CN114525353A - 16K wheat whole genome mSNP segment combination, gene chip and application - Google Patents

16K wheat whole genome mSNP segment combination, gene chip and application Download PDF

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Abstract

The invention relates to a 16K wheat whole genome mSNP segment combination, a gene chip and application, wherein the 16K wheat whole genome mSNP segment combination comprises 15478 mSNP segments, the physical positions of the 15478 mSNP segments are determined based on whole genome sequence comparison of a wheat variety Chinese Spring (Chinese Spring), the version number of the whole genome sequence of the 16K wheat variety Chinese Spring is Chinese _ Spring IWGSC RefSeq 1.0, and the 15478 mSNP segments are shown as S00001-15478. The mSNP segment combination has the characteristics of high representativeness, rich diversity information and uniform marking distribution, has lower cost price under the same marking density, and greatly reduces the application cost.

Description

16K wheat whole genome mSNP segment combination, gene chip and application
Technical Field
The invention belongs to the field of molecular genetic breeding, and particularly relates to a 16K wheat complete genome mSNP segment combination, a gene chip and application.
Background
Wheat is one of the most important food crops, provides more than 20% of energy for human beings, and with the increasing population and the increasing living standard, people put higher demands on the yield and quality of wheat. However, with the continuous extrusion of the cultivated land area and the constant cultivation management measures, the continuous cultivation of new breakthrough varieties with high yield and high quality through the wheat breeding technology is the only means for realizing the yield and quality increase.
At present, although the molecular genetic breeding technology is being developed vigorously, wheat belongs to an allohexaploid plant, has a complex and huge genome, greatly limits the basic research of wheat, and further increases the difficulty of the research of the wheat molecular breeding technology due to the problems of complexity of the phenotypic shape of wheat and the like, so that the conventional breeding technology depending on phenotypic selection is still adopted in the existing wheat breeding technology, and the existing problems are that: 1) the phenotype is easily influenced by environmental conditions, depends on personal experience of a breeder, is easily influenced by subjective factors of the breeder, and has low selection precision; 2) the phenotype is used for selection, and the genetic background is not clear, so that the method has the defect of high blindness and low selection efficiency; 3) the quality character identification procedure is complex, long in period, high in difficulty and high in cost, and is not beneficial to large-scale operation.
Disclosure of Invention
The invention aims to overcome the defects in the prior art and provides a 16K wheat whole genome mSNP segment combination, a gene chip and application.
In order to achieve the purpose, the technical scheme adopted by the invention is as follows:
the first technical scheme is as follows:
A16K wheat whole genome mSNP segment combination is characterized by comprising 15478 mSNP segments, the physical positions of the 15478 mSNP segments are determined based on whole genome sequence alignment of a wheat variety Chinese Spring (Chinese Spring), the version number of the whole genome sequence of the 16K wheat variety Chinese Spring is Chinese _ Spring IWGSC RefSeq 1.0, the mSNP segments are expressed in a mode of the physical position of a chromosome number start site-physical position of a chromosome end site, and 15478 mNP segments are shown as S00001-15478.
S00001：1A_1208095_1208294；S00002：1A_3382953_3383124；
S00003：1A_3845828_3845949；S00004：1A_3911208_3911329；
S00005：1A_4033752_4033873；S00006：1A_4055921_4056120；
S00007：1A_6668635_6668674；S00008：1A_6791357_6791556；
S00009：1A_9579728_9579849；S00010：1A_9579875_9579996；
S00011：1A_10060497_10060574；S00012：1A_10607573_10607772；
S00013：1A_14467814_14467856；S00014：1A_14475247_14475446；
S00015：1A_15373477_15373676；S00016：1A_15432077_15432276；
S00017：1A_17258547_17258636；S00018：1A_17791668_17791771；
S00019：1A_18308527_18308725；S00020：1A_18436323_18436522；
S00021：1A_20171851_20172050；S00022：1A_20368649_20368696；
S00023：1A_22061079_22061194；S00024：1A_23131668_23131764；
S00025：1A_23817575_23817667；S00026：1A_24884343_24884499；
S00027：1A_24884633_24884754；S00028：1A_24884973_24885065；
S00029：1A_25542575_25542715；S00030：1A_25707750_25708054；
S00031：1A_26533611_26533783；S00032：1A_26604704_26604706；
S00033：1A_27049863_27049971；S00034：1A_27050034_27050143；
S00035：1A_27050218_27050323；S00036：1A_27199119_27199244；
S00037：1A_27199343_27199510；S00038：1A_27215962_27215962；
S00039：1A_28608050_28608171；S00040：1A_28663876_28664057；
S00041：1A_29978457_29978574；S00042：1A_29978611_29978859；
S00043：1A_30119233_30119235；S00044：1A_30459473_30459594；
S00045：1A_30459654_30459750；S00046：1A_30548285_30548481；
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S00049：1A_31346649_31346847；S00050：1A_31798354_31798436；
S00051：1A_31808829_31808981；S00052：1A_31818571_31818789；
S00053：1A_31838913_31839005；S00054：1A_31839012_31839135；
S00055：1A_31839165_31839259；S00056：1A_31839776_31840096；
S00057：1A_31850317_31850476；S00058：1A_33084970_33085091；
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S00101：1A_56363488_56363540；S00102：1A_56363589_56363671；
S00103：1A_56365451_56365689；S00104：1A_58348191_58348370；
S00105：1A_58411464_58411587；S00106：1A_59912489_59912610；
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S00111：1A_65232965_65233190；S00112：1A_66006165_66006364；
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S00115：1A_71196615_71196736；S00116：1A_74243173_74243395；
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S00127：1A_86859674_86859859；S00128：1A_86881718_86881903；
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S00133：1A_94241092_94241291；S00134：1A_95866754_95866843；
S00135：1A_96454151_96454350；S00136：1A_97545538_97545735；
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S00151：1A_115357763_115357763；S00152：1A_115371695_115371725；
S00153：1A_116675252_116675328；S00154：1A_117817679_117817765；
S00155：1A_119424765_119424964；S00156：1A_120955626_120955718；
S00157：1A_124523903_124524074；S00158：1A_127291427_127291583；
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S00163：1A_135719048_135719247；S00164：1A_137920360_137920554；
S00165：1A_137920949_137921035；S00166：1A_142263603_142263700；
S00167：1A_142330213_142330412；S00168：1A_144938552_144938730；
S00169：1A_147673737_147673829；S00170：1A_150532874_150532920；
S00171：1A_151351029_151351226；S00172：1A_151835633_151835832；
S00173：1A_155144114_155144226；S00174：1A_158223414_158223535；
S00175：1A_159860548_159860715；S00176：1A_160661393_160661507；
S00177：1A_163849564_163849763；S00178：1A_164124904_164125082；
S00179：1A_166070326_166070444；S00180：1A_166070476_166070694；
S00181：1A_169726043_169726139；S00182：1A_173786239_173786390；
S00183：1A_173966528_173966727；S00184：1A_173980444_173980568；
S00185：1A_177473166_177473361；S00186：1A_177791717_177791823；
S00187：1A_178220346_178220545；S00188：1A_180377940_180377992；
S00189：1A_180378147_180378239；S00190：1A_180378313_180378365；
S00191：1A_182100229_182100409；S00192：1A_182806690_182806850；
S00193：1A_182817700_182817899；S00194：1A_183047543_183047742；
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S15423：7D_586032367_586032449；S15424：7D_586109717_586109799；
S15425：7D_586115928_586116030；S15426：7D_586825768_586825850；
S15427：7D_587419926_587420063；S15428：7D_589059241_589059424；
S15429：7D_589059481_589059602；S15430：7D_593774499_593774593；
S15431：7D_593774654_593774746；S15432：7D_594611612_594611714；
S15433：7D_595104076_595104279；S15434：7D_596314707_596314906；
S15435：7D_598313194_598313276；S15436：7D_599891788_599891987；
S15437：7D_600712459_600712541；S15438：7D_602025918_602026010；
S15439：7D_602026057_602026149；S15440：7D_602026200_602026358；
S15441：7D_602185778_602185860；S15442：7D_602802855_602802947；
S15443：7D_602895145_602895344；S15444：7D_605484477_605484569；
S15445：7D_605484610_605484692；S15446：7D_605942523_605942723；
S15447：7D_606946878_606946878；S15448：7D_608721302_608721302；
S15449：7D_610778303_610778385；S15450：7D_610864769_610864946；
S15451：7D_611638868_611639043；S15452：7D_611640138_611640324；
S15453：7D_611761377_611761459；S15454：7D_611839093_611839175；
S15455：7D_613013652_613013846；S15456：7D_615556229_615556311；
S15457：7D_615912196_615912355；S15458：7D_615912430_615912583；
S15459：7D_615968324_615968523；S15460：7D_616522614_616522802；
S15461：7D_616705673_616705794；S15462：7D_617096938_617097035；
S15463：7D_617115428_617115510；S15464：7D_617379117_617379241；
S15465：7D_617658706_617658816；S15466：7D_619458099_619458298；
S15467：7D_621217825_621217931；S15468：7D_621609186_621609389；
S15469：7D_622120388_622120487；S15470：7D_622580182_622580381；
S15471：7D_623219952_623220034；S15472：7D_623835322_623835497；
S15473：7D_625479272_625479399；S15474：7D_626091700_626091881；
S15475：7D_626120244_626120418；S15476：7D_628124816_628124976；
S15477：7D_628818089_628818537；S15478：7D_629839736_629839935；
And a set of nucleotide probes for detecting the 16K wheat whole genome mSNP segment combination.
A gene chip for detecting the 16K wheat genome mSNP segment combination is a liquid phase chip and comprises a set of nucleotide probes for detecting the 16K wheat whole genome mSNP segment combination.
The 16K wheat whole genome mSNP segment combination or the application of the gene chip in preparing wheat genome SNP gene chips.
The 16K wheat whole genome mSNP segment combination or the gene chip is applied to wheat linkage analysis.
The application of the 16K wheat whole genome mSNP segment combination or the gene chip in identification of color wheat variety resources.
The 16K wheat whole genome mSNP segment combination or the gene chip is applied to wheat whole genome association analysis (GWAS).
Compared with the prior art, the invention has the beneficial effects that:
1. high representativeness and rich diversity information
The markers used by the GBW16K product are derived from large sample-size re-sequencing data and all re-sequencing data published today, the material background of which covers major varieties of wheat (wild, farmed or cultivated) in various regions of the world (spring and winter wheat regions).
2. Uniform distribution of marks
After the GBW16K product marker design is optimized, each chromosome contains about 1800 SNP markers.
3. Equal mark density and lower price
The GBW16K product carries out price accounting according to 14,868 mSNP segments, and finally can provide the actual typing result of 37,669 SNP markers, thereby greatly reducing the use cost of molecular assisted breeding and lowering the price of the product by 20 percent compared with other products of the same type.
Drawings
FIG. 1: statistical map of the distribution of mSNP segments on chromosomes
FIG. 2: chromosome profiling of the mSNP segment;
FIG. 3: whole genome linkage analysis map in example 5;
FIG. 4: the evolutionary tree of the 259 triticale variety in example 6;
FIG. 5: the QQ map of the plant height of the whole genome association analysis in example 7;
FIG. 6: manhattan plot of whole genome association assay strain height in example 7.
In the figure, 1, 2 BS; 2. 4 BL; 3. 4 DL; 4. 5 BL; 5. 6 AS; 6. 7 BL.
Detailed Description
The technical solutions of the present invention will be described clearly and completely with reference to specific embodiments, and it should be understood that the described embodiments are a part of the embodiments of the present invention, and not all of the embodiments. All other embodiments, which can be derived by a person skilled in the art from the embodiments given herein without making any creative effort, shall fall within the protection scope of the present invention.
Example 1:
the method for obtaining the SNP locus comprises the following steps:
step 1, checking target site information:
according to the acquired 660K SNP locus data of 1520 germplasm resource materials, screening probe sequences of loci, wherein the probe sequences can be compared with regions of a wheat reference genome, and combining the regions with close distances to obtain 342K candidate segments;
step 2, target site information screening:
based on 20 parts of wheat whole genome re-sequencing data, preliminarily screening sites in the data, reserving sites with NA proportion of less than 60%, heterozygous frequency of less than 20% and MAF of more than 0.01 for 39M sites, and reserving sections with high polymorphism and SNP number of more than 1 in a region by sliding a 120bp window, wherein 840K candidate sections are obtained in total;
step 3, Probe design and Synthesis
Preferentially screening candidate sections obtained in the step 1 and the step 2 according to the principle of uniform distribution, wherein the PIC value is high (the PIC value is greater than 0.5) or the MAF value of the target SNP in the section is large (the MAF value is greater than 0.01), simultaneously considering section scores (the score parameters GC are greater than or equal to 30 percent and hom is less than or equal to 10), comprehensively considering and selecting the optimal section in the candidate sections as the target section, designing a probe, and designing a 4K probe in the embodiment;
step 4, designing a probe:
testing the probe designed in the step 3 by using a test sample, wherein a target segment capable of being stably captured is determined by sample testing due to the fact that a plurality of positions corresponding to one gene exist in the wheat genome, and a 10K target segment capable of being stably captured is obtained in the embodiment;
step 5, probe adjustment:
the test result shows that the target section stably captured in the step 4 has a hollow area, and the section with high polymorphism is selected by using the candidate section in the step 2 to design a probe;
and 6, determining the conditions of the final probe and the capture site:
testing the probe designed in the step 5 by using the test sample again, and finally determining target sections capable of being stably captured, wherein 15478 target sections capable of being stably captured are obtained in the embodiment; i.e., 15478 mSNP segments, which 15478 mSNP segments are covered with 37,669 SNP markers.
According to SSR provided by customers, SSR loci are evaluated, and 68 SSR loci are evaluated in total in the embodiment.
The number of 15478 mSNP segments obtained in this example on each chromosome is shown in FIG. 1, where the abscissa is the chromosome number, the left ordinate is the number of target segments (in units), and the right ordinate is the chromosome length (in bp). The specific distribution of the core sites on the chromosome is shown in FIG. 2, with the abscissa being the length of the chromosome (in bp) and each vertical line representing the number of markers under the fixed window (window 1 Mb).
Example 2:
obtaining a probe combination:
the probe described in step 5 of example 1 was adapted according to the 15478 mSNP segments obtained in example 1, finally obtaining a probe combination capable of capturing 15478 of said mSNP segments.
Example 3
A liquid chip comprising the combination of probes of example 2 capable of capturing 15478 of said mSNP segments.
Example 4
Use of 15478 combinations of mSNP segments or a liquid phase probe designed from 15478 combinations of said mSNP segments for genotyping a sample of interest, comprising the steps of:
step 1, extracting target sample DNA;
step 2, library construction
100ng of DNA, GenoBaits End Repair Buffer 4uL, GenoBaits End Repair Enzyme 3.1uL, were added to a 0.2 uL PCR tube and made up to 20u L with water; placing the reaction tube in a PCR instrument, performing enzyme digestion and end repair at 37 ℃ for 20min and 72 ℃ for 20min, and adding A;
adding GenoBaits Ultra DNA ligase 2u L, GenoBaits Ultra DNA ligaseBuffer 8u L, GenoBaits Adapter 2uL and nucleic-free water 8u L, placing in a PCR instrument at 22 ℃ for 60min, and completing the connection of sequencing adapters;
adding 1.2 times of GenoPrep DNA Clean Beads, mixing well, placing on magnetic frame, standing for 3min, and removing supernatant. 100u L freshly prepared 80% ethanol was added. Incubate at room temperature for 30 seconds and remove the supernatant. Air-dry until ethanol completely volatilizes, add systems GenoBaits PCR Master Mix 10uL, GenoBaits uni _ oligo 1uL, GenoBaits DNA index 5uL, nuclear-free water 4 uL. Resuspending the magnetic beads, placing in a PCR instrument, and keeping at 98 ℃ for 2 min; 6-8 cycles of 98 ℃ for 30s, 65 ℃ for 30s and 72 ℃ for 40 s; 4min at 72 ℃;
add 20u L GenoPrep DNA Clean Beads, mix well and stand for 5min, remove the supernatant, add 100uL freshly prepared 80% ethanol. Incubate at room temperature for 30s and remove the supernatant. Adding 30u L Tris-HCl heavy suspension library, mixing well, placing on magnetic frame, standing for 3min, and taking out supernatant solution.
Step 3, hybrid Capture of library
500ng of the purified DNA library was taken and added to 5u L GenoBaits Block I and 2u L GenoBaitsBlock II, and the mixture was evaporated to dryness to a dry powder on an Eppendorf Concentrator plus vacuum Concentrator at a temperature of 70 ℃ or less. Adding 8.5u L GenoBaits 2 XHyb Buffer, 2.7u L GenoBaits Hyb Buffer Enhancer and 2.8u L Nuclear-Free Water into a dry powder tube, sucking by a pipette, uniformly mixing, placing on an ABI 9700PCR instrument, incubating at 95 ℃ for 10 minutes, taking out the PCR tube, adding a liquid phase probe which is finished by 3u L, shaking in a vortex, uniformly mixing, placing on the ABI 9700PCR instrument, incubating at 65 ℃ for 2 hours, and finishing the probe hybridization reaction. Wash buffer was used to elute the hybridized library.
Adding 13uL of the resuspended DNA (with magnetic beads) into a new 0.2mL PCR tube, adding 15uLGenoBaits PCR Master Mix and 2uL genoBaits Primer Mix to configure a post-PCR system, and performing library amplification by using an ABI 9700PCR instrument, wherein the amplification procedure comprises the steps of pre-denaturation at 95 ℃ for 5min, denaturation at 95 ℃ for 30s, annealing at 60 ℃ for 30s and extension at 72 ℃ for 30 s; repeating the steps 2-4 for 15 cycles; extension at 72 ℃ for 5 min.
Adding 45u L Beckmen AMPure XP Beads into the post-PCR product, sucking up and down by using a pipettor uniformly, placing a 0.2PCR tube on a magnetic frame until the solution is clear, discarding the supernatant, washing the magnetic Beads twice by using 75% ethanol, eluting the library DNA by using Tris-HCl with the pH of 8.0, and completing the hybridization capture of the liquid-phase chip.
Step 3, quality detection and sequencing of library
The DNA concentration was determined by using a Qubit fluorimetric quantification (Thermo Fisher) and agarose gel electrophoresis was used to determine whether the fragment size of the library DNA was between 350-400 bp. Sequencing the constructed library by using a Huada sequencer to obtain the genotyping data of the target SNP locus.
Example 5
Wheat stripe rust is one of the most important fungal diseases of wheat and is harmful to the yield and quality of wheat;
taking the study of wheat stripe rust as an example, the application of 15478 combinations of mSNP segments or a liquid phase chip designed according to 15478 combinations of mSNP segments in wheat linkage analysis comprises the following steps:
119 leaves of disease-resistant materials with wheat stripe rust resistant phenotype records, Shaanreclamation 99 and Avocet S variety hybrid F6 generation recombinant inbred line were collected, DNA was extracted and genotyping was performed using the liquid phase chip prepared in example 3. And (3) performing quality control on the obtained genotyping result, removing individuals with the minimum allele frequency less than 0.15 and the genotype deletion rate more than 0.2, and finally obtaining 3121 SNP markers. Bin analysis was performed on the SNP sites obtained by screening using ICIMapping4.1 software to obtain 986 Bin markers. And then constructing a genetic linkage map by using bin markers, and performing correlation analysis with 8 phenotypic data, wherein the genetic linkage map is co-localized to 6 disease-resistant related genetic loci which are respectively located at 2BS,4BL,4DL,5BL,6AS and 7BL AS shown in figure 3, wherein the 2BS,6AS and 7BL can be detected under a plurality of environments, and the 2BS locus explains the phenotypic variation of 21.6-38.9%, and can be used for wheat stripe rust resistance breeding. The results show that the wheat 16K liquid chip can carry out accurate linkage analysis, and compared with a common wheat 55K solid chip, the liquid chip disclosed by the invention can be used for carrying out wheat genome and genetic research at lower cost (the price of the 16K liquid chip is only about one third of that of the 55K chip).
Example 6
The color wheat contains rich protein amino acid and trace elements necessary for human body, especially the natural pigment of the seed coat of the color wheat is a anthocyanin substance, and the natural pigment is few in common wheat, and has the important effects of eliminating free radicals in vivo, improving the immunity of the organism, maintaining the normal osmotic pressure of blood vessels, inhibiting the growth of cancer cells, improving the nutrition of cardiac muscle and the like.
Taking colored wheat as an example, introducing 15478 combinations of mSNP segments or a liquid phase chip designed according to 15478 combinations of the mSNP segments in the identification of wheat variety resources, comprising the following steps:
collecting 500 fresh leaves of the colorful wheat variety, adopting the method of the embodiment 4, carrying out genotyping by using the liquid phase chip prepared in the embodiment 3, carrying out quality control on the obtained genotyping result, removing individuals with the minimum allele frequency of less than 0.05, the genotype deletion rate of more than 0.1 and the sample deletion rate of more than 0.1, and finally obtaining 8656 SNP markers and 456 individuals. Then, the SNP typing result sets containing all the samples are respectively subjected to Principal Component Analysis (PCA) and phylogenetic tree construction, the results are shown in FIG. 4, the similarity among the varieties is obtained through analysis according to the clustering results of the first 3 principal components of the principal component analysis and the clustering results of the phylogenetic tree, the varieties with the similarity of more than 99 percent are considered as the same variety, the same variety is removed, and 259 varieties are finally obtained.
Example 7
The plant height is closely related to the yield, and the appropriate plant height can reduce the risk of lodging of the plant and provide guarantee for high and stable yield of wheat.
Taking screening of SNP sites related to wheat plant height as an example, introducing 15478 combinations of mSNP segments or application of a liquid phase chip designed according to 15478 combinations of mSNP segments in wheat whole genome association analysis (GWAS), comprising the following steps:
the SNP site data of 249 samples in example 6 and the phenotype data of the measured plant height are used for whole genome association analysis, a linear regression model of GAPIT software is used for analysis, a Manhattan graph related to the plant height is drawn, as shown in FIGS. 5 and 6, and finally, the marked sites which are obviously related to the plant height are 2A _75881775, 3D _589580662, 4B _46430447, 4B _34901319, 4B _47457515, 4B _37696579, 4B _71221229, 4B _37698165, 4B _63846196, 4B _68356263, 4B _37764607, 4B _37764579, 5A _ 673649, 5D _557457412, the inner 21 SNPs are discovered by utilizing Chinese spring reference genome annotation, the 4BS locus corresponding dwarf gene Rht-B1, Rht-B1 are important green revolution genes and are widely applied to modern wheat varieties, the above results indicate that 15478 mSNP segment combinations or a liquid phase chip designed from 15478 of the mSNP segment combinations enable accurate whole genome association analysis.
The embodiments described above are only preferred embodiments of the invention and are not exhaustive of the possible implementations of the invention. Any obvious modifications to the above would be obvious to those of ordinary skill in the art, but would not bring the invention so modified beyond the spirit and scope of the present invention.

Claims (7)

1. A16K wheat whole genome mSNP segment combination comprises 15478 mSNP segments, the physical positions of the 15478 mSNP segments are determined based on whole genome sequence alignment of a wheat variety Chinese spring, the version number of the whole genome sequence of the wheat variety Chinese spring is Chinese _ SpringIWGSC RefSeq 1.0, 15478 the mSNP segments are shown as S00001-15478.
2. A set of nucleotide probes for detecting the 16K wheat whole genome mSNP segment combination of claim 1.
3. A gene chip for detecting the 16K wheat genome mSNP segment combination according to claim 1, which is a liquid phase chip and comprises a set of nucleotide probes for detecting the 16K wheat genome-wide mSNP segment combination according to claim 1.
4. Use of the 16K wheat whole genome mSNP segment combination of claim 1 or the gene chip of claim 3 for preparing wheat genome SNP gene chip.
5. Use of the 16K wheat whole genome mSNP segment set of claim 1 or the gene chip of claim 3 in wheat linkage analysis.
6. Use of the 16K wheat whole genome mSNP segment set of claim 1 or the gene chip of claim 3 in identification of chromatic wheat variety resources.
7. Use of the 16K wheat whole genome mSNP segment combination of claim 1 or the gene chip of claim 3 in wheat whole genome association analysis.
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