CN110554190A - 来源于人外周血cd4+t细胞的生物标志物在胰腺癌预后中的应用 - Google Patents

来源于人外周血cd4+t细胞的生物标志物在胰腺癌预后中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及来源于人外周血CD4+T细胞的生物标志物在胰腺癌预后中的应用。这些生物标志物包括NDUFA11、EDF1、GGCT、CLIC3、DCK、SAP18、PARN、ALDH1A1、ARRB1、RAB1A、DLG4、PIP4K2B、BASP1、LAGE3、ATP6AP1、HPS6、BRI3BP、HIST1H2BA、MBOAT7、RBM15、NUCKS1、RAB22A、SNX12、NISCH、ZC3H12D、TUBB6和HCA64中的一种或多种。

Description

来源于人外周血CD4+T细胞的生物标志物在胰腺癌预后中的 应用
技术领域
本发明涉及来源于人外周血CD4+T细胞的生物标志物在胰腺癌预后中的应用。
背景技术
胰腺癌是目前世界上发病率第十二、死亡率第七的癌症，胰腺癌的预后极差，每年发病人数和死亡人数接近1:1。世界卫生组织2012年统计结果显示，胰腺癌是目前世界上发病率第十二和死亡率第七的癌症，全世界每年新增胰腺癌病人33万人，每年因胰腺癌死亡的病人有33万人，胰腺癌的发病人数和死亡人数的比值接近1:1。胰腺癌包括内分泌胰腺癌和外分泌胰腺癌，大部分的胰腺癌病人属于外分泌胰腺癌，其中胰腺导管腺癌病人占胰腺癌病人的90％左右。胰腺癌进展非常快，病人预后极差，胰腺癌病人的平均生存期仅为6-9个月，一年生存率为28％，五年存活率为7％；有20％的胰腺癌病人可以进行手术切除，但是可以进行手术切除的病人中有很大一部分会发生癌症复发和转移，这部分患者的中位生存期为12-19个月，五年生存率为20％，胰腺癌有“癌中之王”之称。
尽管从1975到2017年之间美国胰腺癌病人的五年生存率从3.0％上升到8.5％，但目前胰腺癌患者的5年生存率依然不足10％，不容乐观。早期诊断难、预后差、发生发展快，大部分诊断为胰腺癌的病人都到了晚期。手术切除是目前彻底治愈胰腺癌的唯一有效手段，但是手术切除患者胰腺癌复发比例很高。及早发现、及早治疗对于治愈胰腺癌十分关键，而且手术切除后的患者追踪对于术后及时干预提高患者生存率至关重要。
2011年，Douglas和Robert更是将逃脱免疫监视或者抑制免疫反应列为癌症的十大特征之一。在胰腺癌的发生发展过程中，肿瘤细胞和免疫系统相互博弈。一方面，机体的免疫系统会识别肿瘤细胞表面特异的分子诱发免疫反应，杀死肿瘤细胞，例如CD8+T细胞和NKT细胞；另一方面，肿瘤细胞自身会发生某种突变并借助Treg等免疫细胞，抑制机体的免疫反应，最终逃脱免疫系统的监控，形成明显的肿瘤块和新的转移灶。其中，多个免疫细胞参与这个过程，包括肿瘤相关的巨噬细胞(tumor-associated macrophage，TAM)、髓系来源的抑制细胞(myeloid-derived suppressor cell，MDSC)、肿瘤相关的中性粒细胞(tumor-associated neutrophils，TMN)、肥大细胞(MC)、树突状细胞(DC)、肿瘤渗透的淋巴细胞(Treg、CD4+T和CD8+T细胞)，这些细胞一起构成肿瘤细胞的免疫调控系统。
相比组织，外周血获取是无创的，样本采集方便容易。而外周血中的免疫细胞作为机体系统免疫中的一部分，一定程度上反应了机体免疫系统的状态。研究胰腺癌病人外周血中免疫细胞的变化有助于理解和研究胰腺癌发生过程中免疫系统发挥的作用。
发明内容
本发明提供选自以下的蛋白质作为检测对象在制备用于评估、预测胰腺癌病人术后病情发展或癌症恶性程度的试剂或试剂盒中的应用：人外周血CD4+T细胞中的NDUFA11、EDF1、GGCT、CLIC3、DCK、SAP18、PARN、ALDH1A1、ARRB1、RAB1A、DLG4、PIP4K2B、BASP1、LAGE3、ATP6AP1、HPS6、BRI3BP、HIST1H2BA、MBOAT7、RBM15、NUCKS1、RAB22A、SNX12、NISCH、ZC3H12D、TUBB6和HCA64中的一种或多种。
在一个或多个实施方案中，所述蛋白质选自：人外周血CD4+T细胞中的NDUFA11、EDF1、GGCT、CLIC3和DCK中的任意一种或任意多种，优选为人外周血CD4+T细胞中的NDUFA11、EDF1、GGCT、CLIC3和DCK。
在一个或多个实施方案中，所述蛋白质还包括：人外周血CD4+T细胞中的SAP18、PARN、ALDH1A1、ARRB1、RAB1A、DLG4、PIP4K2B、BASP1、LAGE3、ATP6AP1、HPS6、BRI3BP、HIST1H2BA、MBOAT7、RBM15、NUCKS1、RAB22A、SNX12、NISCH、ZC3H12D、TUBB6和HCA64中的一种或多种。
本发明还提供选自以下蛋白质的检测试剂在制备用于评估、预测胰腺癌病人术后病情发展或癌症恶性程度的试剂或试剂盒中的应用：人外周血CD4+T细胞中的NDUFA11、EDF1、GGCT、CLIC3、DCK、SAP18、PARN、ALDH1A1、ARRB1、RAB1A、DLG4、PIP4K2B、BASP1、LAGE3、ATP6AP1、HPS6、BRI3BP、HIST1H2BA、MBOAT7、RBM15、NUCKS1、RAB22A、SNX12、NISCH、ZC3H12D、TUBB6和HCA64中的一种或多种的检测试剂。
在一个或多个实施方案中，所述检测试剂为：人外周血CD4+T细胞中的NDUFA11、EDF1、GGCT、CLIC3和DCK中的任意一种或任意多种的检测试剂，优选为人外周血CD4+T细胞NDUFA11、EDF1、GGCT、CLIC3和DCK的检测试剂。
在一个或多个实施方案中，所述检测试剂还包括：人外周血CD4+T细胞中SAP18、PARN、ALDH1A1、ARRB1、RAB1A、DLG4、PIP4K2B、BASP1、LAGE3、ATP6AP1、HPS6、BRI3BP、HIST1H2BA、MBOAT7、RBM15、NUCKS1、RAB22A、SNX12、NISCH、ZC3H12D、TUBB6和HCA64中的一种或多种的检测试剂。
在一个或多个实施方案中，所述检测试剂为与所述蛋白质特异性结合的试剂，如抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒含有：人外周血CD4+T细胞中的NDUFA11、EDF1、GGCT、CLIC3、DCK、SAP18、PARN、ALDH1A1、ARRB1、RAB1A、DLG4、PIP4K2B、BASP1、LAGE3、ATP6AP1、HPS6、BRI3BP、HIST1H2BA、MBOAT7、RBM15、NUCKS1、RAB22A、SNX12、NISCH、ZC3H12D、TUBB6和HCA64中的一种或多种的检测试剂。
在一个或多个实施方案中，所述试剂盒含有：人外周血CD4+T细胞中的NDUFA11、EDF1、GGCT、CLIC3和DCK中的任意一种或任意多种的检测试剂，优选为人外周血CD4+T细胞NDUFA11、EDF1、GGCT、CLIC3和DCK的检测试剂。
在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还含有人外周血CD4+T细胞中SAP18、PARN、ALDH1A1、ARRB1、RAB1A、DLG4、PIP4K2B、BASP1、LAGE3、ATP6AP1、HPS6、BRI3BP、HIST1H2BA、MBOAT7、RBM15、NUCKS1、RAB22A、SNX12、NISCH、ZC3H12D、TUBB6和HCA64中的一种或多种的检测试剂。
在一个或多个实施方案中，所述试剂盒含有：与所述蛋白特异性结合的试剂，包括抗体或其抗原结合片段；和任选的用于从血液中分离出CD4+T细胞的试剂和用于裂解CD4+T细胞的试剂。
在一个或多个实施方案中，所述试剂包括利用凯氏定氮法、双缩脲法、Folin-酚试剂法、BCA法、胶体金法、Western blot、ELISA和液相色谱-串联质谱中的一种或多种检测所述蛋白的含量中使用到的试剂。
在某些实施方案中，本发明提供NDUFA11蛋白或其片段、EDF1蛋白或其片段、GGCT蛋白或其片段、CLIC3蛋白或其片段、DCK蛋白或其片段、CD7蛋白或其片段、RAB25蛋白或其片段和WNK3蛋白或其片段在制备用于胰腺癌病人预后的试剂或试剂盒中的应用。
在某些实施方案中，本发明提供与NDUFA11蛋白特异性结合的试剂、与EDF1蛋白特异性结合的试剂、与GGCT蛋白特异性结合的试剂、与CLIC3蛋白特异性结合的试剂、与DCK蛋白特异性结合的试剂、与CD7蛋白特异性结合的试剂、与RAB25蛋白特异性结合的试剂以及与WNK3蛋白特异性结合的试剂在制备用于胰腺癌病人预后的试剂或试剂盒中的应用。
在一个或多个实施方案中，所述试剂为抗体，包括单克隆抗体和多克隆抗体，以及抗体的抗原结合片段。
在一个或多个实施方案中，所述试剂盒含有与NDUFA11蛋白特异性结合的试剂、与EDF1蛋白特异性结合的试剂、与GGCT蛋白特异性结合的试剂、与CLIC3蛋白特异性结合的试剂、与DCK蛋白特异性结合的试剂、与CD7蛋白特异性结合的试剂、与RAB25蛋白特异性结合的试剂以及与WNK3蛋白特异性结合的试剂。
在某些实施方案中，本发明还提供一种预测胰腺癌病人术后病情发展的方法，所述方法包括检测该病人外周血CD4+T细胞中NDUFA11、EDF1、GGCT、CLIC3和DCK蛋白的表达量的步骤，其中，与胰腺癌患者CD4+T细胞中NDUFA11、EDF1、GGCT、CLIC3、DCK蛋白各自的平均表达量，所述NDUFA11、EDF1、GGCT、CLIC3、DCK蛋白的表达量都下降表明该病人的预后差。
附图说明
图1：病人外周血中CD4+T细胞的FACS检测结果。
图2：QC样本和DIA样本中11条iRT标肽(SEQ ID NO:1－11)的出峰时间。A、15个QC的DDA样本中11条iRT标肽的出峰时间；B、49个CD4+T细胞DIA样本中11条iRT标肽的出峰时间。
图3：CD4+T细胞中27个差异蛋白质和挑选的5个差异蛋白质的ROC。
具体实施方式
应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。
定量蛋白质组学被广泛用于各种癌症的生物标志物的发现。经典的蛋白质组学生物标志物的研究方法是比较癌组织与远端正常组织(或癌旁组织)之间的蛋白质的差异表达。为了获得重复性好、数据信息丰富、数据质量高和能高通量的数据，本发明首次采用数据非依赖采集(Data-independent acquisition，DIA)的扫描模式，打破了传统的用流式细胞仪研究癌症病人外周血中CD4+T细胞的限制，为癌症以及其他疾病临床研究外周血中CD4+T细胞提供了新的思路，同时构建了一个全新的完整的关于胰腺癌病人外周血中CD4+T细胞中生物标志物的大库。本发明采用DIA扫描模式，基于无标记定量蛋白质组学策略研究32例胰腺癌患者的外周血中CD4+T细胞的蛋白质组。根据术后9-15个月的随访周期，根据病人存活状态将病人分为生存组和死亡组，在两组外周血中CD4+T细胞的蛋白质组中发现了NDUFA11、EDF1、GGCT、CLIC3和DCK可作为指示胰腺癌病人预后的生物标志物，其表达量下调和差的预后有关。
因此，本发明提供预测胰腺癌病人术后病情发展或疾病恶性程度的方法。可根据不同胰腺癌病人的病情实施不同的外科手术，包括但不限于胰头十二指肠切除术、扩大胰头十二指肠切除术、保留幽门的胰十二指肠切除术和全胰腺切除术等。术后的不同时间段，可分析胰腺癌病人外周血CD4+T细胞蛋白质组中作为生物标志物的蛋白表达情况，来评估、预测该病人癌症恶性程度或术后病情发展情况。本文中，可作为生物标志物用以评估、预测该病人癌症恶性程度或术后病情发展情况的蛋白质包括人外周血CD4+T细胞蛋白质组中的NDUFA11、EDF1、GGCT、CLIC3、DCK、SAP18、PARN、ALDH1A1、ARRB1、RAB1A、DLG4、PIP4K2B、BASP1、LAGE3、ATP6AP1、HPS6、BRI3BP、HIST1H2BA、MBOAT7、RBM15、NUCKS1、RAB22A、SNX12、NISCH、ZC3H12D、TUBB6和HCA64中的一种或多种(如至少2种、至少3种或更多)。
本文中，所述NDUFA11、EDF1、GGCT、CLIC3、DCK、SAP18、PARN、ALDH1A1、ARRB1、RAB1A、DLG4、PIP4K2B、BASP1、LAGE3、ATP6AP1、HPS6、BRI3BP、HIST1H2BA、MBOAT7、RBM15、NUCKS1、RAB22A、SNX12、NISCH、ZC3H12D、TUBB6和HCA64具有本领域公认的含义。例如，NDUFA11是膜结合的线粒体复合物I的一个亚基蛋白；EDF1参与调控内皮细胞分化、脂代谢和荷尔蒙诱导的心肌肥大；GGCT蛋白质参与催化从γ-谷胱甘肽形成羟脯氨酸，在谷胱甘肽的稳态调节中发挥重要作用；CLIC3蛋白质是细胞内氯离子通道；DCK是几种脱氧核苷及其核苷类似物磷酸化所需；CD7是免疫球蛋白超家族成员，是一个跨膜蛋白质；RAB25是原癌基因RAS超家族的一员，参与膜运输以及细胞存活；RPL18是核糖体60S亚基中的L18E家族成员。这些蛋白的氨基酸序列和基因序列都可从已知的数据库例如Genbank或中找到。例如，在中，NDUFA11的GCID为GC19M005891，EDF1的GCID为GC09M136862，GGCT的GCID为GC07M030496，CLIC3的GCID为GC09M136994，DCK的GCID为GC04P070992。
应理解的是，不同个体中，NDUFA11、EDF1、GGCT、CLIC3、DCK、SAP18、PARN、ALDH1A1、ARRB1、RAB1A、DLG4、PIP4K2B、BASP1、LAGE3、ATP6AP1、HPS6、BRI3BP、HIST1H2BA、MBOAT7、RBM15、NUCKS1、RAB22A、SNX12、NISCH、ZC3H12D、TUBB6和HCA64可能会存在突变，但只要突变后的蛋白仍然被本领域公认为上述蛋白，则这类突变蛋白的检测及其结果的应用也在本发明范围之内。
在某些实施方案中，本文所述的方法包括检测胰腺癌患者外周血CD4+T细胞NDUFA11、EDF1、GGCT、CLIC3和DCK中的任意一种或任意多种的表达水平。在某些实施方案中，本文所述的方法包括测定胰腺癌患者外周血CD4+T细胞NDUFA11、EDF1、GGCT、CLIC3和DCK蛋白的表达水平。
本文所述的方法中，下调的NDUFA11、EDF1、GGCT、CLIC3和DCK的表达水平表明病人的预后差或疾病恶性程度高，需要采取进一步的治疗手段。
在某些实施方案中，本文各实施方案所述的方法还包括检测胰腺癌患者外周血CD4+T细胞蛋白质组中SAP18、PARN、ALDH1A1、ARRB1、RAB1A、DLG4、PIP4K2B、BASP1、LAGE3、ATP6AP1、HPS6、BRI3BP、HIST1H2BA、MBOAT7、RBM15、NUCKS1、RAB22A、SNX12、NISCH、ZC3H12D、TUBB6和HCA64中的一种或多种的表达水平。SAP18、PARN、ALDH1A1、ARRB1、RAB1A、DLG4、PIP4K2B、BASP1、LAGE3、ATP6AP1、HPS6、BRI3BP、HIST1H2BA、MBOAT7、RBM15、NUCKS1、RAB22A、SNX12和NISCH中的一种或多种的表达下降和ZC3H12D、TUBB6和HCA64中的一种或多种的表达上升表明该患者术后预后差或疾病恶性程度高。
本文所述的“表达下降”和“表达上升”可以与不同对照进行比较，例如，可与病人自身术前的表达水平进行比较，或与病人自身术后最近一次的表达水平或最近几次的表达水平(包括平均表达水平)进行比较。或者，也可与术后一段时间内胰腺癌患者群体的平均表达水平进行比较。例如，可采集一定数量的胰腺癌患者群体术后一个时间段(例如术后1-15个月，或术后9-15个月)的每种蛋白的表达水平，获得每种蛋白的平均表达水平。或者，可采集一定数量的胰腺癌患者群体术后特定时间(例如术后每个月检测一次，尤其包括术后第9到第15个月的检测)每种蛋白的表达水平，计算每种蛋白在该特定时间的平均表达水平，然后检测病人对应时间段(如术后每个月)每种蛋白的表达水平，与对应时间段的平均表达水平进行比较。应理解，可进行上述一种或多种比较。
通常，与对照相比，“表达下降”的蛋白的表达水平下降得越多和/或“表达上升”的蛋白的表达水平上升得越多，表明预后越差或疾病恶性程度越高。
蛋白的定量方法为本领域所周知。例如，可采用常规的凯氏定氮法、双缩脲法、Folin-酚试剂法、BCA法、胶体金法、Western blot、ELISA和液相色谱-串联质谱进行蛋白质定量。在某些实施方案中，可采用多重反应监控(MRM)技术测定，该技术可以和以合成肽段为基础的绝对定量技术(AQUA)相结合，这样就可以直接对多个样品中的某个或某些蛋白质直接进行绝对含量的检测。例如，要检测样品中的某多肽含量，可先合成所述多肽，并用重同位素(如13C)对其进行标记；然后将一定量的所述经重同位素标记的多肽加入待测样品中，用多重反应监控技术检测样品中所述多肽(或其片段)的强度，通过比较未标记多肽(即样品中的多肽)或其片段的强度与经重同位素标记的多肽的强度，确定样品中所述多肽的含量。
因此，本文所述的方法通常可包括：获得病人的外周血，从外周血中分离出CD4+T细胞，裂解CD4+T细胞，以及检测本文所述的蛋白质的表达水平。
本发明还提供检测试剂盒或诊断试剂盒，用于检测胰腺癌患者外周血CD4+T细胞的蛋白质组中的NDUFA11、EDF1、GGCT、CLIC3和DCK中的任意一种或任意多种(如至少2种、至少3种)的表达水平。在某些实施方案中，所述试剂盒含有在测定人外周血CD4+T细胞NDUFA11、EDF1、GGCT、CLIC3和DCK蛋白的表达水平中使用到的试剂。在某些实施方案中，所述试剂盒还含有在测定人外周血CD4+T细胞蛋白质组中SAP18、PARN、ALDH1A1、ARRB1、RAB1A、DLG4、PIP4K2B、BASP1、LAGE3、ATP6AP1、HPS6、BRI3BP、HIST1H2BA、MBOAT7、RBM15、NUCKS1、RAB22A、SNX12、NISCH、ZC3H12D、TUBB6和HCA64中的一种或多种的表达水平中使用到的试剂。
试剂盒中所含的用于检测所述蛋白的表达水平的试剂可以是辅助试剂，例如用于从血液中分离出CD4+T细胞的试剂、用于裂解CD4+T细胞的试剂、以及检测过程中用到的试剂，也可以是直接检测试剂，例如与所述蛋白特异性结合的抗体或其抗原结合片段。适合用于从血液中分离出CD4+T细胞的试剂以及用于裂解CD4+T细胞的试剂包括本领域周知的试剂，包括但不限于SDT裂解缓冲液(4％SDS，0.1M Tris-HCl pH7.6，0.1M DTT)。检测过程中用到的试剂可以是例如为制备合适的待检测蛋白溶液而使用到的试剂，包括如用于制备肽段样品的试剂，如对细胞裂解液的蛋白进行FASP酶解所需的酶解试剂以及对肽段进行脱盐所需的试剂。在进行液相色谱-串联质谱时，所述试剂还包括相应的流动相，如0.1％FA的水溶液和0.1％FA的ACN溶液。
在某些实施方案中，可采用免疫组化方法定量检测本文所述蛋白质的表达量。免疫组化方法是本领域常规的方法，通常利用抗原与抗体的特异性结合，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色，从而确定感兴趣蛋白的存在和/或含量的方法。可利用本文所述的各可作为生物标志物的蛋白质各自的特异性抗体来实施本方法或用途。这类特异性抗体可以是已知的市售抗体。或者，也可根据已知技术(例如杂交瘤技术)自行制备它们各自的特异性抗体。抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体；优选单克隆抗体。也可使用抗体的抗原结合片段。因此，在某些实施方案中，本文试剂盒的各实施方案中所述的试剂可以是与所述各蛋白质特异性结合的抗体，以及任选的实施免疫组化方法所需的其它试剂
在某些实施方案中，采用多重反应监控(MRM)技术结合以合成肽段为基础的绝对定量技术(AQUA)定量测定本文所述蛋白质。因此，试剂盒中和含有待测蛋白或其相应肽段。对于本文所述的可作为生物标志物的各蛋白质，其标志性的肽段会依酶解方法不同而不同，并可由本领域技术人员采用本领域常规技术手段容易确定。
在某些方面，本文也涉及人外周血CD4+T细胞蛋白质组中NDUFA11、EDF1、GGCT、CLIC3、DCK、SAP18、PARN、ALDH1A1、ARRB1、RAB1A、DLG4、PIP4K2B、BASP1、LAGE3、ATP6AP1、HPS6、BRI3BP、HIST1H2BA、MBOAT7、RBM15、NUCKS1、RAB22A、SNX12、NISCH、ZC3H12D、TUBB6和HCA64中的一种或多种作为检测对象在评估、预测胰腺癌病人术后病情发展或癌症恶性程度中的应用。尤其是，本文包括胰腺癌患者外周血CD4+T细胞NDUFA11、EDF1、GGCT、CLIC3和DCK中的任意一种或任意多种(如至少2种、至少3种)作为检测对象在评估、预测胰腺癌病人术后病情发展或癌症恶性程度中的应用。更进一步地，本文包括胰腺癌患者外周血CD4+T细胞NDUFA11、EDF1、GGCT、CLIC3和DCK作为检测对象在评估、预测胰腺癌病人术后病情发展或癌症恶性程度中的应用。更进一步地，本文包括胰腺癌患者外周血CD4+T细胞NDUFA11、EDF1、GGCT、CLIC3和DCK以及选自SAP18、PARN、ALDH1A1、ARRB1、RAB1A、DLG4、PIP4K2B、BASP1、LAGE3、ATP6AP1、HPS6、BRI3BP、HIST1H2BA、MBOAT7、RBM15、NUCKS1、RAB22A、SNX12、NISCH、ZC3H12D、TUBB6和HCA64中的一种或多种作为检测对象在评估、预测胰腺癌病人术后病情发展或癌症恶性程度中的应用。
本文所述的应用包括在制备合适的制剂或试剂盒中的应用。例如，所述应用包括本文所述的生物标志物或其片段在制备评估、预测胰腺癌病人术后病情发展或癌症恶性程度用的制剂或试剂盒中的应用，与本文所述的生物标志物特异性结合的试剂(如抗体或其抗原结合片段)在制备评估、预测胰腺癌病人术后病情发展或癌症恶性程度用的制剂或试剂盒中的应用。在某些实施方案中，本文所述应用还包括能与本文所述各种生物标志物特异性结合的试剂(如抗体或其抗原结合片段)在评估、预测胰腺癌病人术后病情发展或癌症恶性程度中的应用。
下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非用于限制本发明。实施例中所提到的各种方法和材料，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和材料。
实验步骤
实验样本搜集
第二军医大学附属长海医院的胰腺癌患者被邀请参加了该项目。从2016年1月6号到2016年5月4号，共计75名胰腺癌患者入组，根据分离的外周血中CD4+T细胞的数量、纯度以及病理信息和预后信息的完整性，确立32例胰导管腺癌患者作为正式实验分析样本，用于蛋白质组学分析。截止到2017年5月4号，32个胰腺癌病人中有22个胰腺癌病人癌症生存，10个胰腺癌病人死亡。在蛋白质组学分析中，使用非配对t-test的统计学分析方法，并采用HCA和PCA的聚类方法对蛋白质进行聚类分析，同时展示差异蛋白质富集的信号通路。患者的临床资料见下表1。
表1
外周血中CD4+T细胞的分离
从上海医院收集胰腺癌病人术中新鲜血浆，Ficoll-Paque Plus法从新鲜血液中分离PBMC细胞，用美天旎公司的CD4+T Cell Isolation Kit从PBMC中分离CD4+T细胞。每次实验PBMC作为阴性对照，用CD3-APC和CD4-PE抗体染CD4+T细胞，其中PBMC、PBMC-CD3-APC、PBMC-CD4-PE作为阴性对照去确定细胞群参数设置。方法参考试剂盒说明书。
肽段样品制备
CD4+T细胞中加入SDT裂解缓冲液(4％SDS，0.1M Tris-HCl pH7.6，0.1M DTT)，沸水5min，200w超声3min。使用295nm激发波长和350nm吸收光的色氨酸荧光发射测定蛋白质浓度〔Suman S.Thakur、T.G.,Bhaswati Chatterjee、Peter Bandilla、Florian Fro¨hlich、Juergen Cox和Matthias Mann，Deep and Highly Sensitive Proteome Coverageby LC-MS/MS Without Prefractionation，Mol Cell Proteomics，2011.16(7):p.1-9〕。所有样本FASP酶解(FASP方法参考Wisniewski,J.R.等，Universal sample preparationmethod for proteome analysis，Nat Methods，2009，6(5):p.359-62)，肽段StageTip脱盐(方法参考Rappsilber,J.、M.Mann和Y.Ishihama，Protocol for micro-purification,enrichment,pre-fractionation and storage of peptides for proteomics usingStageTips，Nat Protoc，2007，2(8):p.1896-906)。
所有DDA样本(包括QC样本)和DIA样本中取3ug肽段，加入1ul稀释后iRT标肽(Biognosys，序列见SEQ ID NO:1－11)。从CD4+T细胞中肽段量比较多的样本中取出5ug混成混合物，作为DIA样本采集过程中的QC样本。另外肽段量较多样本中取出3ug，采用DDA数据采集模式，搜库，利用DDA搜库结果建立DIA谱图库。在DIA样本采集过程中，每跑10个DIA文件跑一针QC的DDA作为质控。共49对CD4+T细胞样本，98个DIA样本；15个QC的DDA样本；共19个DDA样本，其中四个跑了两次，共计23个预计建库DDA样本。23个建库DDA文件和15个QC的DDA文件一起搜库，作为最后建立DIA谱图库的DDA文件。
液相色谱-串联质谱
肽段通过EASY-nLC 1000色谱(Thermo Fisher Scientific)进行分离，流动相A液为0.1％FA的水溶液，B液为0.1％FA的ACN溶液。C18反相色谱柱为自制75μm×150mm，3μm填料。色谱梯度为(％B)：时间，(2-4)：2min，(4～30)：100min，(30～45)：8min，(45～90)：5min，(99～90)：5min，分离时间2h，流速250nL/min。DDA和DIA采用的质谱仪器为ThermoOrbitrap Fusion，数据采集为“高-高”模式。
DDA数据采集参数设置，一级全扫为orbitrap检测器(300-1500m/z)，分辨率为120,000@m/z 200，AGC target设置为2E5，maximum IT为50ms；二级扫描为数据依赖型采集模式(DDA，top 20)，HCD碎裂，分辨率为15,000@m/z 200，AGC target设置为5E4，maximumIT为54ms，isolation window为1.2m/z，33.0％NCE，orbitrap检测器(200-2000m/z)检测。动态排除设置为：重复次数，1；重复时间，30s；排除时间，120s。所有数据通过Xcalibur软件进行采集。
DIA数据采集参数设置，一级全扫为orbitrap检测器(300-1500m/z)，分辨率为240,000@m/z 200，AGC target设置为2E5，maximum IT为50ms；二级扫描为数据依赖型采集模式(DIA)，HCD碎裂，分辨率为15,000@m/z 200，AGC target设置为5E4，maximum IT为70ms，33.0％NCE，orbitrap检测器(100-2000m/z)检测。根据预计建库的23个DDA样本文件搜库结果，保证每一个DIA窗口内离子数量基本一致，最大化仪器的检测效率，采用可变窗口采集离子。对于300-892m/z的离子，数目较多，isolation window为16m/z，共37个窗口；对于892-1444m/z的离子，因为离子数目少，采用300m/z的窗口进行采集，3个窗口分别为805-1150m/z，931-1231m/z，1144-1444m/z。合计，DIA二级采集了40个窗口，整个DIA采集过程包括：full scan-18MS2-full scan-19MS2-full scan-3MS2。
DDA文件数据库搜索和DIA的DDA谱图库构建
38个DDA Raw文件通过MaxQuant 1.5.2.8软件进行数据检索〔Cox,J.等，Apractical guide to the MaxQuant computational platform for SILAC-basedquantitative proteomics，Nat Protoc，2009，4(5):p.698-705〕，数据库为Swiss-Prot人类数据库(2016年03月下载)。固定修饰设置，半胱氨酸Carbamidomethyl；可变修饰设置oxidized methionine，N-acetylation。蛋白质选择trypsin/P，最多允许2个酶切缺失位点，肽段first search和main search的质量容忍度分别设置为20ppm和4.5ppm，肽段和蛋白质的FDR均设置0.01。
所有DIA Raw文件通过Skyline 3.6.0.10162进行处理〔Egertson,J.D.等，Multiplexed peptide analysis using data-independent acquisition and Skyline，Nat Protoc，2015，10(6):p.887-903〕，谱图库由23个预计建库样本和15个QC样本的DDA搜库结果建立。Peptide setting：酶选择Trypsin[KR|P]，最多允许2个酶切缺失位点，背景蛋白质是Swiss-Prot人类数据库(2016年03月下载)，允许的肽段长度为7-45个氨基酸。固定修饰设置，半胱氨酸Carbamidomethyl；可变修饰设置oxidized methionine，N-acetylation。建库时保留38个DDA文件搜库结果中打分最高的修饰肽段，cut-off0.99，不保留冗余库(减少import DIA文件时间)。Transition setting：母离子2、3、4价态，子离子1、2、3价态，离子类型为p、b、y离子，离子匹配时候只匹配b4、b5…bn-1、y2、y3、y4…yn-3，同时利用DIA前体离子窗口进行筛选。库中ion match tolence设置为0.02m/z，从满足条件的子离子中挑选强度前5的子离子。Full scan中，MS1filtering中同位素峰按count计算最大为3个，前体离子用orbitrap检测，分辨率240,000@200m/z；MS/MS filtering中，数据采集方式选择DIA，子离子分析器orbitrap，isolation scheme设置为Thermo Orbitrap Fusion上的DIA窗口，分辨率60,000@200m/z，用谱图库中肽段出峰时间±2.5min内的时间对保留时间进行过滤。完成上述参数设置后，构建谱图库，添加谱图库肽段对应的decoy库，用于控制肽段的FDR。
DIA文件谱图库匹配
Skyline软件完成谱图库构建后，导入DIA文件，通过skyline内置的mProphet算法对DIA和谱图库中的谱图匹配程度进行打分，优化拟合的模型，完成DIA的数据库检索。导出的DIA匹配结果，q值<0.01的肽段即为高可信的肽段，用于后续的肽段和蛋白质定量，同一条肽段对其所有母离子强度进行加和作为肽段强度，蛋白质有定量信息的所有肽段的强度加和作为蛋白质强度，蛋白质定量结果用于后续差异蛋白质筛选〔Reiter,L.等，mProphet:automated data processing and statistical validation for large-scale SRMexperiments，Nat Methods，2011，8(5):p.430-5〕。
统计与生物信息学分析
对蛋白质的定量结果进行线性矫正(纵向中位数矫正)，不同组之间Mix为相同样本，组间用Mix横向校正，数据分析和统计学检验利用软件R或者Excel完成，通路富集用DAVID软件完成。
(1)层次聚类分析(hierarchical clustering analysis，HCA)：利用软件R中的pheatmap包完成，根据样本之间蛋白质表达水平计算距离，将距离较近的样本聚集在一起。
(2)主成分分析(principal components analysis，PCA)：利用软件R中的prcomp函数完成，将大量相关的变量转化为一组很少的不相关的变量，降低变量的维度，同时尽可能多的保留原始数据信息。
结果
实验流程和数据概览
实验流程如下所述。从医院取得的新鲜血液通过Ficoll密度梯度离心分离PBMC细胞，接着用分离CD4+T细胞的试剂盒分离CD4+T细胞。分离的CD4+T细胞用细胞计数仪计数，对于细胞比较多的T细胞取0.5-1*106个细胞进行FACS检测，测定分离的细胞纯度。最后选择CD4+T细胞数目均大于106的样本作为正式实验样本。
正式样本中蛋白质较多的样本中取出5ug混合成混合物作为QC样本，同时取出3ug作为初始建库和构建DIA isolation window。根据23个预计建库样本的DDA文件构建的隔离窗口在Thermo Orbitrap Fusion上编辑DIA方法，采集98个样本的DIA文件，每跑10个DIA文件接一个mix的DDA作为质量控制。最后共有23个样本的DDA(19个加上4个重复)、15个mix作为QC的DDA、98个DIA文件。为提高98个DIA文件的鉴定结果，将38个DDA文件合并搜库构建一个相对大的谱图库。用Skyline软件导入DIA文件，通过内置的mProphet算法，对DIA谱图和DDA谱图库中谱图的匹配程度进行打分，根据两者的强度、保留时间差异、保留时间差异平方、库强度点积、峰型、共洗脱、信噪比等构建一个综合打分，拟合最优的模型，最后筛选q值<0.01的肽段即为可信肽段。肽段定量是将该肽段满足筛选条件的所有二级子离子强度进行加和，蛋白质的定量是将蛋白质所属的所有肽段强度进行加和。对得到的蛋白质定量结果进行质量控制，去除定量信息比较少的样本，同时结合病人的病理和预后信息，最后确定分析32个胰腺癌病人。
取其中部分样本进行FACS检测，检测结果如图1所示。在FACS检测的样本中，几乎所有分离得到的CD4+T的纯度在90％以上。
最后用23个预计建库样本和15个QC的DDA文件构建DIA的谱图库，库中包含4881条蛋白质，30916条肽段，36063个前体离子和284149个母离子-子离子的离子对。DIA数采集模式受色谱条件影响非常大，所以在所有样本中均加入了11条iRT的标准肽。用谱图库中肽段的保留时间校正鉴定到的可信的肽段和蛋白质数目要优于iRT校正的保留时间，所以后续所有数据均用谱图库中的保留时间作为DIA肽段保留时间校正。
对QC样本和DIA样本中11条iRT标肽的出峰时间进行了统计，统计结果如图2所示。在98个DIA文件中通过模型拟合优化保留q值<0.01的可信肽段，11条iRT标肽的出峰时间也和DDA的出峰时间基本一致，误差在5min以内，说明整个DIA文件采集过程中色谱状态非常稳定，DIA结果受色谱状态影响较小。
结合病理和预后信息，最后确定正式分析32个胰腺癌病人，32个胰腺癌病人外周血CD4+T细胞DIA结果中共定量到4553个可信的蛋白质，所有CD4+T细胞中重叠的蛋白质有1691个，一半以上CD4+T细胞中有定量信息的有3303个蛋白质。对CD4+T细胞中一半以上有定量信息的蛋白质分进行别缺失值填充，用于后续数据分析。
生存组和死亡组胰腺癌病人CD4+T细胞差异蛋白质分析
按生存组(表1中至2017年5月生存的病人组)和死亡组(表1中至2017年5月死亡的病人组)进行t-test假设检验，以p值<0.05和FC≥1.2的筛选标准，在CD4+T细胞中筛选出63种差异表达的蛋白质。结果显示，这些差异蛋白质的HCA和PCA基本可以将生存组和死亡组胰腺癌病人区分开。在死亡胰腺癌病人外周血CD4+T细胞中上调的蛋白质有29个，下调的蛋白质有34个。
为获得可靠有效的生物标志物，按照p值<0.05和FC≥2的筛选标准，在生存组和死亡组病人外周血CD4+T细胞中筛选出27个差异更显著的蛋白质(见表2)，这27个差异蛋白质的HCA和PCA可以很好的将癌症死亡和生存胰腺癌病人区分开。从图3可以看出，差异更显著的27个蛋白质的ROC的AUC为1，挑选的NDUFA11、EDF1、GGCT、CLIC3和DCK的ROC的AUC是0.945，5个蛋白质组合和27个蛋白质组合的ROC的AUC没有显著性差异，能严格的将生存和死亡胰腺癌病人分开，可以作为有效的预后标志物，去预测胰腺癌病人术后生存时间以及进行及时的术后干预，提升病人生存时间。
表2：生存和死亡胰腺癌病人CD4+T细胞中p值<0.05且FC≥2的27个差异蛋白质
*数值大于2为在死亡组中高表达，数值低于0.5为在生存组中高表达。
传统的癌症和外周血中CD4+T和预后相关性的研究多是基于流式筛选的方法研究CD4+T细胞表面蛋白质表达量与预后的相关性，关于外周血中CD4+T细胞的蛋白质表达谱和癌症病人预后相关性的研究较少，在我们的数据中发现NDUFA11、EDF1、GGCT、CLIC3和DCK可作为胰腺癌预后的生物标志物。
NDUFA11是膜结合的线粒体复合物I的一个亚基蛋白，在结直肠癌组织中表达量上调和好的预后相关(表达量高的结直肠癌病人五年存活率79％，表达量低的病人五年存活率52％，两者的统计学显p值为5.9*e-4，数据来源于The Human Protein Atlas)，而在我们的数据中，预后较差胰腺癌病人的CD4+T细胞中NDUFA11的表达量下调，可能和外周血中CD4+T细胞存在不同亚群以及癌组织和CD4+T的差异有关。
EDF1参与调控内皮细胞分化、脂代谢和荷尔蒙诱导的心肌肥大，同时作为转录因子TATA原件结合蛋白TBP和基因特异性的激活子的共激活子，在死亡病人中表达量下调，而TBP作为起始转录的重要蛋白质对于CD4+T细胞发挥功能至关重要，EDF1表达量的下调表明CD4+T细胞的转录收到调控，而其CD4+T细胞中的Th1细胞作为重要的抑制肿瘤效应的T细胞，一旦转录活性降低，那么Th1细胞参与的巨噬细胞和CD8+T的抑肿瘤效应就会受到抑制，癌症就会恶化最后导致病人死亡。
GGCT蛋白质参与催化从γ-谷胱甘肽形成羟脯氨酸，在谷胱甘肽的稳态调节中发挥重要作用，而谷胱甘肽帮忙维持机体正常的免疫系统，老鼠中谷胱甘肽的删除会损害T细胞和巨噬细胞的免疫活性，而谷胱甘肽还参与调节细胞增殖，组织中谷胱甘肽的高表达可能是癌症的生物标志物，一旦机体的谷胱甘肽水平异常机体的免疫细胞将受到破坏。
CLIC3蛋白质是细胞内氯离子通道，主要定位于核上，调控细胞膜电势的稳定、维持细胞内pH和调节细胞体积，在卵巢癌中基质和癌细胞分泌的的CLIC3通过促进TGM2-依赖的侵袭促进癌症血管新生和进展。
Ohhashi通过siRNA敲除DCK基因不影响癌细胞对吉西他滨耐药性细胞的增殖，但是DCK基因下调以后耐药细胞对吉西他滨的耐药性显著提升。Ohmine对胰腺癌病人和细胞系中可能参与吉西他滨代谢和转座的12种酶和13个转座子的蛋白质进行靶向蛋白质组学研究，研究结果发现DCK是在25个候选分子中预测无进展生存期(progress-freesurvival)最好的生物标志物，而且可能是预测吉西他滨治疗的胰腺癌病人对吉西他滨敏感性最好的生物标志物。
9-15个月随访周期内，死亡表示癌症较高的恶性程度，外周血中CD4+T细胞中挑选出来的NDUFA11、EDF1、GGCT、CLIC3和DCK可以作为预测胰腺癌病人癌症恶性程度、作为预后的生物标志物，外周血中CD4+T细胞中NDUFA11、EDF1、GGCT、CLIC3和DCK表达量的下调和胰腺癌病人差的预后显著相关。
序列表
<110> 中国科学院上海生命科学研究院
<120> 来源于人外周血CD4+T细胞的生物标志物在胰腺癌预后中的应用
<130> 180410
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ala Asp Val Thr Pro Ala Asp Phe Ser Glu Trp Ser Lys
1 5 10
<210> 2
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Gly Leu Asp Ala Ala Ser Tyr Tyr Ala Pro Val Arg
1 5 10
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gly Ala Gly Ser Ser Glu Pro Val Thr Gly Leu Asp Ala Lys
1 5 10
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gly Thr Phe Ile Ile Asp Pro Ala Ala Val Ile Arg
1 5 10
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gly Thr Phe Ile Ile Asp Pro Gly Gly Val Ile Arg
1 5 10
<210> 6
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Leu Phe Leu Gln Phe Gly Ala Gln Gly Ser Pro Phe Leu Lys
1 5 10
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Leu Gly Gly Asn Glu Gln Val Thr Arg
1 5
<210> 8
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Thr Pro Val Ile Ser Gly Gly Pro Tyr Glu Tyr Arg
1 5 10
<210> 9
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Thr Pro Val Ile Thr Gly Ala Pro Tyr Glu Tyr Arg
1 5 10
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Val Glu Ala Thr Phe Gly Val Asp Glu Ser Lys
1 5 10
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Tyr Ile Leu Ala Gly Val Glu Asn Ser Lys
1 5 10

Claims (10)

1.选自以下的蛋白质作为检测对象在制备用于评估、预测胰腺癌病人术后病情发展或癌症恶性程度的试剂或试剂盒中的应用：人外周血CD4+T细胞中的NDUFA11、EDF1、GGCT、CLIC3、DCK、SAP18、PARN、ALDH1A1、ARRB1、RAB1A、DLG4、PIP4K2B、BASP1、LAGE3、ATP6AP1、HPS6、BRI3BP、HIST1H2BA、MBOAT7、RBM15、NUCKS1、RAB22A、SNX12、NISCH、ZC3H12D、TUBB6和HCA64中的一种或多种。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蛋白质选自：人外周血CD4+T细胞中的NDUFA11、EDF1、GGCT、CLIC3和DCK中的任意一种或任意多种，优选为人外周血CD4+T细胞中的NDUFA11、EDF1、GGCT、CLIC3和DCK。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述蛋白质还包括：人外周血CD4+T细胞中的SAP18、PARN、ALDH1A1、ARRB1、RAB1A、DLG4、PIP4K2B、BASP1、LAGE3、ATP6AP1、HPS6、BRI3BP、HIST1H2BA、MBOAT7、RBM15、NUCKS1、RAB22A、SNX12、NISCH、ZC3H12D、TUBB6和HCA64中的一种或多种。
4.选自以下蛋白质的检测试剂在制备用于评估、预测胰腺癌病人术后病情发展或癌症恶性程度的试剂或试剂盒中的应用：人外周血CD4+T细胞中的NDUFA11、EDF1、GGCT、CLIC3、DCK、SAP18、PARN、ALDH1A1、ARRB1、RAB1A、DLG4、PIP4K2B、BASP1、LAGE3、ATP6AP1、HPS6、BRI3BP、HIST1H2BA、MBOAT7、RBM15、NUCKS1、RAB22A、SNX12、NISCH、ZC3H12D、TUBB6和HCA64中的一种或多种的检测试剂。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述检测试剂为：人外周血CD4+T细胞中的NDUFA11、EDF1、GGCT、CLIC3和DCK中的任意一种或任意多种的检测试剂，优选为人外周血CD4+T细胞NDUFA11、EDF1、GGCT、CLIC3和DCK的检测试剂。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述检测试剂还包括：人外周血CD4+T细胞中SAP18、PARN、ALDH1A1、ARRB1、RAB1A、DLG4、PIP4K2B、BASP1、LAGE3、ATP6AP1、HPS6、BRI3BP、HIST1H2BA、MBOAT7、RBM15、NUCKS1、RAB22A、SNX12、NISCH、ZC3H12D、TUBB6和HCA64中的一种或多种的检测试剂。
7.如权利要求4-6中任一项所述的应用，其特征在于，所述检测试剂为与所述蛋白质特异性结合的试剂，如抗体或其抗原结合片段。
8.一种试剂盒，所述试剂盒含有：人外周血CD4+T细胞中的NDUFA11、EDF1、GGCT、CLIC3、DCK、SAP18、PARN、ALDH1A1、ARRB1、RAB1A、DLG4、PIP4K2B、BASP1、LAGE3、ATP6AP1、HPS6、BRI3BP、HIST1H2BA、MBOAT7、RBM15、NUCKS1、RAB22A、SNX12、NISCH、ZC3H12D、TUBB6和HCA64中的一种或多种的检测试剂。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有：
人外周血CD4+T细胞中的NDUFA11、EDF1、GGCT、CLIC3和DCK中的任意一种或任意多种的检测试剂，优选为人外周血CD4+T细胞NDUFA11、EDF1、GGCT、CLIC3和DCK的检测试剂；
优选还含有人外周血CD4+T细胞中SAP18、PARN、ALDH1A1、ARRB1、RAB1A、DLG4、PIP4K2B、BASP1、LAGE3、ATP6AP1、HPS6、BRI3BP、HIST1H2BA、MBOAT7、RBM15、NUCKS1、RAB22A、SNX12、NISCH、ZC3H12D、TUBB6和HCA64中的一种或多种的检测试剂。
10.如权利要求8-9中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有：与所述蛋白特异性结合的试剂，包括抗体或其抗原结合片段；和任选的用于从血液中分离出CD4+T细胞的试剂和用于裂解CD4+T细胞的试剂。
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王伟: "Notch信号通路对乙型肝炎患者CD4+T淋巴细胞分泌白细胞介素22的影响", 《临床肝胆病杂志》, 31 July 2016 (2016-07-31), pages 1315 - 1318 *

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