CN114507384B - 丝素蛋白/海藻酸钠复合膜及其制备及药物缓释载体材料 - Google Patents

丝素蛋白/海藻酸钠复合膜及其制备及药物缓释载体材料 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种丝素蛋白/海藻酸钠复合膜及其制备及药物缓释载体材料。所述制备方法，包括以下步骤：S1，将丝素蛋白溶液缓慢滴加到海藻酸钠溶液中，搅拌并在65～75℃范围内水浴加热，并调节pH值到8.8～9.2，其中，丝素蛋白与海藻酸钠的质量比为2～8:8～2；S2，将PEG溶液滴加到反应溶液中充分反应，其中，PEG的质量占所述丝素蛋白与所述海藻酸钠总重量的3～15％；S3，将反应后的溶液铺膜，然后烘干；S4，将烘干后的薄膜用CaCl2溶液浸泡后，清洗并干燥。本发明制备的丝素蛋白/海藻酸钠复合膜的结构中含有赖氨酸、谷氨酸、酪氨酸、甘氨酸等生物活性基元，这能大大提高材料的生物相容性、亲和性、表面性能与降解性能，从而适于药物缓释载体材料的应用。

Description

丝素蛋白/海藻酸钠复合膜及其制备及药物缓释载体材料
技术领域
本发明涉及一种丝素蛋白/海藻酸钠复合膜及其制备及药物缓释载体材料。
背景技术
丝素蛋白对人体无毒害作用，安全可靠，其良好生物性能使其在生物医药领域变成了佼佼者，受到学者们的一致青睐，将其开发成各式各样的功能材料，如人工器官、药物缓释剂等方面。但是要想真正的达到功能材料的标准，其材料就需要一定的形态，研究者们经过对柞蚕丝溶解、透析和冷冻干燥等一系列工艺后，确定将配制的再生丝素蛋白粉作为制备丝素蛋白生物材料的基本材料。
丝素蛋白膜是通过丝素蛋白溶液与其他试剂相交联或者与其他物质相混合后形成的膜材料。丝素蛋白膜的制备原理有两种：将某些高分子溶液与丝素蛋白溶液相互共混，经过改性后制备出膜；另外就是先成膜，而后进行薄膜的物理的或者化学的改性。常用的方法一般有：应力作用、热处理、水合作用、有机溶剂处理等。常用的与丝素蛋白共混的高分子材料有聚氨酯(PU)、聚烯丙胺(PAA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和聚乙烯醇(PVA)等，通过冷冻干燥、流延和水溶液干燥等方法制备出了孔径小、密度大、结晶度高、具有拉伸强度和断裂强度的膜材料。
药物缓释载体材料多青睐于天然材料，丝素蛋白膜具有两性的荷电性能，可作为负载及缓控释药物释放材料，材料的多孔网状结构具有优于其他天然材料的作用。材料的性质和药物释放的速度是可以通过调整丝素的浓度和混合入不同分子量的丝素来加以控制。但已被发现纯的丝素蛋白成形能力差、口服会迅速水解，释药行为难以控制。采用共混、接枝、交联、表面改性等手段对丝素蛋白进行修饰改性，以使其在药物缓释制剂中得到有效地应用。
通过将具有机械强度的海藻酸钠和交联作用的聚乙二醇引入到具有生物活性的丝素蛋白上分子上并制备出复合型共混膜，使材料兼有良好的力学强度和优异的生物相容性。目前，通过国内外文献检索，尚未见通过聚乙二醇将海藻酸钠和与丝素蛋白交联制备复合共混膜。
发明内容
本发明提供了一种丝素蛋白/海藻酸钠复合膜及其制备及药物缓释载体材料，可以有效解决上述问题。
本发明是这样实现的：
本发明提供一种丝素蛋白/海藻酸钠复合膜的制备方法，包括以下步骤：
S1，将丝素蛋白溶液缓慢滴加到海藻酸钠溶液中，搅拌并在65～75℃范围内水浴加热，并调节pH值到8.8～9.2，其中，丝素蛋白与海藻酸钠的质量比为2～8:8～2；
S2，将PEG溶液滴加到反应溶液中充分反应，其中，PEG的质量占所述丝素蛋白与所述海藻酸钠总重量的3～15％；
S3，将反应后的溶液铺膜，然后烘干；
S4，将烘干后的薄膜用CaCl2溶液浸泡后，清洗并干燥。
本发明进一步提供一种丝素蛋白/海藻酸钠复合膜，其通过上述的方法获得。
本发明进一步提供一种药物缓释载体材料，包括上述的丝素蛋白/海藻酸钠复合膜。
本发明的有益效果是：本申请通过获得再生丝素蛋白溶液，并通过聚乙二醇将海藻酸钠溶液引入到体系中，制备出性能良好的丝素蛋白复合膜，其拉伸强度可达到4MPa，断裂伸长率可达到80％以上。进一步的，本发明制备的丝素蛋白/海藻酸钠复合膜的结构中含有赖氨酸、谷氨酸、酪氨酸、甘氨酸等生物活性基元，这能大大提高材料的生物相容性、亲和性、表面性能与降解性能。最后，本发明制备的丝素蛋白/海藻酸钠复合膜可通过溶解共混的方法得到新型生物医用高分子材料，即，药物缓释载体材料，节省了成本且环境友好。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例中制备的丝素蛋白脱胶前后的FT-IR谱图。
图2为本发明实施例中制备的海藻酸钠与丝素蛋白膜的FT-IR谱图。
图3为本发明实施例中制备的丝素蛋白膜AF3的DSC曲线。
图4为本发明实施例中制备的复合膜的热失重曲线。
图5为本发明实施例中制备的复合膜的XRD曲线。
图6为本发明实施例中制备的丝素蛋白膜的拉伸强度的测试结果。
图7为本发明实施例中制备的丝素蛋白膜的断裂伸长率的测试结果。
图8为本发明实施例中制备的丝素蛋白膜的拉伸强度的测试结果。
图9为本发明实施例中制备的丝素蛋白膜的断裂伸长率的测试结果。
图10为本发明实施例中制备的丝素蛋白膜制备而成的各个材料的缓释曲线图。
具体实施方式
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
本发明实施例提供一种丝素蛋白/海藻酸钠复合膜的制备方法，包括以下步骤：
S1，将丝素蛋白溶液缓慢滴加到海藻酸钠溶液中，搅拌并在65～75℃范围内水浴加热，并调节pH值到8.8～9.2，其中，丝素蛋白与海藻酸钠的质量比为2～8:8～2；
S2，将PEG溶液滴加到反应溶液中充分反应，其中，PEG的质量占所述丝素蛋白与所述海藻酸钠总重量的3～15％；
S3，将反应后的溶液铺膜，然后烘干；
S4，将烘干后的薄膜用CaCl2溶液浸泡后，清洗并干燥。
在步骤S1中，所述丝素蛋白为α结构丝素蛋白粉末。丝素蛋白的结构与pH有关，调节微碱性会使蛋白质结构从α结构转化为β结构，从而提高后续膜结构的机械强度。
作为进一步改进的，所述α结构丝素蛋白粉末的制备方法可以包括一下步骤：
S11，将柞蚕壳脱胶获得柞蚕丝素纤维；
S12，将所述柞蚕丝素纤维溶解于Ca(NO3)2·4H2O中形成混合液；
S13，将所述混合液倒入到透析袋内，浸没在去离子水中，在4℃恒温透析；透析后，将透析袋中的溶液离心处理获得上层溶液；然后将所述上层溶液冷冻干燥得到α结构丝素蛋白粉末。
作为进一步改进的，在步骤S11，所述将柞蚕壳脱胶获得柞蚕丝素纤维的步骤具体包括：
将Na2CO3或NaHCO3溶液加热至100℃，然后加入柞蚕壳加热煮沸10～60min后将柞蚕丝倒出用去离子水搓洗干净，重复两次以上步骤后，烘干得到脱胶后的柞蚕丝素纤维。
作为进一步改进的，在步骤S12，所述将所述柞蚕丝素纤维溶解于Ca(NO3)2·4H2O中形成混合液的步骤包括：
将Ca(NO3)2·4H2O加热至融化为液体状态后，加入称量好的柞蚕丝素纤维，加热搅拌2～10h，其中，所述Ca(NO3)2·4H2O与所述柞蚕丝素纤维的质量比为1:30～40。本发明实施例中，选择的是柞蚕(并非桑蚕)丝素蛋白作为原材料，其结构中分子间氢键含量较大，因此可通过硝酸钙中的结晶水渗入到蚕丝结构内，同时在100℃左右高温下使得分子间氢键断裂，溶解过程中并不会造成肽链结构的破坏。进一步的，所述Ca(NO3)2·4H2O与所述柞蚕丝素纤维的质量比为1:30～40是通过实验探究后的的最佳比例，比例太大造成原料浪费，比例太小会使得溶解不充分。
作为进一步改进的，在步骤S13，所述将所述混合液倒入到透析袋内，浸没在去离子水中，在4℃恒温透析的步骤包括：
每隔十二个小时换一次水，共透析72h。通过上述处理，从而可以形成α结构丝素蛋白粉末。
作为进一步改进的，在步骤S3，所述将反应后的溶液铺膜，然后烘干的步骤包括：
在聚四氟乙烯培养皿中铺膜，然后在干燥箱50℃下烘干24h。
作为进一步改进的，在步骤S4，所述将烘干后的薄膜用CaCl2溶液浸泡的步骤包括：
将烘干后的薄膜用1.4wt％的CaCl2溶液10mL浸泡1.5h后，然后并用蒸馏水冲洗五次，并在30℃下干燥。
请参见图1-9，本发明实施例进一步提供一种丝素蛋白/海藻酸钠复合膜，所述丝素蛋白/海藻酸钠复合膜为通过上述方法获得。
本发明实施例进一步提供一种药物缓释载体材料，包括上述的丝素蛋白/海藻酸钠复合膜。
实施例1
(1)柞蚕壳的脱胶
将配制好的Na2CO3或NaHCO3溶液量取250mL分别倒入500mL的三口烧瓶中，并放置在恒温油浴锅中，安装回流装置，加热至100℃，直至烧瓶中溶液被煮沸后，秤取5g左右处理好的柞蚕蚕茧壳，投入三口烧瓶中，加热煮沸30min后将柞蚕丝倒出用去离子水搓洗干净，重复三次煮沸清洗后，拧干，在温度为65℃的恒温鼓风干燥箱中烘干并称重。
(2)蚕丝的溶解
将脱胶、脱盐以及脱色的柞蚕丝素纤维干燥后剪碎，按照质量比为1:35的比例，分别准确秤取柞蚕丝素纤维和Ca(NO3)2·4H2O固体。将添加二甲基硅烷油的集热式磁力恒温搅拌器调至温度为105℃，待其温度稳定后，将Ca(NO3)2·4H2O加入到500mL的三口烧瓶中，安装回流装置，并放置在恒温油浴锅中，直至Ca(NO3)2·4H2O融化为液体状态后，加入称量好的柞蚕丝素纤维，加热搅拌4h后倒出溶液于烧杯中，自然冷却，封口待用。
(3)α结构丝素蛋白粉末的制备
将溶解好的丝素蛋白与硝酸钙的混合溶液冷却后倒入到透析袋内，并用止水夹夹上，浸没在1000mL装有去离子水的烧杯中，在4℃的恒温冰箱中进行透析，每隔十二个小时换一次水，共透析72h后，将透析袋中的溶液小心取出，置于25mL离心管中，在台式离心机中以3500r/min离心15min后，弃去下层固体，将上层溶液放置在具塞锥形瓶中封口，4℃的恒温冰箱中保存、备用。将浓缩后的柞蚕丝素蛋白溶液放置于零下80℃的冷冻干燥箱中冷冻1小时后，进行冷冻干燥48小时，然后取出保存在20mL的样品瓶中，存放于4℃的冰箱中，备用。
实施例2：不同比例的SA/SF复合膜的制备(丝素蛋白分子(SF)，海藻酸钠分子(SA)，和聚乙二醇分子(PEG))
按照SF和SA不同的质量比(2：8、4：6、5：5、6：4、8：2)，称量SA溶液置于100mL的三口烧瓶中，安装回流和滴加装置，在室温下以300rmp下搅拌并滴加1.5wt％SF溶液，滴加完毕后，在70℃的恒温水浴锅中加热，并加入NaOH溶液调整pH到9，用移液枪PEG溶液至恒压滴液漏斗中，滴加时间控制在5min左右。其中，PEG含量是总重量的3％。反应4h后，在聚四氟乙烯培养皿中，铺膜，在电热恒温鼓风干燥箱50℃下烘干24h后，滴加质量分数为1.4％的CaCl2溶液10mL浸泡1.5h后，倒出溶液并用蒸馏水冲洗五次，并在30℃下干燥，取出，分别标记为AF1、AF2、AF3、AF4和AF5，备用。
实施例3：不同PEG添加量的复合膜的制备
按照SF:SA质量比为4:6进行称量，将SA溶液置于100mL三口烧瓶中，安装回流滴加装置，按上述步骤滴加1.5wt％的SF溶液、70℃下加热、调整pH到9后，用移液枪分别移取不同含量的PEG溶液(3wt％、6wt％、9wt％、12wt％及15wt％)，反应4h后，铺膜、干燥、滴加1.4％ CaCl2溶液10mL浸泡1.5h后，冲洗干燥，取出，分别标记为AFE1、AFE2、AFE3、AFE4和AFE5，备用。
本发明采用的仪器与表征方法如下：
①FT-IR采用美国PE公司的Spectrum One红外光谱仪进行测试。固体样品采用KBr压片，液体样品在KBr晶片上涂膜，吸收光谱扫描的波数量程4000～500cm-1，扫描三次。从图1和图2中可以看出，对比图1中脱胶前后的分子的红外光谱图，未脱胶的柞蚕丝中在1621.30cm-1、1526.62cm-1和1241.46cm-1处出现吸收峰，证明其中存在β-折叠结构，而在1312.51cm-1处出现吸收峰，证明其中含有α-螺旋结构。在柞蚕丝完全脱胶后，在1673.75cm-1和1238.52cm-1处出现吸收峰，存在α-螺旋结构，在1528.31cm-1处有吸收峰，存在β-折叠结构。三种处理后的柞蚕丝中存在α-螺旋结构和β-折叠结构，脱胶溶液完全不会破坏柞蚕丝素蛋白构象，并且其α-螺旋结构的酰胺峰明显增强，有利于制备可溶性丝素蛋白粉末。
②X射线衍射仪(XRD)采用德国Bruker D8 ADVANCE型广角X射线衍射仪，Cu靶
Figure GDA0003913507680000101
扫描范围0～35°，在样品结晶范围内选取两个不同温度点进行测试，用于鉴别丝素蛋白分子的结晶类型。从图5可以看出丝素蛋白分子，2θ为20°左右，出现SA的强衍射峰，在14°和38°处出现弥散衍射峰，AFE1和AFE2均在2θ为24°左右出现强衍射峰，AFE3在2θ为16.5°处出现强衍射峰，柞蚕丝素蛋白以SilkII结构存在于复合膜中。随着PEG添加量的增加，在2θ为20°左右的衍射峰强度增大，衍射峰逐渐变尖锐，推断其结晶度降低，说明PEG与SA、SF组分间的化学键减弱，组分分离。
③DSC采用德国Netzsch公司的DSC-204示差扫描量热计进行测试，测量范围-60～400℃，以N2作为保护气，铝坩埚盛放样品，升降温速率均为10～20℃/min。④本发明采用的是生产厂家为德国NETZSCH公司的TG-209C型热失重分析仪。测试方法：在N2保护下，测试温度范围为室温至750℃/min，变温速率为10℃/min。图3中可以看出，100℃左右是自由水的蒸发形成的吸热峰；230℃左右的分解峰是分子内结合水的释放，分子结构需要重排，α-螺旋结构及无规卷曲部分剧烈分子运动转化成β-折叠结构状态引起的，即silkI结构会转变成低结晶度β-sheet构象。310℃左右是部分丝素结晶，SF分子链由非晶区到晶区开始断裂，出现明显的分解吸热峰，是SF分子中的高结晶取向的β-sheet构象造成的，370℃左右是丝素分子中结晶部分的分解峰，说明丝素蛋白分子的结晶均发生分解。图4中可以看出，随着PEG量的增大，在180-360℃内，复合膜失重比例先增大后减少，在360-500℃范围内，复合膜的失重比例大致相同。由于PEG的加入，复合膜中的氢键增多，与Ca2+络合的蛋壳结构减少，使得其膜内的构象不稳定，致使膜的失重比例增加，加入量增多后，虽然发生组分分离，但是形成了非常致密的表面膜结构，保护内层结构，因而失重速率下降。
⑤将已经制备好的SA/SF膜样品裁剪成50mm×10mm的长方形，取三个不同的点用游标卡尺测量其厚度，记录数据并计算其平均厚度(δ)。依据GB13022-91，采用微机控制电子万能试验机(WDW-1010型)对裁剪好的样品条进行机械性能的测试，其中测试内容包括断裂伸长率和拉伸断裂强度。测试的环境温度为25℃，相对湿度为70％，夹距为1cm，夹持长度为2cm，以5mm/min的拉伸速度，同一样品在相同条件下平行测定五次，取其平均值。
计算复合膜的断裂伸长率和拉伸断裂强度，其公式如下：
Figure GDA0003913507680000111
Figure GDA0003913507680000112
式中：Rm为SA/SF膜的拉伸断裂强度，MPa；F为膜拉断时所承受的最大拉力，N；δ为膜的平均厚度，mm；d为膜的宽度，mm；ε为断裂伸长率，％；L为膜变形后的断裂长度，mm；L0为膜的原长，mm。
从图6-7可以看出，随着SF的增加其断裂伸长率先增加，当达到50％左右时，开始降低。故，优选的，SF的质量为40-60％左右。从图8-9可以看出，断裂伸长率和拉伸断裂强度随着PEG的增加先增加，当PEG含量达到9％时，开始降低。故，优选的，PEG含量为9％左右。
载药复合膜的制备：
在铺膜进行2h后，加入一定量的罗丹明B溶液，以300rmp搅拌0.5h，在聚四氟乙烯培养皿中进行铺膜操作，在电热恒温鼓风干燥箱50℃下烘干24h后，用蒸馏水清洗5次后，在30℃下干燥，取出备用。
药物缓释过程：
将载药复合膜放入到具塞锥形瓶中，并加入100mL的PBS缓冲溶液，将具塞锥形瓶放入到温度为37℃、速率为100r/min的水平式摇动的恒温振荡摇床中。分别在0.5h、1h、2h、3h、5.5h、8h、10.5h、13h、24h、48h和72h后分别取5mL溶液于10mL离心管中，做好标记后准备待用。在每次取样之后向具塞锥形瓶中加入5mL的PBS缓冲溶液，以保证其总体积不变，请参见图10，图10为各个材料的缓释曲线图。
以上所述仅为本发明的优选实施方式而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种丝素蛋白/海藻酸钠复合膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，将丝素蛋白溶液缓慢滴加到海藻酸钠溶液中，搅拌并在65～75℃范围内水浴加热，并调节pH值到8.8～9.2，其中，丝素蛋白与海藻酸钠的质量比为2～8:8～2；
S2，将PEG溶液滴加到反应溶液中充分反应，其中，PEG的质量占所述丝素蛋白与所述海藻酸钠总重量的3～15％；
S3，将反应后的溶液铺膜，然后烘干；
S4，将烘干后的薄膜用CaCl2溶液浸泡后，清洗并干燥。
2.如权利要求1所述的丝素蛋白/海藻酸钠复合膜的制备方法，其特征在于，所述丝素蛋白为α结构丝素蛋白粉末。
3.如权利要求2所述的丝素蛋白/海藻酸钠复合膜的制备方法，其特征在于，所述α结构丝素蛋白粉末的制备方法包括：
S11，将柞蚕壳脱胶获得柞蚕丝素纤维；
S12，将所述柞蚕丝素纤维溶解于Ca(NO3)2·4H2O中形成混合液；
S13，将所述混合液倒入到透析袋内，浸没在去离子水中，在4℃恒温透析；透析后，将透析袋中的溶液离心处理获得上层溶液；然后将所述上层溶液冷冻干燥得到α结构丝素蛋白粉末。
4.如权利要求3所述的丝素蛋白/海藻酸钠复合膜的制备方法，其特征在于，在步骤S11，所述将柞蚕壳脱胶获得柞蚕丝素纤维的步骤包括：
将Na2CO3或NaHCO3溶液加热至100℃，然后加入柞蚕壳加热煮沸10～60min后将柞蚕丝倒出用去离子水搓洗干净，重复两次以上步骤后，烘干得到脱胶后的柞蚕丝素纤维。
5.如权利要求3所述的丝素蛋白/海藻酸钠复合膜的制备方法，其特征在于，在步骤S12，所述将所述柞蚕丝素纤维溶解于Ca(NO3)2·4H2O中形成混合液的步骤包括：
将Ca(NO3)2·4H2O加热至融化为液体状态后，加入称量好的柞蚕丝素纤维，加热搅拌2～10h，其中，所述Ca(NO3)2·4H2O与所述柞蚕丝素纤维的质量比为1:30～40。
6.如权利要求3所述的丝素蛋白/海藻酸钠复合膜的制备方法，其特征在于，在步骤S13，所述将所述混合液倒入到透析袋内，浸没在去离子水中，在4℃恒温透析的步骤包括：
每隔十二个小时换一次水，共透析72h。
7.如权利要求3所述的丝素蛋白/海藻酸钠复合膜的制备方法，其特征在于，在步骤S3，所述将反应后的溶液铺膜，然后烘干的步骤包括：
在聚四氟乙烯培养皿中铺膜，然后在干燥箱50℃下烘干24h。
8.如权利要求3所述的丝素蛋白/海藻酸钠复合膜的制备方法，其特征在于，在步骤S4，所述将烘干后的薄膜用CaCl2溶液浸泡的步骤包括：
将烘干后的薄膜用1.4wt％的CaCl2溶液10mL浸泡1.5h后，然后并用蒸馏水冲洗五次，并在30℃下干燥。
9.一种丝素蛋白/海藻酸钠复合膜，其特征在于，所述丝素蛋白/海藻酸钠复合膜为通过权利要求1-8任一项的方法获得。
10.一种药物缓释载体材料，其特征在于，包括权利要求9所述的丝素蛋白/海藻酸钠复合膜。
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