CN114561357B - 基于电磁感应产生的无线电信号加快神经干细胞向神经元分化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于电磁感应产生的无线电信号加快神经干细胞向神经元分化的方法。通过CVD沉积在镍片上制备石墨烯‑镍片基底，再将PDMS旋涂在石墨烯‑镍片基底上，最后通过刻蚀掉镍片得到石墨烯薄膜。本发明将神经干细胞接种于石墨烯薄膜上，在电磁感应诱导装置中进行分化。利用电磁感应原理，在固定旋转磁场频率的前提下，神经干细胞便可在石墨烯介导，电磁感应诱导产生的固定大小的感应电流或感应电动势的作用下，进行神经分化。本发明制备石墨烯薄膜的方法简单高效，石墨烯薄膜具有良好的生物相容性，本发明的方法可以加快神经干细胞的分化速度，操作简单，可提高成体干细胞向神经元分化的比例。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学工程技术领域，具体涉及基于电磁感应产生的无线电信号加快神经干细胞向神经元分化的方法。
背景技术
神经退行性疾病包括帕金森症(Parkinson’s disease,PD)、阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease,AD)、亨廷顿病(Huntington’s disease,HD)及脊髓损伤等已经严重威胁了人类的健康及生活质量。不同类型的神经退行性疾病的病变部位和病因各不相同，但神经细胞的丢失是其共同特性。由于神经元损伤的不可逆和神经元的不可再生，药物只能缓解病症，无法阻止病情的进展，且某些药物副作用大，价格昂贵。因此，获得有功能的神经细胞取代受损细胞成为治疗神经退行性疾病的突破口。
神经干细胞具有自我更新和定向分化的能力，能在植入部位产生分化并产生具有局部特异性的神经细胞，越来越多的证据表明进行有效的细胞移植是修复中枢神经系统损伤的重要治疗方法。神经干细胞不仅可以分化为神经元，也可以分化为星形胶质细胞、少突胶质细胞等。但是大量文章表明，移植至损伤部位的神经干细胞自主分化为神经元的数量极少，且细胞的不定向游走也大大降低了神经损伤的修复效果。因此，急需一种生物相容性良好的支架材料用于固定移植的神经干细胞，同时加快其向神经元定向分化的速度和提高神经元数量。由于神经元的电活动性，导电生物材料协同电刺激作为干细胞神经分化的手段，逐渐受到了人们广泛的重视。电刺激具有低损伤、操作简便和可控的优势。为实现电刺激，研究人员一般选择导电衬底进行干细胞培养，使用导线连接进行脉冲电刺激。然而，外接导线引入的电信号不适用于临床，会对患者造成不便或二次损伤，如何实现原位无导线的电信号输入成为需要解决的瓶颈问题。并且现有技术诱导神经干细胞的分化速度较慢，并且操作复杂、价格昂贵，不利于临床治疗。因此，迫切需要建立一种简单、快捷、高效的诱导神经干细胞神经分化的方法。
发明内容
针对上述问题及需求，本发明的目的是提供基于电磁感应产生的无线电信号加快神经干细胞向神经元分化的方法。本发明的制备方法简单高效，能够实现石墨烯纳米材料平整均匀，在接种细胞过程中不易碎，并且石墨烯纳米材料具有良好的生物相容性，利于神经干细胞的接种和后续的培养。所制备的基底导电性良好，并且厚度均匀、大小可控，在无外接导线的条件下，可利用电磁感应原理将神经干细胞接种在处于旋转磁场中的石墨烯纳米材料基底上，在固定旋转磁场频率的前提下，神经干细胞便可在石墨烯薄膜介导、电磁感应诱导产生的固定大小的感应电流或感应电动势的作用下，进行神经分化。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种石墨烯薄膜的制备方法，包括以下步骤：
(1)将甲烷，氢气和氩气通过CVD方法在基底上制备纳米级石墨烯层，得到纳米级石墨烯-基底；
(2)在步骤(1)得到的纳米级石墨烯-基底上滴加PDMS，旋涂均匀后进行反应，得到PDMS-纳米级石墨烯-基底；
(3)将步骤(2)得到的PDMS-纳米级石墨烯-基底进行刻蚀除去基底，清洗、干燥后得到PDMS-纳米级石墨烯，即为石墨烯薄膜。
优选的，步骤(1)中，所述基底为镍片；所述纳米级石墨烯的厚度为10-100nm。
优选的，步骤(2)中，反应的温度为60～80℃，时间为3-24h。
优选的，步骤(3)中，所述刻蚀为将PDMS-纳米级石墨烯-基底放入六水合三氯化铁-稀盐酸的混合溶液中，在室温下浸泡24-72h。
更为优选的，所述六水合三氯化铁-稀盐酸的混合溶液是将浓度为0.1-0.25mol/L的盐酸溶液加入到六水合三氯化铁溶液中制备得到的。
本发明的第二方面，提供上述制备方法制备得到的石墨烯薄膜。
本发明的第三方面，提供石墨烯薄膜在如下1)-5)至少一项中的应用：
1)干细胞增殖、并维持干细胞干性；
2)干细胞的体外扩增；
3)制备维持干细胞干性、促进干细胞分化的培养体系；
4)加速干细胞的神经分化；
5)提高干细胞向神经元分化的比例。
本发明的第四方面，提供一种电磁感应诱导装置，包括永磁铁以及与永磁铁连接的旋转杆；所述旋转杆一端穿过固定器的底面；所述固定器内设有转动电机；所述旋转杆的一端与永磁铁活动连接，另一端与转动电机连接；所述固定器与支撑架连接。
本发明的第五方面，提供电磁感应诱导装置在诱导干细胞神经分化中的应用。
本发明的第六方面，提供基于电磁感应产生的无线电信号加快神经干细胞向神经元分化的方法，包括以下步骤：
(1)将层粘连蛋白包被于石墨烯薄膜上，然后接种上神经干细胞，再加入神经分化培养液，得到培养体系；
(2)将培养体系置于电磁感应诱导装置中，通过永磁铁产生的电磁感应诱导神经干细胞进行神经分化。
优选的，所述培养体系位于永磁铁的正下方。
优选的，所述永磁铁位于干细胞上方2-10cm。
优选的，所述永磁铁的磁场强度为0.1-1特斯拉。
优选的，所述永磁铁的旋转速度为100-1000转/分。
优选的，所述永磁铁产生的感应电流为0.1-100微安；感应电动势为0.1-10mV。
本发明的有益效果：
(1)本发明制备石墨烯薄膜的方法简单高效，可大量生产；本发明制备的石墨烯薄膜具有良好的生物相容性，结构稳定，粘附细胞能力强，具有优异的促进神经干细胞贴壁的能力，可以调控神经干细胞的增殖和分化，适用体外培养干细胞；厚度均匀可控，具有良好的生物相容性，可以直接用于干细胞培养；作为导体，具有良好的电磁感应效率，能够在旋转磁场下产生无线电信号，该电信号可用于诱导神经干细胞的神经分化。
(2)本发明诱导神经干细胞的方法操作简单，诱导装置简单、成本低；本发明的诱导方法利用电磁感应诱导产生的固定大小的感应电流或感应电动势的作用下，进行神经分化；加速成体干细胞的神经分化；提高成体神经干细胞向神经元分化的比例。
附图说明
图1：本发明的PDMS-石墨烯纳米材料基底制备流程示意图；
图2：本发明制备的PDMS-石墨烯纳米材料基底的的扫描电镜图；
图3:旋转磁场处理接种在PDMS-石墨烯纳米材料基底的干细胞，诱导其分化的流程示意图；
图4：免疫荧光染色显示不同材料上神经干细胞向神经元和神经胶质细胞的分化，红色为神经元，绿色为神经胶质细胞；
图5：电磁感应诱导装置的结构示意图；
图6：电磁感应诱导装置的照片：(A)PDMS衬底，(B)石墨烯薄膜，(C)旋转磁场装置置于细胞上方。
其中：1.永磁铁，2.旋转杆，3.固定器，4.转动电机，5.支撑架。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术部分介绍的，现有的神经干细胞体外分化借助于神经营养因子、化学小分子或基因转染等技术，诱导剂价格昂贵且半衰期短、易失活，需反复刺激，基因转染操作繁琐复杂，细胞分化速度慢。脉冲电刺激可以诱导干细胞的神经分化，但不是单纯的体外培养干细胞，而是利用电诱导干细胞分化。常规方法是将细胞接种在导电材料上，材料两端接电线，通过外接电源产生电信号，诱导其上的细胞分化。直流电刺激碳纳米管多层材料上的神经干细胞向神经元分化和成熟，电刺激参数每天20Hz,1mA and 2h。(具体可参见文献：Electrical stimulation at nanoscale topography boosts neural stem cellneurogenesis through the enhancement of autophagy signaling.Biomaterials,2021Jan；268:120585.doi:10.1016/j.biomaterials.)。这些操作容易染菌，且不能应用到临床。
基于此，本发明的目的是提供基于电磁感应产生的无线电信号加快神经干细胞向神经元分化的方法。本方法采用非接触的电刺激，电信号是材料本身物理性质产生的，不需要外接电线，不会造成污染，且有临床应用的潜在价值。
传统的石墨烯厚度薄，易碎，不利于细胞的接种，特别是作为细胞生长的基底材料。本发明首次将PDMS与石墨烯基底以碳硅结合的形式直接键合，制备得到平整的石墨烯基底并意外的发现，得到的PDMS-石墨烯纳米材料基底不仅利于细胞的接种，更有利于成体干细胞的生长增值、提高成体干细胞向神经元分化的比例，并维持干细胞的干性。
本发明的PDMS-石墨烯纳米材料基底的制备方法中，各步骤相辅相成，是一个有机的整体。石墨烯-镍片基底在温度和时间等因素环境下，基底的厚度，柔软度都会受到影响，从而影响神经干细胞的分化。
如图5所示，本发明设计了一种电磁感应诱导装置，包括永磁铁1以及与永磁铁1连接的旋转杆2；所述旋转杆2一端穿过固定器3的底面；所述固定器3内设有转动电机4；所述旋转杆2的一端与永磁铁1活动连接，另一端与转动电机4连接；所述固定器3与支撑架5连接。
将神经干细胞接种至本发明制备的石墨烯薄膜上，置于本发明的电磁感应诱导装置中(见图3和图6)，进行干细胞分化过程。实现电磁感应诱导神经干细胞神经分化：永磁铁的磁场强度为0.1-1特斯拉；永磁铁的旋转速度为100-1000转/分；永磁铁产生的感应电流为0.1-100微安；感应电动势为0.1-10mV。感应电流的大小与磁场强度及转速成正比。感应电流在一定范围内可加快神经干细胞的神经分化，永磁铁离神经干细胞越近细胞分化效果越好，但永磁铁离神经干细胞的距离需保持在2～10cm之间。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
实施例1
石墨烯薄膜的制备，如图1所示：
(1)将甲烷，氢气和氩气(CH4:H2:Ar＝20:30:270sccm)的混合气体通入反应炉中，通过CVD方法，沉积时间10-30分钟，沉积温度800-1200℃，以镍片为基底烧制合成纳米级石墨烯材料。
(2)在合成的纳米级石墨烯-镍片基底上面滴加聚二甲基硅氧烷(PDMS)，以500-2000rpm旋涂均匀后放入烘箱中70℃下进行反应，12小时后得到PDMS已凝固了的基底样本。
(3)将PDMS-石墨烯-镍片基底放入不断更新的六水合三氯化铁-稀盐酸的混合溶液中，在室温下浸泡刻蚀。六水合三氯化铁-稀盐酸的混合溶液由如下方法制备而成：将浓度为0.15mol/L的盐酸溶液加入到六水合三氯化铁溶液中，制备得到六水合三氯化铁-稀盐酸的混合溶液。浸泡48h后，在去离子水清洗，37℃干燥10-30分钟后即可得到去掉镍片的PDMS-石墨烯基底即为石墨烯薄膜。石墨烯薄膜的厚度为10nm，石墨烯薄膜的扫描电镜图见图2。
实施例2
(1)将2μg/L的层粘连蛋白溶液滴加到实施例1制备的石墨烯薄膜上，室温孵育2小时后移除层粘连蛋白得到包被层粘连蛋白的石墨烯薄膜，将20000个小鼠神经干细胞(提取自从孕小鼠(13-15)天的胎鼠脑中)接种于包被层粘连蛋白的石墨烯薄膜上，细胞会自动贴在石墨烯薄膜上，添加神经干细胞增殖培养液，石墨烯薄膜贴在细胞培养板上，得到培养体系；
神经干细胞增殖培养液为Neurobasal培养基(Thermo Fisher,21103049)+2％(体积百分数)B-27supplement+1％(体积百分数)penicillin/streptomycin+1％(体积百分数)glutaMAXTM-1+碱性成纤维生长因子(bFGF,20ng mL-1)+表皮生长因子(EGF,20ng mL-1)。
(2)将培养体系置于电磁感应诱导装置中，使培养体系位于永磁铁的正下方；接通转动电机的电源，转动电机转动带动旋转杆转动，旋转杆带动永磁铁转动。通过永磁铁产生的电磁感应诱导干细胞进行神经分化，分化7天。永磁铁的磁场强度为0.3特斯拉。永磁铁的旋转速度为300转/分。永磁铁产生的感应电流为10微安，感应电动势为1mV。
通过检测3和7天的分化效果，可以看出采用本实施例的方法分化3天后即可分化出神经元，7天后神经干细胞分化成神经元的分化率高达70％。
试验例
将细胞爬片(TCP)、PDMS和实施例1制备的PDMS-石墨烯纳米材料基底分别包埋层黏连蛋白(石墨烯)，并接种小鼠神经干细胞(提取自从孕小鼠(13-15)天的胎鼠脑中)，置于转速为300rpm的旋转磁场下进行10分钟/次/天的刺激。利用免疫荧光染色结合激光共聚焦扫描电镜检测刺激7天后，神经元标志物(MAP2)和神经胶质细胞标志物(GFAP)的表达情况，发现与对照组即磁场处理的细胞爬片和PDMS组相比，同样条件下的石墨烯组出现更多MAP2阳性细胞(红色)(图4)。
如图4所示：分化的能被染成绿色或红色，没被染色的是未分化的细胞。分化速度也能从图4中看出，石墨烯+磁场处理组等早出现红色细胞，即神经元细胞。红色是神经元，绿色是胶质细胞，从图4中可以看出其他对照试验中的神经干细胞主要分化为胶质，但是石墨烯协同旋转磁场刺激后，出现更多神经元，且时间更早，说明可以加快向神经元分化，且提高神经元的比例。表明旋转磁场诱导石墨烯产生的无线微电流可促进神经干细胞更多地向神经元方向分化。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (1)
1.基于电磁感应产生的无线电信号加快神经干细胞向神经元分化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将层粘连蛋白包被于石墨烯薄膜上，然后接种上神经干细胞，再加入神经分化培养液，得到培养体系；
所述石墨烯薄膜的制备方法为：
1）将甲烷、氢气和氩气通过CVD方法在基底上制备纳米级石墨烯层，得到纳米级石墨烯-基底；所述基底为镍片；所述纳米级石墨烯的厚度为10-100nm；
2）在步骤1）得到的纳米级石墨烯-基底上滴加PDMS，旋涂均匀后进行反应，得到PDMS-纳米级石墨烯-基底；反应的温度为60~80℃，时间为3-24h；
3）将步骤2）得到的PDMS-纳米级石墨烯-基底进行刻蚀除去基底，清洗、干燥后得到PDMS-纳米级石墨烯，即为石墨烯薄膜；所述刻蚀为将PDMS-纳米级石墨烯-基底放入六水合三氯化铁-稀盐酸的混合溶液中，在室温下浸泡24-72h；所述六水合三氯化铁-稀盐酸的混合溶液是将浓度为0.1 -0.25 mol/L的盐酸溶液加入到六水合三氯化铁溶液中制备得到的；
（2）将培养体系置于电磁感应诱导装置中，通过电磁感应诱导装置中的永磁铁产生的电磁感应诱导神经干细胞进行神经分化；所述培养体系位于永磁铁的正下方；所述永磁铁位于培养体系上方2-10cm；所述永磁铁的磁场强度为0.1-1 特斯拉；所述永磁铁的旋转速度为100-1000 转/分；所述永磁铁产生的感应电流为0.1-100 微安；感应电动势为0.1-10mV；
所述电磁感应诱导装置包括永磁铁以及与永磁铁连接的旋转杆；所述旋转杆一端穿过固定器的底面；所述固定器内设有转动电机；所述旋转杆的一端与永磁铁活动连接，另一端与转动电机连接；所述固定器与支撑架连接。
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