知物料的分布情况，并由此确定整个工艺中一个或多个步骤的启动或停止，并最终实现生产时间最小化。因此，汇聚层还实现了操作时间的汇聚，即以下第III点：

III.汇聚层中的层析主单元包含一个层析亚单元；或者

汇聚层中的层析主单元包含多个层析亚单元；多个层析亚单元的操作时间相互连续。

在一实施方案中，纯化系统包含依次连接的第一层析主单元、除病毒主单元、第二层析主单元、第三层析主单元和浓缩和/或换液主单元；第一层析主单元的输出流作为除病毒主单元的输入流，除病毒主单元的输出流作为第二层析主单元的输入流，第二层析主单元的输出流作为第三层析主单元的输入流；第三层析主单元的输出流作为浓缩和/或换液主单元的输入流。在一实施方案中，第一层析主单元包含7个亚单元，通过三根层析柱实现，除病毒主单元包含3个亚单元，通过一个低pH病毒灭活罐运行三个周期来实现，第二层析主单元包含3个亚单元，通过一根层析柱运行三个周期来实现，第三层析主单元包含1个亚单元。在一实施方案中，第一层析主单元的第1、第2亚单元操作完成后，除病毒主单元开始第一操作周期，第一层析主单元的第3、第4亚单元操作完成后，除病毒主单元开始第二操作周期，第一层析主单元的第5、第6、第7亚单元操作完成后，除病毒主单元开始第三操作周期。其中除病毒主单元的一个操作周期的操作时间短于第一层析主单元的两个亚单元的操作时间。在一实施方案中，第一层析主单元以结合-洗脱模式进行层析。在一实施方案中，除病毒主单元的第一操作周期完成后，第二层析主单元开始第一操作周期，除病毒主单元的第二操作周期完成后，经过等待时间t1，第二层析主单元开始第二操作周期，除病毒主单元的第三操作周期完成后，经过等待时间t2，第二层析主单元开始第三操作周期。在一实施方案中，第二层析主单元的第一、第二、第三操作周期在时间上完全连续，t1、t2分别等于第二层析主单元第二或第三操作周期开始的时间减去除病毒主单元第二或第三操作周期结束的时间。在一实施方案中，第一层析主单元为亲和层析主单元，第二、第三层析主单元分别为离子交换层析主单元。在一实施方案中，第二层析主单元以结合-洗脱模式进行层析。在一实施方案中，第三层析主单元以流过模式进行层析。

在一实施方案中，亲和层析主单元位于汇聚层上游。在一实施方案中，汇聚层包含阳离子交换层析主单元、阴离子交换层析主单元或其组合。在一实施方案中，浓缩和/或换液主单元位于汇聚层下游。

在一实施方案中，纯化系统依次包含：亲和层析主单元、阳离子交换层析主单元和阴离子交换层析主单元，其中阳离子交换层析主单元为汇聚层，汇聚层数量为1。以N表示某一层析主单元中包括的层析亚单元数目，则汇聚层的汇聚作用使层析亚单元数目减少的趋势可以用下式(1)和(2)表示：

(1)N(阳离子交换)≤N(亲和)；并且

(2)N(阴离子交换)≤N(亲和)。

在一实施方案中，纯化系统依次包含：亲和层析主单元、阳离子交换层析主单元和阴离子交换层析主单元，其中阳离子交换层析主单元为汇聚层1，阴离子交换层析主单元为汇聚层2，汇聚层数量为2。以N表示某一层析主单元中包括的层析亚单元数目，则汇聚层的汇聚作用使层析亚单元数目减少的趋势可以用下式(3)表示：

(3)N(阴离子交换)≤N(阳离子交换)≤N(亲和)。

应当理解，在整个工艺过程中，越接近产品输出层，物料中的靶分子富集程度上升，物料价值增加，稳健的质量控制显得越为重要。此时，简化的生产操作也有利于降低生产成本。尤其是考虑到在一些实施方式中，随着多个纯化步骤的完成，越接近产品输出层，物料的总量呈现出减少的趋势。因此在接近产品输出层的输出单元中，采用较为集中的生产方式，即，减少亚单元数目，至少在保证产品质量、降低生产成本这两方面是有利的。因此，汇聚层的存在以及PAT在汇聚层的应用是本申请工艺优化的一个重要方面。

2.自动化层

自动化层包括用于数据采集和处理的元件。在一实施方案中，自动化层是指RIO(即，工控机或具有I/O层的基于PC的系统，或其组合)。在一特定的实施方案中，工控机为可编程逻辑控制(PLC)。在一特别具体的实施方案中，自动化层是指具有I/O层的DCS系统。在另一特别具体的实施方案中，自动化层是工控机与具有I/O层的DCS系统的组合。

在一实施方案中，本申请纯化系统的管理系统是指工控机和DCS系统。在一实施方案中，DCS系统其采用多种通信协议与设备通信，其实例包括但不限于Profibus-DP、OPC、Modbus-RTU、4-20mA信号等。在一实施方案中，控制程序运行在DCS系统的主控制器或副控制器中。执行器或传感器产生的数据被DCS系统采集，并进行存储。

PAT用于反馈控制

在一实施方案中，本发明用于实现PAT的装置为本发明的在位UV吸光度检测器。在另一实施方案中，本发明用于实现PAT的装置为本发明的在位UV吸光度检测器与其他在位或在线检测技术的组合。在一实施方案中，所述其他在位或在线检测技术选自：在线或在位光谱方法(例如近红外(NIR)、中红外(MIR)或拉曼光谱，等)、在线或在位色谱方法(例如在线色谱法，比如在线HPLC)及其组合。在一特定的实施方案中，所述其他在位或在线检测技术为在线HPLC。

在一实施方案中，本发明的用于实现PAT的装置中，至少有一个配置于汇聚层。在一特别的实施方案中，管理系统根据用于实现PAT的装置获取的信号，控制以下操作中的一个或多个：

D.来自上游单元的输出流或缓冲体积中的物料流出作为输入流流进汇聚层；

E.来自汇聚层包含的上游单元的输出流作为汇聚层包含的下游单元输入流流进所述下游单元；

F.来自汇聚层包含的上游单元的输出流作为汇聚层包含的下游单元输入流流进所述上游单元和所述下游单元之间的缓冲体积中；

G.由缓冲体积中流出，进入汇聚层包含的下游单元；

H.由汇聚层流出，进入下游单元，或进入上游单元和下游单元之间的缓冲体积。

在一实施方案中，包含一个汇聚层的操作层示意图如图1，其中操作D、E、F、G、H中的一个或多个由管理系统根据用于实现PAT的装置获取的信号来控制。

在一实施方案中，汇聚层配置有至少一个用于实现PAT的装置。在一具体的实施方案中，汇聚层配置有至少一个本发明的在位UV吸光度检测器。在另一实施方案中，汇聚层还配置有在线HPLC装置。在一具体的实施方案中，汇聚层包含至少一个层析单元，至少一个层析单元的上游配置有至少一个在位UV吸光度检测器，管理系统根据上文所述的方法来确定层析单元中的层析介质的载样量。在一实施方案中，根据层析亚单元中的层析介质的载样情况，确定是否需要在层析亚单元所属的层析主单元中增加新的层析亚单元，以装载样品、进行纯化，并且使得所述层析主单元的总运行时间跨度落在预先设定的范围内。

纯化系统的规模

纯化系统以小规模实施时，例如实验室规模实施时，可以使用例如微型设备、集成装置。以大规模实施时，例如工业生产制备时，可以使用大型层析塔、层析床等设备。

纯化系统的实例

在一特别具体的实施方案中，本发明的纯化系统依次包括缓冲体积1、亲和层析主单元、缓冲体积2、除病毒主单元1(除病毒罐)、缓冲体积3、阳离子交换层析主单元、缓冲体积4、阴离子交换层析主单元、缓冲体积5、除病毒主单元2、缓冲体积6、浓缩和/或换液主单元1、缓冲体积7、浓缩和/或换液主单元2。特别地，本发明的纯化系统如图2所示。

操作物料流入/流出缓冲体积的执行器为传输泵和各个缓冲罐、除病毒罐底部的罐底阀。

每个缓冲体积配置有重量传感器和液位传感器。除病毒罐配置有pH传感器、电导传感器、重量传感器和液位传感器。每个缓冲体积以及除病毒罐分别独立地设定一个料液下限和一个料液上限(用重量传感器检测值衡量或重量传感器和液位传感器检测值共同衡量)。以仅有重量传感器进行检测为例，当重量传感器的检测值达到或低于所述重量下限时认为该缓冲体积不适宜再为下游主单元提供料液，从而停止料液向该主单元转移并在适当时停止下游主单元的运行；当重量传感器的值达到或高于所述重量上限时认为该缓冲体积不再适宜再接受上游主单元输入的料液，从而停止上游主单元的运行。

对于每个缓冲体积分别独立地设定一个料液检测区间，用于判断是否可以启动紧邻的下游主单元，该重量区间称为启动该缓冲体积的紧邻的下游主单元的区间，简称为该缓冲体积的启动区间。启动区间的下限即该缓冲体积的料液下限，启动区间的上限小于或等于该缓冲体积的料液上限。

纯化过程可以描述为如下步骤1-8：

1.作为原料的澄清的细胞收获液暂存于缓冲体积1中；

2.缓冲体积1以及缓冲体积2重量及液位控制亲和层析主单元：

当缓冲体积1重量及液位到达设定值时，管理系统发出指令，指示执行器进行操作，使物料由缓冲体积1流入亲和层析主单元；

由DCS系统启动PCC程序，运行亲和层析方法；

在亲和层析过程中，物料由亲和层析主单元流入缓冲体积2；

当缓冲体积1重量低于下限，由DCS系统向PCC发送Digital I/O信号，PCC收到信号后，结束上样，进入结束步骤。PCC程序结束后，亲和层析单元操作完成；

假如缓冲体积2重量达到设定的重量上限，由DCS控制PCC暂停运行，暂停至缓冲体积2重量重新处于启动区间内之后，PCC继续运行；

3.缓冲体积2、除病毒主单元1以及缓冲体积3重量及液位控制除病毒主单元1：

当缓冲体积2重量及液位到达设定值时，管理系统发出指令，指示执行器进行操作，使物料由缓冲体积2流入除病毒主单元1；

缓冲体积2料液转移至除病毒主单元1传输完成后，稳定1-2分钟，根据pH传感器数据，DCS系统判断除病毒主单元1的pH值是否在需要的范围内，然后根据需要由自动化控制的泵操作加酸或者加碱，进行低pH病毒灭活操作；

当缓冲体积2重量低于下限，结束物料向除病毒主单元1的转移；

除病毒主单元1的低pH病毒灭活操作完成后，物料由除病毒主单元1(除病毒主单元1)经过深层过滤流入缓冲体积3；

当除病毒主单元1重量低于下限，结束物料向缓冲体积3的转移；清洗除病毒主单元1；

假如缓冲体积3重量达到设定的重量上限，由DCS控制暂停物料向除病毒主单元1的转移，暂停至缓冲体积3重量重新处于启动区间内之后，物料继续向除病毒主单元1转移。

4.缓冲体积3重量及液位以及

Process控制阳离子交换层析主单元：

当缓冲体积3重量及液位到达设定值时，管理系统发出指令，指示执行器进行操作，使物料由缓冲体积3流入阳离子交换层析主单元。DCS系统发送指令启动阳离子交换层析主单元。在一实施方案中，在使物料由缓冲体积3流入阳离子交换层析主单元之前，DCS系统根据电导传感器数据判断缓冲体积3电导率值是否在设定目标范围内，并根据需要进行电导调节操作，使电导率值达到设定范围的±0.1-0.5mS/cm，稳定1-5min。

当阳离子交换层析主单元进入上样步骤后，DCS系统给在线目标蛋白定量检测系统发送启动蛋白量累计指令，开始实时计算上样蛋白量，并将计算结果发送给DCS系统。

当上样量达到蛋白累计设定值时，DCS系统给

Process发送指令，停止上样，进入后续层析步骤。

假如缓冲体积3重量低于下限后，在线目标蛋白定量检测系统仍未达到蛋白累计设定值，则判断缓冲体积3为空，由DCS系统给

Process发送指令，停止上样，进入后续层析步骤。

阳离子交换层析过程中，物料由阳离子交换层析主单元流入缓冲体积4。

假如缓冲体积4重量达到设定的重量上限，由DCS控制

Process暂停阳离子交换层析运行，暂停至缓冲体积4重量重新处于启动区间内之后，

Process继续运行。

5.缓冲体积4、缓冲体积5重量及液位以及

Process控制阴离子交换层析主单元：

当缓冲体积4重量及液位到达设定值时，管理系统发出指令，指示执行器进行操作，使物料由缓冲体积4流入阴离子交换层析主单元。在一实施方案中，在使物料由缓冲体积4流入阴离子交换层析主单元之前，DCS程序根据在线pH和电导传感器数据进行判断，并根据需要调节pH和电导。

当阴离子交换层析主单元进入上样步骤后，DCS系统给在线目标蛋白定量检测系统发送启动蛋白量累计指令，开始实时计算上样蛋白量，并将计算结果发送给DCS系统。

当上样量达到蛋白累计设定值时，DCS系统给

Process发送指令，停止上样，继续层析步骤。假如缓冲体积4重量低于下限后，在线目标蛋白定量检测系统仍未达到蛋白累计设定值，则判断缓冲体积4为空，由DCS系统给

Process发送指令，停止上样，继续层析步骤。

阴离子交换层析过程中，物料由阴离子交换层析主单元流入缓冲体积5。

假如缓冲体积5重量达到设定的重量上限，由DCS控制

Process暂停阴离子交换层析运行，暂停至缓冲体积5重量重新处于启动区间内之后，

Process继续运行。

6.缓冲体积5、缓冲体积6重量及液位以及除病毒主单元2恒压控制：

当缓冲体积5重量及液位到达设定值时，管理系统发出指令，指示执行器进行操作，使物料由缓冲体积5流入除病毒主单元2，以进行除病毒过滤。

通过调节泵流速，控制除病毒过滤压力为恒压。

当缓冲体积5重量低于下限，关闭缓冲体积5罐底阀；清洗膜包。

除病毒过滤过程中，物料由除病毒主单元2流入缓冲体积6。

假如缓冲体积6重量达到设定的重量上限，由DCS控制暂停物料向除病毒主单元2的转移，暂停至缓冲体积6重量重新处于启动区间内之后，继续物料向除病毒主单元2的转移。

7.缓冲体积6、缓冲体积7重量及液位以及浓缩和/或换液主单元1恒压控制：

当缓冲体积6重量及液位到达设定值时，管理系统发出指令，指示执行器进行操作，使物料由缓冲体积6流入浓缩和/或换液主单元1。启动泵开始浓缩，浓缩过程中通过调节泵流速以控制压力恒定。

当缓冲体积6重量低于下限，停止泵，关闭罐底阀，清洗膜包。

假如缓冲体积7重量达到设定的重量上限，由DCS控制泵暂停运行，暂停至缓冲体积7重量重新处于启动区间内之后，泵继续运行。

浓缩过程中，物料由浓缩和/或换液主单元1流入缓冲体积7。

8.缓冲体积7、缓冲体积8重量及液位以及浓缩和/或换液主单元2恒压控制：

当缓冲体积7重量及液位到达设定值时，管理系统发出指令，指示执行器进行操作，使物料由缓冲体积7流入浓缩和/或换液主单元2。启动泵开始在线切向流换液。控制切向流换液单元进口处的压力为恒压。

当缓冲体积7重量低于下限，关闭罐底阀，清洗膜包。

物料由浓缩和/或换液主单元2流入缓冲体积8，并作为产品输出。

在一优选的实施方案中：

由缓冲体积1流入亲和层析主单元的料流包含一个或多个亚流；

由亲和层析主单元流入缓冲体积2的料流包含多个亚流；

由缓冲体积2流入除病毒主单元1的料流包含一个亚流；

由除病毒主单元1流入缓冲体积3的料流包含多个亚流；

由缓冲体积3流入阳离子交换层析主单元的料流包含一个亚流；

由阳离子交换层析主单元流入缓冲体积4的料流包含一个或多个亚流；

由缓冲体积4流入阴离子交换层析主单元的料流包含一个亚流；

由阴离子交换层析主单元流入缓冲体积5的料流包含一个亚流；

由缓冲体积5流入除病毒主单元2的料流包含一个亚流；

由除病毒主单元2流入缓冲体积6的料流包含一个亚流；

由缓冲体积6流入浓缩和/或换液主单元1的料流包含一个亚流；

由浓缩和/或换液主单元1流入缓冲体积7的料流包含一个亚流；

由缓冲体积7流入浓缩和/或换液主单元的料流包含一个亚流2；

由浓缩和/或换液主单元2流入缓冲体积8的料流包含一个亚流。

有益效果

在生物制药行业的生产应用中，连续操作仍以“仓对仓”方式，作为单个、断开的CM单元操作实施，并通过这样的方式实现工艺设计的较高维度上的连续制造。仓对仓方式仍然需要持续在CM单元操作之间对物料进行管理和转移，具有批次生产的部分特征，因此仅能部分地实现连续制造的空-时经济性(space-time economy)。

本发明提供了一种整合的、自动化的、全连续化的单抗纯化系统，其特征在于(1)采用了自动控制系统与所有设备进行通信连接，实现了对于过程的调节和控制。(2)实现了亲和层析、低pH病毒灭活、阳离子交换层析、阴离子交换层析、除病毒过滤、超滤浓缩、超滤换液整个纯化过程的全连续化生产。(3)采用PAT对生产过程中的关键质量属性进行在位或在线检测，并通过自动控制系统实现反馈控制。

本发明以简单、成本较低、易于实施和维护的在线目标蛋白定量检测系统实现了PAT。其中，在位UV吸光度检测设备采用1个流通池实现了0.1-10mm的光程变化，结构更简单，可变光程范围相对较大，可测量浓度范围更广。

本发明的在线目标蛋白定量检测系统实时计算单位时间流经目标蛋白总量。其任选地与在线HPLC装置配置于同一层析主单元，能够及时提供上样量、产品纯度相关的信息。实现了在目标蛋白纯化的过程中，对目标蛋白进行在线定量检测以及根据检测结果控制目标蛋白的上样载量，并且在需要时通过反馈控制及时调整纯化参数以确保产品质量。

本发明通过特定主单元上游的缓冲罐的重量来控制该主单元的启动和停止，实现了在不需要确切知道上游下游罐料液总量的条件下，自动进行单元操作。

亲和层析主单元上游设置缓冲罐，可以在实现重量控制的同时，设置重量保护，避免料液耗尽时泵吸入空气导致层析柱损坏。重量控制的方法比现有技术常用的采用气泡感应控制上样终点的方法更加的稳定和可靠，采用气泡感应控制上样终点的方法常常会因为澄清的细胞收获液中的细小气泡(由于流体在管路中碰撞，管路存在空气，或管路存在死角等产生)而导致上样提前结束，存在一定的风险。

当在亲和层析阶段采用多柱位连续层析方法，可以对复杂的原料进行快速判断和处理，保证该CM单元操作能够连续输出具有可靠质量属性的产品，而在其后的层析步骤中，实现了相对简单的工艺。对可选地使用在线HPLC检测电荷异构体含量，对产品质量实现了更完善的控制。整个工艺控制过程相对简单，稳定性高，适用于广泛的工艺条件。

通过本发明的连续纯化系统，靶分子的纯化时间可大幅缩短，纯化效率大幅提高，同时，由于连续、封闭和自动化运行，大大降低了产品污染风险，提高了生物药物纯化设备所占的空间的利用率，减小了设备所需空间，大大降低生产成本和提高产能。

实施例

以下将通过具体实施例来进一步描述本发明的技术方案。应注意，所述实施例仅为示例性，而非对本发明保护范围的限制。本发明还可有其他实施方案，或能够以多种方式实践或进行。除非另有说明，本文中所有的百分比、份数、比值等均是按重量计。

仪器、试剂和材料

PCC系统来自GE Healthcare。亲和层析填料(MabSelect Sure LX)来自GE。阳离子交换层析填料(型号：Capto S)来自GE。阴离子交换层析填料(型号：Capto Q)来自GE。SPTFF膜包来自Pall。ILDF膜包来自Pall。在线HPLC设备来自Agilent，型号1260，配备UV检测器。

本发明的其他试剂均为可商购的，例如可以购自默克化工。

实施例1抗体纯化系统

本发明的纯化系统可通过不同方式实施，一个示例性方式如下连续纯化单抗的纯化系统，其可以通过图2所示方式实现：

本实施例的纯化系统包括图2所示缓冲体积1至浓缩和/或换液主单元2，包括图2中的ii至xv示出的物料流动过程。

图2中的过程可以描述为如下步骤1-8，其中操作物料流入/流出缓冲体积的执行器为传输泵和各个Tank底部的罐底阀。

每个缓冲体积配置有重量传感器和液位传感器。除病毒罐(除病毒主单元1)配置有pH传感器、电导传感器、重量传感器和液位传感器。每个缓冲体积以及除病毒罐分别独立地设定一个料液下限和一个料液上限(用重量传感器检测值衡量或重量传感器和液位传感器检测值共同衡量)。以仅有重量传感器进行检测为例，当重量传感器的检测值达到或低于所述重量下限时认为该缓冲体积不适宜再为下游主单元提供料液，从而停止料液向该主单元转移并在适当时停止下游主单元的运行；当重量传感器的值达到或高于所述重量上限时认为该缓冲体积不再适宜再接受上游主单元输入的料液，从而停止上游主单元的运行。

对于每个缓冲体积分别独立地设定一个料液检测区间，用于判断是否可以启动紧邻的下游主单元，该重量区间称为启动该缓冲体积的紧邻的下游主单元的区间，简称为该缓冲体积的启动区间。启动区间的下限即该缓冲体积的料液下限，启动区间的上限小于或等于该缓冲体积的料液上限。

1.作为原料的CCCF暂存于缓冲体积1(Tank0)中，即图中i。

2.Tank0以及缓冲体积2(Tank1)重量及液位控制亲和层析主单元：

当Tank0重量及液位到达设定值时，管理系统发出指令，指示执行器进行操作，使物料由缓冲体积1通过一个或多个亚流流入亲和层析主单元，即图中ii。

由DCS系统启动PCC程序，运行亲和层析方法。

在亲和层析过程中，物料由亲和层析主单元通过多个亚流流入缓冲体积2(Tank1)，即图中iii。

当Tank0重量低于下限，由DCS系统向PCC发送Digital I/O信号，PCC收到信号后，结束上样，进入结束步骤。PCC程序结束后，亲和层析单元操作完成。

假如Tank1重量达到设定的重量上限，由DCS控制PCC暂停运行，暂停至Tank1重量重新处于启动区间内之后，PCC继续运行。

3.Tank1、Tank2以及Tank3重量及液位控制除病毒主单元1：

当Tank1重量达到设定的重量下限，启动搅拌。

当Tank1重量及液位到达设定值时，管理系统发出指令，指示执行器进行操作，使物料由缓冲体积2通过一个亚流流入除病毒主单元1(Tank2)，即图中iv。

当Tank2重量达到设定的重量下限，启动搅拌。Tank1料液转移至Tank2传输完成后，稳定1-2分钟，根据pH传感器数据，DCS系统判断Tank2的pH值是否在需要的范围内，然后根据需要由自动化控制的泵操作加酸或者加碱，进行低pH病毒灭活操作。

当Tank1重量低于下限，停止搅拌，结束物料向除病毒主单元1的转移。

Tank2的低pH病毒灭活操作完成后，停止搅拌，物料由除病毒主单元1(Tank2)经过深层过滤通过一个或多个亚流流入缓冲体积3(Tank3)，即图中v。

当Tank2重量低于下限，结束物料向Tank3的转移，启动清洗泵，清洗Tank2。

假如Tank3重量达到设定的重量上限，由DCS控制暂停物料向除病毒主单元1的转移，暂停至Tank3重量重新处于启动区间内之后，物料继续向除病毒主单元1转移。

4.Tank3重量及液位以及

Process控制阳离子交换层析主单元：

当Tank3重量达到设定的重量下限，启动搅拌。

当Tank3重量及液位到达设定值时，根据电导传感器数据，DCS系统判断Tank3电导率值是否在设定目标范围内，并根据需要进行电导调节操作，使电导率值达到设定范围的±0.1-0.5mS/cm，稳定1-5min。停止搅拌，管理系统发出指令，指示执行器进行操作，使物料由缓冲体积3通过一个亚流流入阳离子交换层析主单元，即图中vi。DCS系统发送指令启动阳离子交换层析主单元。

当阳离子交换层析主单元进入上样步骤后，DCS系统发送启动蛋白量累计指令，蛋白质浓度计算设备开始实时计算上样蛋白量，并将计算结果发送给DCS系统。

当上样量达到蛋白累计设定值时，DCS系统给

Process发送指令，停止上样，进入后续层析步骤(例如洗脱)。

假如Tank3重量低于下限后，在线目标蛋白定量检测系统仍未达到蛋白累计设定值，则判断Tank3为空，由DCS系统给

Process发送指令，停止上样，进入后续层析步骤。

阳离子交换层析过程中，物料由阳离子交换层析主单元通过一个或多个亚流流入缓冲体积4(Tank4)，即图中vii。

假如Tank4重量达到设定的重量上限，由DCS控制

Process暂停阳离子交换层析运行，暂停至Tank4重量重新处于启动区间内之后，

Process继续运行。

5.Tank4、Tank5重量及液位以及

Process控制阴离子交换层析主单元：

当Tank4重量达到设定的重量下限，启动搅拌。

当Tank4重量及液位到达设定值时，DCS程序根据在线pH和电导传感器数据进行判断，并根据需要调节pH和电导。管理系统发出指令，指示执行器进行操作，使物料由缓冲体积4通过一个亚流流入阴离子交换层析主单元，即图中viii。

当阴离子交换层析主单元进入上样步骤后，DCS系统发送启动蛋白量累计指令，蛋白质浓度计算设备开始实时计算上样蛋白量，并将计算结果发送给DCS系统。

当上样量达到蛋白累计设定值时，DCS系统给

Process发送指令，停止上样，继续层析步骤。假如Tank4重量低于下限后，在线目标蛋白定量检测系统仍未达到蛋白累计设定值，则判断Tank4为空，由DCS系统给

Process发送指令，停止上样，继续层析步骤。

阴离子交换层析过程中，物料由阴离子交换层析主单元通过一个亚流流入缓冲体积5(Tank5)，即图中ix。

假如Tank5重量达到设定的重量上限，由DCS控制

Process暂停阴离子交换层析运行，暂停至Tank5重量重新处于启动区间内之后，

Process继续运行。

6.Tank5、Tank6重量及液位以及除病毒主单元2恒压控制：

当Tank5重量达到设定的重量下限，启动搅拌。

当Tank5重量及液位到达设定值时，管理系统发出指令，指示执行器进行操作，使物料由缓冲体积5通过一个亚流流入除病毒主单元2，以进行除病毒过滤，即图中x。

通过调节泵流速，控制除病毒过滤压力为恒压。

当Tank5重量低于下限，关闭Tank5罐底阀；清洗膜包。

除病毒过滤过程中，物料由除病毒主单元2通过一个亚流流入缓冲体积6(Tank6)，即图中xi。

假如Tank6重量达到设定的重量上限，由DCS控制暂停物料向除病毒主单元2的转移，暂停至Tank6重量重新处于启动区间内之后，继续物料向除病毒主单元2的转移。

7.Tank6、Tank7重量及液位以及浓缩和/或换液主单元1恒压控制：

当Tank6重量达到设定的重量下限，启动搅拌。

当Tank6重量及液位到达设定值时，管理系统发出指令，指示执行器进行操作，使物料由缓冲体积6通过一个亚流流入浓缩和/或换液主单元1，即图中xii。启动泵开始浓缩，浓缩过程中通过调节泵流速以控制压力恒定。

当Tank6重量低于下限，停止搅拌，停止泵，关闭罐底阀，清洗膜包。

假如Tank7重量达到设定的重量上限，由DCS控制泵暂停运行，暂停至Tank7重量重新处于启动区间内之后，泵继续运行。

浓缩过程中，物料由浓缩和/或换液主单元1通过一个亚流流入缓冲体积7(Tank7)，即图中xiii。

8.Tank7、Tank8重量及液位以及浓缩和/或换液主单元2恒压控制：

当Tank7重量达到设定的重量下限，启动搅拌。

当Tank7重量及液位到达设定值时，管理系统发出指令，指示执行器进行操作，使物料由缓冲体积7通过一个亚流流入浓缩和/或换液主单元2，即图中xiv。启动泵开始在线切向流换液。控制切向流换液单元进口处的压力为恒压。

当Tank7重量低于下限，停止搅拌，关闭罐底阀，清洗膜包。

物料由浓缩和/或换液主单元2通过一个亚流流入缓冲体积8(Tank8)，并作为产品输出，即图中xv。

管理系统

纯化系统的管理系统包括工控机和DCS系统。上述连续纯化单抗的纯化系统由分布式控制系统(DCS)整体控制，其采用多种通信协议与设备通信，包括Profibus-DP，OPC，Modbus-RTU，4-20mA信号等，控制程序运行在DCS系统的主控制器或副控制器中。设备产生的数据(包括泵、搅拌器、pH传感器、压力传感器、UV传感器、电导传感器、重量传感器、液位传感器等)将被DCS系统采集，并进行存储。

PAT技术

1.在位UV吸光度检测器用于上样载量控制

DCS系统根据服务技术元件(执行器与传感器)提供的数据，确定步骤运行状态、层析介质的载样状态和预先设置的算法，向执行器(例如泵或阀)发出指令，推动料流在流路中流动或停止。在现有批次生产工艺中，需要将低pH病毒灭活收集液送检单抗浓度，然后根据低pH病毒灭活收集液重量，阳离子交换层析柱体积来计算上样量，需耗时4-5h。采用在位控制后，这部分时间可全部节省。

在位UV吸光度检测器包括：流通池，紫外线照射装置和光谱仪。流通池包括溶液流通道接口和光通道接口。在位UV吸光度检测器在纯化系统中的配置方式参见图3至图5。

图3至图5示出：

流通池10，包括横向的溶液流通道接口(11,12)和纵向的光通道接口(13,14)，所述溶液流通道接口(11,12)与层析装置20，所述光通道接口(13,14)与所述蛋白浓度检测计算装置30连接；该流通池10连接在线目标蛋白定量检测系统100多个设备，含目标蛋白的溶液从系统100的前端设备经过该流通池到达系统100的后端设备；

层析装置20，将含目标蛋白的溶液接入所述在线目标蛋白定量检测系统100，并对流经的含目标蛋白的溶液进行蛋白分离，获得含目标蛋白的溶液；层析装置20将所述含目标蛋白的溶液中的其他成分去除，所述含目标蛋白的溶液中的其他成分包括一些其他蛋白的杂质；

蛋白浓度检测计算装置30，对所述含目标蛋白的溶液的浓度进行检测，并实时计算所述含目标蛋白的溶液的蛋白总量；

蛋白质载量控制设备40，与所述蛋白浓度检测计算装置30和所述层析装置20通信连接，根据所述蛋白总量控制所述层析装置20的上样载量。计算所述含目标蛋白的溶液的蛋白总量后，蛋白质载量控制设备40将根据接收到的该信息控制所述层析装置20的上样载量。具体的说，在所述含目标蛋白的溶液的蛋白总量达到预设值后，停止目标蛋白的溶液上样，由此实现了在线目标蛋白定量检测系统100对目标蛋白的在线定量检测。在一优选的实施方案中，所述目标蛋白为单克隆抗体(以下简称“单抗”)。即在线目标蛋白定量检测系统100实现了在线单抗定量检测。

所述层析装置20包括：

层析设备21，与所述流通池10的溶液流通道接口(11,12)连接，将所述含目标蛋白的溶液接入所述在线目标蛋白定量检测系统100；

至少一个层析柱22，与所述流通池19的溶液流通道接口连接(11,12)，对流经的所述含目标蛋白的溶液进行蛋白分离，将所述含目标蛋白的溶液中的其他成分去除，获得目标蛋白溶液。

层析柱22可以包括多个，设置在不同的位置，当用于检测进入层析柱22前的蛋白浓度，并控制上样量时，流通池10设置于层析柱22在流通管道上游的位置，当需要用于检测层析柱22流出溶液中蛋白浓度时，流通池10可以放在层析柱22下游的位置。如在单抗纯化过程中，将流通池10接入层析装置20管路(例如GE

设备)中，并位于层析柱22前，层析柱22是对蛋白进行分离的一种柱型装置，含目标蛋白的溶液流过该柱，使蛋白与其他成分分离。由此，蛋白质载量控制设备40将根据接收到的该信息控制所述层析装置20的上样载量，具体是在单抗层析过程中对层析柱22载量进行控制。

参见图4，本发明的蛋白浓度检测计算装置30包括：紫外线照射装置31，与所述流通池10的光通道接口(上端接口)13连接，照射流经所述流通池10的所述含目标蛋白的溶液；所述紫外线照射装置31的发光光源包括氙灯、氘灯、LED灯或者汞灯；所述紫外线照射装置31的发光光源的发射光波长范围为200nm-400nm；

光谱仪32，与所述流通池10的光通道接口(下端接口)14连接，吸收所述紫外线照射装置31照射流经所述流通池10的所述含目标蛋白的溶液的紫外线，并将所述光谱仪32的紫外吸收值数据传送到蛋白质浓度计算设备33；紫外线照射装置31照射所述含目标蛋白的溶液，所述含目标蛋白的溶液吸收紫外线，光谱仪32检测所述含目标蛋白的溶液吸收紫外线的强度，并将该紫外吸收值数据传送到蛋白质浓度计算设备33；所述光谱仪32包括：紫外光谱仪32，紫外-可见光谱仪32；所述光谱仪32的吸光值范围为在0-2AU。优选的，所述紫外线照射装置31的发射光波长范围为270nm-320nm；所述光谱仪32的吸光值范围为在0.05AU-1.6AU；

蛋白质浓度计算设备33，接收所述光谱仪32的紫外吸收值数据，并根据预设的标定的标准曲线，实时计算所述蛋白质浓度以及单位时间流经流通池10的目标蛋白总量；并将所述目标蛋白总量发送到所述蛋白质载量控制设备40；优选的，蛋白质浓度计算设备33为工控机。

其中所述流通池10、蛋白浓度检测计算装置30中的紫外线照射装置31和光谱仪32及其之间的连接即为本发明的在位UV吸光度检测器。

本发明的在位UV吸光度检测器检测时间在10微秒-10秒。其配置于汇聚层入口处(例如阳离子交换层析主单元/阴离子交换层析主单元)。

在层析装置20运行时，蛋白质浓度计算设备33会根据实时测量的浓度，层析设备21上样流速，及上样时间，实时计算累计的上样量，并将该数据即时传给DCS系统。DCS系统将该数据与事先设定的层析柱22上样载量进行对比，如果两者相等，则DCS系统会控制层析设备21停止上样，进入后续的纯化步骤。从而防止上样量超过层析柱22载量。

在一实施方案中，实际操作时首先在采用缓冲液清洗层析装置20时，对紫外光谱仪32进行调零，以便进行浓度测量。从层析装置20流出的含目标蛋白的溶液经过流通池10时，产生紫外吸收峰，其吸收强度与含目标蛋白的溶液浓度的关系在一定范围内符合朗伯比尔定律，可由公式1计算得到。

公式1中c是单抗浓度,A是紫外吸光值，￡为消光系数，L是流通池10光程。对于已知的含目标蛋白的溶液，如单抗样品，其摩尔消光系数，流通池10光程均为定值。因此可根据紫外吸收值A计算单抗浓度c。光谱仪32的紫外吸收值数据传输至工控机，由工控机根据事先标定的标准曲线，实时计算出单抗浓度。单位时间內，流过流通池10的单抗总量，可以由公式2进行计算：

公式2中，V是含目标蛋白的溶液流速，m是单抗总量，t为时间。含目标蛋白的溶液流速由层析设备21实时流速得到，时间积分运算由工控机进行实时计算。实时计算出的单抗总量，由工控机发送给DCS系统，用于对层析设备21上样载量进行控制。工控机发送给DCS(Distributed Control System,分布式计算机控制系统)。系统之间的通信协议采用工业通信协议(ModBusRTU)。层析装置20和蛋白浓度检测计算装置30之间采用OPC通信协议。

2.HPLC在线检测电荷异构体含量

HPLC在线检测主要用于阳离子纯化步骤中。现有工艺采用离线检测电荷异构体，耗时20-24h，且需要等待检测结果才能决定纯化步骤的合样区间，降低了生产效率。而采用HPLC在线检测之后，大大缩短或消除了等待时间，提升了效率。采用在位检测的方法，相比批次生产工艺可节约19-23h。

在线HPLC装置的具体配置参见实施例4的“在线HPLC装置”部分。

实施例2亲和层析主单元

在本实施例中，层析装置选用GE

多柱纯化系统(

PCC)，其中包括三个层析柱。每根层析柱前后各有一个UV检测器，根据特定层析柱进样料液的UV信号和流出物UV信号判断该层析柱是否达到预设的上样终点。PCC系统仅能检测料液浓度的变化，并以此估算填料载样状态。管理系统根据

PCC系统包含的程序向执行器(例如泵或阀)发出指令，推动料流在流路中流动或停止。

实施例3除病毒主单元1

除病毒主单元1为低pH病毒灭活系统，其主要包括低pH病毒灭活罐(除病毒主单元1(Tank2))，安装于罐上的pH传感器，及分别连接至酸罐和碱罐的加酸泵和加碱泵。除病毒主单元1(Tank2)与缓冲体积2(Tank1)通过泵相连，并可根据程序设定自动通过酸/碱泵调节亲和层析收集液的pH值。病毒灭活完成后，中和回调至设定pH值，料液经过深层过滤后由除病毒主单元1(Tank2)流出至缓冲体积3(Tank3)。

DCS系统判断缓冲体积3(Tank3)电导率值是否在设定目标范围内，如不在范围内，则进行电导调节。

实施例4阳离子交换层析主单元

1.层析装置

在本实施例中，层析装置可以选用多柱纯化系统。层析装置包括一个层析柱。层析柱的入口配置有本发明的在位UV吸光度检测器。管理系统根据相邻步骤的运行情况、离子交换层析介质的结合状态和预先设置的算法向执行器(例如泵或阀)发出指令，推动料流在流路中流动或停止。

2.在位UV吸光度检测器

在位UV吸光度检测器配置于阳离子交换层析柱的入口处。

参见图5至图7，流通池10的溶液流通道接口(11,12)包括设置于所述流通池横向两端的溶液流入接口11和溶液流出接口12；所述光通道接口(13,14)包括设置于所述流通池纵向两端的上端接口13和下端接口14，并且在所述流通池10的中部具有供所述含目标蛋白的溶液通过的光径口15；优选的，所述的流通池10为可变光程流通池；所述可变光程流通池的光程由调整所述光径口15的大小来实现，调整可通过游标卡尺进行调整；具体的，所述光径口15由所述流通池10的中部设置的两根光纤151的间距构成，所述两根光纤151的间距为0.1mm至10mm。调整两根光纤151的间距，即可改变所述可变光程流通池10的光程，而改变流通池10光程是为了可以调整仪器可测量单抗浓度的范围，其可测量的单抗浓度范围在100g/L至0.lg/L之间。

参见图6至图7，蛋白浓度检测计算装置30包括：流通池10的溶液流入接口11与层析设备21连接，流通池10的溶液流出接口12与层析柱22连接；所述上端接口13与所述紫外线照射装置31连接，所述下端口14与所述光谱仪32连接。由层析设备21提供样品流(即所述含目标蛋白的溶液流)。样品经过流通池10后，从溶液流出接口12流出，溶液流出接口12与层析柱22连接。上端接口13为光纤接口，通过光纤151与光源连接。下端接口14为光纤接口，通过光纤151与光谱仪32连接。紫外线照射装置31的光源发射的光，被流通池10中流经两根光纤151之间的单抗吸收，光谱仪32检测透过的光。单抗样品浓度与紫外吸收强度成正比，因此可计算出单抗浓度。而且当光纤在流路中，由于流过光纤狭缝中的料液很少，大部分料液从光线周围空间通过，不会造成流动阻力。此外，所述两根光纤151通过螺纹接口与所述流通池10连接，并且其与上端接口13连接的所述光纤151与所述紫外线照射装置31的发光光源连接；发光光源优选采用HeraeusFiberLight(氘灯)，氘灯发光更稳定。与溶液流出接口12连接的所述光纤151与所述光谱仪32连接。此外，所述光纤151为抗紫外石英光纤，所述光纤151的芯径为450微米；所述两根光纤151通过SMA905接头与所述流通池10连接。

该流通池10材质为不锈钢，两根光纤151采用螺纹接口(例如SMA905)与流通池10连接。其中上端接口13连接的一根光纤151连接光源，用于提供特定波长的紫外光(例如280nm)，另一根与下端接口14连接的光纤151连接光谱仪32,用于将单抗吸收后的光信号传输至光谱仪32,从而得到吸光值A。光谱仪32选用OCEAN-FX-UV-VIS-ES单波长光谱仪，可手动任意设定波长(200nm-850nm)；光谱仪32的检测时间在10微秒-10秒，光谱仪32的检测范围在0-2AU,流通池10光程可由改变两根光纤151之间的间距来进行调节，通常可在0.1毫米至10毫米之间调节。其可测量的单抗浓度在100g/L至0.1g/L之间。

可选地，发光光源在光源机中，光源机为紫外线照射装置31，紫外线照射装置31照射流通池10的两光纤151之间的蛋白溶液。可以选择的发光光源包括但不限于氙灯，氘灯，LED灯，汞灯等，其发射光波长范围应包含200nm-400nm,优选波长在270nm-320nm之间。以及可以选择的光谱仪32包括但不限于紫外光谱仪，紫外-可见光谱仪等，其吸光值范围通常在0-2AU之间。为防止光谱仪32出现信号饱和导致灵敏度下降，通常其可用的吸光值范围为0.05-1.6AU。普通石英光纤在较强紫外光(300nm以下)的照射下会在光纤内形成缺陷中心，导致光纤透射率下降。光纤为抗紫外石英光纤，芯径450微米，材质为抗紫外辐照石英XSR190-1100nm,所述两根光纤通过接头SMA905与流通池10连接。

在线目标蛋白定量检测系统100进行目标蛋白定量检测，具体的：

(1)检测例1

流通池10：不锈钢流通池，可变光程(游标卡尺手动调整至约0.5mm，即两根光纤151之间的距离)；样品：Mab1

1)系统平衡后调零，建立标准曲线；选取了4个点建立标准曲线

表1

2)标准曲线准确度测定

表2

3)在线目标蛋白定量检测系统100对单位时间内的蛋白累计量测定

表3

测定结果参见表1～表3，由此可见在线目标蛋白定量检测系统100的3个循环次数上样过程UV值基本稳定，蛋白累计误差较小。本次测试中实现了UV调零和蛋白累计调零的自动控制。

(2)检测例2

流通池10：不锈钢流通池，可变光程(游标卡尺手动调整至约0.15mm，即两根光纤151之间的距离)；样品：Mab2

1)系统平衡后调零，建立标准曲线；选取了4个点建立标准曲线

表4

2)标准曲线准确度测定

表5

3)在线目标蛋白定量检测系统100对单位时间内的蛋白累计量测定

表6

测定结果参见表4～表6，由此可见2个Cycle上样过程UV值基本稳定，蛋白累计误差较小，本次测试中实现了UV调零和蛋白累计调零的自动控制。

由此可见，在线目标蛋白定量检测系统100对单位时间内的蛋白累计量测定、测量速度快，最快可达到1ms。其他方案在1s或以上。可测量范围广，单个流通池10就可测量0.1g/L至100g/L浓度范围。可以与DCS系统进行数据通信；可以对一定时间内流过流通池10的单抗量进行计算。

3.在线HPLC装置

如图8所示，在线HPLC装置中，进样环与六通阀2号、5号位置连接，HPLC泵与六通阀1号位置连接，HPLC分析柱与六通阀6号位置连接，六通阀4号位置通过取样管路与纯化系统的流路连接。在线HPLC检测的方法为：

(1)取样(Bypass/Loop loading)：DCS发送指令使六通阀切换，样品由4号位置流入六通阀，经5号位置流入进样环。在一定流速下，经过预设的载样时间后，进样环的载样过程完成，DCS发送指令使六通阀切换，进入(2)样品分析步骤。

(2)样品分析(Mainpass/Column loading)：HPLC泵推动步骤(1)中装载于进样环的样品由5号位置流入六通阀，经6号位置流入HPLC分析柱。

(3)数据处理与样品收集：

检测器收集不同时间点的检测信号，传输至Matlab软件，并计算目标分子的纯度，判断该样品是否符合合样标准。计算得到的样品纯度数据如果小于产品纯度设定值，则将相应流分(fraction)转化为废液。如果样品纯度大于等于产品纯度设定值，则将相应流分收集至产品收集罐(即，本步骤层析主单元的下游缓冲体积，例如实施例1所示的缓冲体积4(Tank4))。由于实现了基于对产品纯度的实时测量来合并流分，产品质量的可变性得以最小化。

4.层析过程

(1)当阳离子交换层析进入平衡步骤时，在线目标蛋白定量检测系统进入待机状态。当平衡步骤进行约20min后，确保UV流通池已冲洗干净，对在线目标蛋白定量检测系统进行调零。

(2)当阳离子程序进入上样步骤后，DCS系统给在线目标蛋白定量检测系统发送启动蛋白量累计指令，开始实时计算上样蛋白量，并将计算结果发送给DCS系统。

(3)当上样量达到蛋白累计设定值时，DCS系统发送指令，停止上样；或者

如上一步骤输出的料液已全部用于上样，而在线目标蛋白定量检测系统检测结果仍未达到蛋白累计设定值，则由DCS系统发送指令，停止上样，并开始进行下一步骤。

(4)以结合-洗脱模式进行阳离子交换层析。洗脱过程中，对洗脱的样品进行HPLC在位检测。在洗脱步骤开始时，由DCS系统对HPLC发送启动信号，开始进行HPLC分析。

(5)HPLC方法为自主开发的快速CEX-HPLC方法，检测时间仅为4.7min。阳离子洗脱保留时间为6min，因此每个洗脱体积(column volume,CV)均可以检测到。

(6)洗脱收集液采用在线HPLC进行实时分析。

(7)HPLC的分析结果传输至Matlab软件，当样品检测完成后，由自主开发的程序按照给定的合样标准进行合样计算(例如酸性异构体峰<30％，主峰>60％，碱性异构体峰<15％)。所述程序与DCS系统之间通过所述程序包含的数据接口相连接。本领域技术人员可以根据实际情况，用可商购的工作站、程序包或应用来代替本步骤采用的自主开发的程序。

(8)根据程序给出的合样计算结果(例如合样区间为P2-P11，或者例如P2至P11分别进行合样操作)在缓冲体积4(Tank4)进行样品合样。

实施例5阴离子交换层析主单元

在本实施例中，层析装置可以选用多柱纯化系统。层析装置包括一个层析柱。层析柱的入口配置有本发明的在位UV吸光度检测器。管理系统根据相邻步骤的运行情况、离子交换层析介质的结合状态和预先设置的算法向执行器(例如泵或阀)发出指令，推动料流在流路中流动或停止。

实施例6除病毒主单元2

除病毒主单元2为除病毒过滤系统(纳滤)，包括恒压泵及除病毒过滤器，恒压泵的一个进口与缓冲体积5(Tank5)连接，通过调节隔膜泵流速控制恒定在设定压力(29psi)下进行除病毒过滤，过滤后样品流出除病毒主单元2。

实施例7浓缩和/或换液主单元

1.浓缩和/或换液主单元1(单向切向流过滤(SPTFF))

浓缩和/或换液主单元1为超滤浓缩系统，由恒压泵及单向切向流浓缩膜包构成，恒压泵的一个进口与缓冲体积6(Tank6)相连，在设定压力(1.5Bar)下进行浓缩，浓缩后样品流出浓缩和/或换液主单元1。

浓缩结束后，以预定的冲洗体积冲洗膜包。

2.浓缩和/或换液主单元2(切向流换液)

浓缩和/或换液主单元2为超滤换液系统，由泵及单向在位洗滤膜包构成，泵进口与缓冲体积7(Tank7)相连，在程序设定条件下进行单向洗滤。

以蠕动泵为调节料流流动或停止的执行器。控制切向流换液单元进口处的压力为恒压(15-25psi)。进料蠕动泵和置换液蠕动泵的转速比按照恒定比例进行调节(约4-5倍)。

换液结束后，以预定的冲洗体积冲洗膜包。

换液后样品即为最终产品溶液。

实施例8存在汇聚层的纯化系统

当关注汇聚层的汇聚作用时，由于层析主单元是提高物料纯度的关键步骤，因此汇聚层的汇聚作用主要通过各个层析主单元来体现。在实施例1所述的纯化系统的基础上，本实施例设置包含汇聚层的纯化系统。

8.1层析主单元中的亚单元设置

亲和层析主单元包括7个亚单元，其通过三个层析柱分别以结合-洗脱模式运行2或3个周期来实现。当亲和层析主单元包括7个亚单元时，其输出流包含7个亚流。

阳离子交换层析主单元包括3个亚单元，其通过一个层析柱以结合-洗脱模式运行3个周期来实现；或者包括1个亚单元，其通过一个层析柱以结合-洗脱模式运行1个周期来实现。

阴离子交换层析主单元包括1个亚单元，其通过一个层析柱以流穿模式运行1个周期来实现。

8.2存在一个汇聚层的纯化系统

存在一个汇聚层(阳离子交换层析主单元作为汇聚层)的纯化系统示意图参见图9。其中：

阳离子交换层析主单元包括1个亚单元；

亲和层析主单元输出的7个亚流沿纯化系统的管路流动至阳离子交换层析主单元出口时，已汇聚为1个亚流。即，阳离子交换层析主单元输出流仅包含1个亚流。

在该系统中，每个亲和层析从单元通常各自独立地分别由样品检测系统进行检测，因此亲和层析主单元这一单元操作需要样品检测系统运行7次。阳离子交换层析主单元仅配置一套检测器，相应地，该单元一个运行周期仅需要样品检测系统运行1次。

8.3存在二个汇聚层的纯化系统

存在二个汇聚层(阳离子交换层析主单元、阴离子交换层析主单元作为汇聚层)的纯化系统示意图参见图10。其中：

阳离子交换层析主单元包括3个亚单元；

亲和层析主单元输出的7个亚流沿纯化系统的管路流动至阳离子交换层析主单元出口时，已汇聚为3个亚流。其中阳离子交换层析主单元的3个亚流沿纯化系统的管路流动至阴离子交换层析主单元出口时，已汇聚为1个亚流。

Claims (22)

1.一种用于进行连续纯化的纯化系统，其包含

(1)至少一个亲和层析主单元，其中每个亲和层析主单元各自独立地包含一个或更多个亲和层析亚单元；

(2)至少一个病毒灭活主单元，其中病毒灭活主单元各自独立地包含一个或更多个病毒灭活亚单元；和

(3)至少一个浓缩和/或换液主单元，其中每个浓缩和/或换液主单元各自独立地包含一个或更多个浓缩和/或换液亚单元；

在每个主单元的上游或下游各自独立地任选存在的一个或更多个缓冲体积；每个所述主单元及缓冲体积之间通过可使料液流通的管路连接，

其中，每个缓冲体积配置至少一个重量传感器和/或至少一个液位传感器，所述重量传感器和液位传感器与管理系统通信连接；

所述管理系统根据所述重量传感器和/或液位传感器的信号对所述纯化系统进行启动、继续和停止的控制；

所述纯化系统纯化的靶分子是蛋白；

所述浓缩和/或换液单元是用于实施以连续操作进行的超滤或透析的单元，在所述浓缩和/或换液单元中，包含样品的流股的流动方向与滤出方向不同。

2.权利要求1的纯化系统，其中，

亲和层析主单元上游存在至少一个缓冲体积，并且任一主单元上游和下游均存在至少一个缓冲体积；所述管理系统根据重量及液位信号来控制进行以下操作：

I.当亲和层析主单元上游的缓冲体积的重量传感器反馈值和/或液位传感器反馈值达到预设值时，纯化系统运行启动；

II.当任一主单元上游的缓冲体积的重量传感器反馈值和/或液位传感器反馈值达到预设值时，启动该主单元运行；

III.当任一主单元上游的缓冲体积的重量传感器反馈值和/或液位传感器反馈值为设定下限值时，停止料液向该主单元转移，当单元操作完成后该主单元停止运行；

IV.当任一主单元下游的缓冲体积的重量传感器和液位传感器反馈值均达到设定上限值时，该主单元停止运行。

3.权利要求1或2的纯化系统，其依次包含：

(1)至少一个亲和层析主单元，其中每个亲和层析主单元各自独立地包含一个或更多个亲和层析亚单元；

(2)至少一个病毒灭活主单元，其中病毒灭活主单元各自独立地包含一个或更多个病毒灭活亚单元；

(3)至少一个阳离子交换层析主单元，所述阳离子交换层析主单元各自独立地包含一个或更多个阳离子交换层析亚单元；

(4)至少一个阴离子交换层析主单元，所述阴离子交换层析主单元各自独立地包含一个或更多个阴离子交换层析亚单元；和

(5)至少一个浓缩和/或换液主单元，其中每个浓缩和/或换液主单元各自独立地包含一个或更多个浓缩和/或换液亚单元。

4.权利要求1-3中任一项的纯化系统，其中

在至少一个上游主单元的至少一个亚单元目标料液流出所述主单元之后，所述管理系统允许至少一个所述上游主单元的紧邻下游主单元的至少一个亚单元启动运行；并且

所述管理系统允许任一所述上游主单元的第一亚单元目标料液流出所述上游主单元之后，所述上游主单元与其紧邻下游主单元运行时间至少一部分重叠。

5.权利要求1-4中任一项的纯化系统，其中

在所述纯化系统流通管道的相对于至少一个层析单元的上游或下游的位置，配置有一个或多个在位UV吸光度检测器，其与管理系统通信连接；

管理系统根据所述在位UV吸光度检测器在位检测的信号来控制所述层析单元的上样终点。

6.权利要求1-5中任一项的纯化系统，其包括操作层和自动化层，其中，操作层包括所有工艺技术元件(PTU)和服务技术元件(STU)，自动化层包括用于数据采集和处理的元件；并且

操作层包含按以下顺序连接的三个层：(1)原料输入层；(2)汇聚层；(3)产品输出层；

其中汇聚层具备以下I、II、III：

I.向汇聚层输入的物料已经经过至少一个纯化步骤，在用于表征物料属性的参数组成的空间中，不同时间点向汇聚层输入的物料的属性分散的程度相对于原料而言已经降低；并且根据预先设定的参数要求，汇聚层将物料进行进一步汇聚，使得由汇聚层输出的物料在预先设定的一个或多个维度上具备比向汇聚层输入的物料更高的汇聚性；

II.以N表示某一层析主单元中包括的层析亚单元数目，则所述使层析亚单元数目减少的趋势可以用下式(1)和/或(2)表示：

(1)N(汇聚层)≤N(汇聚层上游相邻层析主单元)；

(2)N(汇聚层下游相邻纯化主单元)≤N(汇聚层上游相邻层析主单元)；

其中所述汇聚层下游相邻纯化主单元是层析主单元、除病毒主单元或浓缩和/或换液主单元；

III.汇聚层中的层析主单元包含一个层析亚单元；或者

汇聚层中的层析主单元包含多个层析亚单元；多个层析亚单元的操作时间相互连续。

7.权利要求1-6中任一项的纯化系统，其中

所述操作层包含一个汇聚层，其为阳离子交换层析主单元。

8.权利要求1-7中任一项的纯化系统，其中

所述操作层包含二个汇聚层，分别为阳离子交换层析主单元和阴离子交换层析主单元。

9.权利要求8的纯化系统，其中阳离子交换层析主单元以结合-洗脱模式进行层析；阴离子交换层析主单元以流过模式进行层析。

10.权利要求6-9中任一项的纯化系统，其中

在所述汇聚层的入口处，配置有一个或多个在位UV吸光度检测器，其与管理系统通信连接；

管理系统根据所述在位UV吸光度检测器在位检测的信号来控制汇聚层层析单元中的层析介质的上样终点。

11.权利要求1-10中任一项的纯化系统，其中

所述浓缩和/或换液步骤为切向流过滤，优选单向切向流过滤；或者，所述浓缩和/或换液步骤为单向切向流过滤和/或在位透析。

12.权利要求1-11中任一项的纯化系统，其中

所述除病毒主单元选自除病毒过滤、病毒灭活或其组合；

其中，病毒灭活的方式优选为低pH灭活。

13.权利要求1-12中任一项的纯化系统，其中

所述亲和层析主单元为多柱纯化系统；

所述多柱位层析系统包含至少两个层析柱，每个层析柱各自独立地处于以下状态之一：a.加载步骤、b.非加载步骤和c.静息状态；

在所述纯化系统流通管道的相对于至少一个层析柱的上游或下游的位置，配置有一个或多个在位UV吸光度检测器，其与管理系统通信连接；

所述管理系统根据层析柱的结合状态和预先设置的算法发出指令，控制层析柱在所述状态a、b和c之间切换。

14.权利要求1-13中任一项的纯化系统，其依次包括缓冲体积1、亲和层析主单元、缓冲体积2、除病毒主单元1、缓冲体积3、阳离子交换层析主单元、缓冲体积4、阴离子交换层析主单元、缓冲体积5、除病毒主单元2、缓冲体积6、浓缩和/或换液主单元1、缓冲体积7、浓缩和/或换液主单元2，纯化过程中物料的流动如以下操作iii至xv：

i.作为原料的澄清的细胞收获液暂存于缓冲体积1中；

ii.物料由缓冲体积1通过一个或多个亚流流入亲和层析主单元；

iii.物料由亲和层析主单元通过多个亚流流入缓冲体积2；

iv.物料由缓冲体积2通过一个亚流流入除病毒主单元1；

v.物料由除病毒主单元1通过多个亚流流入缓冲体积3；

vi.物料由缓冲体积3通过一个亚流流入阳离子交换层析主单元；

vii.物料由阳离子交换层析主单元通过一个或多个亚流流入缓冲体积4；

viii.物料由缓冲体积4通过一个亚流流入阴离子交换层析主单元；

ix.物料由阴离子交换层析主单元通过一个亚流流入缓冲体积5；

x.物料由缓冲体积5通过一个亚流流入除病毒主单元2；

xi.物料由除病毒主单元2通过一个亚流流入缓冲体积6；

xii.物料由缓冲体积6通过一个亚流流入浓缩和/或换液主单元1；

xiii.物料由浓缩和/或换液主单元1通过一个亚流流入缓冲体积7；

xiv.物料由缓冲体积7通过一个亚流流入浓缩和/或换液主单元2；

xv.物料由浓缩和/或换液主单元2通过一个亚流流入缓冲体积8，并作为产品输出；

优选地，缓冲体积1、缓冲体积2、缓冲体积3、缓冲体积4、缓冲体积5、缓冲体积6、缓冲体积7分别为缓冲罐；管理系统根据重量及液位信号来控制进行如权利要求2所述的操作。

15.权利要求1-14中任一项的纯化系统，其中

所述在位UV吸光度检测器包含：

流通池，包括溶液流通道接口和光通道接口，所述溶液流通道接口与层析装置连接，所述光通道接口与所述蛋白浓度检测计算装置连接；

紫外线照射装置，与所述流通池的光通道接口连接，照射流经所述流通池的所述含目标蛋白的溶液；

光谱仪，与所述流通池的光通道接口连接，检测所述紫外线照射装置照射流经所述流通池的所述含目标蛋白的溶液的紫外线强度，并将紫外吸收值数据传送到蛋白质浓度计算设备。

16.权利要求15的纯化系统，其中

所述流通池的溶液流通道接口包括设置于所述流通池横向两端的溶液流入接口和溶液流出接口；所述光通道接口包括设置于所述流通池纵向两端的上端接口和下端接口，并且在所述流通池的中部具有供所述含目标蛋白的溶液通过的光径口；

所述流通池的溶液流入接口与所述层析设备连接，所述流通池的溶液流出接口与所述层析柱连接；所述上端接口与所述紫外线照射装置连接，所述下端接口与所述光谱仪连接。

17.权利要求15或16的纯化系统，其中

所述流通池为可变光程流通池；所述可变光程流通池的光程由调整所述光径口的大小调整；

所述光径口由所述流通池的中部设置的两根光纤的间距构成，所述两根光纤的间距为0.1mm至10mm。

18.权利要求16或17的纯化系统，其中

所述流通池上端接口和下端接口为光纤接口，所述两根光纤通过所述上端接口和下端接口与所述流通池连接，并且与所述上端接口连接的所述光纤与所述紫外线照射装置的发光光源连接；与所述下端接口连接的所述光纤与所述光谱仪连接。

19.权利要求18的纯化系统，其中

所述光纤为抗紫外石英光纤，所述光纤的芯径为450微米；所述两根光纤通过SMA905接头与所述流通池连接。

20.权利要求15-19中任一项的纯化系统，其中

所述紫外线照射装置的发光光源包括氙灯、氘灯、LED灯或者汞灯；所述紫外线照射装置的发光光源的发射光波长范围为200nm-400nm；

所述光谱仪包括：紫外光谱仪，紫外-可见光谱仪；所述光谱仪的吸光值范围为0-2AU。

21.权利要求20所述的纯化系统，其中

所述紫外线照射装置的发射光波长范围为270nm-320nm；

所述光谱仪的吸光值范围为在0.05AU-1.6AU；

所述目标蛋白为单抗。

22.一种纯化靶分子的方法，所述方法通过权利要求1-21中任一项的系统完成。

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