CN114560944A - 胶体金颗粒标记的抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及胶体金颗粒标记的抗体及其应用。本发明针对CEA靶标制备并获得了高活性的单克隆抗体，并针对该抗体开发了新的胶体金颗粒标记方法，本申请制备的胶体金，保证各检测线显色清晰的基础上，能进一步加快试纸条的检测速度，保证试纸条的检测准确度。采用该单克隆抗体制备的试剂盒具有较好的检测特异性，具有良好的应用前景。

Description

胶体金颗粒标记的抗体及其应用
技术领域
本发明涉及检测领域，更具体的，涉及一种胶体金颗粒标记的抗体及其应用。
背景技术
癌胚抗原(CEA)是一种分子量为180-200kDa的多糖蛋白复合物.1965年首先由加拿大学者从结肠腺瘤和胎儿肠中提取的一种肿瘤相关抗原。主要存在于直肠.结肠癌组织和胚胎肠粘膜上。因这种抗原也存在于2-6个月胚胎的胃肠、肝脏和胰腺组织中.故名癌胚抗原，也称胚胎抗原(EA)或胎儿抗原(FA)。
CEA作为最常用的肿瘤标志物，广泛应用于多种肿瘤的诊断，已成为临床诊断的重要辅助指标之一。健康者血清CEA水平一般小于5ng/mL。恶性肿瘤可导致CEA表达水平明显升高，当其持续升高5～10倍时，提示可能存在肠癌。以CEA水平升高为首发表现的甲状腺髓样癌，提示在鉴别CEA升高的疾病时，应考虑甲状腺髓样癌的可能。CEA表达水平与肿瘤临床分期密切相关。有研究显示，胃癌患者CEA阳性率随胃癌分期递增而升高，IA、IB、Ⅱ、ⅢA、ⅢB、Ⅳ期胃癌患者CEA阳性率分别为4.6％、12.3％、27.80％、39.1％、48.3％、53.0％。乳腺癌患者CEA表达水平与疾病临床分期也呈正相关，随着临床分期升高而增高。
CEA可用于肿瘤术后疗效评价，术后CEA水平明显降低表示手术效果较好。在有效的结直肠癌切除术后，外周血CEA水平一般在4～6周恢复正常水平，若超过6周仍未恢复正常，提示肿瘤有可能早期复发。在肿瘤治疗方法中，放化疗和手术治疗一样重要。在放化疗过程中，应定期检测血清CEA水平，以监测放化疗疗效。一般而言，CEA水平在放疗后明显降低。
传统的测定CEA含量的方法是免疫分析法，是建立在抗体一抗原的专一性和灵敏性的基础上。自上世纪40年代以来.陆续出现了免疫荧光技术、放射免疫技术及免疫酶技术三大经典免疫技术。三大经典免疫技术的相继问世一次次地推动着免疫技术的发展。免疫荧光技术启动了标记抗原抗体的可能.放射免疫技术将免疫测定的灵敏度推上一个巅峰.而免疫酶技术则开拓了免疫技术的视野。而近年来发展起来的化学发光免疫检测和电化学免疫检测以及蛋白芯片技术更是进一步推动了I临床检测技术的发展用。目前，临床上用来检测CEA浓度的方法主要有酶联免疫吸附测定、荧光免疫测定、放射免疫测定、电化学发光免疫测定、安培免疫测定、免疫金标技术以及蛋白芯片技术。
免疫金标记技术(immunogold labeling technique，ICG)是以胶体金为标记物.利用特异性抗原抗体反应.在光镜电镜下对抗原或抗体物质进行定位、定性乃至定量研究的标记技术。研究表明对同一标本同时采用放射免疫法、酶联免疫法和金标法进行CEA检测，结果表明金标法是一种简便易行的初筛方法。目前金标技术主要朝着高灵敏度、多元化检测、定量或半定量检测方向发展。但是针对CEA的检测还有进一步提高的空间，针对CEA检测的胶体金颗粒标记方法也有待进一步的提高，特别是针对CEA的更优的抗体研究也有待进一步的提高。
发明内容
本发明克服现有技术的缺陷，提供一种改进的胶体金颗粒标记方法，以及针对CEA的单克隆抗体以及真对该抗体开展的标记方法及试剂盒。
一方面，本发明提供一种针对CEA的单克隆抗体4D05，该抗体的轻链可变区(SEQID NO：1)
Figure BDA0003571796320000021
重链可变区(SEQ ID NO：2)
Figure BDA0003571796320000022
其中，本发明还提供了一种包含编码上述氨基酸序列的多核苷酸序列或组合的重组DNA表达载体；所述重组DNA表达载体的DNA序列中进一步的包含编码抗4D05抗体的上述重链可变区、重链恒定区、轻链可变区和轻链恒定区的氨基酸序列。
其中，本发明还提供了一种转染上述重组DNA表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞包含原核细胞、酵母、昆虫或哺乳动物细胞。
其中，所述原核细胞优选大肠杆菌。
其中，所述哺乳动物细胞优选HEK293E细胞、CHO细胞或NS0细胞。
进一步的，本发明的单克隆抗体还可以通过小鼠腹水来产生。
进一步的，本发明还提供一种胶体金颗粒标记方法，所述方法具体包括以下步骤：将实验用的各种玻璃器具均需要经蒸馏水多遍洗净并用双蒸水多次冲洗，烘干；并将器皿放入浓硫酸溶液中浸泡24h超纯水多遍浸泡冲洗，烘干，避免粉尘等污染。经高压灭菌进行灭菌处理，最后经过去离子水冲洗多遍，高温干燥，备用。制备胶体金：取250mL三角瓶一个，加双蒸水及1％氯化金溶液，用0.22μm滤膜过滤，加热沸腾。取柠檬酸钠先用0.22μm滤膜过滤，再加入上述溶液中，迅速混合均匀，再保持沸腾时间10min，在上述搅拌过程中，锥形瓶中溶液颜色呈现由浅黄色一紫色一酒红色的变化过程，取下锥形瓶冷却至室温，并用双蒸水补充至原体积K2CO3调节pH 6.5，制备成酒红色的胶体金溶液，经0.22μm滤膜过滤，用紫外-可见光分光光度计在可见光(400-600nm)范围内扫描胶体金溶液，得到胶体金可见光光区的最大吸收波长为521nm，而且吸收峰宽度较小，说明胶体金溶液颗粒大小均匀，质量较好。将胶体金按照1/10(V/V)的比例加入的4D05单克隆抗体溶液，室温反应后，加入聚乙二醇，离心，吸去上清。用含牛血清白蛋白(BSA)的PBS洗涤。最后沉淀重悬于相当于原体积1/5的1％BSA溶液中，4℃保存即制备获得胶体金颗粒标记的单克隆抗体。通过采用上述技术方案，若胶体金的粒径过大，则会影响胶体金在检测垫上的移动速度，若胶体金的粒径过小，则会影响各检测线的显色深浅。两者均会影响检测人员对检测结果的读取，降低试纸条的检测准确度。本申请制备的胶体金，保证各检测线显色清晰的基础上，能进一步加快试纸条的检测速度，保证试纸条的检测准确度。
进一步的，本发明还提供一种胶体金标记抗体制备的检测试剂盒，所述试剂盒含有试纸条，所述试纸条的制备方法包括：用加样器将的0.5-5mg/L浓度的4D05单克隆抗体溶液以及兔抗鼠IgG溶液以直线的形式平行点加到NC膜上的A、B处，A与B之间间距为3mm；胶体金标记抗体的固化：取已用含BSA的PBS稀释的胶体金标记抗CEA单克隆抗体溶液等体积混合，加至结合物垫上，干燥备用；试剂条的黏贴、组装：按常规方式组装，首先将包被了抗体的NC膜黏贴于单面胶的塑料底板上，再依次黏贴胶体金结合物垫、样品垫以及吸水垫。
进一步的，将所述各垫装入一个盒体中，所述的盒体对应于样品垫的部位设有加样孔，所述的盒体对应于检测线和质控线的部位设有观测窗以及检测线和质控线的位置标识。
具体的，所述NC膜还可以是醋酸纤维素膜或混合膜；所述样品垫可以是玻璃纤维或聚酯纤维或混合纤维；所述吸水垫由吸水材料制备，如吸水纸。
更进一步的，所述NC膜宽度控制在20～30mm；所述吸水垫可宽度为20～40mm，所述胶体金结合物垫的宽度为5～10mm；所述样品垫宽度为10～40mm。
进一步的，检测线的单克隆抗体工作浓度为0.1～2.0mg/mL，喷涂量为0.5～10μL/cm；质控线的工作浓度为0.1～2.0mg/mL，喷涂量为0.5～10μL/cm；胶体金标记探针单克隆抗体的工作浓度(以蛋白浓度计)：1～100μg/mL，喷涂量为1～100μL/cm。
进一步的，所述的试纸条背面背板材料的选择是多种多样的，可以是塑料板，如聚氯乙烯板(PVC)等。
进一步的，将所述带有背板的免疫层析试纸条切成3～5mm宽，装入一个检测卡的盒体中。
本发明的试剂盒检测的样本可以是CEA蛋白或者人体全血或者血清。
当样品是全血或者血清时，检测方法为使用PBS缓冲液50μL稀释50μL样本全血或25μL血清/血浆，加至制备好的试纸条加样孔中进行检测，10min后观察检测结果。
癌胚抗原(CEA)为广谱性的肿瘤标志物，正常人血清中含量极低，小于5ng/ml，CEA水平升高常见于大肠癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、甲状腺髓样癌等。因此，采用所述试剂盒检测到高浓度表达的CEA时对应的能够用于判断癌症的发生。
有益效果
本发明针对CEA靶标制备并获得了高活性的单克隆抗体，并针对该抗体开发了新的胶体金颗粒标记方法，本申请制备的胶体金，保证各检测线显色清晰的基础上，能进一步加快试纸条的检测速度，保证试纸条的检测准确度。采用该单克隆抗体制备的试剂盒具有较好的检测特异性，具有良好的应用前景。
附图说明
图1重组CEA纯化结果图
图2试纸条结构图
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
实施例1 CEA蛋白表达
针对CEA基因PCR设计的引物序列如下：
5端：5’-GCGGCCGCGCCACCATGGAGTCTCCCTCGGCCCCT-3’(下画线碱基为NotI酶切位点)，3端：5’-GGAATTCCTATATCAGAGCAACCCCAACCAG-3’(下画线碱基为EcoRI酶切位点)。
用PCR的方法从人血液DNA中提取CEA基因片段，将特异PCR产物用低熔点琼脂糖凝胶电泳回收纯化后，应用NotI和EcoRI双酶切，扩增产物连接到巴氏毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9-his的NotI,EcoRI位点。将SalI酶线性化的pPIC9k-CEA表达质粒以电穿孔法转化GS115菌株,涂MD平板。取单菌落接种于含G418浓度(mg/ml)为1和2的YPD平板,30℃培养2d后,取菌落溶于20μl无菌水中,95℃加热10min,取2μl进行菌落PCR,选择鉴定重组质粒已经插入酵母基因组的菌落进行诱导表达。
挑取抗性克隆接种于BMGY(100mmol/ml K3PO4,1.34％YNB,0.00004％生物素,1％甘油)培养基中,30℃振荡培养至D600为5时,离心收集菌体并悬于1/10体积的BMMY(100mmol/ml K3PO4,1.34％YNB,0.00004％生物素,1％甘油,0.5％甲醇)培养基中继续培养,每天补充0.5％甲醇进行诱导表达。将培养上清采用Ni柱进行纯化，经SDS-PAGE检验，如图1所示，纯化获得了较纯的CEA，将其浓度调整为1mg/mL备用。空白对照没有蛋白条带。
实施例2 CEA单克隆抗体的制备
以BALB/c小鼠为免疫小鼠，首次免疫时，在小鼠颈背部皮下注射100μg BTN3A3-mFc蛋白。首免后第21天进行第2次免疫，每只小鼠颈背部皮下注射100μg CEA蛋白。第2次免疫后第14天进行第3次免疫，经腹腔给每只小鼠注射100μg CEA蛋白，并经小鼠眼眶静脉丛采血。第3次免疫后的第14天进行第4次免疫，分别在邻近脾和腹腔内给小鼠注射50μg CEA蛋白。第4次免疫7d后经眼眶静脉丛采血，与三免血清一起用ELISA检测血清效价。融合前3～4d再经脾给小鼠注射100μg生理盐水稀释的CEA蛋白。取免疫小鼠脾细胞与Sp2/0细胞按常规方法融合。间接ELISA法筛选、有限稀释法克隆化。
经细胞融合、筛选及克隆化，获得5株能稳定分泌CEA单抗的杂交瘤细胞株，其中效果最好的3个克隆号分别为2A03、4D05、7E08。按照常规方法，用上述杂交瘤细胞株分别制备小鼠腹水，将腹水纯化后获得单抗。
利用小鼠Ig类/亚类/亚型检测试剂盒对CEA单抗进行检测，结果如表1所示。
表1 CEA单克隆抗体亚型检测
克隆号 重链亚类 轻链亚类
2A03 IgM κ
4D05 IgM κ
7E08 IgM κ
从表1的结果可以看出，2A03、4D05、7E08三个单克隆抗体重链亚类都是IgM，轻链都是κ链。
Western印迹法检测单抗特异性：分别将大肠杆菌细胞和人乳腺癌细胞裂解液、实施例1制备的CEA、BSA蛋白，制备成Western印迹样本，进行电泳并转膜，依次孵育待检测3种单抗，4℃反应过夜，HRP标记的山羊抗小鼠IgG二抗室温孵育40min后进行显影。结果显示，2A03、4D05、7E08三个单克隆抗体均能够在人上皮细胞裂解液、实施例1制备的CEA中形成单一条带，说明能够特异性检测到CEA，而在大肠杆菌和BSA中均无条带，说明具有较好的特异性。
采用捕获法测定全抗体的亲和力。将山羊抗小鼠IgG偶联到CM5芯片表面，分别稀释三个单抗保证大约200RU左右的抗体被山羊抗人IgG捕获。将CEA设置一系列的浓度梯度(200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.125nM、1.5625nM、0.78125nM)流经固定相表面，测定抗体的亲和力。结果发现筛出的三株抗体都具有较高的亲和力(见表2)。
表2 CEA单克隆抗体亲和力鉴定
克隆号 亲和力常数KD(M)
2A03 7.52E-10
4D05 4.81E-10
7E08 5.64E-10
从表2的结果可以看出，2A03、4D05、7E08三个单克隆抗体亲和力均较好，特别是4D05，亲和力达到了4.81E-10。
实施例3 4D05单克隆抗体序列的鉴定
4D05杂交瘤细胞株扩大培养后，收集对数生长期的细胞，使用Novagen鼠源抗体可变区基因克隆的整套试剂并按照其说明书对本发明中所述抗体的重轻链可变区基因进行克隆测序。具体方法路线为：使用StraightA’sTMmRNAIsolationKits从收集杂交瘤细胞株中分离总RNA，然后使用FirstStrandcDNASynthesisKit和Ig-3’constantregionprimer合成第一条cDNA链,接着使用Ig-5’primers和NovaTaqDNAPolymerase以第一条cDNA链为模板进行PCR扩增，得到的PCR扩增产物使用Vector Cloning Kit克隆到克隆载体中，并进行筛选，分离DNA进行基因测序。通过分析获得了该抗体的轻链和重链的可变区序列分别如下：
轻链可变区(SEQ ID NO：1)
Figure BDA0003571796320000071
重链可变区(SEQ ID NO：2)
Figure BDA0003571796320000072
实施例4胶体金标记4D05单克隆抗体的试纸条的制备
将实验用的各种玻璃器具均需要经蒸馏水多遍洗净并用双蒸水多次冲洗，烘干；并将器皿放入浓硫酸溶液中浸泡24h超纯水多遍浸泡冲洗，烘干，避免粉尘等污染。经高压灭菌进行灭菌处理，最后经过去离子水冲洗多遍，高温干燥，备用。
制备胶体金：取250mL三角瓶一个，加99mL双蒸水及1mL 1％氯化金溶液，用0.22μm滤膜过滤，加热沸腾3min。取2mL的1％柠檬酸钠先用0.22μm滤膜过滤，再加入上述溶液中，迅速混合均匀，再保持沸腾时间10min，在上述搅拌过程中，锥形瓶中溶液颜色呈现由浅黄色一紫色一酒红色的变化过程，取下锥形瓶冷却至室温，并用双蒸水补充至原体积，0.1mol/mL K2CO3调节pH 6.5，制备成酒红色的胶体金溶液，经0.22μm滤膜过滤，用紫外-可见光分光光度计在可见光(400-600nm)范围内扫描胶体金溶液，得到胶体金可见光光区的最大吸收波长为520nm，而且吸收峰宽度较小，说明胶体金溶液颗粒大小均匀，质量较好。
将胶体金按照1/10(V/V)的比例加入0.3mg/mL的4D05单克隆抗体溶液，室温反应15min后，加入1％聚乙二醇，8000r/min离心30min，吸去上清。用含1％牛血清白蛋白(BSA)的0.02mol/L PBS洗涤2次。最后沉淀重悬于相当于原体积1/5的1％BSA溶液中，4℃保存。
用加样器将优化后的1.5mg/ml浓度的4D05单克隆抗体溶液以及兔抗鼠IgG溶液以直线的形式平行点加到NC膜上的A、B处，A与B之间间距为3mm；胶体金标记抗体的固化：取已用含1％BSA的0.02mol/L PBS稀释的胶体金标记抗CEA单克隆抗体(货号Z211N113，北京科跃中楷生物技术有限公司)溶液等体积混合，按30uL/cm的比例加至结合物垫上，干燥备用；试剂条的黏贴、组装：按常规方式组装，首先将包被了抗体的NC膜黏贴于单面胶的塑料底板上，再依次黏贴胶体金结合物垫、样品垫以及吸水垫，两两之间分别重叠2mm黏贴，见图2。
用不同浓度的CEA标准液，按常规的测定步骤进行测定。CEA标准液2ng/mL时，A区测定线开始有显色，与阴性结果有明显区别；该浓度测定5次，每次测定线均显色，且显色深浅基本一致，故该双抗体夹心法试纸条检测CEA的敏感性为2μng/mL。
实施例5胶体金标记4D05单克隆抗体的试纸条的特异性检测
试纸条的特异性分别配制CEA、前列腺特异性抗原PSA、肿瘤标志性抗原CA125和铁蛋白(Ferritin)、人血白蛋白的标准溶液，浓度分别为0、10、50、100、200ng/mL。用试纸条检测，每个浓度重复3次，判断试纸条的特异性。结果如表3所示。
表3胶体金标记4D05单克隆抗体的试纸条的特异性检测结果
Figure BDA0003571796320000091
从表3的结果可以看出，采用试纸条针对CEA、前列腺特异性抗原PSA、肿瘤标志性抗原CA125和铁蛋白(Ferritin)、人血白蛋白等样本就行检测，发现此试纸条与其他蛋白均没有交叉反应，只与CEA有特异性反应。
对于本领域的普通技术人员而言，具体实施例只是对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性的改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京科跃中楷生物技术有限公司
<120> 胶体金颗粒标记的抗体及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Ile Val Ile Thr Gln Arg Pro Ala Leu Met Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Tyr Phe Thr Asn His Gly Lys Asp Asn
20 25 30
His Asp His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ile Ser Pro Lys Pro Trp
35 40 45
Ile Tyr Phe Asn Lys Asp Phe Arg Arg Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Ser Met Glu
65 70 75 80
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Pro Phe Tyr Leu Thr Glu Asp
85 90 95
Met Cys Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 2
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Ala Thr Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Ser Tyr Ala
20 25 30
Thr Trp Gln Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Cys Tyr Ala Ser Met Met Pro Phe Met Glu Glu His Met Trp
50 55 60
Tyr Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Tyr Ala Met Arg Arg Gly Phe Trp Gly Leu Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Ala Val Ser Ser
115

Claims (5)

1.一种针对CEA的单克隆抗体4D05，该抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO：1所示；重链可变区序列如SEQ ID NO：2所示。
2.一种采用胶体金颗粒标记的权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于:所述胶体金颗粒标记方法为将胶体金按照1/10V/V的比例加入0.3mg/mL的4D05单克隆抗体溶液，室温反应15min后，加入1％聚乙二醇，8000r/min离心30min，吸去上清；用含1％牛血清白蛋白的0.02mol/LPBS洗涤2次；最后沉淀重悬于相当于原体积1/5的1％BSA溶液中，即制备获得胶体金类标记的单克隆抗体。
3.一种CEA检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒中含有试纸条，所述试纸条中标记有权利要求2所述的胶体金颗粒标记的单克隆抗体。
4.权利要求2中所述的胶体金颗粒标记的单克隆抗体在制备用于CEA检测的试剂盒中的用途。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于所述试剂盒检测的样本为血清、血液或者CEA蛋白。
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