CN114555107A - 用于干眼病的tsg6多肽片段 - Google Patents

Abstract

本发明涉及治疗干眼病，并且具体地涉及(但不限于)用LINK_TSG6多肽治疗干眼病。

Description

用于干眼病的TSG6多肽片段

本申请要求于2019年7月25日提交的GB1910645.9的优先权，其内容和要素通过引用并入本文用于所有目的。

技术领域

本发明涉及治疗眼表病症，并且具体地涉及(但不限于)用LINK_TSG6多肽治疗干眼病。

背景技术

肿瘤坏死因子(TNF)-刺激基因6(TSG-6)是TNF-刺激基因-6的～35kDa分泌产物，响应于炎性介质和生长因子而表达。

虽然在少数组织中组成型表达，但是TSG-6通常在有炎症的地方上调。大多数情况下，TSG-6表现出抗炎和组织保护特性，但已被认为有时在疾病病理例如在肺中发挥作用。虽然TSG-6由广泛的细胞类型产生，但是TSG-6被发现是由间充质干细胞/基质细胞(MSC)响应于炎性信号而产生的，并且它介导了它们的许多免疫调节和修复活性，这已经导致了大量关于该令人感兴趣的分子在广泛的疾病模型中的治疗作用的出版物。

TSG-6是相对较小的蛋白，分子量仅为～35至38kDa，主要由两个模块结构域组成。考虑到TSG-6的大小，它具有惊人的大量活性，包括调节免疫和基质细胞功能及其对细胞外基质形成、运作机制和重塑的贡献。TSG-6能够调节基质组织并控制基质分子与细胞表面受体和细胞外信号传导因子(例如，趋化因子)的关联，这可能是其多样化功能库的基础。在这方面，TSG-6与大量配体如糖胺聚糖(GAG)、蛋白聚糖(PG)核心蛋白和其它基质组分相互作用，并直接与多种趋化因子和骨形态发生蛋白(BMP)结合。TSG-6的一个特别不寻常的功能是其作为酶的作用，催化非硫酸化GAG透明质酸(HA)与来自蛋白聚糖的间-α-抑制剂(IαI)家族的所谓重链(HC)的共价修饰。由全长TSG6蛋白而不是仅含有TSG-6片段的LINK_TSG6多肽介导的该过程导致HC·HA复合物的形成，并且对于哺乳动物排卵和受精是必需的，并且还发生在许多其它背景下(例如炎症)，其中HC·HA给予组织保护或有助于病理过程。

在“戴和米尔纳(Day&Milner)”(《基质生物学(Matrix Biology)》(2019)78-79,60-83)中综述了TSG-6表达的位点和背景，其结构和配体结合特性，以及这些如何共同支持其在分子水平上的多样化作用方式和治疗潜力。

US2015/0057229描述了LINK_TSG6在抑制软骨退化中的用途。

干眼病(也称为干燥性角膜结膜炎)是最常见的眼病中的一个，其发生在全世界7％至33％的人群中。它是泪膜和眼表的多因素病症，并伴有泪膜渗透压升高和眼表炎症、神经营养缺乏和睑板腺功能障碍。

Kim等人(2016)(《角膜(Cornea)》35(4),536-542)比较了局部应用TSG-6、环孢菌素(cyclosporine)和泼尼松龙(prednisolone)治疗干眼病。对12周龄的NOD.B10.H2b小鼠每天4次局部施用重组TSG-6(0.1％)、每天2次局部施用0.05％环孢菌素(丽眼达(Restasis))，或每天4次局部施用1％泼尼松龙(百力特(Pred Forte))，持续1周。发现局部TSG-6在炎症介导的干眼病中与环孢菌素滴眼剂一样有效。然而，他们得出结论，TSG-6的临床应用受到各种因素的限制，包括大规模生产的困难或重组蛋白稳定性的变化。

WO2011/139357描述了成体干细胞/祖细胞和干细胞蛋白用于治疗眼部损伤和疾病的用途。他们提出的疗法基于以下发现：在对大鼠角膜进行化学灼伤后，应用多MSC或MSC条件培养基减轻了炎症和血流重建。他们提出使用由间充质干细胞表达的抗凋亡和抗炎蛋白，如STC-1和TSG-6。通过应用乙醇和机械清创角膜和角膜缘上皮在大鼠眼中产生角膜表面炎症。与PBS对照组相比，应用重组全长TSG-6导致角膜混浊和新血管形成降低，并且作者得出结论，由MSC响应于损伤信号而产生的蛋白可以通过增加角膜上皮祖细胞的生存力和增殖以及通过抑制角膜表面的炎症来保护角膜表面免受损害。

US2016/0075750(Prockop等人)描述了一种在悬浮于无蛋白培养基中的哺乳动物细胞中生产蛋白或多肽，如TSG-6蛋白的方法，该培养基包括至少一种抑制玻璃酸、透明质酸或其盐的产生的试剂。

鉴于以上考虑设计了本发明。

发明内容

本公开涉及LINK_TSG6多肽，其用于治疗或预防眼表病症，如干眼病或具有类似于在干眼病中观察到的角膜病变的其它眼表病症。本发明人已经发现该多肽能够以剂量依赖性方式减轻或预防干眼病的体征和症状。惊人的是，本发明人已经发现该多肽在减少角膜上皮缺损方面比全长TSG-6更有效。

在一些情况下，本文所述的治疗或预防干眼病包含选自由以下组成的组中的一种或多种作用：角膜上皮缺损的愈合；泪液产生的增加；炎症的抑制；以及结膜杯状细胞数量的增加或保持。炎症的抑制可以包含减少角膜、眶内泪腺或角膜和眶内泪腺两者中的一种或多种促炎细胞因子的产生，该促炎细胞因子任选地选自TNFα、IFNγ、IL-6和IL-1β。

治疗或预防干眼病可以包含与施用LINK_TSG6多肽之前的角膜上皮缺损、泪液产生、炎症或结膜杯状细胞数量相比，以及与施用PBS媒介物相比，角膜上皮缺损的愈合、泪液产生的增加、炎症的抑制或结膜杯状细胞数量的增加或保持。

治疗或预防干眼病可以包含与利用全长TSG-6蛋白治疗的对照个体中的角膜上皮缺损、泪液产生、炎症或结膜杯状细胞数量相比，角膜上皮缺损的愈合、泪液产生的增加、炎症的抑制或结膜杯状细胞数量的增加或保持。

在本文所述的一些方面，治疗包含向眼局部施用LINK_TSG6多肽。LINK_TSG6多肽可以配制成滴眼剂。治疗可以包含施用包含LINK_TSG6的滴眼剂。LINK_TSG6多肽可以与泼尼松龙、环孢菌素、利非斯特(Lifitegrast)(Xiidra^TM)、人工泪液或其任何组合共同配制，或者治疗可以涉及与泼尼松龙、环孢菌素、利非斯特(Xiidra^TM)、人工泪液或其任何组合共同施用。

在一些方面，治疗包含每天两次施用LINK_TSG6多肽。在一些方面，治疗包含每天施用LINK_TSG6多肽两次以上。在一些情况下，治疗包含每天施用LINK_TSG6多肽少于4次或每天施用LINK_TSG6多肽少于3次。在一些情况下，治疗包含每天一次施用LINK_TSG6多肽。在一些情况下，治疗包含以低于每天一次的频率施用LINK_TSG6多肽，如每两天一次、每三天一次、每周一次或每两周一次。

治疗可以涉及每只眼施用10至200μg LINK_TSG6，如每只眼100至200μg LINK_TSG6、每只眼100至150μg LINK_TSG6、每只眼120至150μg LINK_TSG6。优选地，治疗涉及每只眼施用约120μg至150μg LINK_TSG6多肽，或每只眼施用约12至15μg LINK_TSG6。

本文公开的治疗或预防眼表病症如干眼病适用于与任何原因相关联的干眼病。所治疗的个体可以患有与干眼病发病率增加相关联的病症，如干燥综合征、类风湿性关节炎或糖尿病。在一些情况下，该个体患有1型糖尿病或2型糖尿病。由于衰老、暴露于空气污染和/或增加使用视觉装置(例如，智能手机、计算机、平板电脑)，该个体可能处于患上眼表病症如干眼病的风险中。

治疗可以涉及施用LINK_TSG6多肽，LINK_TSG6多肽包含以下各项、由以下各项组成，或基本上由以下各项组成：(i)SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9的氨基酸序列，或者(ii)与SEQ ID NO:7或9的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。

本文还公开了治疗或预防眼表病症如干眼病的方法。该方法可以涉及向有需要的患者施用治疗有效量的LINK_TSG6。它可以涉及向眼局部施用LINK_TSG6。

本文公开的另一个方面是LINK_TSG6多肽在制造用于治疗或预防眼表病症如干眼病的药剂中的用途。该药剂可以配制成向眼局部施用，如制成滴眼剂。

本文公开的进一步方面是包含LINK_TSG6多肽的药物组合物。该药物组合物可以包含溶解在盐水中的LINK_TSG6多肽。该药物组合物可以包含溶解在磷酸盐缓冲盐水中的LINK_TSG6多肽。在一些方面，该药物组合物包含至少2000μg/ml、2100μg/ml、2200μg/ml、2300μg/ml、2400μg/ml、2500μg/ml、2600μg/ml、2700μg/ml、2800μg/ml、2900μg/ml、3000μg/ml、3100μg/ml、3200μg/ml、3300μg/ml或超过3300μg/ml的LINK_TSG6。在一些方面，该药物组合物包含至少200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/ml、700μg/ml、800μg/ml、900μg/ml、1000μg/ml、1200μg/ml、1300μg/ml、1400μg/ml、1500μg/ml、1600μg/ml、1700μg/ml、1800μg/ml、1900μg/ml、2000μg/ml的LINK_TSG6。在一些方面，该药物组合物包含至少200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/ml、700μg/ml、800μg/ml、900μg/ml、1000μg/ml、1200μg/ml、1300μg/ml、1400μg/ml、1500μg/ml、1600μg/ml、1700μg/ml、1800μg/ml、1900μg/ml、2000μg/ml的LINK_TSG6。优选地，该药物组合物包含至少2000μg/ml的LINK_TSG6。此类制剂可以用于每滴递送约120μg至约150μg的LINK_TSG6。

该药物组合物可以是滴眼剂制剂。该滴眼剂制剂可以包含1500μg/ml至3500μg/ml、1500μg/ml至3000μg/ml、2000μg/ml至3000μg/ml，或2400μg/ml至3000μg/ml。优选地，该滴眼剂制剂包含约2400μg/ml至约3000μg/ml。在一些情况下，该滴眼剂制剂包含至少2200、至少2300μg/ml、至少2400μg/ml、至少2500μg/ml、至少2600μg/ml、至少2700μg/ml、至少2800μg/ml、至少2900μg/ml、至少3000μg/ml或超过3000μg/ml。该滴眼剂制剂还可以包含泼尼松龙、环孢菌素、利非斯特(Xiidra^TM)或人工泪液。该滴眼剂制剂可以包含药学上可接受的载体。该滴眼剂制剂可以包含溶解在盐水中的LINK_TSG6多肽。该滴眼剂制剂可以包含溶解在磷酸盐缓冲盐水中的LINK_TSG6多肽。

本发明包括所描述的方面和优选特征的组合，除非明显不允许或明确避免此类组合。

附图说明

现在将参考附图讨论绘示出本发明原理的实施例和实验，其中：

图1.与本公开相关的序列。

图2.LINK_TSG6减轻干眼病的体征。A.丽丝胺绿染色后的眼部染色评分；B.通过酚红棉线试验确定的水性泪液产生；C.通过实时RT-PCR确定的促炎细胞因子mRNA水平；D.PAS(高碘酸-希夫染色)染色的结膜切片中的结膜杯状细胞计数。对于A和B，通过用于处理前后比较的Wilcoxon配对符号秩检验和用于PBS和LINK_TSG6之间比较的曼-惠特尼U检验确定显著性。并且ns＝不显著，p>0.05；**＝p<0.01；***＝p<0.001。对于C和D，通过单向方差分析和Tukey多重比较检验确定显著性，ns＝不显著，p>0.05；*＝p<0.05；**＝p<0.01；***＝p<0.001；****＝p<0.0001。

图3.LINK_TSG6以剂量依赖性方式减轻干眼病的体征。A.

定量丽丝胺绿染色角膜中的角膜上皮缺损。LINK_TSG6 1μg和0.1μg可有效减少角膜上皮缺损，但LINK_TSG6 0.01μg未显著改善角膜上皮缺损。B.通过酚红棉线试验定量水性泪液产生。LINK_TSG6 1μg和0.1μg均可有效增加泪液产生量，但LINK_TSG6 0.01μg未显著改善泪液产生。C.通过实时RT-PCR分析定量促炎细胞因子。LINK_TSG6 1μg在抑制TNF-α表达方面最有效。在A和B中，通过Wilcoxon配对符号秩检验确定显著性。*＝p<0.05；***＝p<0.01；ns＝不显著，p>0.05。在C中，通过单向方差分析和Tukey多重比较检验确定显著性，ns＝不显著，p>0.05；*＝p<0.05；**＝p<0.01***＝p<0.001；****＝p<0.0001。

图4.LINK_TSG6的剂量响应数据。A.通过眼部染色定量丽丝胺绿染色角膜中的角膜上皮缺损；B.通过酚红棉线试验定量水性泪液产生；C.通过实时RT-PCR确定的促炎细胞因子mRNA水平；D.PAS染色的结膜切片中的结膜杯状细胞计数。通过单向方差分析和Tukey多重比较检验确定显著性，ns＝不显著，p>0.05；*＝p<0.05；**＝p<0.01；***＝p<0.001；****＝p<0.0001。

图5.在减轻干眼病的体征方面LINK_TSG6比全长人重组TSG-6(FL TSG6)更有效。A.丽丝胺绿染色后的眼部染色评分；B.通过酚红棉线试验确定的水性泪液产生；C.PAS染色的结膜切片中的结膜杯状细胞计数；D.泪腺中CD3免疫染色的组织学分析，表达为CD3细胞浸润的病灶数量。分别比较对应于1、0.1和0.01μg LINK_TSG6以及3.27、0.327和0.0327μgFL TSG-6的等效摩尔剂量(92、9.2和0.92pmol)。通过单向方差分析和Tukey多重比较检验确定显著性。*＝p<0.05。

图6.评价干燥损伤诱导的干眼模型中的LINK_TSG6并与丽眼达进行比较。A.干燥损伤诱导和处理前的眼部染色；B.干燥损伤后和处理后的眼部染色；C.干燥损伤诱导和处理前的泪液产生；D.干燥损伤后和处理后的泪液产生；E.引流颈部淋巴结中的Th1细胞；F.引流颈淋巴结中的Th17细胞，ns＝不显著，p>0.05；*＝p<0.05；**＝p<0.01；***＝p<0.001；****＝p<0.0001。

图7.评价已经干燥的小鼠中的LINK_TSG6。A.眼部染色；B.泪液产生；C.处理后PAS染色的结膜切片中的结膜杯状细胞计数；D.眼表处的MMP-9mRNA水平；ns＝不显著，p>0.05；*＝p<0.05；**＝p<0.01；***＝p<0.001；****＝p<0.0001。A和B Wilcoxon配对符号秩检验以用于处理前后比较。C和D单向方差分析和Tukey多重比较检验。

图8.比较干眼病模型中的LINK_TSG6和丽眼达。A.处理前丽丝胺绿染色后的眼部染色评分；B.处理后丽丝胺绿染色后的眼部染色评分；C.处理前通过酚红棉线试验定量水性泪液产生；D.处理后通过酚红棉线试验定量水性泪液产生；E.处理后PAS染色的结膜切片中的结膜杯状细胞计数；F.泪腺中CD3免疫染色的组织学分析，ns＝不显著，p>0.05；*＝p<0.05；**＝p<0.01；***＝p<0.001；****＝p<0.0001，单向方差分析和Tukey多重比较检验。

具体实施方式

现在将参考附图讨论本发明的各方面和实施例。进一步的方面和实施例对于本领域技术人员来说是显而易见的。本文中提及的全部文件均通过引用并入本文。

本发明提供了一种用于治疗或预防眼表病症如干眼病的方法，该方法包含向受试者施用LINK_TSG6多肽。本发明人已经示出，在减少角膜上皮病变和治疗或减轻眼表病症如干眼病的体征或症状方面，LINK_TSG6比重组人TSG-6更有效。不希望受理论束缚，这可能是由于渗透进入组织的改善(由于分子的大小较小)、与全长蛋白相比的生物分布的差异，或CUB_C结构域影响的信号传导或酶活性的缺乏。在这方面，全长TSG-6比LINK_TSG6更有效地结合HA，因为前者的相互作用是协同的(并且可能涉及CUB_C结构域)(Baranova等人,2011《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》286,25675-25686)。HA与一些抗炎活性有关(见“戴和米尔纳”2019)。

TSG-6(肿瘤坏死因子-刺激基因-6)

TSG-6是由两个模块结构域组成的分泌蛋白。TSG-6通常不在成体组织中组成型表达，而是响应于炎性介质而被诱导。在炎症期间，TSG-6是组织的内源性保护剂。MSC的许多免疫调节和组织保护作用由其分泌TSG-6介导。

重组全长TSG-6蛋白已显示在广泛的疾病模型中具有抗炎和组织保护作用，如动脉粥样硬化、心肌梗塞、肥厚性瘢痕、结肠炎、自身免疫性糖尿病、类风湿性关节炎、创伤性脑损伤或急性肺损伤。

全长TSG-6难以制备，不溶且易于聚集。如本文所公开的，这些缺点与LINK_TSG6(包含人TSG-6的LINK模块的短重组肽)无关。该短多肽比全长TSG6更容易制备，并且在溶液中是高度易溶和稳定的。

如本文所公开的LINK_TSG6多肽仅包含人或哺乳动物TSG-6的Link模块。在一些实施例中，TSG-6多肽包含或基本上由根据SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成。Link模块对应于SEQ ID NO:2和5的37-128位残基，并在SEQ ID NO:7中示出。在一些优选的方面，可用于本发明的LINK_TSG6多肽在N端子处不包含SEQ ID NO:2或5的全长TSG6序列的1-35位残基中的一些或全部。

Link模块负责透明质酸(HA)结合活性、软骨素-4-硫酸盐结合活性、聚集蛋白聚糖结合活性、α-抑制剂间(IαI)结合活性、双库尼茨抑制剂结合活性、多功能蛋白聚糖结合活性、硫酸皮肤素结合活性、正五聚蛋白-3结合活性、血小板反应蛋白-1结合活性、血小板反应蛋白-2结合活性、纤连蛋白结合活性、肝素/硫酸乙酰肝素结合活性、TSG-6的RANKL结合活性、骨形态发生蛋白(BMP)-2结合活性、BMP-4结合活性、BMP-5结合活性、BMP-6结合活性、BMP-7结合活性、BMP-13结合活性、BMP-14结合活性、CXCL4结合活性、CXCL6结合活性、CXCL8结合活性、CXCL11结合活性、CXCL12结合活性、CCL2结合活性、CCL5结合活性、CCL7结合活性、CCL19结合活性、CCL21结合活性或CCL27结合活性。

LINK_TSG6可以是TSG-6的片段，其表现出透明质酸(HA)结合活性、软骨素-4-硫酸盐结合活性、聚集蛋白聚糖结合活性、α-抑制剂间(IαI)结合活性、双库尼茨抑制剂结合活性、多功能蛋白聚糖结合活性、硫酸皮肤素结合活性、正五聚蛋白-3结合活性、血小板反应蛋白-1结合活性、血小板反应蛋白-2结合活性、纤连蛋白结合活性、肝素/硫酸乙酰肝素结合活性、RANKL结合活性、骨形态发生蛋白(BMP)-2结合活性、BMP-4结合活性、BMP-5结合活性、BMP-6结合活性、BMP-7结合活性、BMP-13结合活性、BMP-14结合活性、CXCL4结合活性、CXCL6结合活性、CXCL8结合活性、CXCL11结合活性、CXCL12结合活性、CCL2结合活性、CCL5结合活性、CCL7结合活性、CCL19结合活性、CCL21结合活性或CCL27结合活性。

TSG-6的LINK结构域(LINK_TSG6)可以是全长TSG-6N-端子至CUB_C结构域的区域。照此，LINK_TSG6蛋白可能缺乏CUB_C结构域的全部或部分。

LINK结构域可以含有SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9的氨基酸序列。LINK_TSG6多肽包含以下各项、由以下各项组成，或基本上由以下各项组成：(i)SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9的氨基酸序列，或者(ii)与SEQ ID NO:7或9的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。

LINK_TSG6优选地是包含以下各项或由以下各项组成的多肽：(i)SEQ ID NO:7或9的氨基酸序列，或者(ii)与SEQ ID NO:7或9的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

因此，LINK_TSG6多肽可以包含：

(a)SEQ ID NO:7的氨基酸序列；

(b)其变体，变体与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少50％同一性并且具有RANKL结合活性；或者

(c)具有CXCL4结合活性、CXCL6结合活性、CXCL8结合活性、CXCL11结合活性、CXCL12结合活性、CCL2结合活性、CCL5结合活性、CCL7结合活性、CCL19结合活性、CCL21结合活性或CCL27结合活性的(a)或(b)的片段。

LINK_TSG6多肽可以由或基本上由SEQ ID NO:7所示的序列组成。

SEQ ID NO:9示出了包括TSG-6的Link模块(LINK_TSG6)的重组多肽。因此，本发明使用的TSG-6多肽可以优选地包含：

(a)SEQ ID NO:9的氨基酸序列；

(b)其变体，变体与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少50％同一性并且具有RANKL结合活性；或者

(c)具有CXCL4结合活性、CXCL6结合活性、CXCL8结合活性、CXCL11结合活性、CXCL12结合活性、CCL2结合活性、CCL5结合活性、CCL7结合活性、CCL19结合活性、CCL21结合活性或CCL27结合活性的(a)或(b)的片段。

LINK_TSG6多肽优选地由或基本上由SEQ ID NO:9所示的序列组成。

在本文所述的一些方面，LINK_TSG6多肽不缀合至活性剂，如抗体或抗原结合片段。例如，在一些情况下，LINK_TSG6多肽不缀合至IL-17A抗体或其片段。在一些情况下，LINK_TSG6多肽包含LINK_TSG6多肽的单拷贝(如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9的单拷贝)或由LINK_TSG6多肽的单拷贝组成。换言之，在这些情况下，LINK_TSG6多肽不包含多个LINK模块序列，如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9的多个拷贝。在一些情况下，LINK_TSG6多肽不包含His标签，如6xHIS标签。

可以使用任何合适的算法计算氨基酸同一性。例如，UWGCG软件包提供了BESTFIT程序，其可以用于计算同源性(例如在其默认设置下使用)(Devereux等人(1984)《核酸研究(ucleic Acids Research)》12,387-395)。PILEUP和BLAST算法可以用于计算同源性或排列序列(如识别等效或对应序列(通常在其默认设置下))，例如在Altschul(1993)《分子进化学杂志(J.Mol.Evol.)》36,290-300；Altschul等人(1990)《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》215,403-10中所述。

用于执行BLAST分析的软件可以通过国家生物技术信息中心(National Centerfor Biotechnology Information)公开获得(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。该算法涉及首先通过识别查询序列中长度为W的短字来识别高评分序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的字对齐时，短字匹配或满足某一正值阈值评分T。T被称为相邻字评分阈值(Altschul等人,supra)。这些初始相邻字匹配记录充当种子以启动搜索以发现含有它们的HSP。字匹配记录沿着每个序列在两个方向上延伸，直到累积对齐评分可以增加。在以下时刻，在每个方向上的字匹配记录延伸将停止：累积对齐评分从其最大实现值下降数量X；由于一个或多个负评分残基对齐的累积，累积评分趋于零或更低；或者到达任一序列的末尾。BLAST算法参数W、T和X确定了对齐的灵敏度和速度。BLAST程序默认使用的字长(W)为11、BLOSUM62评分矩阵(见Henikoff和Henikoff(1992)《美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sei.)》89,10915-10919)对齐(B)为50、期望值(E)为10、M＝5、N＝4，并比较两条串。

BLAST算法对两个序列之间的类似性执行统计分析；见例如Karlin和Altschul(1993)《美国国家科学院院报》90,5873-5787。BLAST算法提供的一种类似性度量是最小总概率(P(N))，其提供了两个多核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果该序列与另一个序列相比的最小总概率小于约1、优选地小于约0.1、更优选地小于约0.01、以及最优选地小于约0.001，则认为第一序列与第二序列类似。

变体序列通常相差至少1、2、5、10、20、30、50或更多个突变(其可以是氨基酸的取代、缺失或插入)。例如，可以有1至50、2至30、3至20或5至10个氨基酸取代、缺失或插入。经修饰的多肽通常可以优选地以剂量依赖性方式保留CXCL4结合活性、CXCL6结合活性、CXCL8结合活性、CXCL11结合活性、CXCL12结合活性、CCL2结合活性、CCL5结合活性、CCL7结合活性、CCL19结合活性、CCL21结合活性或CCL27结合活性。取代优选地为保守取代，例如根据下表。在第二列中的相同框中并且优选地在第三列中的相同行中的氨基酸可以彼此取代：

脂肪族	非极性	G A P
					I L V
	极性-不带电荷	C S T M
					N Q
	极性-带电荷	D E
					K R
芳香族		H F W Y

本发明使用的LINK_TSG6多肽的长度通常为至少10个，例如至少15、20、25、30、40、50、60、70、80、90或更多个氨基酸，至多100、150、200或250个氨基酸，只要其保留TSG-6的CXCL4结合活性、CXCL6结合活性、CXCL8结合活性、CXCL11结合活性、CXCL12结合活性、CCL2结合活性、CCL5结合活性、CCL7结合活性、CCL19结合活性、CCL21结合活性或CCL27结合活性即可。优选地，多肽包括SEQ ID NO:7所示的序列。SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、或SEQ ID NO:9的氨基酸序列的片段优选地含有残基，这些残基在Mahoney等人(2001)《生物化学杂志》276,22764-22771和Blundell等人(2003)《生物化学杂志》278,49261-49270中显示为对于透明质酸结合必不可少。SEQ ID NO:2或5的氨基酸序列的片段优选地含有SEQ ID NO:2或5的残基Lys-46和/或Tyr-47和/或Tyr-94和/或Phe-105和/或Tyr-113。最优选地，SEQ ID NO:2或5的片段含有SEQ ID NO:2或5的残基Lys-46、Tyr-47、Tyr-94、Phe-105和Tyr-113中的每一个。

SEQ ID NO:7的氨基酸序列的片段可以用于本发明。此类片段优选地含有SEQ IDNO:7的残基Lys-10和/或Tyr-11和/或Tyr-58和/或Phe-69和/或Tyr-77。最优选地，SEQ IDNO:7的片段含有SEQ ID NO:7的残基Lys-10、Tyr-11、Tyr-58、Phe-69和Tyr-77中的每一个。

SEQ ID NO:9的氨基酸序列的片段优选地含有SEQ ID NO:9的残基Lys-11和/或Tyr-12和/或Tyr-59和/或Phe-70和/或Tyr-78。最优选地，SEQ ID NO:9的片段含有SEQ IDNO:9的残基Lys-11、Tyr-12、Tyr-59、Phe-70和Tyr-78中的每一个。本发明使用的TSG-6多肽可以被化学修饰，例如翻译后修饰。例如，它们可以被糖基化、磷酸化，或包含经修饰的氨基酸残基。它们可以通过加入组氨酸残基以帮助其纯化或通过加入跨膜序列以促进插入细胞膜而被修饰。此类经修饰的多肽落入本文所用术语“多肽”的范围内。

用于确定TSG-6多肽结合HA、软骨素-4-硫酸盐、聚集蛋白聚糖、间-α-抑制剂(IαI)、双库尼茨抑制剂、多功能蛋白聚糖、硫酸皮肤素、正五聚蛋白-3、血小板反应蛋白-1、肝素/硫酸乙酰肝素、纤连蛋白和RANKL的能力的合适测定法是本领域众所周知的(Getting等人(2002)《生物化学杂志》277,51068-51076；Mahoney等人(2005)《生物化学杂志》280,27044-27055；Salustri等人(2004)《发展(Development)》131,1577-1586；Parkar等人(1997)《FEBS Lett.》410,413-417；Parkar等人(1998)《FEBS Lett.》428,171-176；Mahoney等人(2001)《生物化学杂志》276,22764-22771；Nentwich等人(2002)《生物化学杂志》211,15354-15362；Kuznetsova等人(2005)《生物化学杂志》280,30899-30908),Dyer等人(2014)《免疫学杂志(J.Immunol)》192,2177-2185；Dyer等人(2016)《生物化学杂志》291,12627-12640；以及Mahoney等人(2008)《生物化学杂志》283,25952-25962.

用于本发明的TSG-6多肽可以是基本上分离的形式。应当理解，多肽可以与载体或稀释剂混合，载体或稀释剂不会干扰多肽的预期目的并且仍然被认为是基本上分离的。用于本发明的多肽也可以是基本上纯化的形式，在这种情况下，其通常包含制剂中的多肽，其中制剂中多肽重量的超过50％、例如超过80％、90％、95％或99％是本发明的多肽。

用于本发明的LINK_TSG6多肽可以是天然或非天然存在的多肽。多肽可以分离自表达TSG-6多肽的任何合适的生物体。TSG-6多肽可以分离自人或另一种合适的哺乳动物，如灵长类、大鼠或小鼠。替代地，TSG-6多肽可以分离自鱼或两栖动物。用于本发明的多肽也可以制备为此类分离的多肽的片段。

此外，LINK_TSG6多肽也可以通过合成或重组方法制备。例如，重组LINK_TSG6多肽可以通过用包含与合适的控制序列可操作地链接的编码多肽的核苷酸序列的表达载体转染培养物中的细胞、培养细胞、提取和纯化由细胞产生的LINK_TSG6多肽来产生。用于多肽的重组生产的方法是本领域众所周知的(例如，Sambrook等人,2001,《分子克隆:实验室手册(Molecular Cloning:a laboratory manual)》,第3版,冷港实验室出版社)。优选地，LINK_TSG6多肽在细菌，如大肠杆菌中制备。优选地，LINK_TSG6多肽不是在CHO细胞或其它哺乳动物细胞中制备的。如本领域技术人员将理解的，在细菌如大肠杆菌中制备的蛋白和多肽将完全或基本上缺乏糖基化，而糖基化是在哺乳动物细胞如CHO细胞中制备的蛋白和多肽的共同特征。特别地，根据本公开的LINK_TSG6可能在Asn118(SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:5)上缺乏N-链糖基化。

用于本发明的LINK_TSG6多肽的氨基酸序列可以被修饰成包括非天然存在的氨基酸或增加化合物的稳定性。当通过合成方法生产多肽时，可以在生产期间引入此类氨基酸。也可以在合成或重组生产后修饰多肽。在一些方面，本文所述的LINK_TSG6多肽不包含多组氨酸标签，如6His标签。在一些方面，本文所述的LINK_TSG6多肽在多肽的C-端子处不包含多组氨酸标签。

用于本发明的LINK_TSG6多肽也可以使用D-氨基酸产生。在此类情况下，氨基酸将以C至N方向的反向序列链接。这是本领域中生产此类多肽的常规方法。

许多侧链修饰是本领域已知的，并且可以对LINK_TSG6多肽的侧链进行，条件是多肽保留角膜缺损愈合活性。

眼表病症

本公开涉及治疗或预防眼表病症。眼表病症包括干眼病(DED)、与糖尿病性角膜病变、神经营养性角膜病变、暴露性角膜病变或角膜缘缺乏相关联的持续性角膜上皮病变(不愈合性上皮缺损)；隐形眼镜/滴眼剂诱导的上皮糜烂；眼移植物抗宿主病(GVHD)；史蒂文斯-约翰逊综合征(SJS)；中毒性表皮坏死松解症(TEN)、青光眼患者眼表功能障碍、青光眼手术复发性角膜糜烂导致的角膜创伤、浅层点状角膜炎、上缘角膜结膜炎。

干眼病

本公开涉及治疗或预防干眼病。干眼病(也称为干眼综合征或干燥性角膜结膜炎)是患有干眼的病症，并且影响世界人口的7-33％。干眼病发生在泪液产生不足时(水性缺乏性干眼病)，或泪液蒸发过快时(蒸发性干眼病)。原因包括衰老(已知其引起泪腺萎缩和炎症)、感染、暴露于环境刺激物如烟雾、隐形眼镜使用、睑板腺功能障碍、过敏、怀孕、干燥综合征、维生素A缺乏、激光眼科治疗，或由于药物如抗组胺药、血压药物、激素替代疗法和一些抗抑郁药。在一些情况下，干眼病是由与眨眼率降低相关联的活动引起的，如使用屏幕，如计算机显示器、智能手机或平板、电视或驾驶。干眼病可能导致眼表上的微小磨损(即，角膜上皮缺损)。干眼病可能导致角膜上皮的病理变化，如鳞状化生和杯状细胞损失，在严重情况下导致角膜糜烂、溃疡、新血管形成和瘢痕形成，或变薄和穿孔。干眼病的诊断可能涉及标准化的干眼问卷(眼表疾病指数，或OSDI)，其是用于评估与干眼病相关的症状及其对视力的影响的12项量表。

干眼病是由眼表干燥损伤或泪腺炎性损害导致的疾病。它在临床上不同于其它创伤，如化学烧伤或由眼表直接暴露于化学品(如酒精)导致的创伤、物理或化学清创术、眼部钝器外伤、穿透性眼损伤或其它眼部创伤诱导的眼部病症，尽管这些创伤诱导的眼部病症可能导致后续患上干眼病。

干眼病的体征和症状包括刺激、发红、流泪、眼容易疲劳和视力模糊。这些体征和症状的范围从轻微和偶尔到严重和持续不等，并且如果不治疗可能导致角膜瘢痕形成。

如本文所公开的，肽LINK_TSG6可以用于治疗或预防干眼病。施用LINK_TSG6可以导致角膜上皮缺损的愈合、泪液产生的增加、炎症的抑制和/或结膜杯状细胞数量的增加/保持。角膜上皮缺损的愈合可以导致角膜上皮缺损的数量减少或角膜上皮缺损的大小减小。优选地，角膜上皮缺损的愈合导致包含角膜上皮缺损的角膜表面的比例降低。

角膜上皮缺损是上皮(最外角膜层)损失的区域，并且可能是由于机械创伤、角膜干燥、神经营养性角膜、手术后变化或任何其他各种病因。LINK_TSG6可以用于减少或修复角膜上皮缺损。角膜上皮缺损的存在与否可以通过评分来确定。角膜上皮缺损可以通过染色显现。例如，通过使用丽丝胺绿或荧光素染料。将染色剂应用到角膜上，并且将上皮缺损的区域染色，从而使缺损显现。

泪液产生的增加可以通过Schirmer泪液分泌试验或酚红棉线试验确定。

结膜中杯状细胞的数量可以通过印迹细胞学确定。将醋酸纤维素滤纸施压于结膜表面以收集浅层，并进行PAS染色以染色分泌粘蛋白的杯状细胞。在PAS染色的载玻片中计算杯状细胞的数量。

可以通过观察结膜发红或结膜上皮缺损来确定眼表炎症的存在与否或量。炎症可能引起角膜和结膜上皮的破坏。

可以在来自患者的泪液样品中确定炎性细胞因子的水平。可以使用Schirmer泪液测试条获得泪液样品。可以通过在碳酸氢铵和丙酮中培育泪液条而从该条带中提取核酸和/或蛋白。可以通过RT-PCR或ELISA定量或定性炎性细胞因子的水平。炎性细胞因子可以选自IFN-γ、TNF-α、IL-1β和IL-6。在一些情况下，可以通过免疫测定定量或定性炎性细胞因子。在一些情况下，使用“InflammaDry”试剂盒在人眼中以半定量方式(阳性、痕量或阴性)确定MMP9的水平。

角膜是眼的透明前部，覆盖虹膜、瞳孔和前房。角膜与前房和晶状体共同折射光，其中角膜占眼的总光功率的大约三分之二。虽然角膜对眼的聚焦能力的大部分有贡献，但其焦点是固定的。角膜具有对触摸、温度和化学品敏感的无髓神经末梢；触摸角膜引起无意识的反射以闭合眼睑。因为透明度是最重要的，所以健康的角膜在其内部没有或不需要血管。相反，氧溶解在泪液中，并且然后扩散到整个角膜中以保持其健康。类似地，营养物经由从泪液通过外表面和房水通过内表面的扩散而被输送。营养物也经由角膜神经提供的神经营养因子来提供。在人体中，角膜的直径约为11.5mm，中心厚度为0.5至0.6mm，并且周边厚度为0.6至0.8mm。透明性、无血管性、未成熟常驻免疫细胞的存在以及免疫特权使角膜成为非常特殊的组织。

本文公开的方法具体地涉及角膜上皮及其损害。角膜上皮是快速生长和容易再生的细胞的极薄(大约50μm)多细胞上皮组织层(非角质化分层鳞状上皮)，用泪液保持湿润。角膜上皮由上皮细胞组成并覆盖角膜的前部。它充当前线屏障以保护角膜，抵抗来自泪液的流体的自由流动，并防止细菌进入角膜和眼内部。角膜上皮的不规则或缺损会破坏空气/泪膜界面的光滑度，其是眼的总屈光力的最重要组分，从而降低视力。它与结膜上皮是连续的，并且由约6层细胞组成，细胞不断地在暴露层上脱落并通过在基底层中增殖而再生。在干眼病中，角膜上皮通常受损。

在一些方法中，增加泪液产生，或增加涂覆眼的泪膜的厚度。在一些情况下，泪液保留减少，使得泪液从眼快速蒸发。流泪(也称为泪出或泪溢)是响应于外部或内部刺激物的泪液的反射性分泌。泪液是可以用于响应于刺激而清洁和润滑眼的体液。在健康的哺乳动物眼中，角膜持续地保持湿润并由基底泪液滋养。它们润滑眼，并有助于清除灰尘。泪液含有水、粘蛋白、脂质、溶菌酶、乳铁蛋白、脂质运载蛋白、催泪蛋白、免疫球蛋白、葡萄糖、尿素、钠和钾。泪液中的一些物质(如溶菌酶)作为免疫系统的一部分对抗细菌感染。溶菌酶通过溶解某些细菌的外包衣中的一层(称为肽聚糖)来做到这一点。泪液是典型体液，具有类似于血浆的盐含量。通常，在24小时内，会分泌0.75至1.1克(0.03至0.04盎司常衡)的泪液；该速率随着年龄而减慢。此外，基底泪液由抗坏血酸盐、尿酸盐、半胱氨酸、谷胱甘肽和酪氨酸等抗氧化剂组成。抗坏血酸盐和尿酸盐构成泪液的一半。

第二种类型的泪液是由外来颗粒对眼的刺激导致的，或者是由眼环境(包括角膜、结膜或鼻粘膜)中存在刺激性物质(如洋葱蒸汽、香水和其它香料、催泪瓦斯或胡椒喷雾)导致的，刺激性物质触发眼神经中的TRP通道。它也可能发生在明亮的光线和对舌和嘴的热或辣的刺激下。它还与呕吐、咳嗽和打哈欠有关。这些反射性泪液试图洗掉可能与眼接触的刺激物。

本文公开的方法可以涉及泪液产生，如基底泪液或反射性泪液的保持或改善。

患者选择

根据本发明的方法，该方法可以附加地包含选择受试者以利用治疗有效量的包含LINK_TSG6或由LINK_TSG6组成的多肽进行治疗的步骤。

该方法可以包含评价受试者或患者的眼表病症如干眼病的证据或易感性，如角膜损害(例如角膜上皮病变的存在)、泪液产生不足和炎症(例如发红或肿胀，或存在炎症的一种或多种生物标志物，如促炎细胞因子TNFα、IL-1β、IFN-γ或IL-6和MMP9中的一种或多种)。

该方法可以涉及全面的眼科检查。这可以包括：评估病史，以确定患者的体征和症状，并记录可能导致干眼问题的任何一般健康问题、药物或环境因素；外部眼检查，包括眼睑结构和眨眼动态；使用亮光和放大倍数评价眼睑和角膜；或测量泪液数量和质量是否有任何异常。

可以例如通过用丽丝胺绿、玫瑰红或荧光素染料染色来确定个体患有角膜上皮缺损。

可以例如通过使用酚红棉线试验或Schirmer泪液分泌试验来确定个体的泪液产生不足。

在本文所述的一些情况下，待治疗的个体患有与眼表病症如干眼病的发病率增加相关联的病症。在一些情况下，该病症是自身免疫性病症。自身免疫性病症可能是干燥综合征。该个体可能先前已被诊断为患有干燥综合征。干燥综合征引起最严重形式的干眼病中的一种，其特征在于泪腺和眼表的炎性破坏。泪腺和眼表的炎症是干眼病的关键特征，并且在干眼病和干燥综合征的发病机理中起重要作用。在一些情况下，自身免疫性病症是类风湿性关节炎或糖尿病。在一些情况下，该个体患有1型糖尿病或2型糖尿病。

在一些情况下，眼表病症如干眼病不涉及炎症。与炎症无关的干眼病可能与泪膜不稳定性和/或泪液快速蒸发相关联。

治疗

本文公开了治疗或预防眼表病症如干眼病的方法。该方法可以涉及减轻或消除眼表病症如干眼病的一种或多种体征和症状，如角膜上皮缺损或病变的减少、泪液产生的增加、杯状细胞数量的增加或保持、一种或多种炎性细胞因子表达的减少，或发红或灼热感、疼痛或不适的减轻，或视觉体征和症状如视力丧失或视力模糊的改善。

该方法可以涉及治疗或预防角膜上皮缺损或病变。该方法可以导致角膜上皮病变的数量和/或程度的下降。与治疗前角膜上皮病变的数量和/或程度相比，该方法可以导致角膜上皮病变的数量和/或程度的下降。与未经治疗的对照组或用全长TSG-6(如包含SEQID NO:3或SEQ ID NO:5或者由SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5组成的TSG-6)治疗的对照组中的角膜上皮病变的数量和/或程度相比，该方法可以导致角膜上皮病变的数量和/或程度的下降。与对照组相比，角膜上皮病变的程度可以下降至少25％、至少50％、至少75％或至少100％。该治疗可以导致角膜表面0％、小于10％、小于20％、小于30％、小于40％或小于50％上的角膜上皮病变。

该方法可以涉及治疗或预防泪液产生不足。该方法可以导致泪液产生的增加，如泪液产生体积的增加。与治疗前的泪液体积相比，该方法可以导致产生的泪液体积增加。与未经治疗的对照组或用全长TSG-6(如包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5或者由SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5组成的TSG-6)治疗的对照组中的泪液体积相比，该方法可以导致产生的泪液体积增加。与对照组相比，泪液体积可以增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％或超过100％。

该方法可以涉及增加或保持杯状细胞的数量。在本上下文中，增加或保持杯状细胞的数量是指在用LINK_TSG6治疗后杯状细胞的数量没有下降至与在没有治疗的情况下，如在未经治疗的对照组中观察到的下降相同的程度。在一些情况下，与治疗之前的杯状细胞的数量相比，杯状细胞的数量增加或不变。

该方法可以涉及一种或多种炎性细胞因子的水平的降低。例如，该方法可以导致对应于一种或多种炎性细胞因子的核酸水平的降低。在一些情况下，该方法导致炎性细胞因子蛋白水平的降低。炎性细胞因子可以选自TNFα、IL6、IFN-γ和IL-1β。与治疗前的水平相比，或与未经治疗的对照组相比，水平可以降低5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。

治疗可以导致眼表病症如干眼病的体征和症状的完全消退。

预防可以指不出现眼表病症如干眼病的体征和症状，或者它可以指眼表病症如干眼病的体征和症状发展到比没有治疗时更低的程度。

本文所述的方法可以涉及LINK_TSG6的局部施用。LINK_TSG6可以局部施用于眼(眼部递送)，优选地施用于角膜，如角膜表面。在一些情况下，LINK_TSG6作为滴眼剂施用。LINK_TSG6可以配制成局部液体制剂，如滴眼剂。LINK_TSG6可以通过悬浮液或乳液配制。

优选地以治疗有效量施用。LINK_TSG6的治疗有效量可以根据各种参数来确定，特别是根据多肽；待治疗患者的年龄、体重和病症；施用途径；以及所需的方案。同样，医生将能够确定任何特定患者所需的施用途径和剂量。LINK_TSG6的治疗有效量是有效改善眼表病症如干眼病的一种或多种体征和症状的量，如降低角膜损害或角膜病变的水平、提高泪腺功能，或增加泪腺泪液产生，或减轻眼中的炎症如角膜中的炎症。

在一些情况下，LINK_TSG6的施用为每只眼12μg至15μg，如10μg至20μg，或12μg至15μg。在一些情况下，LINK_TSG6的施用为每只眼约8μg、每只眼约9μg、每只眼约10μg、每只眼约11μg、每只眼约12μg、每只眼约13μg、每只眼约14μg或每只眼约15μg。

在一些情况下，需要更高的剂量。在此类情况下，LINK_TSG6的施用为每只眼约120μg至150μg。在一些情况下，LINK_TSG6的剂量为每只眼至少80μg、至少90μg、至少100μg、至少110μg、至少120μg、至少130μg或至少140μg。在一些情况下，LINK_TSG6的剂量为每只眼小于170μg、小于160μg、小于150μg、小于140μg、小于130μg或小于120μg。

在一些情况下，需要甚至更高的剂量。例如，LINK_TSG6的剂量可以是至少170μg、至少180μg、至少190μg、至少200μg、至少210μg、至少220μg、至少230μg、至少240μg、至少250μg、至少260μg、至少270μg、至少280μg、至少290μg、至少300μg、至少320μg、至少340μg、至少360μg、至少380μg、至少400μg、至少420μg、至少440μg、至少460μg、至少480μg、至少500μg、至少550μg、至少600μg、至少650μg、至少700μg、至少750μg、至少800μg、至少900μg、至少1mg、至少1.1mg、至少1.2mg、至少1.3mg、至少1.4mg、至少1.5mg、至少1.6mg或至少1.7mg。

施用可以是每天一次、每天两次、每天三次、每天四次、每天五次、每天六次、每天七次、每天八次、每天九次、每天十次或每天十次以上。施用优选地为每天两次。在一些优选的情况下，施用为每天两次以上，如每天三次或四次。在一些优选的情况下，施用为少于每天四次，或少于每天三次，或每天两次或每天一次。在特别优选的情况下，施用为每天两次。在一些情况下，治疗包含每天一次施用LINK_TSG6多肽。在一些情况下，治疗包含以低于每天一次的频率施用LINK_TSG6多肽，如每两天一次、每三天一次、每周一次或每两周一次。

本发明的多肽的施用的剂量、时间表、模式或时程可以根据对治疗的反响应而修改。例如，如果对治疗的响应未达最佳，则可以增加施用的剂量和/或频率和/或施用的时程。相反，如果对治疗的响应优于预期，则可以降低施用的剂量和/或频率和/或施用的时程。

在一些情况下，治疗涉及LINK_TSG6与人工泪液、泼尼松龙、环孢菌素、利非斯特(Xiidra^TM)或其任何组合的共同施用。施用可以是顺序的或同时的。优选地，当LINK_TSG6与泼尼松龙、环孢菌素、利非斯特(Xiidra^TM)或人工泪液中的一种或多种共同施用时，施用是同时的或基本上同时的。优选地，共同施用的试剂经由相同的施用途径施用，如通过局部施用至眼。

可以在施用治疗有效量的LINK_TSG6之前、期间或之后的任何时间点评价受试者的眼表病症如干眼病。在一些实施例中，本发明的方法包含开始施用，如上评价受试者，以及基于该评价继续、改变或中断进一步施用。在一些实施例中，改变施用包含提高或降低施用的剂量和/或频率和/或时程。

制剂

适用于眼部施用的制剂包括滴眼剂，其中，活性化合物溶解或悬浮在合适的载体，特别是活性化合物的水性溶剂中。在优选的制剂中，LINK_TSG6溶解在盐水溶液中。在一些制剂中，LINK_TSG6溶解在PBS(磷酸盐缓冲盐水)中。如本文所述，本发明人已经发现，与全长TSG6相比，LINK_TSG6多肽在盐水中具有高溶解度。本文描述了包含高浓度LINK_TSG6的组合物，具体地是药物组合物。

该药物组合物可以包含溶解在盐水中的LINK_TSG6多肽。该药物组合物可以包含溶解在磷酸盐缓冲盐水中的LINK_TSG6多肽。在一些方面，该药物组合物包含至少2000μg/ml、2100μg/ml、2200μg/ml、2300μg/ml、2400μg/ml、2500μg/ml、2600μg/ml、2700μg/ml、2800μg/ml、2900μg/ml、3000μg/ml、3100μg/ml、3200μg/ml、3300μg/ml或超过3300μg/ml的LINK_TSG6。优选地，该药物组合物包含至少2000μg/ml的LINK_TSG6。

本文公开的滴眼剂制剂还可以包含防腐剂、抗氧化剂、稳定剂、张度调节剂、粘度调节剂或缓冲剂中的一种或多种。优选地，该滴眼剂制剂是无菌滴眼剂制剂。在一些情况下，该滴眼剂制剂含有约240μg/ml至约300μg/ml的LINK_TSG6。此类制剂可以用于每滴递送约12μg至约15μg的LINK_TSG6。每个液滴可以为约50μl。该滴眼剂制剂可以包含200μg/ml至350μg/ml、200μg/ml至320μg/ml、220μg/ml至320μg/ml，或240μg/ml至300μg/ml。优选地，该滴眼剂制剂包含约240μg/ml至约300μg/ml。该滴眼剂制剂可以含有至少200μg/ml、至少220μg/ml、至少230μg/ml、至少240μg/ml、至少250μg/ml、至少260μg/ml、至少270μg/ml、至少280μg/ml、至少290μg/ml、至少300μg/ml、至少310μg/ml、至少320μg/ml或超过320μg/ml的LINK_TSG6多肽。

在一些情况下，需要更高剂量的制剂。此类制剂可以含有2400至3000μg/ml的LINK_TSG6。此类制剂可以用于每滴递送约120μg至约150μg的LINK_TSG6。该滴眼剂制剂可以包含2000μg/ml至3500μg/ml、2000μg/ml至3200μg/ml、2200μg/ml至3200μg/ml，或2400μg/ml至3000μg/ml。优选地，该滴眼剂制剂包含约2400μg/ml至约3000μg/ml。该滴眼剂制剂可以含有至少2000μg/ml、至少2200μg/ml、至少2300μg/ml、至少2400μg/ml、至少2500μg/ml、至少2600μg/ml、至少2700μg/ml、至少2800μg/ml、至少2900μg/ml、至少3000μg/ml、至少3100μg/ml、至少3200μg/ml或超过3200μg/ml的LINK_TSG6多肽。

在一些情况下，该滴眼剂制剂还可以包含人工泪液。人工泪液是润滑滴眼剂。人工泪液可以含有一种或多种选自羧甲基纤维素、聚乙烯醇、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、透明质酸、水、盐和聚合物如聚乙二醇或聚丙二醇的试剂。

在一些情况下，该滴眼剂制剂还可以包含泼尼松龙、环孢菌素、利非斯特(Xiidra^TM)或泼尼松龙和环孢菌素的组合、泼尼松龙和利非斯特(Xiidra^TM)的组合、环孢菌素和利非司特(Xiidra^TM)的组合，或泼尼松龙、环孢菌素和利非斯特(Xiidra^TM)的组合。

可以使用由被认为安全和有效的材料组成的药学上可接受的“载体”来制备药物组合物。“药学上可接受的”是指“通常被认为是安全的”的分子实体和组合物，例如，当施用于人体时，它们是生理上可忍受的，并且通常不产生过敏或类似的不良反应，如肠胃不适、味觉丧失或改变(味觉丧失)等。在一些实施例中，该术语是指由美国联邦或州政府的管理机构批准的分子实体和组合物，如联邦食品、药品和化妆品法案的第204和409节下的GRAS清单，其经过美国食品和药物管理局的上市前审查和批准，或类似清单、美国药典或另一个普遍认可的针对用于动物，并且更具体地用于人的药典。

术语“载体”是指稀释剂、粘合剂、润滑剂和崩解剂。本领域技术人员熟悉此类药物载体和使用此类载体配制药物组合物的方法。

本文提供的药物组合物可以包括一种或多种赋形剂，例如溶剂、增溶剂、悬浮剂、缓冲剂、等渗剂、抗氧化剂或抗微生物防腐剂。当使用时，组合物的赋形剂不会不利地影响活性成分(即组合物中使用的LINK_TSG6)的稳定性、生物有效性、安全性和/或功效。因此，本领域技术人员将理解，在所提供的组合物中，剂型的任何组分之间没有不相容性。赋形剂可以选自由缓冲剂、增溶剂、张度剂、螯合剂、抗氧化剂、抗微生物剂和防腐剂组成的组。软膏通常由活性化合物和石蜡或水混溶性软膏基质制备。

霜剂通常由活性化合物和水包油霜剂基质制备。如果需要，霜剂基质的水相可以包括例如至少约30％w/w的多元醇，即，具有两个或更多个羟基的醇，如丙二醇、丁-1,3-二醇、甘露醇、山梨醇、甘油和聚乙二醇及其混合物。局部制剂可以理想地包括增强活性化合物通过皮肤或其它受影响区域的吸收或渗透的化合物。此类皮肤渗透增强剂的实例包括二甲亚砜和相关类似物。

乳液通常由活性化合物和油相制备，油相可以任选地仅包含乳化剂(也称为利泄剂)，或者其可以包含至少一种乳化剂与脂肪或油或与脂肪和油两者的混合物。优选地，亲水性乳化剂与充当稳定剂的亲脂性乳化剂包括在一起。还优选地包括油和脂肪两者。含或不含稳定剂的乳化剂共同构成所谓的乳化蜡，并且蜡与油和/或脂肪共同构成所谓的乳化软膏基质，其形成霜剂制剂的油性分散相。

合适的乳化剂和乳液稳定剂包括吐温60(Tween 60)、司盘80(Span 80)、十六醇十八醇混合物、肉豆蔻醇、单硬脂酸甘油酯和十二烷基硫酸钠。用于制剂的合适的油或脂肪的选择是基于实现所需的化妆品特性，因为活性化合物在可能用于药物乳液制剂的大多数油中的溶解度可能非常低。因此，霜剂应当优选地为非油性的、非染色的和可洗涤的产品，具有合适的稠度以避免从管或其它容器中泄漏。可以使用直链或支链的一元或二元烷基酯，如二异己二酸酯、硬脂酸异十六烷酯、椰子脂肪酸丙二醇二酯、肉豆蔻酸异丙酯、油酸癸酯、棕榈酸异丙酯、硬脂酸丁酯、棕榈酸2-乙基己酯或称为Crodamol CAP的支链酯的共混物，后三种是优选的酯。根据所需的特性，这些可以单独使用或组合使用。替代地，可以使用高熔点脂质如白软石蜡和/或液体石蜡或其它矿物油。

在前面的描述或所附权利要求或附图中所公开的特征，以它们的具体形式或者在用于执行所公开功能的手段，或者用于获得所公开结果的方法或工艺方面，视情况，可以单独地或者以此类特征的任意组合，被用于以其各种形式实现本发明。

虽然已经结合上述示范性实施例描述了本发明，但是当给出本公开时，许多等效的修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，上述本发明的示范性实施例被认为是说明性的而非限制性的。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所描述的实施例进行各种改变。

为了避免任何疑问，本文提供的任何理论解释均是为了提高读者的理解。本发明人不希望受任何这些理论解释的束缚。

本文使用的任何章节标题均仅出于组织目的，并且不应被解释为限制所描述的主题。

在本说明书(包括所附权利要求)中，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”和“包括(include)”以及如“包含(comprises)”、“包含(comprising)”和“包括(including)”的变型应当被理解为暗示包括所陈述的整体或步骤或者整体或步骤的组，但不排除任何其它整体或步骤或者整体或步骤的组。

必须注意，如在本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括复数形式，除非上下文另有明确规定。范围在本文中可以表达为从“约”一个特定值，和/或至“约”另一个特定值。当表达此类范围时，另一个实施例包括从一个特定值和/或到另一个特定值。类似地，在通过使用先行词“约”将值表达为近似值时，应当理解，该特定值形成另一个实施例。与数值相关的术语“约”是任选的并且是指例如+/-10％。

实例

实例1：LINK_TSG6比全长TSG-6更易溶

使用紫外分光光度法和动态光散射(DLS)在一定浓度范围内比较全长TSG-6和LINK_TSG6在PBS中的溶解度和聚集状态。LINK_TSG6在2mg/ml时完全溶解，并且在0.4、0.8、1.6或3.2mg/ml时未显示聚集。全长蛋白的溶解度低得多，在0.4、0.8、1.6和3.2mg/ml时只有少于40％的蛋白保留在溶液中。全长蛋白也在0.2、0.40.8、1.6和3.2mg/ml时高度聚集。全长TSG-6在1.6和3.2mg/ml时的DLS测量值超出范围，表明形成了大于2500万道尔顿的聚集体。

实例2：LINK TSG6改善小鼠模型中干眼病的体征和症状

局部TSG-6先前已显示为在炎症介导的干眼病中与环孢菌素滴眼剂一样有效(Kim等人,2016)。为了测试LINK_TSG6多肽是否可以用于该适应症，我们研究了其在原发性眼部干燥综合征(无糖尿病的自发性干眼病)的NOD.B10小鼠模型中的作用。

将NOD.B10.H2^b小鼠(12周龄，杰克森实验室(Jackson Lab))(原发性眼部干燥综合征(无糖尿病的干眼病)的模型)用LINK_TSG6局部施用进行处理，持续7天。将C57BL/6小鼠用作阴性对照组，因为它们不患有自发性干眼。

对小鼠局部应用在10μl PBS中的1μg LINK_TSG6，每天4次(QID)进行处理，持续7天。通过腹膜内注射唑拉西泮-替来他明

法国卡罗的维克公司(Virbac，Carros，France))对小鼠进行麻醉，并使用移液管施用10μl LINK_TSG6或PBS。如下将小鼠随机分配至处理组：

1)第1组(阴性对照组)：C57BL/6小鼠，12周龄(n＝6，12只眼)，未经处理

2)第2组(阳性对照组)：NOD.B10，12周龄(n＝6，6只眼)+PBS 10μl QID

3)第3组(实验组)：NOD.B10，12周龄(n＝8，8只眼)+LINK_TSG6 1μg(在10μl PBS中)QID。

为了评估处理对干眼病的作用，我们进行以下测定：

1)通过对缺损部位的活体染色(用丽丝胺绿)和评分测定角膜上皮缺损。在将一滴3％丽丝胺绿B应用到小鼠的下外侧结膜囊之后，由两名眼科医师按照以下眼部染色评分系统以盲法方式对角膜表面的染料染色进行分级：无点状染色评分为0；少于三分之一的角膜表面被染色时评分为1；三分之二或更少被染色时评分为2；以及超过三分之二被染色时评分为3；

2)通过酚红棉线试验检查泪腺泪液产生；

3)角膜和眶内腺中通过实时RT-PCR测定炎性细胞因子表达；以及

4)测定PAS染色的结膜穹窿上的结膜杯状细胞计数。在来自同一动物的眼的四个不同切片中，每100μm对PAS染色的细胞的数量进行计数，并且在每只眼中将平均计数确定为杯状细胞密度。

如图2A所示，在LINK_TSG6处理后，角膜上皮缺损显著减少(p<0.01)。在PBS处理的组和Link_TSG6处理的组之间，角膜上皮缺损有显著改善(p<0.001)。

如图2B所示，通过LINK_TSG6处理，泪液产生显著增加(p<0.01)。在PBS处理的组和LINK_TSG6处理的组之间，泪液产生有显著改善(p<0.001)。

图2C示出了LINK_TSG6处理显著抑制角膜和眶内腺中的IFN-γ、TNF-α和IL-1β的mRNA水平。LINK_TSG6处理的眼具有与对照组C57BL/6小鼠类似的细胞因子水平。

图2D示出了LINK_TSG6处理显著增加结膜杯状细胞的数量(这些细胞在泪液中产生粘蛋白组分)。

总之，这些结果证明LINK_TSG6在NOD.B10干眼小鼠中显著抑制炎症、减少角膜上皮缺损，并且增加泪液产生以及增加结膜杯状细胞。

实例3：LINK TSG6对干眼病的作用是剂量依赖性的

我们有兴趣了解在实施例1中观察到的作用是否是剂量依赖性的。为此，我们向12周龄的NOD.B10.H2b小鼠(杰克逊实验室)局部QID应用在5μl PBS中的1、0.1或0.01μg的LINK_TSG6，持续7天。

将小鼠随机分配至以下处理组：

1)第1组(阴性对照组)：C57BL/6小鼠，12周龄(n＝6，12只眼)未经处理

2)第2组(阳性对照组)：NOD.B10(n＝8，8只眼)+PBS 5μl QID

3)第3组(实验组)：NOD.B10(n＝8，8只眼)+LINK_TSG6 1μg(在5μl PBS中)QID

4)第4组(实验组)：NOD.B10(n＝8，8只眼)+LINK_TSG6 0.1μg QID

5)第5组(实验组)：NOD.B10(n＝8，8只眼)+LINK_TSG6 0.01μg QID

按照实例1确定处理的作用。

如图3A所示，在丽丝胺绿染色的角膜中定量角膜上皮缺损。LINK_TSG6 1μg和0.1μg可有效减少角膜上皮缺损，但LINK_TSG6 0.01μg未显著改善角膜上皮缺损。

在图3B中，酚红棉线试验表明LINK_TSG6 1μg和0.1μg可有效增加泪液产生量，但LINK_TSG6 0.01μg未显著提高泪液产生量。

如图3C和D所示，所测试的LINK_TSG6的最高剂量1μg在抑制TNF-α表达方面最有效。

总之，这些结果证明了局部应用LINK_TSG6多肽(1μg最有效并且0.01μg最不有效)对干眼参数的改善是剂量依赖性的。

使用较高剂量的LINK_TSG6也观察到这些作用。如图4A所示，与PBS处理的小鼠相比，较高剂量(1μg和10μg)的LINK_TSG6表现出显著较少的角膜上皮损害。在最高剂量时，许多LINK_TSG6处理的眼没有角膜病变(评分为0)，这与未经处理的阴性对照组C57BL/6小鼠相同。这显示LINK_TSG6可以促进上皮病变的愈合或修复。

还在泪液产生(图4B—注意，即使是最低测试剂量的LINK_TSG6也对泪液产生具有显著影响)、炎症(图4C)和结膜杯状细胞数量(图4D)方面观察到剂量依赖性响应。

实例4：全长TSG-6蛋白和LINK_TSG6对干眼病的作用的比较

我们的实验揭示了LINK_TSG6多肽在治疗干眼病方面是有效的。我们有兴趣了解其与全长(FL)TSG-6(FL TSG6)比较如何。我们比较了每天2次(BID)施用的等效摩尔剂量的FL TSG6和LINK_TSG6。

如下将12周龄的NOD.B10小鼠和C57BL/6小鼠随机分配至处理组：

1)第1组NOD.B10+PBS 5μl BID，持续7天(阳性对照组)；

2)第2组NOD.B10+全长TSG-6(FL TSG6)(安迪生物(R&D Systems))5μl(3.27、0.327、0.0327μg)BID，持续7天；

3)第3组NOD.B10+LINK_TSG6 5μl(1、0.1、0.01μg)BID，持续7天；以及

4)第4组C57BL/6小鼠(阴性对照组，无干眼)。

按照实例2选择0.01、0.1和1.0微克LINK_TSG6的剂量。使用质谱分析确定重组人TSG-6(安迪生物)的分子量为35.7kDa。基于该确定，我们计算了全长TSG-6(FL TSG6)的0.037、0.37和3.7微克的等摩尔剂量。

按照先前的实例确定干眼病的体征和症状，即：

1)对角膜上皮损害的丽丝胺绿染色和评分。在将一滴3％丽丝胺绿B应用到小鼠的下外侧结膜囊之后，由两名眼科医师按照以下眼部染色评分系统以盲法方式对角膜表面的染料染色进行分级：无点状染色评分为0；痕量染色评分为0.5；少于三分之一的角膜表面被染色时评分为1；三分之二或更少被染色时评分为2；以及超过三分之二被染色时评分为3；

2)泪液分泌的酚红棉线试验

3)组织学(结膜PAS染色、泪腺CD3免疫染色)

如图5A所示，与等摩尔浓度的全长TSG-6相比，LINK_TSG6导致角膜上皮病变的显著减少。

图5B、5C和5D示出了与等摩尔剂量(3.27μg)的全长TSG-6相比，最高测试剂量1μgLINK_TSG6引起泪液产生增加、杯状细胞保持以及眶内腺中CD3染色的炎性病灶的数量减少。

实例5：评价干燥损伤诱导的干眼模型中的LINK_TSG6并与丽眼达进行比较。

在证明了LINK_TSG6在原发性眼部干燥综合征(无糖尿病的自发性干眼病)的NOD.B10小鼠模型中的功效之后，我们有兴趣了解LINK_TSG6在治疗患有普遍的环境蒸发性干眼症的个体方面是否也有效。

我们使用的干燥模型可以更好地模拟蒸发性干眼，与较不普遍的干燥综合征样干眼相比，蒸发性干眼是更普遍的干眼形式。将7周龄的C57BL/6小鼠保持在干燥室中，并且每天三次腹膜内注射东莨菪碱，持续10天，以诱导干燥损伤。使来自电风扇的气流通过筛网进入笼中，持续24小时，并且笼内的湿度保持在30至35％。如下将小鼠分成处理组：

1)无干燥损伤(阴性对照组，2只小鼠，4只眼)

2)第1组(5只小鼠，10只眼)：干燥损伤+PBS 5μl BID，持续10天(阳性对照组)

3)第2组(5只小鼠，10只眼)：干燥损伤+LINK_TSG6 0.1μg(在5μl PBS中)BID，持续10天

4)第3组(5只小鼠，10只眼)：干燥损伤+LINK_TSG6 1μg(在5μl PBS中)BID，持续10天

5)第4组(5只小鼠，10只眼)：干燥损伤+LINK_TSG6 10μg(在5μl PBS中)BID，持续10天

6)第5组(5只小鼠，10只眼)：干燥损伤+丽眼达(0.05％环孢菌素A)5μl BID，持续10天

10天后，如下评价干眼的体征和症状；

1)角膜上皮损害的荧光素染色和评分(C57BL/6小鼠为黑色，并且荧光素染色比丽丝胺绿更利于可视化)

2)泪液分泌的酚红棉线试验

3)组织学(结膜PAS染色、泪腺CD3免疫染色)

4)眼表和泪腺的分子测定(炎性细胞因子的实时RT-PCR)

干燥损伤在C57BL/6小鼠中显著诱导角膜上皮缺损(p<0.01)，如图6A(干燥前和处理前，示出选择用于处理的动物在研究开始时没有角膜病变)和6B(干燥后和处理后)所示，并且LINK_TSG6 1μg在干燥下有效减少角膜上皮缺损(p<0.001)。有趣的是，丽眼达在该模型中未显著减少角膜上皮缺损，并且LINK_TSG6 1μg在减少角膜上皮缺损方面优于丽眼达(p<0.05)。

如图6C(干燥前和处理前)和6D(干燥后和处理后)所示，干燥损伤显著降低C57BL/6小鼠中的泪液产生(p<0.0001)。与原发性眼部干燥综合征的小鼠模型一样，LINK_TSG6 1μg和10μg在干燥下有效地保持泪液产生(p<0.0001)，并且甚至0.1μg的LINK_TSG6也保持泪液产生(p＝0.0552)。尽管丽眼达在干燥下有效保持泪液产生(p<0.05)，但有趣的是，LINK_TSG6 1μg在保持泪液产生方面优于丽眼达(p<0.001)。

众所周知，Th1和Th17细胞在干燥应激下在引流颈淋巴结(DLN)中增加，并且这些细胞是诱导干眼的原因。因此，我们对宫颈引流淋巴结进行了FACS分析，以确定Th1(IFN-γ⁺CD4⁺细胞)和Th17细胞(IL17A⁺CD4⁺细胞)对各种处理的响应水平。如图6E和6F所示，LINK_TSG6还有效抑制颈部淋巴结中的Th1和Th17细胞。丽眼达没有此类抑制作用。

因此，这些数据表明LINK_TSG6在治疗干眼病方面，包括在患有普遍的环境蒸发性干眼的个体中也是有效的。

实例6：LINK TSG6在已确立的干燥损伤诱导的干眼病的评价

在证明了LINK_TSG6在治疗干眼病方面，包括在患有普遍的环境蒸发性干眼的个体中是有效的之后，我们有兴趣了解LINK_TSG6在治疗患有确立的干眼的个体方面是否也是有效的，以逆转该疾病的影响。

我们使用与实例5中相同的干燥模型，这次允许干眼病在用LINK_TSG6处理之前确立一周。在对眼表施加干燥损伤后，将LINK_TSG6应用于眼表。然后将小鼠保持在干燥室中，用东莨菪碱注射，持续10天，在此期间施用处理。

将7周龄的C57BL/6小鼠保持在干室中，并且每天三次腹膜内注射东莨菪碱，持续7天，以确立干眼。如下将小鼠分成处理组：

1)无干燥损伤(阴性对照组，2只小鼠，4只眼)

2)第1组(5只小鼠，10只眼)：干燥损伤+PBS 5μl BID，持续10天(阳性对照组)

3)第2组(5只小鼠，10只眼)：干燥损伤+LINK_TSG6 0.1μg(在5μl PBS中)BID，持续10天

4)第3组(5只小鼠，10只眼)：干燥损伤+LINK_TSG6 1μg(在5μl PBS中)BID，持续10天

5)第4组(5只小鼠，10只眼)：干燥损伤+LINK_TSG6 10μg(在5μl PBS中)BID，持续10天。

按照先前的实例确定干眼病的体征和症状，即：

1)角膜上皮损害的荧光素染色和评分(B6小鼠为黑色，并且荧光素染色比丽丝胺绿更利于可视化)；

2)泪液分泌的酚红棉线试验；以及

3)组织学(结膜PAS染色、泪腺CD3免疫染色)。

如图7A所示，LINK_TSG6在全部测试浓度下均可有效减少角膜上皮缺损。如图7B所示，在全部测试浓度下，LINK_TSG6有效增加水性泪液产生。即使是最低测试浓度也观察到显著变化。

图7C证明，与对照组相比，1μg和10μg的LINK_TSG6导致杯状细胞数量增加，恢复至与在不存在干燥的情况下观察到的水平相当的水平。

另外，如图7D所示，用LINK_TSG6处理有效抑制眼表中MMP-9mRNA的水平。

因此，这些数据表明，LINK_TSG6除了降低干燥损伤的严重程度之外，还有效治疗已确立的干眼病。这些数据支持LINK_TSG6用于治疗患有干眼症的个体，包括患有普遍的环境蒸发性干眼病的个体。

实例7：评价干眼模型中的LINK_TSG6并与丽眼达进行比较。

在证明了LINK_TSG6在治疗蒸发性干眼方面相对于丽眼达的优越性之后，我们有兴趣在原发性眼部干燥综合征(无糖尿病的自发性干眼病)的NOD.B10小鼠模型(如实例4中所使用的)中比较LINK_TSG6与丽眼达。

如下将12周龄的NOD.B10小鼠和C57BL/6小鼠随机分配至处理组：

1)第1组C57BL/6小鼠(阴性对照组，无干眼/干燥)。

2)第2组NOD.B10+PBS 5μl BID，持续7天(阳性对照组)；

3)第3组NOD.B10+LINK_TSG6 5μl(0.1、1、10μg/5μl)BID，持续7天；以及

4)第4组NOD.B10+丽眼达5μl BID，持续7天；

按照先前的实例确定干眼病的体征和症状，即：

1)对角膜上皮损害的丽丝胺绿染色和评分。

2)泪液分泌的酚红棉线试验

3)组织学(结膜PAS染色、泪腺CD3免疫染色)

如图8B和D所示，并且与我们在实例4中的研究一致，LINK_TSG6导致原发性眼部干燥综合征的NOD.B10小鼠模型中角膜上皮病变的显著减少和泪液产生的增加。另外，与丽眼达相比，在1和10μg剂量下，LINK_TSG6均比丽眼达促进更大程度的愈合，导致角膜病变减少、杯状细胞数量的保持和眶内腺中CD3染色的炎性病灶的数量减少。这显示，即使在最低测试剂量下，LINK_TSG6在治疗原发性眼部干燥综合征(无糖尿病的自发性干眼病)的NOD.B10小鼠模型中的干眼方面也比丽眼达更好，如先前在预防患上蒸发性干眼病或治疗已确立的蒸发性干眼病中所观察到的。这些数据进一步支持LINK_TSG6用于治疗患有干眼症的个体。

序列表

<110> 曼彻斯特大学

首尔国立大学医院

<120> 干眼病的治疗

<130> 007667538

<150> GB1910645.9

<151> 2019-07-25

<160> 9

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 1440

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 对人TSG-6全长Q144同种异型变体进行编码的核酸序列

<400> 1

cagtcacatt tcagccactg ctctgagaat ttgtgagcag cccctaacag gctgttactt 60

cactacaact gacgatatga tcatcttaat ttacttattt ctcttgctat gggaagacac 120

tcaaggatgg ggattcaagg atggaatttt tcataactcc atatggcttg aacgagcagc 180

cggtgtgtac cacagagaag cacggtctgg caaatacaag ctcacctacg cagaagctaa 240

ggcggtgtgt gaatttgaag gcggccatct cgcaacttac aagcagctag aggcagccag 300

aaaaattgga tttcatgtct gtgctgctgg atggatggct aagggcagag ttggataccc 360

cattgtgaag ccagggccca actgtggatt tggaaaaact ggcattattg attatggaat 420

ccgtctcaat aggagtgaaa gatgggatgc ctattgctac aacccacacg caaaggagtg 480

tggtggcgtc tttacagatc caaagcaaat ttttaaatct ccaggcttcc caaatgagta 540

cgaagataac caaatctgct actggcacat tagactcaag tatggtcagc gtattcacct 600

gagtttttta gattttgacc ttgaagatga cccaggttgc ttggctgatt atgttgaaat 660

atatgacagt tacgatgatg tccatggctt tgtgggaaga tactgtggag atgagcttcc 720

agatgacatc atcagtacag gaaatgtcat gaccttgaag tttctaagtg atgcttcagt 780

gacagctgga ggtttccaaa tcaaatatgt tgcaatggat cctgtatcca aatccagtca 840

aggaaaaaat acaagtacta cttctactgg aaataaaaac tttttagctg gaagatttag 900

ccacttataa aaaaaaaaaa aaggatgatc aaaacacaca gtgtttatgt tggaatcttt 960

tggaactcct ttgatctcac tgttattatt aacatttatt tattattttt ctaaatgtga 1020

aagcaataca taatttaggg aaaattggaa aatataggaa actttaaacg agaaaatgaa 1080

acctctcata atcccactgc atagaaataa caagcgttaa cattttcata tttttttctt 1140

tcagtcattt ttctatttgt ggtatatgta tatatgtacc tatatgtatt tgcatttgaa 1200

attttggaat cctgctctat gtacagtttt gtattatact ttttaaatct tgaactttat 1260

aaacattttc tgaaatcatt gattattcta caaaaacatg attttaaaca gctgtaaaat 1320

attctatgat atgaatgttt tatgcattat ttaagcctgt ctctattgtt ggaatttcag 1380

gtcattttca taaatattgt tgcaataaat atccttgaac acaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1440

<210> 2

<211> 277

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人TSG-6全长Q144同种异型变体的氨基酸序列

<400> 2

Met Ile Ile Leu Ile Tyr Leu Phe Leu Leu Leu Trp Glu Asp Thr Gln

1 5 10 15

Gly Trp Gly Phe Lys Asp Gly Ile Phe His Asn Ser Ile Trp Leu Glu

20 25 30

Arg Ala Ala Gly Val Tyr His Arg Glu Ala Arg Ser Gly Lys Tyr Lys

35 40 45

Leu Thr Tyr Ala Glu Ala Lys Ala Val Cys Glu Phe Glu Gly Gly His

50 55 60

Leu Ala Thr Tyr Lys Gln Leu Glu Ala Ala Arg Lys Ile Gly Phe His

65 70 75 80

Val Cys Ala Ala Gly Trp Met Ala Lys Gly Arg Val Gly Tyr Pro Ile

85 90 95

Val Lys Pro Gly Pro Asn Cys Gly Phe Gly Lys Thr Gly Ile Ile Asp

100 105 110

Tyr Gly Ile Arg Leu Asn Arg Ser Glu Arg Trp Asp Ala Tyr Cys Tyr

115 120 125

Asn Pro His Ala Lys Glu Cys Gly Gly Val Phe Thr Asp Pro Lys Gln

130 135 140

Ile Phe Lys Ser Pro Gly Phe Pro Asn Glu Tyr Glu Asp Asn Gln Ile

145 150 155 160

Cys Tyr Trp His Ile Arg Leu Lys Tyr Gly Gln Arg Ile His Leu Ser

165 170 175

Phe Leu Asp Phe Asp Leu Glu Asp Asp Pro Gly Cys Leu Ala Asp Tyr

180 185 190

Val Glu Ile Tyr Asp Ser Tyr Asp Asp Val His Gly Phe Val Gly Arg

195 200 205

Tyr Cys Gly Asp Glu Leu Pro Asp Asp Ile Ile Ser Thr Gly Asn Val

210 215 220

Met Thr Leu Lys Phe Leu Ser Asp Ala Ser Val Thr Ala Gly Gly Phe

225 230 235 240

Gln Ile Lys Tyr Val Ala Met Asp Pro Val Ser Lys Ser Ser Gln Gly

245 250 255

Lys Asn Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Asn Lys Asn Phe Leu Ala Gly

260 265 270

Arg Phe Ser His Leu

275

<210> 3

<211> 260

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 无信号序列的人TSG-6的Q144同种异型变体的氨基酸序列

<400> 3

Trp Gly Phe Lys Asp Gly Ile Phe His Asn Ser Ile Trp Leu Glu Arg

1 5 10 15

Ala Ala Gly Val Tyr His Arg Glu Ala Arg Ser Gly Lys Tyr Lys Leu

20 25 30

Thr Tyr Ala Glu Ala Lys Ala Val Cys Glu Phe Glu Gly Gly His Leu

35 40 45

Ala Thr Tyr Lys Gln Leu Glu Ala Ala Arg Lys Ile Gly Phe His Val

50 55 60

Cys Ala Ala Gly Trp Met Ala Lys Gly Arg Val Gly Tyr Pro Ile Val

65 70 75 80

Lys Pro Gly Pro Asn Cys Gly Phe Gly Lys Thr Gly Ile Ile Asp Tyr

85 90 95

Gly Ile Arg Leu Asn Arg Ser Glu Arg Trp Asp Ala Tyr Cys Tyr Asn

100 105 110

Pro His Ala Lys Glu Cys Gly Gly Val Phe Thr Asp Pro Lys Gln Ile

115 120 125

Phe Lys Ser Pro Gly Phe Pro Asn Glu Tyr Glu Asp Asn Gln Ile Cys

130 135 140

Tyr Trp His Ile Arg Leu Lys Tyr Gly Gln Arg Ile His Leu Ser Phe

145 150 155 160

Leu Asp Phe Asp Leu Glu Asp Asp Pro Gly Cys Leu Ala Asp Tyr Val

165 170 175

Glu Ile Tyr Asp Ser Tyr Asp Asp Val His Gly Phe Val Gly Arg Tyr

180 185 190

Cys Gly Asp Glu Leu Pro Asp Asp Ile Ile Ser Thr Gly Asn Val Met

195 200 205

Thr Leu Lys Phe Leu Ser Asp Ala Ser Val Thr Ala Gly Gly Phe Gln

210 215 220

Ile Lys Tyr Val Ala Met Asp Pro Val Ser Lys Ser Ser Gln Gly Lys

225 230 235 240

Asn Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Asn Lys Asn Phe Leu Ala Gly Arg

245 250 255

Phe Ser His Leu

260

<210> 4

<211> 1440

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 对人TSG-6全长R144同种异型变体进行编码的核酸序列

<400> 4

cagtcacatt tcagccactg ctctgagaat ttgtgagcag cccctaacag gctgttactt 60

cactacaact gacgatatga tcatcttaat ttacttattt ctcttgctat gggaagacac 120

tcaaggatgg ggattcaagg atggaatttt tcataactcc atatggcttg aacgagcagc 180

cggtgtgtac cacagagaag cacggtctgg caaatacaag ctcacctacg cagaagctaa 240

ggcggtgtgt gaatttgaag gcggccatct cgcaacttac aagcagctag aggcagccag 300

aaaaattgga tttcatgtct gtgctgctgg atggatggct aagggcagag ttggataccc 360

cattgtgaag ccagggccca actgtggatt tggaaaaact ggcattattg attatggaat 420

ccgtctcaat aggagtgaaa gatgggatgc ctattgctac aacccacacg caaaggagtg 480

tggtggcgtc tttacagatc caaagcggat ttttaaatct ccaggcttcc caaatgagta 540

cgaagataac caaatctgct actggcacat tagactcaag tatggtcagc gtattcacct 600

gagtttttta gattttgacc ttgaagatga cccaggttgc ttggctgatt atgttgaaat 660

atatgacagt tacgatgatg tccatggctt tgtgggaaga tactgtggag atgagcttcc 720

agatgacatc atcagtacag gaaatgtcat gaccttgaag tttctaagtg atgcttcagt 780

gacagctgga ggtttccaaa tcaaatatgt tgcaatggat cctgtatcca aatccagtca 840

aggaaaaaat acaagtacta cttctactgg aaataaaaac tttttagctg gaagatttag 900

ccacttataa aaaaaaaaaa aaggatgatc aaaacacaca gtgtttatgt tggaatcttt 960

tggaactcct ttgatctcac tgttattatt aacatttatt tattattttt ctaaatgtga 1020

aagcaataca taatttaggg aaaattggaa aatataggaa actttaaacg agaaaatgaa 1080

acctctcata atcccactgc atagaaataa caagcgttaa cattttcata tttttttctt 1140

tcagtcattt ttctatttgt ggtatatgta tatatgtacc tatatgtatt tgcatttgaa 1200

attttggaat cctgctctat gtacagtttt gtattatact ttttaaatct tgaactttat 1260

aaacattttc tgaaatcatt gattattcta caaaaacatg attttaaaca gctgtaaaat 1320

attctatgat atgaatgttt tatgcattat ttaagcctgt ctctattgtt ggaatttcag 1380

gtcattttca taaatattgt tgcaataaat atccttgaac acaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1440

<210> 5

<211> 277

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人TSG-6全长R144同种异型变体的氨基酸序列

<400> 5

Met Ile Ile Leu Ile Tyr Leu Phe Leu Leu Leu Trp Glu Asp Thr Gln

1 5 10 15

Gly Trp Gly Phe Lys Asp Gly Ile Phe His Asn Ser Ile Trp Leu Glu

20 25 30

Arg Ala Ala Gly Val Tyr His Arg Glu Ala Arg Ser Gly Lys Tyr Lys

35 40 45

Leu Thr Tyr Ala Glu Ala Lys Ala Val Cys Glu Phe Glu Gly Gly His

50 55 60

Leu Ala Thr Tyr Lys Gln Leu Glu Ala Ala Arg Lys Ile Gly Phe His

65 70 75 80

Val Cys Ala Ala Gly Trp Met Ala Lys Gly Arg Val Gly Tyr Pro Ile

85 90 95

Val Lys Pro Gly Pro Asn Cys Gly Phe Gly Lys Thr Gly Ile Ile Asp

100 105 110

Tyr Gly Ile Arg Leu Asn Arg Ser Glu Arg Trp Asp Ala Tyr Cys Tyr

115 120 125

Asn Pro His Ala Lys Glu Cys Gly Gly Val Phe Thr Asp Pro Lys Arg

130 135 140

Ile Phe Lys Ser Pro Gly Phe Pro Asn Glu Tyr Glu Asp Asn Gln Ile

145 150 155 160

Cys Tyr Trp His Ile Arg Leu Lys Tyr Gly Gln Arg Ile His Leu Ser

165 170 175

Phe Leu Asp Phe Asp Leu Glu Asp Asp Pro Gly Cys Leu Ala Asp Tyr

180 185 190

Val Glu Ile Tyr Asp Ser Tyr Asp Asp Val His Gly Phe Val Gly Arg

195 200 205

Tyr Cys Gly Asp Glu Leu Pro Asp Asp Ile Ile Ser Thr Gly Asn Val

210 215 220

Met Thr Leu Lys Phe Leu Ser Asp Ala Ser Val Thr Ala Gly Gly Phe

225 230 235 240

Gln Ile Lys Tyr Val Ala Met Asp Pro Val Ser Lys Ser Ser Gln Gly

245 250 255

Lys Asn Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Asn Lys Asn Phe Leu Ala Gly

260 265 270

Arg Phe Ser His Leu

275

<210> 6

<211> 260

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 无信号序列的人TSG-6的R144同种异型变体的氨基酸序列

<400> 6

Trp Gly Phe Lys Asp Gly Ile Phe His Asn Ser Ile Trp Leu Glu Arg

1 5 10 15

Ala Ala Gly Val Tyr His Arg Glu Ala Arg Ser Gly Lys Tyr Lys Leu

20 25 30

Thr Tyr Ala Glu Ala Lys Ala Val Cys Glu Phe Glu Gly Gly His Leu

35 40 45

Ala Thr Tyr Lys Gln Leu Glu Ala Ala Arg Lys Ile Gly Phe His Val

50 55 60

Cys Ala Ala Gly Trp Met Ala Lys Gly Arg Val Gly Tyr Pro Ile Val

65 70 75 80

Lys Pro Gly Pro Asn Cys Gly Phe Gly Lys Thr Gly Ile Ile Asp Tyr

85 90 95

Gly Ile Arg Leu Asn Arg Ser Glu Arg Trp Asp Ala Tyr Cys Tyr Asn

100 105 110

Pro His Ala Lys Glu Cys Gly Gly Val Phe Thr Asp Pro Lys Arg Ile

115 120 125

Phe Lys Ser Pro Gly Phe Pro Asn Glu Tyr Glu Asp Asn Gln Ile Cys

130 135 140

Tyr Trp His Ile Arg Leu Lys Tyr Gly Gln Arg Ile His Leu Ser Phe

145 150 155 160

Leu Asp Phe Asp Leu Glu Asp Asp Pro Gly Cys Leu Ala Asp Tyr Val

165 170 175

Glu Ile Tyr Asp Ser Tyr Asp Asp Val His Gly Phe Val Gly Arg Tyr

180 185 190

Cys Gly Asp Glu Leu Pro Asp Asp Ile Ile Ser Thr Gly Asn Val Met

195 200 205

Thr Leu Lys Phe Leu Ser Asp Ala Ser Val Thr Ala Gly Gly Phe Gln

210 215 220

Ile Lys Tyr Val Ala Met Asp Pro Val Ser Lys Ser Ser Gln Gly Lys

225 230 235 240

Asn Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Asn Lys Asn Phe Leu Ala Gly Arg

245 250 255

Phe Ser His Leu

260

<210> 7

<211> 92

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人TSG-6的Link模块的氨基酸序列

<400> 7

Val Tyr His Arg Glu Ala Arg Ser Gly Lys Tyr Lys Leu Thr Tyr Ala

1 5 10 15

Glu Ala Lys Ala Val Cys Glu Phe Glu Gly Gly His Leu Ala Thr Tyr

20 25 30

Lys Gln Leu Glu Ala Ala Arg Lys Ile Gly Phe His Val Cys Ala Ala

35 40 45

Gly Trp Met Ala Lys Gly Arg Val Gly Tyr Pro Ile Val Lys Pro Gly

50 55 60

Pro Asn Cys Gly Phe Gly Lys Thr Gly Ile Ile Asp Tyr Gly Ile Arg

65 70 75 80

Leu Asn Arg Ser Glu Arg Trp Asp Ala Tyr Cys Tyr

85 90

<210> 8

<211> 319

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 对Link_TSG6进行编码的核酸序列

<400> 8

aggagatata catatgggtg tgtaccaccg tgaagcacgg tctggcaaat acaagctcac 60

ctacgcagaa gctaaggcgg tgtgtgaatt tgaaggcggc catctcgcaa cttacaagca 120

gctagaggca gcccgtaaaa ttggatttca tgtctgtgct gctggatgga tggctaaggg 180

ccgtgttgga taccccattg tgaagccagg gcccaactgt ggatttggaa aaactggcat 240

tattgattat ggaatccgtc tcaataggag tgaacgttgg gatgcctatt gctacaaccc 300

acacgcaaag taagaattc 319

<210> 9

<211> 98

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Link_TSG6的氨基酸序列

<400> 9

Gly Val Tyr His Arg Glu Ala Arg Ser Gly Lys Tyr Lys Leu Thr Tyr

1 5 10 15

Ala Glu Ala Lys Ala Val Cys Glu Phe Glu Gly Gly His Leu Ala Thr

20 25 30

Tyr Lys Gln Leu Glu Ala Ala Arg Lys Ile Gly Phe His Val Cys Ala

35 40 45

Ala Gly Trp Met Ala Lys Gly Arg Val Gly Tyr Pro Ile Val Lys Pro

50 55 60

Gly Pro Asn Cys Gly Phe Gly Lys Thr Gly Ile Ile Asp Tyr Gly Ile

65 70 75 80

Arg Leu Asn Arg Ser Glu Arg Trp Asp Ala Tyr Cys Tyr Asn Pro His

85 90 95

Ala Lys

Claims (17)

1.一种LINK_TSG6多肽，其用于治疗或预防眼表病症，如干眼病。

2.根据权利要求1所述供使用的LINK_TSG6多肽，其中，所述治疗或预防眼表病症，如干眼病包含选自由以下组成的组中的一种或多种作用：

角膜上皮缺损的愈合；

泪液产生的增加；

炎症的抑制；

以及更高数量的结膜杯状细胞。

3.根据权利要求1或权利要求2所述供使用的LINK_TSG6多肽，其中，所述治疗包含向眼局部施用LINK_TSG6多肽。

4.根据权利要求1至3中任一项所述供使用的LINK_TSG6多肽，其中，所述治疗包含每天两次施用LINK_TSG6多肽。

5.根据权利要求1至3中任一项所述供使用的LINK_TSG6多肽，其中，所述治疗包含每天施用LINK_TSG6多肽少于四次。

6.根据权利要求3所述供使用的LINK_TSG6多肽，其中，所述LINK_TSG6多肽配制成滴眼剂。

7.根据前述权利要求中任一项所述供使用的LINK_TSG6多肽，其中，LINK_TSG6与泼尼松龙(prednisolone)、环孢菌素(cyclosporine)、利非斯特(Lifitegrast)(Xiidra^TM)或人工泪液中的一种或多种共同施用。

8.根据前述权利要求中任一项所述供使用的LINK_TSG6多肽，其中，每只眼施用约10μg至200μg LINK_TSG6多肽，优选地为每只眼施用120μg至150μg LINK_TSG6多肽。

9.根据权利要求2所述供使用的LINK_TSG6多肽，其中，所述炎症的抑制包含角膜或眶内泪腺中一种或多种促炎细胞因子的产生的减少，所述促炎细胞因子任选地选自TNF-α、IL-6、IFN-γ和IL-1β。

10.根据权利要求2所述供使用的LINK_TSG6多肽，其中，所述治疗或预防干眼病包含与所述施用LINK_TSG6多肽之前的角膜上皮缺损、泪液产生、炎症或结膜杯状细胞数量相比，角膜上皮缺损的愈合、泪液产生的增加、炎症的抑制或结膜杯状细胞数量的增加。

11.根据权利要求2所述供使用的LINK_TSG6多肽，其中，所述治疗或预防干眼病包含与利用全长TSG-6蛋白治疗的对照个体的角膜上皮缺损、泪液产生、炎症或结膜杯状细胞数量相比，角膜上皮缺损的愈合、泪液产生的增加、炎症的抑制或结膜杯状细胞数量的增加。

12.根据前述权利要求中任一项所述供使用的LINK_TSG6多肽，其中，所治疗的所述个体患有干燥综合征。

13.根据前述权利要求中任一项所述供使用的LINK_TSG6多肽，其中，所述治疗包含施用包含LINK_TSG6的滴眼剂。

14.根据前述权利要求中任一项所述供使用的LINK_TSG6多肽，其中，所述LINK_TSG6多肽包含以下各项，由以下各项组成，或基本上由以下各项组成：(i)SEQ ID NO:7或SEQ IDNO:9的氨基酸序列，或者(ii)与SEQ ID NO:7或9的所述氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。

15.一种包含LINK_TSG6多肽的滴眼剂制剂。

16.根据权利要求15所述的滴眼剂制剂，其包含240μg/ml至3000μg/ml，优选地为2400μg/ml至3000μg/ml。

17.根据权利要求15或权利要求16所述的滴眼剂制剂，其还包含泼尼松龙、环孢菌素、利非斯特(Xiidra^TM)或人工泪液。

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