CN114504657A - 一种用于治疗杜氏肌营养不良症的生物矿化纳米材料及基因编辑系统 - Google Patents

一种用于治疗杜氏肌营养不良症的生物矿化纳米材料及基因编辑系统 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种用于治疗杜氏肌营养不良症的生物矿化纳米材料及基因编辑系统，该生物矿化纳米材料，按体积份数计包括如下组分：碳酸盐1份，可溶性钙盐2～5份，高分子包被材料0.5份，缓冲液18～20份；其中，所述碳酸盐包括但不限于Na2CO3和K2CO3；所述可溶性钙盐包括但不限于CaCl2；所述高分子包被材料包括但不限于PVP和PAA；所述缓冲液的pH=7～8，且其中不含碳酸根；该生物矿化纳米材料可以高效地搭载CRISPR/Cas9质粒，且可保护质粒在血清中免受降解，实现在细胞内及生物体内基因编辑。本发明基因编辑系统为采用所述生物矿化纳米材料为基础载体搭载CRISPR/Cas9质粒系统用于治疗杜氏肌营养不良症，具有广阔的应用前景及医疗价值。

Description

一种用于治疗杜氏肌营养不良症的生物矿化纳米材料及基因 编辑系统
技术领域
本发明涉及一种用于治疗杜氏肌营养不良症的生物矿化纳米材料及基因编辑系统。
背景技术
杜氏肌营养不良症，也称假肥大性肌营养不良（DMD），是由抗肌萎缩蛋白基因（Dystrophin，Dys）突变所致。DMD是隐性遗传性疾病，也是儿童早期最常见的遗传性肌肉疾病，其在男性中的患病率为1/5000。DMD基因编码的是肌营养不良蛋白（dystrophin），它与心肌和骨骼肌的肌膜相关，对维持和支持肌肉组织的结构和功能至关重要。DMD基因突变会导致肌营养不良蛋白表达的缺失，致使DMD患者出现严重的肌肉萎缩，心肌衰竭和呼吸衰竭，并且大部分患者30岁前就会死亡。
DMD基因的突变主要由外显子缺失引起，外显子的缺失会导致突变出终止密码子，进而破坏了mRNA的读取，导致肌营养不良蛋白的表达过早停止。对于DMD治疗而言，目前主要有三种方式。其一，是通过皮质类固醇药物治疗。这种治疗方式也是目前最常见的方式，例如糖皮质激素，它可以显著的延长患者寿命，但是长期使用会对患者产生很多副作用，如骨质疏松，免疫抑制等。其二，通过破坏终止密码子允许产生功能性全长杜氏肌营养不良蛋白。这种方式存在高剂量长期使用下导致患者耳毒性和肾毒性的问题，不过针对这个问题也出现了替代药物Ataluren，其是一种非氨基糖苷类药物，可以持续破坏终止密码子，并且也是FDA（美国食品药品监督管理局）批准的第一种治疗DMD根本原因的药物。其三，是通过跳过突变外显子的剪切区恢复肌营养不良蛋白表达及功能，即通过跳过突变的外显子纠正DMD阅读框恢复缺失的营养不良蛋白表达。理论上，跳过外显子剪切区是治疗DMD的有效策略，针对这一理念开发的寡核苷酸小分子药物Eteplirsen (EXONDYS 51)即可跳过51号外显子的剪切区，恢复肌营养不良蛋白的部分功能，并且该药物也已被FDA批准。然而，Eteplirsen需要长期服用，有研究显示需服用至少1年以上，且尚无足够的证据证明Eteplirsen对DMD的治疗效果，因此FDA的批准也饱受争议。
CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short PalindromicRepeats/CRISPR-associated9成簇规则间隔短回文重复序列）系统具有高效、多功能性和设计简单的优点，极大地促进了哺乳动物基因组编辑的研究。有文献报道称利用腺相关病毒（AAV）介导的CRISPR/Cas9系统靶向突变的51号外显子的剪切区，在小鼠和比格犬体内实现了跳过51号外显子纠正阅读框恢复肌营养不良蛋白的下游表达。然而，病毒载体目前争议较多，例如其搭载能力有限，可能存在免疫原性和整合的风险等问题；且与非病毒载体相比，DNA片段随机整合和Cas9持续表达的效率更高，这可能会导致较高的脱靶概率。因此，由于病毒载体存在以上的缺陷，限制了CRISPR/Cas9在基因编辑方面的深入研究。
随着将CRISPR/Cas9以非病毒方式递送的纳米材料的发展，开发以CRISPR/cas9为基础的非病毒传递方法有很大的潜力。许多研究者已经将CRISPR/Cas9系统以DNA、RNA(sgRNA+ Cas9 mRNA的体外转录本，IVTs)或蛋白质(Cas9蛋白+ sgRNA的核糖核蛋白复合物)的形式递送。且纳米材料不仅可以高效搭载多种形式的CRISPR，而且具有较好的生物相容性，其瞬时表达的特性，降低了免疫原整合风险及脱靶概率，更重要的是可以通过修饰纳米材料起到对组织的靶向研究。现在已经报道了很多纳米材料递送CRISPR治疗疾病的相关研究。例如，Si-Xue Cheng等人利用适配体和肽修饰的纳米材料搭载CRISPR质粒来抗肿瘤，Hye Young Lee等人利用金纳米球搭载RNP治疗脆性X染色体综合征，Xin Zhang等人利用可追踪的纳米生物复合物搭载CRISPR质粒治疗神经退行性疾病，还有目前已被美国食品药品监管局批准的脂质体治疗晚期胰腺癌等等。然而，如何利用纳米材料递送CRISPR治疗DMD尚鲜少见报道。
发明内容
针对上述存在的问题，本发明提供一种用于治疗杜氏肌营养不良症的生物矿化纳米材料及基因编辑系统，首先制备一种生物矿化纳米材料，用于递送CRISPR，实现在细胞内及体内基因编辑，可进一步实现治疗或预防杜氏肌营养不良症；该方法具有简捷、高效、安全等优势，拓展了CRISPR系统在DMD治疗中的应用。具体技术方案如下：
首先，本发明提供一种用于治疗杜氏肌营养不良症的生物矿化纳米材料，该生物矿化纳米材料，按体积份数计包括如下组分：
碳酸盐1份，
可溶性钙盐2～5份，
高分子包被材料 0.5份，
缓冲液18～20份；
其中，所述碳酸盐包括但不限于Na2CO3和K2CO3；所述可溶性钙盐包括但不限于CaCl2；所述高分子包被材料包括但不限于PVP和PAA；所述缓冲液不含碳酸根。
优选的，所述碳酸盐的浓度为40～200mM；所述可溶性钙盐的浓度为180～460mM；所述高分子包被材料的浓度为1M；所述缓冲液的pH=8.0，其含有50 mM Tris-HCl、300 mMNaCl和20%的甘油。
其次，本发明提供一种用于治疗杜氏肌营养不良症的基因编辑系统，该基因编辑系统为采用前述的生物矿化纳米材料作为基础载体搭载CRISPR/Cas9质粒系统；具体的搭载及矿化过程包括如下步骤：
1）质粒准备：将设计的CRISPR/Cas9质粒系统与鱼精蛋白共孵育，形成待被搭载的目标质粒；
2）搭载矿化：将准备好的目标质粒与碳酸盐溶液混合均匀后再加入到缓冲液中混合均匀，然后加入可溶性钙盐，并进行快速涡旋混合，得到搭载目标质粒的矿化纳米颗粒悬浮液；
3）高分子包被：向得到的矿化纳米颗粒悬浮液中加入高分子包被材料，并静置使高分子材料包被在矿化的纳米颗粒上；
4）离心沉淀：将高分子包被后的矿化纳米颗粒悬浮液进行离心，获得搭载目标质粒的矿化纳米颗粒沉淀物；
5）分散重悬：将离心得到的搭载了目标质的粒矿化纳米颗粒沉淀物用DMEM或超纯水分散重悬，获得所需浓度的生物矿化纳米颗粒重悬液以用于基因编辑或用于制备预防及治疗杜氏肌营养不良症的药物。
作为优选的技术方案的，步骤1）中，所述CRISPR/Cas9质粒系统与鱼精蛋白共孵育，鱼精蛋白的用量与CRISPR/Cas9质粒系统的质量比为：鱼精蛋白:CRISPR/Cas9质粒系统=1:1～1:5；共孵育的条件为室温温度下共孵育20～40min。
作为优选的技术方案的，步骤2）中，所述搭载矿化，加入的目标质粒的量为0.1～10μg；所述快速涡旋混合的搅拌速度为500～2000rpm/min混合时间为30s～1min.
作为优选的技术方案的，步骤3）中，所述高分子包被的静置时间为30min，包被后的矿化的纳米颗粒形貌为直径100～120nm的圆球状；步骤4）中，所述离心沉淀的离心速率为8000～10000rmp，离心时间为10min。
前述的用于治疗杜氏肌营养不良症的基因编辑系统，高分子包被之前还设有细胞跨膜肽吸附步骤，具体为：搭载矿化后，将细胞跨膜肽溶液逐滴滴加至得到矿化纳米颗粒悬浮液中，并于室温下磁力搅拌10min，以将细胞跨膜肽吸附于矿化纳米颗粒的表面，然后进行高分子包被。
作为优选的技术方案的，所述细胞跨膜肽为来源于HIV病毒的细胞跨膜肽TAT，其序列为RKKRRQRRR，且该细胞跨膜肽的工作溶液浓度为10μg/μL，滴加量为10～50μL。
前述的用于治疗杜氏肌营养不良症的基因编辑系统，步骤1）中，所述CRISPR/Cas9质粒系统为CRISPR变体无PAM限制基因编辑系统，其用于破坏Dys基因的51号外显子；该CRISPR/Cas9质粒系统的靶序列为SEQ51-1～SEQ51-4中的任意一种：
SEQ51-1：CACCAGAGCTAACACTCTGAGTAG，
SEQ51-2：TCACCAGAGCTAACACTCTGAGTA，
SEQ51-3：GTGGTCTCATTGTCAGACTCATC，
SEQ51-4：AGTGGTCTCATTGTCAGACTCAT。
前述的用于治疗杜氏肌营养不良症的基因编辑系统，步骤4）中，所述基因编辑包括细胞内基因编辑和生物体内基因编辑；其中所述细胞内基因编辑具体为：将制备的生物矿化纳米颗粒用DMEM重悬获得浓度为0.1～10mg/mL的生物矿化纳米颗粒重悬液，然后以与细胞培养基体积比1:5～1:10的比例直接加入到细胞培养皿中，进行细胞培养48小时后，提取细胞的基因组进行检测其基因突变情况；所述生物体内基因编辑具体为：将制备的用DMEM重悬获得浓度为50～100mg/μL的生物矿化纳米颗粒重悬液，通过肌肉注射或静脉注射的方式注射在小鼠体内；其中肌肉注射为每天2针，每次100μL，持续注射三天后提取小鼠肌肉组织的基因组进行检测其基因突变情况。
本发明的有益效果：
1）本发明纳米材料矿化方法灵感源自于大自然中的生物矿化过程，碳酸盐和可溶性钙盐之间的反应条件温和，不会对内部搭载的核酸等造成损伤，并能保持核酸的高活性；且本发明生物矿化方法是在生理环境下进行的，矿化材料没有经过复杂的化学修饰，制备成本低，制备方法快速简单；本发明生物矿化纳米材料可以高效地搭载质粒，且搭载质粒的大小远超病毒载体，搭载质粒的容量也远超大部分以静电吸附作用力搭载质粒的其他非病毒载体。
2）本发明选择的碳酸盐和可溶性钙盐之间反应生成碳酸钙，在进入核内体的酸性环境后碳酸钙溶解，形成具有缓冲能力的碳酸根，其可不断结合核内体膜表面的质子泵形成“质子海绵”效应主动运输的氢离子，使核内体内的渗透压不断升高，从而涨破核内体，使得搭载的质粒释放进细胞质内以便进行基因编辑。
3）本发明缓冲液选择含有50mMTris-HCl、300mMNaCl和20%的甘油的复合缓冲液，且将其pH控制在8.0，碳酸盐浓度控制为40～200mM，可溶性钙盐浓度控制为180～460mM，确保高分子材料包被后有效控制纳米颗粒的粒径为100～120nm，提高其被细胞内吞的效果。
4）本发明CRISPR/Cas9质粒在被搭载前先与鱼精蛋白进行共孵育，鱼精蛋白上有核定位序列可以帮助质粒进入细胞核提高基因编辑效率；本发明采用来源HIV病毒的细胞跨膜肽TAT吸附在碳酸钙表面，该TAT细胞跨膜肽富含碱性氨基酸，其携带极强的正电荷，在搭载目标质粒的生物纳米颗粒被内吞后能够有效协助其突破核内体屏障，实现所搭载的目标质粒高效地在细胞内转运。
5）本发明生物矿化纳米材料递送目标质粒，可以很好的保护质粒免受血清的降解；实现在加入血清的情况下进行细胞培养转染，相较于大部分纳米材料在转染的时候都需要在无血清或者低血清的环境下才能实现培养转染的实验方式，细胞转染率高，转染效果好。且实验表明本发明基因编辑系统不仅能在10%的血清中保护质粒免受降解，并且在高浓度（20%～30%血清）血清下仍可以保护质粒不失活，为实现将其在体内应用提供有力的支撑。
6）本发明中所使用的碳酸钙及其细胞跨膜肽均来源于自然界，均为生物体中的物质，其具有良好的生物相容性，且使用同样具有生物相容的PVP进行包被，使其在细胞内和组织内的环境下更加稳定。本发明生物矿化纳米材料与细胞共孵育48小时没有出现细胞死亡，将其注射到小鼠体内后组织切片也没有出现炎症，证明了其生物相容性极好，且安全、无风险的优点，可以用于递送CRISPR质粒进行基因编辑治疗杜氏肌营养不良症及应用在活体实验中。
7）本发明的采用的CRISPR/Cas9质粒系统为CRISPR变体无PAM限制基因编辑系统，其用于破坏Dys基因的51号外显子，而其下游的52～79号外显子都可以正常的编码，以恢复肌营养不良蛋白的功能，且其在体内为瞬时表达，这大大减少了整合风险和脱靶概率，为治疗杜氏肌营养不良症提供新的途径。
8）此外，本发明的生物矿化纳米材料还可以作为基底，在其表面修饰聚合物，生物膜，受体或靶向肽等，以靶向进入病灶区或者突破血脑屏障治疗或改善其他疾病，具有广阔的应用前景及医疗价值。
附图说明：
图1为本发明构建的基因编辑系统结构示意图；
图2为本发明生物矿化后的上清凝泳胶电泳图；
图3为本发明为生物矿化的纳米颗粒电镜图；
图4为本发明生物矿化的纳米颗粒的电子衍射图；
图5为本发明细胞毒性检测结果；
图6为本发明小鼠组织切片检测结果；
图7为本发明搭载质粒的生物矿化纳米颗粒在细胞内共定位聚焦图片；
图8为本发明矿化质粒在转染48小时细胞内瞬时表达的共聚焦图片；
图9为本发明矿化质粒转染细胞三天和十天的激光共聚焦图；
图10为本发明矿化质粒转染细胞三天和十天的蛋白质印迹；
图11为本发明矿化后的质粒在10%FBS中孵育后琼脂糖凝胶电泳图片；
图12为本发明矿化后的质粒在不同浓度血清下细胞激光共聚焦显微镜图；
图13为本发明四个不同靶点的PCR-RE电泳结果；
图14为本发明四个不同靶点的NGS测序；
图15为本发明小鼠组织切片荧光观察结果；
图16为本发明小鼠肌肉组织基因组NGS数据。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例及附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。其中，实施例1是一种制备生物矿化纳米材料的方法，实施例2～8是根据实施例1中生物矿化纳米材料矿化方法，制备搭载CRISPR/Cas9质粒系统的纳米基因编辑系统，并进行细胞及小鼠体内基因编辑。
实施例1
本实施例是制备一种生物矿化纳米材料，该生物矿化纳米材料按体积份数计包括碳酸盐1份，可溶性钙盐2～5份，高分子包被材料0.5份，缓冲液18～20份；其中，所述可溶性磷酸盐包括但不限Na2CO3和K2CO3，其浓度为40～200mM；所述可溶性钙盐包括但不限于CaCl2，其浓度为180～460mM；所述高分子包被材料包括但不限于PVP或PAA，其浓度为1M；所述缓冲液选择含有50mM Tris-HCl、300mM NaCl和20%的甘油的复合缓冲液，且其pH控制在8.0，不含碳酸根，确保控制高分子材料包被后的纳米颗粒的粒径，确保其被细胞内吞的效果。本实施例所述的生物矿化纳米材料，其制备方法为：先将碳酸盐与0.1～10μg的被搭载物混合均匀，再加入到缓冲液中混合均匀后加入可溶性钙盐，再次混合均匀使其矿化形成矿化纳米颗粒；然后加入高分子包被材料静置包被，将包被后的矿化纳米颗粒离心沉淀即可获得生物矿化纳米材料。
本实施例所述的生物矿化纳米材料其矿化方法灵感源自于大自然中的生物矿化过程，碳酸盐和可溶性钙盐之间的反应条件温和，不会对内部搭载的核酸等造成损伤，并能保持核酸的高活性；且本发明生物矿化方法是在生理环境下进行的，矿化材料没有经过复杂的化学修饰，制备成本低，制备方法快速简单；本发明生物矿化纳米材料可以高效地搭载质粒，且搭载质粒的大小远超病毒载体，搭载质粒的容量也远超大部分以静电吸附作用力搭载质粒的其他非病毒载体。且本实施例生物矿化纳米材料碳酸盐和可溶性钙盐之间反应生成碳酸钙，在进入核内体的酸性环境后碳酸钙溶解，形成具有缓冲能力的碳酸根，其可不断结合核内体膜表面的质子泵形成“质子海绵”效应主动运输的氢离子，使核内体内的渗透压不断升高，从而涨破核内体，使得搭载的质粒释放进细胞质内以便进行基因编辑，可用于研究靶点基因编辑或制备用于预防或治疗疾病的药物。
使用本实施例所述的生物矿化纳米材料可实现细胞内基因编辑，搭载了CRISPR/Cas9质粒系统的生物矿化纳米材料可转染MCF-7细胞，鼠源细胞或者是干细胞，进行靶点基因编辑；具体过程为：将搭载CRISPR/Cas9质粒的生物矿化的纳米颗粒使用DMEM或ddH2O重悬，浓度为0.1～10mg/mL，然后以与细胞培养基体积比1:5～1:10的比例加入到细胞培养皿中，并放入细胞培养箱中48小时，然后提取细胞基因组检测基因突变情况。本实施例所述的生物矿化纳米材料还可以实现在生物体内进行基因编辑，例如可将搭载CRISPR/Cas9质粒系统的生物矿化的纳米颗粒悬液，浓度为50～100mg/μL，直接肌肉注射或静脉注射到小鼠体内。肌肉注射每天2针，每次100μL，持续治疗三天，然后取小鼠肌肉组织，分别进行组织切片和提取基因组检测基因突变情况。静脉注射，可以修饰PEG、聚羟基甜菜碱或者聚磺基甜菜碱后进行，具有简捷、高效、安全等优势。
此外，本实施例所述的生物矿化材料还可以作为基底在其表面修饰聚合物、生物膜、受体或靶向肽等，可以靶向病灶区或者突破血脑屏障，治疗或改善其他疾病。例如，使用该生物矿化纳米材料搭载质粒或治疗DMD的药物或修饰肌营养不良症蛋白的基因等治疗杜氏肌营养不良症。且本实施例所述的生物矿化纳米材料经实验验证，其对细胞及生物体均无毒可直接应用在活体实验中；并且经验证本实施例所述的生物矿化纳米材料可保护质粒在血清中免受降解，并且在高浓度（20%～30%血清）血清下仍可以保护质粒不失活，可以在体内应用，具有重要的医疗应用前景及价值。
实施例2
本实施例是根据实施例1中生物矿化纳米材料矿化方法，搭载构建的CRISPR/Cas9质粒，形成纳米基因编辑系统，该基因编辑系统结构如图1所示。目标质粒的搭载及生物矿化具体过程如下：
本实施例中，构建的CRISPR/Cas9质粒为CRISPR的变体无PAM限制的基因编辑系统，其靶序列设计为SEQ51-1～SEQ51-4中的任意一种：
SEQ51-1：CACCAGAGCTAACACTCTGAGTAG，
SEQ51-2：TCACCAGAGCTAACACTCTGAGTA，
SEQ51-3：GTGGTCTCATTGTCAGACTCATC，
SEQ51-4：AGTGGTCTCATTGTCAGACTCAT。
具体的搭载及生物矿化过程如下：
1）质粒准备：将设计的CRISPR/Cas9质粒系统与鱼精蛋白共孵育，形成待被搭载的目标质粒；鱼精蛋白上有核定位序列可以帮助质粒进入细胞核提高基因编辑效率。鱼精蛋白的用量与CRISPR/Cas9质粒系统的质量比为：鱼精蛋白:CRISPR/Cas9质粒系统=1:1～1:5，优选为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5，最优选为1:5；共孵育的条件为室温温度下共孵育20～40min，优选为共孵育30min。
2）搭载矿化：取8μg准备好的目标质粒与体积份为1份，浓度为100mM的Na2CO3溶液混合均匀，然后加入到体积份为19份的缓冲液中再次混合均匀，之后加入体积份为3份，浓度为200mM的CaCl2溶液，并进行快速涡旋混合，快速涡旋混合的搅拌速度为500～2000rpm/min混合时间为30s～1min，得到搭载目标质粒的矿化纳米颗粒悬浮液。
3）细胞跨膜肽吸附：将源于HIV病毒的细胞跨膜肽TAT（其序列为RKKRRQRRR）溶液逐滴滴加至得到矿化纳米颗粒悬浮液中，并于室温下磁力搅拌10min，以使TAT吸附于矿化纳米颗粒的表面，所述细胞跨膜肽TAT的工作溶液浓度为10μg/μL，滴加量为10～50μL。由于TAT细胞跨膜肽富含碱性氨基酸，其携带极强的正电荷，在搭载了目标质粒的生物纳米颗粒被内吞后能够有效协助其突破核内体屏障，实现所搭载的目标质粒高效地在细胞内转运。
4）高分子包被：向得到的矿化纳米颗粒悬浮液中加入体积份为0.5份，浓度为1M的高分子包被材料PVP，然后静置30min使高分子材料包被在矿化的纳米颗粒上，控制生物矿化纳米颗粒的粒径大小，保证后续的实验效果。
5）离心沉淀：将高分子包被后的矿化纳米颗粒悬浮液进行离心，离心速率为8000～10000rmp，离心时间为10min，获得搭载目标质粒的矿化纳米颗粒沉淀物。
6）分散重悬：最后将离心得到的搭载了目标质的粒矿化纳米颗粒沉淀物用DMEM或超纯水ddH2O分散重悬，得到一定浓度的生物矿化纳米颗粒重悬液，备用。
取上述离心得到的上清进行琼脂糖凝胶电泳，同时采用分散重悬的生物矿化纳米颗粒重悬液进行琼脂糖凝胶电泳对照。结果如图2所示，分散重悬的生物矿化纳米颗粒重悬液凝胶电泳结果可以看到明显的条带，而在离心得到的上清中电泳结果已经不残留质粒，说明质粒已经全部被搭载上。另外，通过透射电子显微镜对矿化后的矿化纳米颗粒进行表征，结果如图3所示，该生物矿化纳米颗粒呈粒径约为100～120nm的圆球形貌；而对矿化后的矿化纳米颗粒进行电子衍射测试，结果如图4所示，图中显示无衍射环及衍射点出现，证明本实施例的矿化纳米颗粒中的碳酸钙为无定形碳酸钙，通过元素分析（TEM-mapping）结果显示，C、N元素为质粒的特有元素，Ca为碳酸钙的成分，这些元素共定位在同一纳米颗粒中，也证明目标质粒被成功搭载进生物矿化纳米颗粒中，形成基因编辑系统。
实施例3
本实施例是对实施例2中构建的基因编辑系统的生物毒性进行测定。具体如下：
1）细胞共孵育毒性测试。首先将制备的搭载目标质粒的生物矿化纳米颗粒使用DMEM重悬，获得的浓度为2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL和10mg/mL的生物矿化纳米颗粒重悬液用于生物毒性测试，同时采用PBS作为对照。将MCF-7细胞接种于96孔板中（每孔5×103个细胞），24h后加入上述制备的不同浓度的生物矿化纳米颗粒重悬液及PBS，加入量均以与细胞培养基体积比1:10的比例加入，放入细胞培养箱中48小时，然后在每孔中加入MTT试剂，再于CO2培养箱中孵育4h，各孔均产生蓝紫色晶体沉淀，即MTT被线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原成甲臜Formazan在细胞中沉淀，而死细胞没有这个功能，这说明生物矿化纳米颗粒重悬液与MCF-7细胞共孵育48小时后，细胞仍然存活。然后仔细抽吸各孔的培养基，以防止细胞破裂，每孔加入二甲亚砜（100μL），37℃孵育10min，直至晶体全部溶解。再用酶标仪在570hm波长处检测吸光值，反映活细胞数量，结果如图5所示，随着矿化纳米颗粒的浓度增加，细胞的存活率没有很大的改变，并且都在100%左右，说明实施例2中构建的基因编辑系统对细胞没有任何毒性。
2）生物体毒性测定。将制备的生物矿化纳米颗粒使用DMEM重悬，获得浓度为60mg/μL的生物矿化纳米颗粒重悬液，注射到小鼠肌肉组织，每天2针，每次100μL，注射三天。完成注射后，取出小鼠心、肝、脾、肺、肾和肌肉组织进行组织切片，观察出现炎症情况，结果如图6所示，注射完生物矿化纳米颗粒重悬液的小鼠各器官组织切片没有出现任何炎症，说明实施例2中构建的基因编辑系统对小鼠等生物体也没有任何毒性。
实施例4
本实施例是为了探究实施例2构建的基因编辑系统的矿化纳米颗粒在细胞内的转运路径。具体过程如下：
按照实施例2的搭载及生物矿化过程将CRISPR/Cas9质粒换成有Cy3标记的CRISPR/Cas9质粒，得到搭载Cy3标记的CRISPR/Cas9质粒生物矿化纳米颗粒重悬液，分散浓度为10mg/mL。将该生物矿化纳米颗粒重悬液按体积比为1:10的比例加入到MCF-7细胞培养基中，孵育3.5小时，向细胞培养基中加入溶酶体红色荧光探针（Lyso Tracker Red DND-99）和细胞核染料（Hoechst 33342）对细胞的溶酶体和细胞核染色，再继续共孵育0.5小时，然后进行共聚焦拍摄，结果如图7所示，搭载了Cy3标记的CRISPR/Cas9质粒生物矿化纳米颗粒与溶酶体共定位，并且可以观察到少量化纳米颗粒与细胞核共定位；这说明搭载了目标质粒的生物矿化纳米颗粒在细胞内的转运路径为：先溶酶体逃逸 ，然后进入细胞核。
实施例5
本实施例是验证实施例2构建的基因编辑系统对细胞的转染情况及转染后目标质粒在细胞内的表达情况。具体过程如下：
按照实施例2的搭载及生物矿化过程将CRISPR/Cas9质粒换成可同时转录翻译出Cas9蛋白和绿色荧光蛋白的标记质粒，然后用DMEM分散得浓度为10mg/mL的生物矿化纳米颗粒重悬液；然后将该生物矿化纳米颗粒重悬液按体积比1:10的比例加入到含有10%血清（v/v）的MCF-7细胞培养基中，并将其放入细胞培养箱中培养48小时进行转染，然后共聚焦检测绿色荧光蛋白和Cas9蛋白的表达情况。由于搭载的质粒可以同时转录翻译出Cas9蛋白和绿色荧光蛋白，这两种蛋白之间由P2A连接，当质粒成功进入细胞核并成功转录翻译出Cas9蛋白和绿色荧光蛋白后，P2A会自动熔断，两种蛋白会分开，互不干扰，因此产生绿色荧光蛋白的同时则说明成功表达了Cas9蛋白。
本实施例中，转染48小时的共聚焦结果如图8所示，转染效率为30%～40%，说明搭载标记质粒的生物矿化纳米颗粒被成功的递送到细胞中。将转染成功的细胞继续培养，分别在转染3天和10天再次拍摄共聚焦，结果如图9所示，转染3天荧光减弱，转染10天后已没有任何荧光。另外，将转染3天、10天的细胞和未作转染的WT细胞分别提取蛋白进行蛋白印迹实验，结果如图10所示，转染3天有明显的Cas9蛋白，而到第10天的时候就不再表达Cas9蛋白。这均说明搭载了CRISPR/Cas9质粒的生物矿化纳米颗粒对细胞对的转染是瞬时转染，这个优点会大大减少整合风险和脱靶概率，为构建的基因编辑系统应用于活体实验提供了依据。
实施例6
本实施例是为了验证实施例2中构建的基因编辑系统对其搭载的质粒具有保护作用。具体过程如下：
实验组：将实施例2中制备的搭载了目标质粒的生物矿化纳米颗用ddH2O分散成浓度为100mg/μL生物矿化纳米颗重悬液；将其分装成6管，每管10μL，并分别加入1μL的血清，即血清浓度为10%（v/v）；于37℃条件下，分别孵育10min、20min、30min、40min、50min和60min取出，加蛋白酶K后58℃反应10分钟，去除血清中的各种酶，90℃灭活2分钟，去除蛋白酶K，获得6组实验样品。对照组：将生物矿化过程中的CaCl2换成ddH2O，并且不进行高分子包被，获得搭载目标质粒的纳米颗粒对照悬液；然后以与实验组同样的处理方式得到6组对照样品。
将所有的实验样品及对照样品进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图11所示，1～6为实验样品电泳结果，7～12为对照样品电泳结果。可以看到，实验样品在孵育60min后仍有清晰的质粒条带，而对照组样品在孵育10min后质粒就已经被血清中的核酸酶完全降解出现了弥散的条带，这说明该基因编辑系统的生物矿化纳米颗对其搭载的质粒有很好的保护作用可以免受血清的降解。
为了进一步验证该基因编辑系统对其搭载的质粒的保护情况，本实施例对其在不同浓度血清下进行转染验证。按照实施例2的搭载及生物矿化过程将CRISPR/Cas9质粒换成可同时转录翻译出Cas9蛋白和绿色荧光蛋白的标记质粒，获得相应的生物矿化纳米颗粒，并用ddH2O分散成浓度为100mg/μL生物矿化纳米颗重悬液。然后将该生物矿化纳米颗重悬液按体积比1:10的比例分别加入到血清浓度10%、20%和30%的细胞培养基中，然后放入细胞培养箱中培养，48小时后共聚焦检测绿色荧光蛋白和Cas9蛋白的表达情况。结果如图12所示，在不同血清浓度的条件下，细胞表达出绿色荧光蛋白的量不受影响，这说明基因编辑系统不仅可实现在体外实验中，不仅可保护质粒不被低浓度的血清降解，并且在更高的血清浓度下也有一定的保护效果；且在高浓度的血清环境下，本实施例构建的基因编辑系统对细胞转染效果并未产生影响，这个优点为实施例2中构建的基因编辑系统实现细胞内基因编辑直及接应用到生物体内治疗DMD提供有力的理论支撑。
实施例7
本实施例是采用实施例2中构建的基因编辑系统实现细胞内基因编辑。具体如下：
将实施例2中制备的搭载靶序列SEQ51-1～SEQ51-4基因编辑系统的生物矿化纳米颗粒，用DMEM分散得到浓度为10mg/mL的生物矿化纳米颗粒重悬液。然后将各生物矿化纳米颗粒重悬液按体积比1:10的比例直接加入到含10%血清的MCF-7细胞培养基中，并均放入细胞培养箱中48小时，然后提各细胞的基因组，进行PCR扩出靶标片段并进行高通量（NGS）测序，结果如图13和图14所示：图13为PCR-RE的实验结果，这表明每个靶点都存在基因突变，但是突变效率有所不同；图14为NGS测序结果，可见四种不同靶点产生的基因突变类型中，插入一个碱基T的突变概率最高，这种在51号外显子的剪切区形成的插入T的突变，不仅可以移走因为DMD基因突变过早产生的终止密码子，还可以恢复整个51号外显子的编码，达到治疗DMD的效果。即便出现小概率的其他插入或者缺失，但在该靶点只会破坏51号外显子的剪切区，使51号外显子无法编码，而下游的52～79号外显子都可以正常的编码，这样也可以恢复肌营养不良蛋白的部分功能。实验说明，实施例2中构建的基因编辑系统可以准确地实现细胞内基因编辑达到治疗杜氏肌营养不良症的目的。
实施例8
本实施例是对实施例2中构建的基因编辑系统实现生物内基因编辑的结果进进行验证。具体如下：
按照实施例2的搭载及生物矿化过程将CRISPR/Cas9质粒换成可同时转录翻译出Cas9蛋白和绿色荧光蛋白的标记质粒，获得搭载标记质粒的生物矿化纳米颗粒，并用DMEM分散成浓度为100mg/μL生物矿化纳米颗重悬液。然后将该纳米颗粒重悬液直接注射到小鼠肌肉组织内，每天2针，每次100μL，持续治疗三天后，提取小鼠肌肉组织，分别进行组织切片观察和提取基因组测序。组织切片结果如图15所示，可以看到明显的绿色荧光，这说明该基因编辑系统成功地将目标质粒递送到小鼠肌肉组织中，并在肌肉细胞内成功表达Cas9蛋白。NGS测序结果如图16所示，其结果也表明肌肉组织中存在基因突变。因此，本实施例也说明实施例2中构建的基因编辑系统可以实现生物内基因编辑，为其应用于治疗杜氏肌营养不良症进一步提供实验支撑。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的。此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非只包含一个的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种用于治疗杜氏肌营养不良症的生物矿化纳米材料及基因编辑系统
<140> 2022100866367
<141> 2022-01-25
<160> 50
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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Claims (10)

1.一种用于治疗杜氏肌营养不良症的生物矿化纳米材料，其特征在于：该生物矿化纳米材料，按体积份数计包括如下组分：
碳酸盐1份，
可溶性钙盐2～5份，
高分子包被材料 0.5份，
缓冲液18～20份；
其中，所述碳酸盐包括但不限于Na2CO3和K2CO3；所述可溶性钙盐包括但不限于CaCl2；所述高分子包被材料包括但不限于PVP和PAA；所述缓冲液不含碳酸根。
2.根据权利要求1所述的用于治疗杜氏肌营养不良症的生物矿化纳米材料，其特征在于：
所述碳酸盐的浓度为40～200mM；
所述可溶性钙盐的浓度为180～460mM；
所述高分子包被材料的浓度为1M；
所述缓冲液的pH=8.0，其含有50 mM Tris-HCl、300mM NaCl和20%的甘油。
3.一种用于治疗杜氏肌营养不良症的基因编辑系统，其特征在于：该基因编辑系统为采用权利要求1或2所述的生物矿化纳米材料作为基础载体搭载CRISPR/Cas9质粒系统；具体的搭载及矿化过程包括如下步骤：
1）质粒准备：将设计的CRISPR/Cas9质粒系统与鱼精蛋白共孵育，形成待被搭载的目标质粒；
2）搭载矿化：将准备好的目标质粒与碳酸盐溶液混合均匀后再加入到缓冲液中混合均匀，然后加入可溶性钙盐，并进行快速涡旋混合，得到搭载目标质粒的矿化纳米颗粒悬浮液；
3）高分子包被：向得到的矿化纳米颗粒悬浮液中加入高分子包被材料，并静置使高分子材料包被在矿化的纳米颗粒上；
4）离心沉淀：将高分子包被后的矿化纳米颗粒悬浮液进行离心，获得搭载目标质粒的矿化纳米颗粒沉淀物；
5）分散重悬：将离心得到的搭载了目标质的粒矿化纳米颗粒沉淀物用DMEM或超纯水分散重悬，获得所需浓度的生物矿化纳米颗粒重悬液以用于基因编辑或用于制备预防及治疗杜氏肌营养不良症的药物。
4.根据权利要求3所述的用于治疗杜氏肌营养不良症的基因编辑系统，其特征在于：步骤1）中，所述CRISPR/Cas9质粒系统与鱼精蛋白共孵育，鱼精蛋白的用量与CRISPR/Cas9质粒系统的质量比为：鱼精蛋白:CRISPR/Cas9质粒系统=1:1～1:5；共孵育的条件为室温温度下共孵育20～40min。
5.根据权利要求3所述的用于治疗杜氏肌营养不良症的基因编辑系统，其特征在于：步骤2）中，所述搭载矿化，加入的目标质粒的量为0.1～10μg；所述快速涡旋混合的搅拌速度为500～2000rpm/min混合时间为30s～1min。
6.根据权利要求3所述的用于治疗杜氏肌营养不良症的基因编辑系统，其特征在于：步骤3）中，所述高分子包被的静置时间为30min，包被后的矿化的纳米颗粒形貌为直径100～120nm的圆球状；步骤4）中，所述离心沉淀的离心速率为8000～10000rmp，离心时间为10min。
7.根据权利要求3所述的用于治疗杜氏肌营养不良症的基因编辑系统，其特征在于：高分子包被之前还设有细胞跨膜肽吸附步骤，具体为：搭载矿化后，将细胞跨膜肽溶液逐滴滴加至得到矿化纳米颗粒悬浮液中，并于室温下磁力搅拌10min，以将细胞跨膜肽吸附于矿化纳米颗粒的表面，然后进行高分子包被。
8.根据权利要求7所述的用于治疗杜氏肌营养不良症的基因编辑系统，其特征在于：所述细胞跨膜肽为来源于HIV病毒的细胞跨膜肽TAT，其序列为RKKRRQRRR，且该细胞跨膜肽的工作溶液浓度为10μg/μL，滴加量为10～50μL。
9.根据权利要求3所述的用于治疗杜氏肌营养不良症的基因编辑系统，其特征在于：步骤1）中，所述CRISPR/Cas9质粒系统为CRISPR变体无PAM限制基因编辑系统，其用于破坏Dys基因的51号外显子；该CRISPR/Cas9质粒系统的靶序列为SEQ51-1～SEQ51-4中的任意一种：
SEQ51-1：CACCAGAGCTAACACTCTGAGTAG，
SEQ51-2：TCACCAGAGCTAACACTCTGAGTA，
SEQ51-3：GTGGTCTCATTGTCAGACTCATC，
SEQ51-4：AGTGGTCTCATTGTCAGACTCAT。
10.根据权利要求3所述的用于治疗杜氏肌营养不良症的基因编辑系统，其特征在于：步骤4）中，所述基因编辑包括细胞内基因编辑和生物体内基因编辑；
所述细胞内基因编辑具体为：将制备的生物矿化纳米颗粒用DMEM重悬获得浓度为0.1～10mg/mL的生物矿化纳米颗粒重悬液，然后以与细胞培养基体积比1:5～1:10的比例直接加入到细胞培养皿中，进行细胞培养48小时后，提取细胞的基因组进行检测其基因突变情况；
所述生物体内基因编辑具体为：将制备的用DMEM重悬获得浓度为50～100mg/μL的生物矿化纳米颗粒重悬液，通过肌肉注射或静脉注射的方式注射在小鼠体内；其中肌肉注射为每天2针，每次100μL，持续注射三天后，提取小鼠肌肉组织的基因组进行检测其基因突变情况。
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