CN114502280A - 用于单细胞处理的微流控装置以及用于使用该微流控装置进行单细胞处理的方法和系统 - Google Patents

用于单细胞处理的微流控装置以及用于使用该微流控装置进行单细胞处理的方法和系统 Download PDF

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Abstract

提供了一种用于单细胞处理的微流控装置，包括：衬底；设置在衬底中的流体通道；和邻近流体通道布置的多个电极，用于确定细胞在流体通道中的位置，多个电极包括感测电极对，感测电极对包括第一感测电极和第二感测电极，其中感测电极对中的至少第一感测电极在第一方向上延伸，感测电极对配置为当细胞流过流体通道的传感器部分时测量跨感测区域的差分电信号；以及布置在第一感测电极与第二感测电极之间的偏置电极，偏置电极配置为接收偏置电压。第二感测电极和偏置电极中的一者在至少基本上平行于第一感测电极的方向上延伸，并且第二感测电极和偏置电极中的另一者布置成相对于第一感测电极具有倾斜取向。还提供了一种形成微流控装置的方法，以及使用微流控装置进行单细胞处理的方法和系统。

Description

用于单细胞处理的微流控装置以及用于使用该微流控装置进 行单细胞处理的方法和系统
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年9月3日提交的第10201908123Q号新加坡专利申请的优先权，其内容整体上通过引用并入本文，以用于所有目的。
技术领域
本发明总体上涉及用于单细胞处理的微流控装置、形成该微流控装置的方法、使用该微流控装置进行单细胞处理的方法和系统。
背景技术
由于生物样品固有的异质性，细胞分离是各种生物医学应用中的必要步骤。开发了各种用于细胞分离和分选的微流控技术，这些技术可分为主动方法(例如，介电泳、声电泳、磁电泳)和被动方法(例如，惯性聚焦、芯片上过滤和确定性横向位移)。对于所有这些细胞分离技术，可以表征系统的性能，诸如通量、纯度和回收率。传统上，微流控细胞分离和分选的性能可以通过分析所收集的输入和输出样品(例如，通过流式细胞仪、血细胞计数器、基于成像的处理)或通过使用具有后图像分析的高速照相机检测细胞的横向位置，这是因为这样的位置与分离性能直接相关。前一种方法需要额外的多个芯片外分析步骤或昂贵的设备(例如，流式细胞仪)，这不容易获得且不适用于实时分析。后一种方法需要昂贵的高速成像装置和复杂的图像处理算法或费力的手动分析。此外，高速照相机产生大量成像数据用于需要高端计算能力的后分析，使得这种途径难以实现用于瞬时反馈控制的单细胞横向位置的实时测量。
需要开发一种用于流动粒子(例如，也可互换地称为细胞)的横向位置测量的简单途径。在这点上，基于阻抗的微流控装置实现了用于细胞计数、大小测定以及研究细胞功能和表型的无标记和高通量手段。例如，基于阻抗的微流控装置能够通过细胞通过收缩通道所需的通过时间来表征单个细胞的机械特性。更特别地，可以从测量的电信号中提取通过时间，而不是使用高速摄像机视频记录来提取通过时间。基于阻抗的微流控细胞仪可以用于测量微流体通道中的细胞位置，包括横向位置(即，沿着通道宽度)、横截面位置(即，沿着通道宽度和高度)和纵向位置(即，沿着通道长度)。在H.Wang，N.Sobahi和A.Han，Lab Chip，2017，17，1264-1269中，他们提出了一种具有非平行电极的微流控系统，以检测单个粒子的横向位置，该位置由信号峰的幅度和宽度指示。在B.Brazey，J.Cottet，A.Bolopion，H.VanLintel，P.Renaud和M.Gauthier，Lab Chip，2018，18，818-831中，他们通过使用星形电极设计展示了纵向敏感位置传感器。在M.Solsona，E.Y.Westerbeek，J.G.Bomer，W.Olthuis和A.van den Berg，Lab Chip，2019，19，1054-1059中，他们开发了一种微流控系统，通过利用由电沉积面积增加的两个相对电极诱导的电场梯度来跟踪粒子的横向位置。使用这个系统，粒子的横向位置由峰的幅度来指示。在R.Reale、A.De Ninno、L.Businaro、P.Bisegna和F.Caselli，Microfluid.Nanofluid.，2018，22中，他们展示了用两组不同的电极对单个粒子的横截面位置进行电测量，其中粒子的横向位置可以通过五对电极和两个产生的差分电流来确定。
因此，需要提供一种用于单细胞处理的微流控装置，以及用于使用该微流控装置进行单细胞处理的方法和系统，其试图克服常规微流控装置和用于单细胞处理的常规方法和系统的缺陷中的一个或多个缺陷，诸如但不限于，以改进的分辨率、改进的流速和/或在最小测量粒子大小中的改进来改进细胞在流体通道中的位置测量(例如，横向位置、竖直位置)。正是在这种背景下开发了本发明。
发明内容
根据本发明的第一方面，提供了一种用于单细胞处理的微流控装置，该微流控装置包括：
衬底；
设置在衬底中的流体通道，其中流体通道配置为形成流体路径，用于允许包括细胞的流体样品沿着通道流动；和
邻近流体通道布置的多个电极，用于确定细胞在流体通道中的位置，所述多个电极包括：
感测电极对，该感测电极对包括第一感测电极和第二感测电极，该感测电极对限定了与流体通道的传感器部分重叠的感测区域，其中该感测电极对中的至少第一感测电极在第一方向上延伸，该感测电极对配置为当细胞流过流体通道的传感器部分时测量跨感测区域的差分电信号；和
布置在第一感测电极与第二感测电极之间的偏置电极，该偏置电极配置为接收偏置电压，
其中第二感测电极和偏置电极中的一者在至少基本上平行于第一感测电极的方向上延伸，并且第二感测电极和偏置电极中的另一者布置成相对于第一感测电极具有倾斜取向。
根据本发明的第二方面，提供了一种形成用于单细胞处理的微流控装置的方法，该方法包括：
提供衬底；
在衬底中提供流体通道，其中流体通道配置为形成流体路径，用于允许包括细胞的流体样品沿着通道流动；以及
形成邻近流体通道布置的多个电极，用于确定细胞在流体通道中的位置，多个电极包括：
感测电极对，该感测电极对包括第一感测电极和第二感测电极，该感测电极对限定与流体通道的传感器部分重叠的感测区域，其中该感测电极对中的至少第一感测电极在第一方向上延伸，该感测电极对配置为当细胞流过流体通道的传感器部分时测量跨感测区域的差分电信号；和
布置在第一感测电极与第二感测电极之间的偏置电极，该偏置电极配置为接收偏置电压，
其中第二感测电极和偏置电极中的一者在至少基本上平行于第一感测电极的方向上延伸，并且第二感测电极和偏置电极中的另一者布置成相对于第一感测电极具有倾斜取向。
根据本发明的第三方面，提供了一种使用根据上述第一方面所述的用于单细胞处理的微流控装置进行单细胞处理的方法，该方法包括：
向偏置电极施加偏置电压；
当细胞流过对应于感测区域的流体通道的传感器部分时，基于第一感测电极和第二感测电极获得差分电信号；以及
基于差分电信号确定细胞在流体通道的传感器部分中的位置。
根据本发明的第四方面，提供了一种用于单细胞处理的系统，该系统包括：
根据上述第一方面描述的用于单细胞处理的微流控装置；和
计算系统，包括：
存储器；和
至少一个处理器，处理器通信地联接到存储器和微流控装置，并配置成：
向偏置电极施加偏置电压；
当细胞流过对应于感测区域的流体通道的传感器部分时，基于第一感测电极和第二感测电极获得差分电信号；以及
基于差分电信号确定细胞在流体通道的传感器部分中的位置。
附图说明
通过以下仅以示例的方式并结合附图的书面描述，本发明的实施例对于本领域的普通技术人员来说将得到更好理解和显而易见，其中：
图1A描绘了根据本发明的各种实施例的用于单细胞处理的微流控装置的示意图；
图1B描绘了根据本发明的各种实施例的用于单细胞处理的微流控装置的另一示意图；
图1C描绘了根据本发明的各种实施例的用于单细胞处理的微流控装置的另一示意图；
图2描绘了根据本发明的各种实施例的形成用于单细胞处理的微流控装置的方法的示意流程图；
图3描绘了根据本发明的各种实施例的使用微流控装置进行单细胞处理的方法的示意性流程图；
图4描绘了根据本发明的各种实施例的用于单细胞处理的系统的示意图；
图5描绘了示例性计算机系统的示意性框图，在示例性计算机系统中可以实现或实施根据本发明的各种实施例的用于单细胞处理的系统；
图6A示出了根据本发明的各种示例性实施例的微流控装置的电传感区域的示意图；
图6B示出了电传感区域的显微图像；
图6C示出了感测区域的示意图，并示出了根据本发明的各种示例性实施例的来自第一感测电极和第二感测电极的所测量的电信号的示例性电信号曲线图；
图7A示出了根据本发明的各种示例性实施例的另一示例性微流控装置的示意图；
图7B示出了根据本发明的各种示例性实施例的又一示例性微流控装置的示意图；
图7C示出了根据本发明的各种示例性实施例的沿着通道长度的流体通道的横截面的示例性示意图，以及流过对应于感测区域的流体通道的传感器部分的三种不同粒子的示例性信号曲线图；
图7D示出了根据本发明的各种示例性实施例的流过流体通道的传感器部分的粒子的测量的电信号的信号曲线图的示例性示意图；
图8A描绘了示出根据各种示例性实施例的流过微通道的下部(i)、中部(ii)和上部(iii)部分的三个代表性珠子的所测量的电学位置x相对于通过时间t1/通过时间t2的实验结果的图；
图8B示出了根据本发明的各种示例实施例的图8A的所相应测量的差分电信号的图；
图8C示出了根据本发明的各种示例性实施例的用于测量光学位置x的三个代表性珠子的代表性电信号及其相应的显微光学图像(同时捕获)的放大视图；
图9示出了根据各种示例性实施例的电学方法的结果与通过光学方法获得的结果之间10μm珠子的横向位置的定量比较；
图10示出了比较通过根据各种示例实施例的电学方法获得的横向位置x与通过光学方法获得的横向位置x的布兰德-奥特曼(Bland-Altman analysis)分析；
图11A至图11B示出了根据各种示例实施例的具有良好性能的微流控装置可以检测的最小粒子的分析结果；
图12A至图12B示出了从根据各种示例实施例的微流控装置获得的结果与通过光学方法获得的结果之间的RBC的横向位置的定量比较；
图13A至图13D示出了根据各种示例实施例的5和10μm珠子的混合物的横向位置x和电气直径的测量；
图14A至图14B示出了从根据各种示例实施例的微流控装置获得的结果与通过光学方法获得的结果之间的7μm珠子的横向位置的定量分析结果；
图15A示出了根据各种示例性实施例的用于在一定流速下监测7μm珠子的鞘流诱导聚焦的示意性图像；
图15B示出了图15A中示出的图像的像素强度曲线图(灰度级)；和
图15C示出了由鞘流聚焦在不同区域的7μm珠子的电学位置x的直方图。
具体实施方式
本发明的实施例提供了用于单细胞处理的微流控装置、形成该微流控装置的方法以及使用该微流控装置进行单细胞处理的方法和系统。本领域技术人员将会理解，细胞也可以互换地称为粒子。微流控装置可以用于测量位置(例如，横向、竖直)以及确定单个细胞/粒子在流体通道中的连续流中的位置。可以使用从测量的电信号和流动细胞、电极与微通道的位置之间的几何关系导出的解析表达式来确定细胞的位置。本发明的各种实施方式可以容易地与各种上游应用(例如，细胞分选、细胞聚焦)整合，用于以实时方式评估细胞操作的效率，从而消除使用高速照相机或芯片外分析的多个步骤。例如，跟踪单个细胞/粒子的位置在评估微流体细胞聚焦、分离和分选的效率中起着重要作用。
图1A描绘了根据本发明的各种实施方式的用于单细胞处理的微流控装置100的示意图。微流控装置100包括：衬底110；设置在衬底110中的流体通道114，其中流体通道配置成形成流体路径，用于允许包括细胞(或粒子)的流体样本沿着通道流动；和邻近流体通道114布置的多个电极118，用于确定细胞在流体通道中的位置。多个电极118包括感测电极对，该感测电极对包括第一感测电极118a和第二感测电极118b，该感测电极对118a、118b限定与流体通道的传感器部分重叠的感测区域120。该感测电极对中的至少第一感测电极118a在第一方向上延伸。该感测电极对118a、118b配置成当细胞流过流体通道的传感器部分时测量感测区域120上的差分电信号。多个电极118还包括布置在第一感测电极118a与第二感测电极118b之间的偏置电极118c，该偏置电极118c配置为接收偏置电压。第二感测电极118b和偏置电极118c中的一者在至少基本上平行于第一感测电极1１8a的方向上延伸，并且第二感测电极118b和偏置电极118c中的另一者布置成相对于第一感测电极118a具有倾斜取向。
本领域技术人员可以理解，仅出于说明目的而非限制，图1A示出了微流控装置100的示例性配置(例如，第一示例性配置)，其中第二感测电极118b在至少基本上平行于第一感测电极118a的方向上延伸，并且偏置电极118c布置成相对于第一感测电极118a和第二感测电极118b(在感测区域中)具有倾斜取向。也就是说，第二感测电极11 8b是上述在至少基本上平行于第一感测电极118a的方向上延伸的第二感测电极118b和偏置电极118c中的一者，并且偏置电极118c是上述布置成相对于第一感测电极118a具有倾斜取向的第二感测电极118b和偏置电极118c中的另一者。本领域技术人员将理解，微流控装置100不限于偏置电极118c布置成相对于第一感测电极118a具有倾斜取向，并且在另一个示例性配置(例如，第二示例性配置)中，偏置电极118c在至少基本上平行于第一感测电极118a的方向上延伸，并且第二感测电极118b布置成相对于第一感测电极118a和偏置电极118c(在感测区域中)具有倾斜取向，如图1B所示。
图1B描绘了根据本发明的各种实施例的用于单细胞处理的微流控装置150的示意图，其类似于微流控装置100，除了偏置电极118c在至少基本上平行于第一感测电极118a的方向上延伸，并且第二感测电极118b布置成相对于第一感测电极118a和偏置电极118c具有倾斜取向。
在又一示例性配置(例如，第三示例性配置)中，多个电极还包括在第一方向上延伸的浮动电极对(例如，第一浮动电极118d、第二浮动电极118e)，如图1C所示。图1C描绘了根据本发明的各种实施例的用于单细胞处理的微流控装置180的示意图，其类似于微流控装置100和/或150，除了多个电极118还包括在第一方向上延伸的浮动电极对118d、118e。换言之，该浮动电极对118d、118e可以布置在至少基本上平行于第一感测电极118a的方向上。
为了清楚和简明起见，除非另有陈述，本发明的各种实施例将在下文中参考具有如图1A所示的示例性配置(即，第一示例性配置)的微流控装置100来描述。本领域技术人员将理解，参考第一示例性配置描述的各种特征和相关优点可以类似地、等同地或相应地应用于第二示例性配置和第三示例性配置，因此为了清楚和简明起见，不需要明确陈述或重复。
与用于测量流体通道中的粒子位置(例如，横向位置、竖直位置)的常规的基于阻抗的微流控装置相比，用于单细胞处理的微流控装置100的上述配置有利地提供了许多优点，诸如但不限于，提高的分辨率、提高的流速和在最小测量粒子尺寸(例如，约3.6μm珠子)中的改进。此外，使用不同尺寸珠子(例如，5和10μm珠子)的混合物，除了测量位置(例如，横向位置、竖直位置)之外，根据本发明的各种实施例可以同时表征单个粒子/细胞的特性(例如，大小)。
如所描述的，流体通道配置成形成流体路径，用于允许包括细胞的流体样品沿着通道流动。例如，流体样品可以配置为在通道长度的方向(即长度方向)上流动。本领域技术人员将会理解，图1A中所示的流体通道114(类似地在图1B和图1C中)可能仅示出了微流控装置的流体通道的一部分。
在各种实施例中，流体通道可以具有宽度(也可互换地称为通道宽度)和高度(也可互换地称为通道高度)。
在各种实施例中，第一方向沿着流体通道的宽度方向。流体通道的宽度方向是至少基本上平行于通道宽度的方向。例如，宽度方向可以沿着x轴，如图1A至图1C所示。微流控装置可以还包括第二方向。在各种实施例中，第二方向可以沿着流体通道的高度方向。流体通道的高度方向是至少基本上平行于通道高度的方向。例如，在宽度方向沿着x轴的情况下，高度方向可以沿着y轴(图1A至图1C中未示出y轴)。x轴、y轴和z轴可以基本上相互垂直。
在各种实施例中，第一感测电极、第二感测电极和偏置电极布置成形成对应于N形的配置。例如，图1A示出了布置在传感器区域120中的第一感测电极118a、第二感测电极118b和偏置电极118c，以形成对应于N形的配置。
偏置电极相对于第一感测电极和第二感测电极中的至少一者的倾斜取向可以根据流体通道的尺寸处于一定角度。在各种实施例中，偏置电极的倾斜取向相对于第一感测电极和第二感测电极中的至少一者处于范围为约10度至约60度内的角度。在各种实施例中，偏置电极的倾斜取向相对于第一感测电极和第二感测电极中的至少一者处于约22度的角度。
在各种实施例中，细胞的位置包括在流体通道中的横向位置，该横向位置相对于流体通道的宽度方向，并且基于细胞与多个电极之间的几何关系来确定。
关于参照图1B描述的第二示例性配置和参照图1C描述的第三示例性配置，在各种实施例中，第二感测电极相对于偏置电极的倾斜取向可以取决于流体通道的尺寸处于一定角度。在各种实施例中，第二感测电极的倾斜取向相对于偏置电极处于范围为约10度至约60度内的角度。在各种实施例中，第二感测电极的倾斜取向相对于偏置电极处于约22度的角度。
在各种实施例中，多个电极还包括在第一方向上延伸的浮动电极对。该浮动电极对在至少基本上平行于第一感测电极的方向上延伸。该浮动电极对为不联接到任何电源的电极。
在各种实施例中，该浮动电极对布置在该感测电极对之间，并且偏置电极布置在该浮动电极对之间。如图1C所示，该浮动电极对118d、118e布置在该感测电极对118a、118b之间，并且偏置电极118c布置在该浮动电极对118d、118e之间。
在各种实施例中，细胞的位置包括在流体通道中的横截面位置。横截面位置包括在流体通道中的横向位置，该横向位置相对于流体通道的宽度方向而言。横截面位置还包括在流体通道中的竖直位置，该竖直位置相对于流体通道的高度方向而言。
在各种实施例中，偏置电压包括交流电压。
在各种实施例中，差分电信号包括感测区域上的差分电流响应。
图2描绘了形成用于单细胞处理的微流控装置的方法200的示意性流程图，微流控装置诸如本文参考图1A、图1B或图1C描述的微流控装置100、150或180。方法200包括：提供(在202)衬底；在衬底中提供(在204)流体通道，其中流体通道配置成形成流体路径，用于允许包括细胞的流体样品沿着通道流动；以及形成(在206)邻近流体通道布置的多个电极，用于确定细胞在流体通道中的位置，多个电极包括感测电极对，该感测电极对包括第一感测电极和第二感测电极，该感测电极对限定与流体通道的传感器部分重叠的感测区域，其中该感测电极对中的至少第一感测电极在第一方向上延伸，该感测电极对配置成当细胞流过流体通道的传感器部分时测量跨感测区域的差分电信号；以及布置在第一感测电极与第二感测电极之间的偏置电极，该偏置电极配置为接收偏置电压，其中第二感测电极和偏置电极中的一者在至少基本上平行于第一感测电极的方向上延伸，并且第二感测电极和偏置电极中的另一者布置成相对于第一感测电极具有倾斜取向。
在各种实施例中，方法200用于形成如本文参考图1A、图1B或图1C所述的微流控装置100、150或180，因此，方法200可以还包括对应于提供或形成如本文根据各种实施例所述的微流控装置100、150或180的各种配置和/或部件/元件的各种步骤，因此为了清楚和简明起见，不需要相对于方法200重复这些对应的步骤。换言之，本文在微流控装置100、150或180的上下文中描述的各种实施例类似地或相应地适用于方法200(例如，用于制造如本文根据各种实施例描述的具有各种配置和/或部件/元件的微流控装置100、150或180)，反之亦然。
仅作为示例而非限制，衬底可以由玻璃(例如，硼硅酸盐玻璃)、石英或聚合物晶片形成。多个电极可以由本领域已知的合适的电极材料形成，因此无需在此描述。仅作为示例而非限制，多个电极可以各自由包括由铬形成的第一层(例如，具有约10nm的厚度)和在第一层上由金形成的第二层(例如，具有约100nm的厚度)的电极材料形成。
图3描绘了根据各种实施例的用于使用如本文参考图1A、图1B或图1C所述的微流控装置100、150或180进行单细胞处理的方法300的示意性流程图。方法300包括：向偏置电极施加(在302)偏置电压；当细胞流过对应于感测区域的流体通道的传感器部分时，基于第一感测电极和第二感测电极获得(在304)差分电信号；以及基于差分电信号确定(在306)细胞在流体通道的传感器部分中的位置。
在各种实施例中，获得的差分电信号包括多个信号峰，这些信号峰对应于细胞流过流体通道的传感器部分从第一感测电极到第二感测电极的情况。
在各种实施例中，多个信号峰包括对应于细胞在流体通道的传感器部分中从第一感测电极流动到偏置电极的第一信号峰，以及对应于细胞在流体通道的传感器部分中从偏置电极流动到第二感测电极的第二信号峰。在各种实施例中，上述确定细胞在流体通道的传感器部分中的位置包括基于第一信号峰的宽度和第二信号峰的宽度确定细胞在流体通道中的横向位置，该横向位置相对于流体通道的宽度方向而言。在各种实施例中，第一信号峰的宽度对应于细胞在流体通道的传感器部分中从第一感测电极流到偏置电极的通过时间t1，并且第二信号峰的宽度对应于细胞在流体通道的传感器部分中从偏置电极流到第二感测电极的通过时间t2。
在各种实施例中，第一信号峰和第二信号峰可以具有相反的极性。例如，第一信号峰可以是正峰，并且第二信号峰可以是负峰。在其他实施例中，第一信号峰可以是负峰，并且第二信号峰可以是正峰。
在各种实施例中，上述确定细胞在流体通道中的横向位置还基于细胞与多个电极之间的几何关系。换言之，可以基于差分电信号(例如，第一信号峰的宽度对应于通过时间t1，并且第二信号峰的宽度对应于通过时间t2)，以及流动细胞、多个电极(例如，第一感测电极、第二感测电极、偏置电极)与流体通道的位置之间的几何关系，来确定细胞在流体通道中的横向位置。
在多个电极还包括浮动电极对的情况下，在各种实施例中，第一信号峰可以包括第一子峰。第一子峰可以是双峰。换言之，第一子峰可以是由三个平行电极(第一感测电极118a、第一浮动电极118d和偏置电极118c)产生的对称峰(例如双峰)。在各种实施例中，上述确定细胞在流体通道的传感器部分中的位置还包括基于第一子峰的幅度与第一子峰的谷值的比率来确定细胞在流体通道中的竖直位置，该竖直位置相对于流体通道的高度方向而言。
在各种实施例中，方法300可以还包括基于第一信号峰的幅度和第二信号峰的幅度来确定细胞的尺寸(例如，大小)。在非限制性示例中，细胞的尺寸可以是细胞的直径。
图4描绘了根据本发明的各种实施例的用于单细胞处理的系统400的示意图，比如对应于根据各种实施例在上文中关于图3描述的用于单细胞处理的方法300。系统400包括如上文参考图1A、图1B或图1C所述的用于单细胞处理的微流控装置100、150或180；以及计算系统402，该计算系统402包括：存储器404；和至少一个处理器406，其通信联接到存储器404和微流控装置100，并配置为：向偏置电极施加偏置电压；当细胞流过对应于感测区域的流体通道的传感器部分时，基于第一感测电极和第二感测电极获得差分电信号；并且基于差分电信号确定细胞在流体通道的传感器部分中的位置。
本领域技术人员将意识到，至少一个处理器406可以配置成通过能由至少一个处理器406执行的指令集(例如，软件模块)来执行所需的功能或操作，以执行所需的功能或操作。因此，如图4所示，系统400可以包括电信号测量模块(或电路)410，其配置为向偏置电极施加偏置电压；并且当细胞流过对应于感测区域的流体通道的传感器部分时，基于第一感测电极和第二感测电极获得差分电信号；以及细胞位置确定模块(或电路)412，其配置为基于差分电信号确定细胞在流体通道的传感器部分中的位置。
本领域技术人员将理解，上述模块不一定是单独的模块，并且在不脱离本发明的范围的情况下，一个或多个模块可以根据需要或适当地由一个功能模块(例如，电路或软件程序)来实现或实施为一个功能模块。例如，电信号测量模块410和细胞位置确定模块412可以实现(例如，一起编译)为一个可执行的软件程序(例如，软件应用或简称为“应用”)，该软件程序例如可以存储在存储器404中，并且能由至少一个处理器406执行，以执行根据各种实施例在此描述的功能/操作。
在各种实施例中，计算系统402对应于如上文参考图3所述的用于单细胞处理的方法300，因此，配置为由至少一个处理器406执行的各种功能或操作可以对应于如上文根据各种实施例所述的方法300的各种步骤，因此为了清楚和简明起见，不需要关于系统402进行重复。换言之，本文在方法的上下文中描述的各种实施例对于相应的系统类似地有效，反之亦然。
例如，在各种实施例中，存储器404可以在其中存储电信号模块410和细胞位置确定模块412，它们分别对应于根据各种实施例的如上文所述的方法300的各种步骤，这些步骤能由至少一个处理器406执行以执行如本文所述的相应功能/操作。
根据本公开中的各种实施例，可以提供计算系统、控制器、微控制器或提供处理能力的任何其他系统。这样的系统可以包括一个或多个处理器和一个或多个计算机可读存储介质。例如，上文描述的计算系统402可以包括处理器(或控制器)406和计算机可读存储介质(或存储器)404，它们例如用于如本文所述在其中执行的各种处理。在各种实施例中使用的存储器或计算机可读存储介质可以是易失性存储器，例如DRAM(动态随机存取存储器)，或非易失性存储器，例如PROM(可编程只读存储器)、EPROM(可擦除PROM)、EEPROM(电可擦除PROM)或闪存，例如浮栅存储器、电荷俘获存储器、MRAM(磁阻随机存取存储器)或PCRAM(相变随机存取存储器)。
在各种实施例中，“电路”可以被理解为任何种类的逻辑实现实体，其可以是专用电路或者执行存储在存储器、固件或其任意组合中的软件的处理器。因此，在一个实施例中，“电路”可以是硬连线逻辑电路或可编程逻辑电路，诸如可编程处理器，例如微处理器(例如，复杂指令集计算机(CISC)处理器或精简指令集计算机(RISC)处理器)。“电路”也可以是执行软件的处理器，例如任何种类的计算机程序，例如使用虚拟机代码(例如Java)的计算机程序。根据各种可替换实施例，将在下面更详细描述的各个功能的任何其他种类的实现也可以被理解为“电路”。类似地，“模块”可以是本发明中根据各种实施例的系统的一部分，并且可以涵盖如上所述的“电路”，或者可以被理解为由此而来的任何种类的逻辑实现实体。
本公开的一些部分以对计算机存储器内的数据的操作的算法和功能或符号表示的形式明确或隐含地呈现。这些算法描述和功能或符号表示是数据处理领域的技术人员用来向本领域的其他技术人员最有效地传达他们工作的实质的手段。算法在这里通常被认为是导致期望结果的自洽的步骤序列。这些步骤是那些需要对物理量进行物理操作的步骤，诸如能够被存储、传输、组合、比较以及以其他方式操作的电、磁或光信号。
除非另有具体说明，并且从下文中显而易见的是，贯穿本说明书，使用诸如“应用”、“获得”、“确定”等术语的讨论指的是计算机系统或类似电子装置的动作和过程，其将表示为计算机系统内的物理量的数据操纵并转换成类似地表示为计算机系统或其他信息存储、传输或显示装置内的物理量的其他数据。
本说明书还公开了用于执行本文描述的方法的操作/功能的计算系统(例如，其也可以体现为装置或设备)，比如系统402。这样的系统可以为所需目的而专门构建，或者可以包括通用计算机或由存储在计算机中的计算机程序选择性激活或重新配置的其他装置。本文提出的算法并不固有地与任何特定的计算机或其他装置相关。根据本文的教导，各种通用机器可以与计算机程序一起使用。可替代地，构造更专用的设备来执行所需的方法步骤可能是合适的。
此外，本说明书还至少隐含地公开了计算机程序或软件/功能模块，因为对于本领域技术人员来说显而易见的是，本文描述的方法的各个步骤可以通过计算机代码来实现。计算机程序不旨在限于任何特定的编程语言及其实施方式。应当理解，可以使用多种编程语言及其编码来实现本文包含的公开的教导。此外，计算机程序不旨在限于任何特定的控制流程。存在计算机程序的许多其他变型，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，其可以使用不同的控制流程。本领域技术人员将理解，本文描述的各种模块(例如，电信号测量模块410和/或细胞位置确定模块412)可以是由计算机处理器能执行的(多个)计算机程序或(多个)指令集实现的(多个)软件模块，以执行所需的功能，或者可以是(多个)硬件模块，其是被设计为执行所需功能的(多个)功能硬件单元。还应当理解，可以实现硬件和软件模块的组合。
此外，本文描述的计算机程序/模块或方法的各个步骤可以并行执行，而不是顺序执行。这样的计算机程序可以存储在任何计算机可读介质上。计算机可读介质可以包括存储装置，诸如磁盘或光盘、存储芯片或适于与通用计算机接口的其他存储装置。当在这样的通用计算机上加载并执行时，计算机程序有效地产生实现本文描述的方法的步骤的设备。
在各种实施例中，提供了一种具体化在一个或多个计算机可读存储介质(非暂时性计算机可读存储介质)中的计算机程序产品，其包括能由一个或多个计算机处理器执行的指令(例如，电信号测量模块410和/或细胞位置确定模块412)，以执行用于单细胞处理的方法300，如上文参考图3所述。因此，本文描述的各种计算机程序或模块可以存储在其中的系统(诸如图4所示的计算系统402)能接收的计算机程序产品中，用于由计算系统402的至少一个处理器406执行，以执行所需或期望的功能。
本文描述的软件或功能模块也可以实现为硬件模块。更特别地，在硬件意义上，模块是被设计成与其他组件或模块一起使用的功能硬件单元。例如，模块可以使用分立的电子部件来实现，或者它可以形成整个电子电路(诸如专用集成电路(ASIC))的一部分。存在许多其他可能性。本领域技术人员将理解，本文描述的软件或(多个)功能模块也可以实现为硬件和软件模块的组合。
在各种实施例中，计算系统402可以由包括至少一个处理器和存储器的任何计算系统(例如，台式或便携式计算系统)来实现，计算系统诸如为仅作为示例而非限制的图5中示意性示出的计算系统500。各种方法/步骤或功能模块(例如，电信号测量模块410和/或细胞位置确定模块412)可以被实现为软件，诸如在计算系统500内执行的计算机程序，并指示计算系统500(具体地，其中的一个或多个处理器)执行本文描述的各种实施例的方法/功能。计算系统500可以包括计算机模块502、诸如键盘504和鼠标506的输入模块、以及诸如显示器508和打印机510的多个输出装置。计算机模块502可以经由合适的收发器装置514连接到计算机网络512，以允许访问例如互联网或其他网络系统，诸如局域网(LAN)或广域网(WAN)。示例中的计算机模块502可以包括用于执行各种指令的处理器518、随机存取存储器(RAM)520和只读存储器(ROM)522。计算机模块502还可以包括多个输入/输出(I/O)接口，例如到显示器508的I/O接口524和到键盘504的I/O接口526。计算机模块502的部件典型地经由互连总线528并以相关领域技术人员已知的方式进行通信。
本领域技术人员将会理解，本文使用的术语仅仅是为了描述各种实施例的目的，而不是为了限制本发明。如本文所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”旨在也包括复数形式，除非上下文另有明确说明。还将理解，术语“包括”和/或“包含”在本说明书中使用时，指定所陈述的特征、整数、步骤、操作、元件和/或部件的存在，但不排除一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、元件、部件和/或其组合的存在或添加。
为了可以容易地理解本发明并将其付诸实践，本发明的各种示例实施例将在下文中仅通过示例而非限制来描述。然而，本领域技术人员将会理解，本发明可以以各种不同的形式或配置来实施，并且不应被解释为限于下文阐述的示例性实施例。相反，提供这些示例实施例是为了使本公开彻底和完整，并将本发明的范围完全传达给本领域技术人员。
根据本发明的各种示例性实施例，提供了一种用于单细胞处理的微流体阻抗流式细胞术装置(也可互换地称为微流控装置)，单细胞处理诸如测量单细胞的位置(例如，对应于根据各种实施例在上文中描述的微流控装置100、150或180)。
在各种示例实施例中，微流体阻抗流式细胞术装置可以用于单细胞/粒子的横向位置测量，并具有N形电极设计(例如，对应于邻近流体通道布置的多个电极)。可以从N形电极收集差分电流(对应于跨感测区域测量的差分电信号)。差分电流可以对流动的单细胞/粒子的轨迹进行编码。图6A示出了根据本发明的各种示例性实施例的微流控装置的电传感区域的示意图。特别地，图6A示出了微流体阻抗血细胞计数仪中的电传感区域620的示意性设计。整个流体通道(也可互换地称为微通道)614可以被压力驱动流引入的细胞访问。根据各种示例实施例的N形电极可以包括两个外侧电极(例如，对应于第一感测电极和第二感测电极118a、118b)和一个中间倾斜电极(例如，对应于偏置电极118c)，它们布置成检测单个细胞的通过事件(例如，单独地检测细胞的通过事件)。
在各种示例实施例中，第一感测电极和第二感测电极和偏置电极可以各自具有范围从约10μm到约40μm的宽度。在各种示例实施例中，在微通道具有约200μm的宽度和约20μm的高度的情况下，第一感测电极和第二感测电极和偏置电极可以各自具有约20μm的宽度。在各种非限制性示例中，电传感区域620可以具有约240μm的长度ls(例如，两个外部电极的外部边缘之间的空间)。在各种示例实施例中，根据微通道的尺寸，偏置电极118c可以相对于第一感测电极118a和第二感测电极118c中的至少一者以约10度至约60度范围内的角度以倾斜取向布置。在各种示例实施例中，中间电极可以相对于外部电极中的任一者具有约22度的倾斜角。基于所测量的电信号和流动粒子、电极与微通道的位置之间的几何关系，可以计算流过N形电极的单个粒子/细胞的横向位置。
图6B至图6C示出了根据本发明的各种示例性实施例的微流控装置的工作机制。图6B示出了电传感区域或区的显微图像，其用符号示出了电测量的设置。在非限制性示例中，可以向偏置电极118c(例如，中间倾斜电极)施加(例如，在约500kHz下约3V的)交流(AC)电压。可以从第一感测电极和第二感测电极118a、118b(例如，另外两个电极)测量差分电流响应(Idiff)。
图6C示出了感测区域或区的示意图，并示出了来自第一感测电极和第二感测电极的测量的电信号的示例性电信号曲线图。图6C示出了流动细胞、电极(例如，包括第一感测电极和第二感测电极以及偏置电极)与流体通道的位置之间的几何关系。由于单个流动细胞通过对应于感测区域的流体通道的传感器部分，可以产生测量的电信号的一对相反的信号峰。
根据本发明的各种示例性实施例，基于产生的电流与流动粒子、电极和微通道的位置之间的关系，可以导出用于粒子横向位置测量的简单解析表达式。图6C还示出了根据各种示例性实施例的流动粒子的横向位置测量的解析表达式，该解析表达式是从测量的电信号以及流动粒子、电极与微通道的位置之间的几何关系导出的。
流动粒子的横向位置测量的解析表达式可推导如下。
等式(1)描述了通过距离d1、d2与通过时间t1、t2之间的关系，如下所示：
Figure BDA0003562867440000181
其中d1和d2分别是与通过时间t1和t2相对应的流动细胞的通过距离。例如，通过时间t1是指细胞在流体通道的传感器部分中从第一感测电极118a行进到偏置电极118c所花费的时间，通过时间t2是指细胞在流体通道的传感器部分中从偏置电极118c行进到第二感测电极118b所花费的时间，通过距离d1是指细胞在通过时间t1内在流体通道的传感器部分中从第一感测电极118a行进到偏置电极118c的距离，通过距离d2是指细胞在通过时间t2内在流体通道的传感器部分中从偏置电极118c行进到第二感测电极118b的距离。
可以假定感测区域中的通道内的细胞的流速是恒定的(例如，假定v1等于沿着电感测区域的流速v2)，导致如下的等式(2)：
Figure BDA0003562867440000182
例如，由于根据各种示例性实施例，电感测区域具有约240μm的长度ls，所以可以假定感测区域中的流体通道内的细胞的流速是恒定的。例如，在感测区域长度较短的情况下，可以假定细胞在感测区域中的流体通道内的的流速是恒定的。
流动细胞、电极与通道的位置之间的几何关系可以由下面的等式(3)给出：
Figure BDA0003562867440000183
其中x是细胞横向位置并被定义为从下部通道壁到细胞中心的距离，w是通道宽度(例如，200μm)。
下面的等式(4)可以通过组合等式(2)和(3)来导出，
Figure BDA0003562867440000184
其中
Figure BDA0003562867440000185
且
Figure BDA0003562867440000186
M1、M2和α的值可以是装置的已知尺寸，在非限制性示例中，其可以分别是80.3μm、76.2μm和22°。D可以是粒子的直径。在非限制性示例中，M1可以是跨传感器区域长度l的第一感测电极118a与偏置电极118c之间的最短距离和电极宽度的1.5倍之和，而M2可以是跨传感器区域长度l的偏置电极118c与第二感测电极118b之间的最短距离和电极宽度的1.5倍之和。
因为峰的幅度与粒子(或细胞)的体积成正比，所以可以使用下面的等式(5)来估计粒子(或细胞)的直径(D)。
Figure BDA0003562867440000191
其中G是取决于装置几何形状和电学特性的校准因子(例如，当根据各种示例实施例由10μm珠子校准时，G可以是
Figure BDA0003562867440000192
)，a表示第一信号峰的幅度，b表示第二信号峰的幅度。根据等式(4)，横向位置x可以容易地根据从测量的电信号和微流控装置的已知尺寸提取的参数来确定。
在各种示例性实施例中，由根据本发明的各种示例性实施例的装置测量的珠子和人红细胞(RBC)的横向位置与由常规显微成像方法获得的那些横向位置具有良好的相关性和一致性。
图7A至图7B示出了根据本发明的各种示例性实施例的另外的示例性微流控装置的示意图。与参照图6A至图6C描述的微流控装置相比，这些微流控装置可以具有不同的电极设计。参考图7A，偏置电极118c在至少基本上平行于第一感测电极118a的方向上延伸，并且第二感测电极118b布置成相对于第一感测电极118a和偏置电极118c具有倾斜取向。图7A示出了用于横向位置测量的感测区域的示意图。类似于各种示例实施例的N形电极的工作原理，单个粒子的横向位置可以通过具有如下等式(6)的电极设计来测量。
Figure BDA0003562867440000193
根据各种示例实施例，电极设计可以与沿着通道宽度延伸的浮动电极对(例如，第一浮动电极118d和第二浮动电极1１8e)集成，以测量单个粒子的横截面位置，仅需要一个信号输出。因此，可以仅用一个电信号输出来执行流过微通道的单细胞或粒子的横截面位置测量。横截面位置可以包括在流体通道中的横向位置和竖直位置。图7B示出了用于流动粒子的横截面测量的感测区域的示意图。通过添加两个浮动电极118d、118e，所得信号曲线图编码了粒子轨迹的高度(对应于流体通道中的竖直位置)。
例如，当细胞从第一感测电极118a通过到偏置电极118c时，可以观察到第一信号峰，并且当细胞从偏置电极118c通过到第二感测电极118b时，可以观察到第二信号峰。在各种示例实施例中，第一信号峰可以高于信号基线(即，正峰)，并且第二信号峰可以低于信号基线(即，负峰)，如图7B所示。可替代地，在其他实施例中，第一信号峰可以是负峰，而第二信号峰可以是正峰。如图7B所示，第一信号峰可以包括第一子峰，并且第二信号峰可以包括第二子峰。根据各种示例实施例，第一子峰可以是双峰。换言之，第一子峰可以是对称峰(例如双峰)。第一子峰可以由前三个平行电极(第一感测电极118a、第一浮动电极118d和偏置电极118c)产生。
图7C示出了沿着通道长度的横截面流体通道的示例性示意图，以及流过对应于感测区域的流体通道的传感器部分的三种不同粒子的示例性信号曲线图。参考图7C，信号曲线图随着流体通道中粒子轨迹的高度而变化。
参考图7D，相对日珥S与粒子竖直位置y相关。相对日珥S如下：
Figure BDA0003562867440000201
其中Q表示第一子峰(例如双峰)的幅度，而Q表示第一子峰之间的谷值。
可以使用二次拟合来计算细胞的竖直位置y，如等式(8)所示：
y＝h*(b0+b1*S+b2*S2) 等式(8)
其中h是通道高度。参数bi取决于实验设置，并且可以通过校准过程来计算。因此，可以仅使用一个电信号输出来测量单个粒子的横截面位置(即，沿着横截面的横向位置x和竖直位置y)。
根据一个示例性实施例展示了监测珠子聚焦的应用，示出与将要描述的光学量化的良好一致性。
实验设置和数据分析
根据进行的示例性实验，可以制造具有N形电极的微流控装置。微流体通道中的流体流动可以使用压力泵(例如，Elveflow AF1)来控制。在非限制性实例中，整个微流体通道被3.6、5、7、10μm的珠子和人RBC访问。施加约300、500和700mbar(毫巴)的驱动压力，以研究在不同流速下粒子横向位置的测量精度，导致流速分别为约25.4、42.4和59.3μl min-1。相应的粒子平均流速分别约为0.08、0.14和0.21m s-1，它们是从记录的高速视频中提取的。在监测鞘流诱导的粒子聚焦的实验中，使用三个单独的注射泵(KD Scientific，霍利斯顿，马萨诸塞州)来控制流体流。通过鞘流将样品流(例如，7μm珠子)集中在流体通道(横向方向x)的底部(例如，下部位置)(15、4和1μl min-1)、中部(例如，中间位置)(8、4和8μl min-1)和顶部(例如，上部位置)(1、4和15μl min-1)。蓝色食品染料混合在鞘流中，以光学方式显示粒子聚焦区域，这通过分析显微图像的像素强度曲线图来量化。例如，诸如ImageJ的软件可以用于分析仅携带强度信息的灰度图像。示出了减去基线后的像素强度曲线图。
用阻抗分光镜(例如HF2IS，苏黎世仪器)记录电流数据，同时用高速照相机捕捉粒子的轨迹用于比较。通过定制的MATLAB程序(Matlab，Mathworks，美国)分析电学数据，以提供根据各种示例实施例通过电学方法测量的横向位置x(电学位置x)，并且使用学术上公开的跟踪软件(例如，DMV)从捕获的高速视频中导出相应的光学位置x，该跟踪软件可以提供精确的多个参数，诸如粒子横向位置、区和速度。
线性回归和布兰德-奥特曼分析用于评估电学方法与光学方法之间的相关性和一致性。在模型性能研究中经常使用的两个测量值的均方根偏差(RMSD)被用作测量粒子横向位置的微流控装置的精确度的测量值。
在低激发频率下，细胞的电学特征类似于绝缘珠子，因为细胞膜作为电容阻止电场线穿过它。由于实验利用了500kHz的低频交流电压，所以测量粒子横向位置类似于测量细胞横向位置。通过将流动的3.6、5、7、10μm珠子和人红细胞(RBC)的电学位置x与它们的光学位置x进行比较，验证了根据各种示例性实施例的微流体阻抗细胞仪装置的功能。
图8A描绘了示出根据各种示例实施例在25.4μl min-1的流速下10μm珠子的测量的电学位置x相对于t1/t2的实验结果的图。更特别地，图8A示出了根据各种示例性实施例获得的10μm珠子的横向位置和由光学方法获得的横向位置，其中三个代表性珠子以25.4μlmin-1的流速流过微通道的下部(I)、中部(ii)和上部(iii)部分(或位置)。由光学方法确定的位置x相对于(由电学方法确定的)t1/t2也被绘制作为参考。为了比较两种方法，由电学方法获得的t1/t2值用于绘制相应的光学横向位置。图8B中示出了相应的测量的差分电信号的图。
图8C示出了用于光学位置x的测量的三个代表性珠子的代表性电信号和它们相应的显微光学图像(同时捕获)的放大视图。通过电学方法和光学方法测量的位置x非常一致，示出了与光学估计相当的结果。例如，对于穿过微通道的相对中间部分或位置的10μm珠子(ii)，98.0μm的电学位置x与96.5μm的光学位置x相当。
在各种示例实施例中，由于相对于第一感测电极倾斜的偏置电极(例如，倾斜的中间电极)的独特设计，如果细胞穿过相对靠近下通道壁的横向位置，则细胞穿过前两个电极(例如，第一感测电极和偏置电极)的通过时间(t1)比穿过后两个电极(例如，偏置电极和第二感测电极)的通过时间(t2)长。这可能是由于在微通道的较低位置处，前两个电极之间的距离比后两个电极长。例如，图8C示出了流动粒子(i)，其中粒子相对靠近下部通道壁流动。相应的电流变化(a)(即第一信号峰(例如负峰)的幅度)低于相应的电流变化(b)(即来自后两个电极的第二信号峰(例如正峰)的幅度)，因为左侧的电场弱于右侧。相反，如果细胞通过通道的上半部分，如粒子(iii)所示，则t1比t2短，并且相应的电流变化(a)短(即第一信号峰的幅度)大于相应的电流变化(b)(即第二信号峰的幅度)。在细胞通过通道的中间位置的情况下，如粒子(ii)所示，两个峰是相似的，表明t1可以等于t2，并且对应的电流变化(a)(即第一信号峰的幅度)可能等于对应的电流变化(b)(即第二信号峰的幅度)。
图9示出了根据各种示例性实施例的电学方法的结果与通过光学方法获得的结果之间10μm珠子的横向位置的定量比较。更特别地，图9示出了在(a)25.4μl min-1、(b)42.4μlmin-1和(c)59.3μl min-1的流速下，10μm珠子的电学位置x与光学位置x的关系。对于三种流速获得了R2＞0.99的决定系数，证明了根据各种示例实施例的电学方法与光学方法之间的良好线性相关性。计算每个流速的均方根偏差(RMSD)。在流速分别为25.4、42.4和59.3μlmin-1时，这两个测量值的RMSD分别为3.2μm、6.9μm和12.7μm，分别相当于河道宽度的1.60％、3.45％和6.35％。
除了线性相关外，布兰德-奥特曼分析也用于研究两个测量值的一致性。布兰德-奥特曼图是两个测量值相对于平均值的差异散点图。图10示出了布兰德-奥特曼分析，其比较了在(d)25.4μl min-1、(e)42.4μl min-1和(f)59.3μl min-1的流速下通过电学方法和光学方法获得的横向位置x。大多数值都在95％的一致性界限之间，其在图中用两条虚线表示(即正偏差和负偏差)。可以观察到，当粒子通过通道的下半部分时，电学位置x高于光学位置x，导致负差异。相反，当粒子相对靠近上通道壁流动时，存在正差异。这是因为左侧两个电极内的电场强度不同于右侧两个电极。对于N形电极的下半部分，左侧的电场强度弱于右侧，因为左侧的两个电极之间的间隙比右侧的大，从而导致电信号在粒子到达中间电极的中心线之前下降到基线。因此，用于位置x计算的等式(4)中使用的值C1高于真实值，并且相反，C2小于真实值，这一起导致与真实位置x(即，光学位置x)相比更高的电学位置x。类似地，当粒子流过N形电极的上部部分时，左侧的电场强度比右侧的强，因此从电学方法来看，较小的C1和较高的C2导致较小的位置x。
如图10所示，当横向位置x接近通道的中间部分或位置时，两个测量值之间的差异减小。这是因为两对电极之间的电场强度的差异随着位置x接近N形电极的中间部分而减小(即，如果N形电极与微流体通道之间没有错位，位置x是100μm)。可以发现，RMSD(如图9所示)和最大差值(如图10所示)随着流速的增加而增加。这可能是由于两对电极之间的电场强度差随着流速的增加而增加。换言之，较高的流速会降低粒子横向位置的测量精度。
具有不同直径的珠子被用于研究可以使用根据各种示例实施例的微流控装置测量的最小粒子尺寸。图11A至图11B示出了可以由具有良好性能的微流控装置检测的最小粒子(即，3.6μm珠子)。图11A示出了根据各种示例性实施例的电学方法与光学方法之间的良好线性相关性(R2＝0.9616)，并且图11B示出了布兰德-奥特曼分析，该分析证明了两个测量值之间的良好一致性。在25.4μl min-1的流速下，两个测量值的均方根偏差(RMSD)为11.0μm(即通道宽度的5.5％)。
人红细胞(RBC)用于验证根据各种示例实施例的微流控装置可以用于单细胞的精确横向位置测量。图12A至图12B示出了从根据各种示例性实施例的微流控装置获得的结果与通过光学方法在42.4μl min-1的流速下获得的结果之间的RBC横向位置的定量比较。图12A示出了示出电学位置x相对于光学位置x的图，示出了两个测量值之间的决定系数(0.9863的R2)的良好线性相关性和高分辨率(11.7μm的RMSD，即通道宽度的5.7％)。图12B示出了图示布兰德-奥特曼分析的曲线图，该分析比较了通过电学方法和光学方法获得的横向位置x，其示出了良好的一致性。大多数值(94.6％)位于95％的一致性界限之间，在图12B中用两条虚线表示。
5μm和10μm珠子的混合物的横向位置和大小测量
为了测试根据各种示例实施例的微流控装置是否能够区分流过相同位置x的具有不同物理特性(例如，大小)的细胞或粒子，在42.4μl min-1的流速下测试5和10μm珠子的混合物。图13A至图13D示出了在42.4μl min-1的流速下，5和10μm珠子的混合物的横向位置x和电气直径的测量。图13A示出了电学位置x和光学位置x之间的比较。如图13A所示，两个测量值之间的决定系数(R2＝0.9895)具有良好的线性相关性，并且具有高分辨率(RMSD＝10.3μm，即通道宽度的5.15％)。
图13B示出了布兰德-奥特曼分析的图，其比较了通过电学方法和光学方法获得的横向位置x。布兰德-奥特曼分析证明了两种方法之间的良好一致性。大多数值都在95％的一致性界限之间，其用两条虚线表示。与相同流速下10μm珠子的结果相比，对于5μm珠子占大多数的混合物，RMSD从6.9μm(通道宽度的3.45％)增加到10.3μm(通道宽度的5.15％)。如上所述，根据等式(5)计算电学直径D。图13C示出了电学直径的直方图。如图13C所示，清楚地观察到两种不同的分布，其分别对应于5μm和10μm珠子。图13D示出了电学直径相对于电学位置x的散点图，表明根据各种示例性实施例的微流控装置不仅测量单个细胞/粒子的横向位置，还可以同时表征它们的物理特性(例如，大小)。如图13D所示，即使流过相同的位置x，两种不同的珠子也可以被清楚地区分，这意味着微流控装置不仅可以测量流动珠子的横向位置x，而且还可以表征它们的生物物理特性，比如所展示的大小。这使得能够评估细胞分离的效率，比如计算具有不同大小和横向位置的分选细胞的纯度和回收率。
监测鞘流诱导的粒子聚焦
粒子聚焦通常是检测、计数以及分选粒子或细胞之前的必要步骤。根据各种示例实施例的微流体阻抗细胞计(微流控装置)被应用于监测鞘流诱导的粒子聚焦，其中7μm珠子悬浮在样品流中。如图14A至图14B所示，在粒子聚焦实验之前，对从根据各种示例实施例的微流控装置获得的结果与通过光学方法获得的结果之间的7μm珠子的横向位置进行定量分析。显示了两个测量值之间良好的线性相关性(R2＞0.99)和良好的一致性(布兰德-奥特曼分析)。RMSD为7.0μm(即通道宽度的3.5％)。
图15A示出了在20μl min-1的总流速下用于监测鞘流诱导的7μm珠子的聚焦的示意性图像。图像示出了样品流与鞘流之间的边界。图像示出鞘流将样品流集中在通道的底部、中部和顶部(横向方向x)。图15B示出了图15A所示图像的像素强度曲线图(灰度)，其反映了粒子聚焦区域。图15C示出了由鞘流聚焦在不同区域(在通道的底部、中部和顶部(横向方向x))的7μm珠子的电学位置x的直方图。如图15B和图15C中的虚线所示，根据各种示例实施例的基于电学的结果与基于光学的结果非常一致。例如，对于聚焦在通道中间的样品流，通过两种方法，聚焦区域都在80μm至125μm之间。这些结果表明，根据各种示例实施例的微流控装置能够精确地确定粒子的横向位置，并且是用于监测粒子聚焦的有力工具。
与常规的基于阻抗的方法相比，各种示例性实施例提供了在最高流速下具有更精确的单细胞/粒子位置测量的微流控装置(例如，具有N形电极的微流体阻抗细胞仪装置)。细胞的位置(例如，横向位置和/或竖直位置)可以由简单的解析表达式直接确定，而不是由常规技术中带有校准系数的线性映射来确定。通过将珠子和RBC的电学横向位置与光学横向位置进行比较，验证了根据各种示例性实施例的微流体阻抗细胞仪装置的功能。两种方法在所有情况下都有很好的相关性和一致性。与常规的基于阻抗的方法相比，可以实现横向位置测量的更高分辨率。混合物的实验结果表明，根据各种示例性实施例的微流控装置不仅可以测量单个细胞或粒子在流体通道中的位置，而且可以同时研究或提供与它们的物理性质诸如大小相关的信息。鞘流诱导的粒子聚焦的实验表明，根据各种示例实施例的微流控装置是用于监测并评估粒子或细胞聚焦的有力工具。因此，根据各种示例性实施方式的微流控装置为细胞分选和分离性能的实时表征提供了巨大的潜力。
由于具有电信号的快速和精确处理以及阻抗流式细胞仪的高通过量的优点，所描述的各种示例实施例可以容易地与其他微流体平台集成，例如，作为用于单细胞和粒子的位置(例如，横向位置、竖直位置)和物理特性的实时测量的下游途径。
虽然已经参照具体实施例特别地示出并描述了本发明的实施例，但是本领域技术人员应该理解，在不脱离由所附权利要求限定的本发明的范围的情况下，可以在形式和细节上进行各种改变。因此，本发明的范围由所附权利要求表示，并且因此旨在包含在权利要求的等效含义和范围内的所有变化。

Claims (28)

1.一种用于单细胞处理的微流控装置，包括：
衬底；
设置在所述衬底中的流体通道，其中所述流体通道配置为形成流体路径，用于允许包括细胞的流体样品沿着所述通道流动；和
邻近所述流体通道布置的多个电极，用于确定所述细胞在所述流体通道中的位置，所述多个电极包括：
感测电极对，所述感测电极对包括第一感测电极和第二感测电极，所述感测电极对限定与所述流体通道的传感器部分重叠的感测区域，其中所述感测电极对中的至少第一感测电极在第一方向上延伸，所述感测电极对配置为当所述细胞流过所述流体通道的所述传感器部分时测量跨所述感测区域的差分电信号；和
布置在所述第一感测电极与所述第二感测电极之间的偏置电极，所述偏置电极配置为接收偏置电压，
其中所述第二感测电极和所述偏置电极中的一者在至少基本上平行于所述第一感测电极的方向上延伸，并且所述第二感测电极和所述偏置电极中的另一者布置成相对于所述第一感测电极具有倾斜取向。
2.根据权利要求1所述的装置，其中所述第二感测电极在至少基本上平行于所述第一感测电极的方向上延伸，并且所述偏置电极布置成相对于所述第一感测电极和所述第二感测电极具有倾斜取向。
3.根据权利要求2所述的装置，其中所述第一感测电极、所述第二感测电极和所述偏置电极布置成形成对应于N形的配置。
4.根据权利要求2或3所述的装置，其中所述偏置电极的倾斜取向相对于所述第一感测电极和所述第二感测电极中的至少一者处于范围为约10度至约60度内的角度。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的装置，其中所述细胞的所述位置包括在所述流体通道中的横向位置，所述横向位置相对于所述流体通道的宽度方向，并且基于所述细胞与所述多个电极之间的几何关系来确定。
6.根据权利要求1所述的装置，其中所述偏置电极在至少基本上平行于所述第一感测电极的方向上延伸，并且所述第二感测电极布置成相对于所述第一感测电极和所述偏置电极具有倾斜取向。
7.根据权利要求6所述的装置，其中所述第二感测电极的倾斜取向相对于所述偏置电极处于范围为约10度至约60度内的角度。
8.根据权利要求6或7所述的装置，其中所述多个电极还包括浮动电极对，所述浮动电极对在所述第一方向上延伸。
9.根据权利要求8所述的装置，其中所述浮动电极对布置在所述感测电极对之间，并且所述偏置电极布置在所述浮动电极对之间。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的装置，其中所述偏置电压包括交流电压。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的装置，其中所述差分电信号包括跨所述感测区域的差分电流响应。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的装置，其中所述第一方向沿着所述流体通道的宽度方向。
13.一种形成用于单细胞处理的微流控装置的方法，所述方法包括：
提供衬底；
在所述衬底中提供流体通道，其中所述流体通道配置为形成流体路径，用于允许包括细胞的流体样品沿着所述通道流动；
形成邻近所述流体通道布置的多个电极，用于确定所述细胞在所述流体通道中的位置，所述多个电极包括：
感测电极对，所述感测电极对包括第一感测电极和第二感测电极，所述感测电极对限定与所述流体通道的传感器部分重叠的感测区域，其中所述感测电极对中的至少所述第一感测电极在第一方向上延伸，所述感测电极对配置为当所述细胞流过所述流体通道的所述传感器部分时测量跨所述感测区域的差分电信号；和
布置在所述第一感测电极与所述第二感测电极之间的偏置电极，所述偏置电极配置为接收偏置电压，
其中所述第二感测电极和所述偏置电极中的一者在至少基本上平行于所述第一感测电极的方向上延伸，并且所述第二感测电极和所述偏置电极中的另一者布置成相对于所述第一感测电极具有倾斜取向。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述第二感测电极在至少基本上平行于所述第一感测电极的方向上延伸，并且所述偏置电极布置成相对于所述第一感测电极和所述第二感测电极具有倾斜取向。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述第一感测电极、所述第二感测电极和所述偏置电极布置成形成对应于N形的配置。
16.根据权利要求14或15所述的方法，其中所述偏置电极的倾斜取向相对于所述第一感测电极和所述第二感测电极中的至少一者处于范围为约10度至约60度内的角度。
17.根据权利要求13所述的方法，其中所述偏置电极在至少基本上平行于所述第一感测电极的方向上延伸，并且所述第二感测电极布置成相对于所述第一感测电极和所述偏置电极具有倾斜取向。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述第二感测电极的倾斜取向相对于所述偏置电极处于范围为约10度至约60度内的角度。
19.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述多个电极还包括浮动电极对，所述浮动电极对沿所述第一方向延伸。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述浮动电极对布置在所述感测电极对之间，并且所述偏置电极布置在所述浮动电极对之间。
21.根据权利要求1 3至20中任一项所述的方法，其中所述第一方向沿着所述流体通道的宽度方向。
22.一种用于使用根据权利要求1至12中任一项所述的微流控装置进行单细胞处理的方法，所述方法包括：
向所述偏置电极施加偏置电压；
当所述细胞流过对应于所述感测区域的所述流体通道的所述传感器部分时，基于所述第一感测电极和所述第二感测电极获得差分电信号；以及
基于所述差分电信号确定所述细胞在所述流体通道的所述传感器部分中的所述位置。
23.根据权利要求22所述的方法，其中获得的所述差分电信号包括多个信号峰，所述信号峰对应于所述细胞流过所述流体通道的所述感测部分从所述第一感测电极到所述第二感测电极的情况。
24.根据权利要求22或23所述的方法：
其中所述多个信号峰包括对应于所述细胞在所述流体通道的所述传感器部分中从所述第一感测电极流到所述偏置电极的第一信号峰和对应于所述细胞在所述流体通道的所述传感器部分中从所述偏置电极流到所述第二感测电极的第二信号峰；并且
所述确定所述细胞在所述流体通道的所述传感器部分中的所述位置包括基于所述第一信号峰的宽度和所述第二信号峰的宽度确定所述细胞在所述流体通道中的横向位置，所述横向位置相对于所述流体通道的宽度方向。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述确定所述细胞在所述流体通道中的横向位置还基于所述细胞与所述多个电极之间的几何关系。
26.根据权利要求24或25所述的方法，其中所述第一信号峰包括第一子峰，并且所述确定所述细胞在所述流体通道的所述传感器部分中的所述位置还包括基于所述第一子峰的幅度与所述第一子峰的谷值的比率来确定所述细胞在所述流体通道中的竖直位置，所述竖直位置相对于所述流体通道的高度方向。
27.根据权利要求24至26中任一项所述的方法，还包括基于所述第一信号峰的幅度和所述第二信号峰的幅度确定所述细胞的尺寸。
28.一种用于单细胞处理的系统，所述系统包括：
根据权利要求1至12中任一项所述的用于单细胞处理的微流控装置；和
计算系统，包括：
存储器；和
至少一个处理器，所述处理器通信地联接到所述存储器和所述微流控装置，并配置成：
向所述偏置电极施加偏置电压；
当所述细胞流过对应于所述感测区域的所述流体通道的所述传感器部分时，基于所述第一感测电极和所述第二感测电极获得差分电信号；以及
基于所述差分电信号确定所述细胞在所述流体通道的所述传感器部分中的所述位置。
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