CN114573678A - 一种Rheb蛋白激活剂及其应用 - Google Patents
一种Rheb蛋白激活剂及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114573678A CN114573678A CN202210244945.2A CN202210244945A CN114573678A CN 114573678 A CN114573678 A CN 114573678A CN 202210244945 A CN202210244945 A CN 202210244945A CN 114573678 A CN114573678 A CN 114573678A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- protein
- rheb
- atp6ap1
- activator
- cell strain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108700019578 Ras Homolog Enriched in Brain Proteins 0.000 title claims abstract description 77
- 102000046951 Ras Homolog Enriched in Brain Human genes 0.000 title claims abstract description 77
- 239000012190 activator Substances 0.000 title claims abstract description 20
- 101150020518 RHEB gene Proteins 0.000 claims abstract description 45
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 38
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 102000016285 Guanine Nucleotide Exchange Factors Human genes 0.000 claims abstract description 35
- 108010067218 Guanine Nucleotide Exchange Factors Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 101000807820 Homo sapiens V-type proton ATPase subunit S1 Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 102100037090 V-type proton ATPase subunit S1 Human genes 0.000 claims abstract description 35
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 16
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 10
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 36
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 34
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N biotin Natural products N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 33
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 22
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 22
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 22
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims description 19
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 17
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 17
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 17
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims description 11
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 3
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 claims description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 10
- 238000002372 labelling Methods 0.000 abstract description 5
- 102000008135 Mechanistic Target of Rapamycin Complex 1 Human genes 0.000 description 14
- 108010035196 Mechanistic Target of Rapamycin Complex 1 Proteins 0.000 description 14
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 8
- 230000007783 downstream signaling Effects 0.000 description 7
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 6
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 5
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 238000001994 activation Methods 0.000 description 2
- 238000003197 gene knockdown Methods 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- ZCKYZTGLXIEOKS-CIUDSAMLSA-N Asp-Asp-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N ZCKYZTGLXIEOKS-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000013446 GTP Phosphohydrolases Human genes 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 1
- 108091006109 GTPases Proteins 0.000 description 1
- 102100031561 Hamartin Human genes 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 101000795643 Homo sapiens Hamartin Proteins 0.000 description 1
- 101000584785 Homo sapiens Ras-related protein Rab-7a Proteins 0.000 description 1
- GVKKVHNRTUFCCE-BJDJZHNGSA-N Ile-Leu-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N GVKKVHNRTUFCCE-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- MPSBSKHOWJQHBS-IHRRRGAJSA-N Leu-His-Met Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)N MPSBSKHOWJQHBS-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- OVZLLFONXILPDZ-VOAKCMCISA-N Leu-Lys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O OVZLLFONXILPDZ-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- LCNASHSOFMRYFO-WDCWCFNPSA-N Leu-Thr-Gln Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O LCNASHSOFMRYFO-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- RFQATBGBLDAKGI-VHSXEESVSA-N Lys-Gly-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)CNC(=O)[C@H](CCCCN)N)C(=O)O RFQATBGBLDAKGI-VHSXEESVSA-N 0.000 description 1
- SQUTUWHAAWJYES-GUBZILKMSA-N Met-Asp-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O SQUTUWHAAWJYES-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- 102100030019 Ras-related protein Rab-7a Human genes 0.000 description 1
- 102100036924 Solute carrier family 22 member 5 Human genes 0.000 description 1
- 102000013530 TOR Serine-Threonine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108010065917 TOR Serine-Threonine Kinases Proteins 0.000 description 1
- FQPDRTDDEZXCEC-SVSWQMSJSA-N Thr-Ile-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FQPDRTDDEZXCEC-SVSWQMSJSA-N 0.000 description 1
- PELIQFPESHBTMA-WLTAIBSBSA-N Thr-Tyr-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 PELIQFPESHBTMA-WLTAIBSBSA-N 0.000 description 1
- 102000004604 Vesicle-Associated Membrane Protein 3 Human genes 0.000 description 1
- 108010017749 Vesicle-Associated Membrane Protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 108091006004 biotinylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000000749 co-immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 1
- 238000005932 reductive alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 229940126586 small molecule drug Drugs 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
- C07K14/4705—Regulators; Modulating activity stimulating, promoting or activating activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/62—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating the ionisation of gases, e.g. aerosols; by investigating electric discharges, e.g. emission of cathode
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Obesity (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种Rheb蛋白激活剂及其应用。本发明利用新型邻近标记技术筛选得到Rheb蛋白激活剂‑ATP6AP1蛋白作为Rheb的GEF(鸟嘌呤核苷酸交换因子)，ATP6AP1蛋白的C末端30个氨基酸可以直接靶向激活Rheb，使得Rheb‑GDP转变为GTP形式，进而发挥疗效，筛选出的ATP6AP1蛋白具有较大的药用价值，尤其在治疗糖尿病领域具有更佳的药用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种Rheb蛋白激活剂及其应用。
背景技术
Rheb是Ras超家族的小GTP酶，有Rheb-GDP和Rheb-GTP两种形式，是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体1(mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1)信号通路的上游正调控因子，与mTORC1信号通路共同调控着细胞生长、增殖和分化等过程。
GDP-GTP交换需要特定因子的参与，即：在GAP催化下Rheb-GTP水解为GDP形式，Rheb-GDP可以被GEF(鸟嘌呤核苷酸交换因子)重新激活，转变为GTP形式。目前已知TSC2作为Rheb的GAP(G蛋白调控因子)发挥功能，但目前并未发现已知Rheb的GEF。同时，目前也并未发现体内外可以直接靶向激活Rheb的小分子药物或短肽药物。
Rheb的GEF是哪一类蛋白、其激活过程受什么调控，目前仍是有待解决的科学问题。由于Rheb蛋白本身存在较弱的GTPase活性，因此在细胞中多数情况以GTP结合形式存在，这可能是Rheb的GEF不容易被发现的原因。同时，由于Rheb与其GEF的结合较为瞬时，因此，传统的检测蛋白互作的手段难以发现。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种Rheb蛋白激活剂及其应用。本发明利用新型邻近标记技术筛选方法找到了ATP6AP1蛋白作为Rheb的GEF(鸟嘌呤核苷酸交换因子)，可以使得Rheb-GDP重新被激活，转变为GTP形式，进而发挥疗效。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
第一目的，本发明提供了一种Rheb蛋白激活剂，所述Rheb蛋白激活剂为ATP6AP1蛋白。
第二目的，本发明提供了ATP6AP1蛋白作为靶向Rheb蛋白激活剂的应用。
作为本发明所述应用的优选实施方式，采用ATP6AP1蛋白的C末端30个氨基酸激活Rheb蛋白，30个氨基酸的序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明人经过大量的实验，筛选得到ATP6AP1蛋白可以作为Rheb的潜在GEF，ATP6AP1蛋白的C末端30个氨基酸(TYGLHMILSLKTMDRFDDHKGPTISLTQIV)可以直接在体内外激活Rheb，作为直接靶向激活Rheb的激活剂使用。
第三目的，本发明提供了一种筛选Rheb蛋白激活剂的方法，包括以下步骤：
1)构建生物素连接酶与Rheb融合表达载体，将载体转入宿主细胞内，药物筛选稳定表达Rheb蛋白的细胞株，同时构建对照细胞株；
2)向稳定表达Rheb蛋白的细胞株中加入胰岛素和生物素进行刺激，向对照细胞株中加入生物素刺激，然后进行质谱检测，分析蛋白；
3)在有/无进行胰岛素刺激条件下，分别将稳定表达Rheb蛋白的细胞株中的富集蛋白扣除(扣除表示为将两组数据中重叠的蛋白去掉，以达到去除对照组干扰的目的)对照细胞株中的富集蛋白，获得有/无进行胰岛素刺激条件下的Rheb邻近蛋白，分析Rheb邻近蛋白，经鸟嘌呤核苷酸交换因子筛选条件，得ATP6AP1蛋白。
更优选地，鸟嘌呤核苷酸交换因子筛选条件包括以下条件：
(1)GEF(鸟嘌呤核苷酸交换因子)与Rheb存在体内外相互作用；
(2)过表达GEF后可以激活mTORC1下游信号通路；
(3)敲低或敲除GEF后，mTORC1下游信号通路活性受到大幅度抑制；
(4)体外实验证明GEF可以直接促进Rheb完成GDP-GTP转换过程。
本发明通过新型邻近标记技术筛选得到Rheb蛋白激活剂-ATP6AP1蛋白，ATP6AP1蛋白的C末端30个氨基酸可以直接靶向激活Rheb，具有较大的药用价值，尤其在糖尿病领域具有更佳的药用价值。
作为本发明所述方法的优选实施方式，胰岛素的浓度为0.1nM-10μM，生物素的浓度为50μM-500μM。
胰岛素和生物素采用上述浓度为细胞株在正常发挥功能下的较低浓度，更为符合生理状态。
更优选地，胰岛素的浓度为0.9μM，生物素的浓度为50μM。
作为本发明所述方法的优选实施方式，刺激的时间为10-20min。
GEF蛋白与Rheb的相互作用是较为瞬时的，刺激时间超过20min可能会导致一些负反馈现象的发生，不能准确捕捉到GEF蛋白。
作为本发明所述方法的优选实施方式，所述生物素连接酶包括生物素连接酶xxID，生物素连接酶与Rheb融合表达载体为HAFlag-xxID-Rheb。本发明中提到的生物素连接酶不仅限于本发明，还可以为本领域中常规使用的生物素连接酶。
优选地，稳定表达Rheb蛋白的细胞株为HeLa-xxID-Rheb稳定表达细胞株，对照细胞株为HeLa-xxID稳定表达细胞株。
更优选地，宿主细胞包括HeLa细胞，还可以为其他细胞。
第四目的，本发明提供了一种蛋白质药物组合物，包含ATP6AP1蛋白。
第五目的，本发明提供了上述Rheb蛋白激活剂或蛋白质药物组合物在制备激活Rheb而预防和/或治疗糖尿病药物中的用途。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种Rheb蛋白激活剂及其应用，本发明利用新型邻近标记技术筛选得到Rheb蛋白激活剂-ATP6AP1蛋白作为Rheb的GEF(鸟嘌呤核苷酸交换因子)，ATP6AP1蛋白的C末端30个氨基酸可以直接靶向激活Rheb，使得Rheb-GDP转变为GTP形式，进而发挥疗效，筛选出的ATP6AP1蛋白具有较大的药用价值，尤其在治疗糖尿病领域具有更佳的药用价值，同时相比于其他小分子激活剂，小肽激活剂的特异性较高。
附图说明
图1为HeLa-xxID-Rheb稳定表达细胞株和HeLa-xxID稳定表达细胞株构建过程图及质谱检测图；
图2为实施例1中Come/GO/Stay组的差异倍数分析图；
图3为ATP6AP1蛋白与Rheb存在体内外相互作用示意图；
图4为过表达ATP6AP1蛋白激活mTORC1下游信号通路示意图；
图5为敲低或敲除ATP6AP1蛋白，mTORC1下游信号通路活性示意图；
图6为体外实验证明ATP6AP1蛋白可以直接促进Rheb完成GDP-GTP转换过程的结果图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、一种筛选Rheb蛋白激活剂的方法
一种筛选Rheb蛋白激活剂的方法，包括以下步骤：
1)构建生物素连接酶(xxID)与Rheb融合表达载体(HAFlag-xxID-Rheb)，将载体转入HeLa细胞内，药物筛选HeLa-xxID-Rheb稳定表达细胞株，同时构建对照细胞系HeLa-xxID稳定表达细胞株，利用含10％透析血清培养基培养；实验前16小时，使用无血清培养基培养，规避胰岛素的干扰。
2)然后向HeLa-xxID-Rheb稳定表达细胞株中加入胰岛素(0.9μM)和生物素(50μM)进行刺激，刺激15min，向HeLa-xxID稳定表达细胞株中加入生物素(50μM)刺激，不加入胰岛素，刺激15min，对样品进行裂解，提取蛋白后，利用链霉亲和素下拉，富集生物素化的蛋白，对链霉亲和磁珠进行还原烷基化，胰酶酶解，脱盐，最后将样品真空干燥后干粉保存，进行质谱检测(如图1所示)，分析蛋白。
3)在有/无进行胰岛素刺激条件下，分别将HeLa-xxID-Rheb稳定表达细胞株中的富集蛋白扣除HeLa-xxID稳定表达细胞株中的富集蛋白，获得有/无进行胰岛素刺激条件下的Rheb邻近蛋白，将这部分富集蛋白(Rheb邻近蛋白)进一步分析，可分为Come/GO/Stay组，即刺激后出现蛋白组/刺激前后稳定存在组/刺激后离开蛋白组(如图2所示)，Come组包括ATP6AP1蛋白、REEPS蛋白、SC22B蛋白，GO组包括VAMP3蛋白、SCD蛋白，Stay组包括RAB7A蛋白、TSC1蛋白，由于GEF蛋白应该在胰岛素刺激后出现，因此将Come组蛋白作为GEF候选蛋白进行验证。
4)对质谱表单的候选蛋白进行验证，Rheb的GEF候选蛋白需满足以下条件：
(1)GEF(鸟嘌呤核苷酸交换因子)与Rheb存在体内外相互作用；
(2)过表达GEF后可以激活mTORC1下游信号通路；
(3)敲低或敲除GEF后，mTORC1下游信号通路活性受到大幅度抑制；
(4)体外实验证明GEF可以直接促进Rheb完成GDP-GTP转换过程。
通过筛选，发现ATP6AP1蛋白(C末端30个氨基酸，TYGLHMILSLKTMDRFDDHKGPTISLTQIV)可以很好的满足上述条件(结果示意图如图3-图6所示)，证明ATP6AP1蛋白是Rheb的潜在GEF。
参考图3为ATP6AP1蛋白与Rheb存在体内外相互作用示意图；通过免疫共沉淀实验，分别在体内/体外证明ATP6AP1/C tail与Rheb的存在相互作用，体外实验证明二者存在直接相互作用。体内实验是将ATP6AP1-SFB/C tail-SFB和GST-Rheb在293T细胞中过表达，通过Flag IP后，利用GST抗体检测是否与Rheb存在相互作用。体外实验是将体外纯化的GST-Rheb蛋白与C tail短肽进行GST下拉实验，证明GST-Rheb与C tail存在直接相互作用。
图4为过表达ATP6AP1蛋白激活mTORC1下游信号通路示意图；通过在HeLa细胞中，分别过表达ATP6AP1-SFB与C tail-SFB，检测mTORC1信号通路是否被激活，可以看到相比于对照组GFP，过表达ATP6AP1和C tail均能明显激活mTORC1下游信号通路。
图5为敲低或敲除ATP6AP1蛋白，mTORC1下游信号通路活性示意图；在HeLa细胞中，敲低ATP6AP1后，检测对mTORC1下游信号通路的影响，发现会抑制mTORC1下游信号通路。
图6为体外实验证明ATP6AP1蛋白可以直接促进Rheb完成GDP-GTP转换过程的结果图。
本发明利用新型邻近标记技术筛选得到Rheb蛋白激活剂-ATP6AP1蛋白作为Rheb的GEF(鸟嘌呤核苷酸交换因子)，ATP6AP1蛋白的C末端30个氨基酸可以直接靶向激活Rheb，使得Rheb-GDP转变为GTP形式，进而发挥疗效，筛选出的ATP6AP1蛋白具有较大的药用价值，尤其在糖尿病领域具有更佳的药用价值。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学
<120> 一种Rheb蛋白激活剂及其应用
<130> 2022-03-08
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Thr Tyr Gly Leu His Met Ile Leu Ser Leu Lys Thr Met Asp Arg Phe
1 5 10 15
Asp Asp His Lys Gly Pro Thr Ile Ser Leu Thr Gln Ile Val
20 25 30
Claims (9)
1.一种Rheb蛋白激活剂，其特征在于，所述Rheb蛋白激活剂为ATP6AP1蛋白。
2.ATP6AP1蛋白作为靶向Rheb蛋白激活剂的应用。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，采用ATP6AP1蛋白的C末端30个氨基酸激活Rheb蛋白，30个氨基酸的序列如SEQ ID NO:1所示。
4.一种筛选Rheb蛋白激活剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)构建生物素连接酶与Rheb融合表达载体，将载体转入宿主细胞内，药物筛选稳定表达Rheb蛋白的细胞株，同时构建对照细胞株；
2)向稳定表达Rheb蛋白的细胞株中加入胰岛素和生物素进行刺激，向对照细胞株中加入生物素刺激，然后进行质谱检测，分析蛋白；
3)在有/无进行胰岛素刺激条件下，分别将稳定表达Rheb蛋白的细胞株中的富集蛋白扣除对照细胞株中的富集蛋白，获得有/无进行胰岛素刺激条件下的Rheb邻近蛋白，分析Rheb邻近蛋白，经鸟嘌呤核苷酸交换因子筛选条件，得ATP6AP1蛋白。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，胰岛素的浓度为0.1nM-10μM，生物素的浓度为50μM-500μM。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，刺激的时间为10-20min。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，生物素连接酶包括生物素连接酶xxID，生物素连接酶与Rheb融合表达载体为HAFlag-xxID-Rheb。
8.一种蛋白质药物组合物，其特征在于，包含ATP6AP1蛋白。
9.如权利要求1所述的Rheb蛋白激活剂或权利要求8所述的蛋白质药物组合物在制备激活Rheb而预防和/或治疗糖尿病药物中的用途。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210244945.2A CN114573678B (zh) | 2022-03-11 | 2022-03-11 | 一种Rheb蛋白激活剂及其应用 |
| PCT/CN2022/083980 WO2023168770A1 (zh) | 2022-03-11 | 2022-03-30 | 一种Rheb蛋白激活剂及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210244945.2A CN114573678B (zh) | 2022-03-11 | 2022-03-11 | 一种Rheb蛋白激活剂及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114573678A true CN114573678A (zh) | 2022-06-03 |
| CN114573678B CN114573678B (zh) | 2022-12-27 |
Family
ID=81780941
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210244945.2A Active CN114573678B (zh) | 2022-03-11 | 2022-03-11 | 一种Rheb蛋白激活剂及其应用 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114573678B (zh) |
| WO (1) | WO2023168770A1 (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107001455A (zh) * | 2014-11-19 | 2017-08-01 | 皇家飞利浦有限公司 | 利用hnl的诊断方法 |
| CN108738346A (zh) * | 2015-09-25 | 2018-11-02 | 普罗维斯塔诊断公司 | 用于检测具有致密的乳腺的女性中的乳腺癌的生物标志 |
| CN108977534A (zh) * | 2018-03-30 | 2018-12-11 | 江苏省人民医院 | 一种靶向测序试剂盒及其使用方法及靶向测序方法 |
| CN110554190A (zh) * | 2018-05-30 | 2019-12-10 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 来源于人外周血cd4+t细胞的生物标志物在胰腺癌预后中的应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10168338B2 (en) * | 2014-09-12 | 2019-01-01 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Methods of identifying modulators of sestrin-gator-2 interaction for modulating mTORC1 activity |
| WO2019173636A1 (en) * | 2018-03-07 | 2019-09-12 | Poseida Therapeutics, Inc. | Cartyrin compositions and methods for use |
-
2022
- 2022-03-11 CN CN202210244945.2A patent/CN114573678B/zh active Active
- 2022-03-30 WO PCT/CN2022/083980 patent/WO2023168770A1/zh unknown
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107001455A (zh) * | 2014-11-19 | 2017-08-01 | 皇家飞利浦有限公司 | 利用hnl的诊断方法 |
| CN108738346A (zh) * | 2015-09-25 | 2018-11-02 | 普罗维斯塔诊断公司 | 用于检测具有致密的乳腺的女性中的乳腺癌的生物标志 |
| CN108977534A (zh) * | 2018-03-30 | 2018-12-11 | 江苏省人民医院 | 一种靶向测序试剂盒及其使用方法及靶向测序方法 |
| CN110554190A (zh) * | 2018-05-30 | 2019-12-10 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 来源于人外周血cd4+t细胞的生物标志物在胰腺癌预后中的应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| HAO JIANG: "Constitutively active Rheb induces oncogenic transformation", 《NIH PUBLIC ACCESS》 * |
| PARMAR AND TAMANOI: "Rheb G-Proteins and the Activation of mTORC1", 《NIH PUBLIC ACCESS》 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2023168770A1 (zh) | 2023-09-14 |
| CN114573678B (zh) | 2022-12-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Stam et al. | Identification of candidate transcriptional modulators involved in successful regeneration after nerve injury | |
| Bizzarro et al. | Annexin A1 induces skeletal muscle cell migration acting through formyl peptide receptors | |
| Minoshima et al. | Integrated analysis of glycan and RNA in single cells | |
| Fanis et al. | Five friends of methylated chromatin target of protein-arginine-methyltransferase [prmt]-1 (chtop), a complex linking arginine methylation to desumoylation | |
| Peng et al. | A hypermethylation strategy utilized by enhancer-bound CARM1 to promote estrogen receptor α-dependent transcriptional activation and breast carcinogenesis | |
| Yan et al. | The cardiac translational landscape reveals that micropeptides are new players involved in cardiomyocyte hypertrophy | |
| Qi et al. | Coordinated regulation of dendrite arborization by epigenetic factors CDYL and EZH2 | |
| Sjölinder et al. | The growing pre-mRNA recruits actin and chromatin-modifying factors to transcriptionally active genes | |
| KR101853418B1 (ko) | 암 세포의 역분화 | |
| Ding | Generation of patient-specific motor neurons in modeling movement diseases | |
| Gracia-Diaz et al. | Gain and loss of function variants in EZH1 disrupt neurogenesis and cause dominant and recessive neurodevelopmental disorders | |
| Sun et al. | Identification of interactive molecules between antler stem cells and dermal papilla cells using an in vitro co-culture system | |
| Qian et al. | Decrotonylation of AKT1 promotes AKT1 phosphorylation and activation during myogenic differentiation | |
| CN114573678B (zh) | 一种Rheb蛋白激活剂及其应用 | |
| Hua et al. | Peptidome analysis of human intrauterine adhesion tissues and the identification of antifibrotic peptide | |
| CN111153981B (zh) | 一种经瓜氨酸修饰后的trim28蛋白及其制备得到的药物和试剂盒 | |
| Chang et al. | Integrated proteomic, phosphoproteomic, and N-glycoproteomic analyses of the longissimus thoracis of yaks | |
| Kedracka-Krok et al. | Impact of imipramine on proteome of rat primary glial cells | |
| Zhang et al. | Decellularised spinal cord matrix manipulates glial niche into repairing phase via serglycin‐mediated signalling pathway | |
| Yang et al. | Angiopoietin-like 4 promotes epidermal stem cell proliferation and migration and contributes to cutaneous wound re-epithelialization: ANGPTL4 promotes EpSC proliferation and skin wound healing | |
| CN112891542A (zh) | 一种包含UCHs抑制剂的药物组合物及其应用 | |
| Wang et al. | RNF220-mediated ubiquitination promotes aggresomal accumulation and autophagic degradation of cytoplasmic Gli via HDAC6 | |
| CN114621338B (zh) | 一种mTOR抑制剂及其应用 | |
| Mutgan et al. | A comprehensive map of proteoglycan expression and deposition in the pulmonary arterial wall in health and pulmonary hypertension | |
| Kim et al. | JAG1 intracellular domain acts as a transcriptional cofactor that forms an oncogenic transcriptional complex with DDX17/SMAD3/TGIF2 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |