CN114496066A - 一种三阴性乳腺癌预后的基因模型的构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种三阴性乳腺癌预后的基因模型的构建方法及其应用，属于生物医学技术领域，其特征在于，包括从数据库中获取三阴性乳腺癌患者的样本数据，结合HRD评分筛选出差异基因，基于差异基因，筛选出与三阴性乳腺癌预后相关的关键基因，基于关键基因，构建风险评分模型，本发明开发了HRD特征的风险评分模型并证明了其在三阴性乳腺癌患者中的预后价值，预期可用于临床智能化决策系统。

Description

一种三阴性乳腺癌预后的基因模型的构建方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种三阴性乳腺癌预后的基因模型的构建方法及其应用。

背景技术

三阴性乳腺癌(TNBC)是一种侵袭性乳腺癌亚型，其特征是雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体-2(HER-2)的表达缺失，占10-20% 的所有类型的乳腺癌。与非TNBC患者相比，TNBC患者具有年龄小、组织学分级高、肿瘤体积大、淋巴结阳性率高、易向肺、脑等部位转移等特点。其次，TNBC无法从内分泌治疗和抗HER-2靶向治疗中获益，化疗已成为TNBC患者的主要辅助治疗。但随着耐药性的增加，TNBC的有效化疗受到限制，即使积极治疗，转移性三阴性乳腺癌患者的中位总生存期不足一年。

但是，TNBC也具有明显的异质性，不同亚型之间存在生存差异，并非所有患者的预后都很差，传统的临床病理指标和单分子标志物在预测预后方面有明显的局限性。

同源重组修复(HRR)是多种细胞过程的重要信号通路，包括DNA双链断裂(DSB)的无错误修复和停滞的DNA复制叉的恢复，其中关键蛋白是BRCA1和BRCA2。BRCA1或BRCA2功能丧失导致同源重组缺陷 (HRD)。然而，其他 HRR 相关基因(如 PALB2、CDK12、RAD51、CHEK2、ATM 或 BRCA1 基因启动子甲基化)的种系和体细胞改变可导致散发性癌症中的 HRD，广泛称为BRCAness。通过HRD高发卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌和胰腺癌的一些临床研究发现，HRD状态与铂类化疗药物和PARP抑制剂的敏感性高度相关，是多种肿瘤治疗方案和预后的关键指标。为此，用于识别HRD的平台的开发和临床评估最近已成为深入研究的主题，尤其是在TNBC中，因为该亚型被认为是由于同源重组(HR)途径缺陷而丰富的。已有研究显示高HRD评分与TNBC患者对新辅助铂类化疗的敏感性显着相关。然而，围绕HRD开展的大部分工作是研究HRD相关基因的突变，以及基因组学识别HRD的准确性。不涉及转录组学研究。

发明内容

针对上述存在的技术不足，本发明的目的是提供一种三阴性乳腺癌预后的基因模型的构建方法，基于基因模型的同源重组缺陷评分的鉴定结果以改善三阴性乳腺癌患者的生存预测。

为解决上述技术问题，本发明提供一种三阴性乳腺癌预后的基因模型及其构建方法，本发明的基因模型的及其构建方法为：

从数据库中获取三阴性乳腺癌患者的样本数据，作为训练集，结合HRD评分筛选出差异基因，基于差异基因，筛选出与三阴性乳腺癌预后相关的预后基因，基于预后基因，构建风险评分模型；具体步骤为：

S1.从数据库获取三阴性乳腺癌样本数据，作为训练集，根据HRD评分，将获得的三阴性乳腺癌样本数据分为两组：HRD评分≥42的HRD肿瘤样本和HRD评分＜42的非HRD肿瘤样本；

S2. R语言limma包用于分析HRD肿瘤样本和非HRD肿瘤样本之间差异表达的基因，显着差异的阈值被指定为P值<0.005，筛选出三阴性乳腺癌样本的HRD肿瘤样本和非HRD肿瘤样本之间的差异表达基因；共筛选出417个差异基因，包括203个上调基因和214个下调基因，基于所述差异表达基因，通过WGCNA识别与三阴性乳腺癌的预后相关的关键模块，共识别出199个关键模块；

S3.通过LASSO-Cox回归分析，基于步骤S2所述关键模块识别用于构建风险评分模型的预后基因，具体为：单变量Cox回归分析199个关键模块基因，确定了一组P值小于0.1的与三阴性乳腺癌预后显著相关的29个候选基因，对29个候选基因进行LASSO分析，多变量Cox分析，确定预后基因，共确定6个预后基因，具体为：MUCL1、IVL、FAM46C、CHI3L1、PRR15L和 CLEC3A。

S4.基于S3所述6个预后基因，构建三阴性乳腺癌预后的风险评分模型。

进一步的，所述本发明的基因模型具体为：

患者风险评分=（0.53×PRR15L表达水平）+（0.23×MUCL1表达水平）+（0.2×IVL表达水平）-（0.38×FAM46C表达水平）-（0.3×CLEC3A表达水平）-（0.25×CHI3L1表达水平）

本发明的另一目的是提供一种三阴性乳腺癌预后的基因模型的应用，具体为：验证所述风险评分模型的预测性能：

与训练集对比验证：根据基因表达水平和每个基因的风险系数，计算每个患者的风险评分，以每个模型的风险评分中位数作为阈值，将样本分为高风险和低风险组绘制Kaplan-Meier曲线和模型评价的危险因素连锁图，与低危组相比，判断所述高风险组和所述低风险组的预后差异。

进一步的，Kaplan-Meier生存分析显示高危组预后明显较差。

进一步的，验证所述风险评分模型的拟合优度，从基因表达综合（GEO）数据库中获得了数据集，作为验证集，使用本发明的风险评分模型进行生存分析，绘制Kaplan-Meier曲线，其结果与训练组一致。

进一步的，所述风险评分模型是一个独立的预后指标：单变量Cox分析中的本发明的风险评分模型与总生存期显著相关；多变量Cox分析显示本发明的风险评分模型是一个独立的预后指标。

进一步的，采用1年、3年、5年时间依赖性ROC曲线评价本发明风险评分模型的预测能力（AUC=1年0.957、3年0.835、5年0.847）及其预测能力，本发明风险评分模型的预测能力比AJCC阶段更好。

进一步的，本发明的一种三阴性乳腺癌预后的基因模型的应用还包括：非暂时性存储计算机可读指令的存储器，运行计算机可读指令的处理器，其中，所述处理器运行的计算机可读指令包括本发明任一实施例提供的一种三阴性乳腺癌预后基因模型。

本发明的又一目的是提供一种三阴性乳腺癌预后的基因模型构建方法的应用，具体为：

本发明的一种三阴性乳腺癌预后的基因模型的构建方法的应用还包括：非暂时性存储计算机可读指令的存储器，运行计算机可读指令的处理器，其中，所述处理器运行的计算机可读指令包括本发明任一实施例提供的一种三阴性乳腺癌预后基因模型的构建方法。

本发明的有益效果在于：

1、本发明开发了 HRD 特征的风险评分模型并证明了其在 TNBC 患者中的预后价值；2、本发明的风险评分模型生存曲线中，高危和低危亚组患者的生存曲线中有明显的分离，并对其进行评估作为类别变量（除以中值截断值），低风险组的死亡比例非常低；2、结合TNM评分，临床亚组（N0 分期、N1+N2+N3 分期、I+II 期、T1+T2 分期）分析显示， 6 基因风险评分仍然可以更好地预测预后；3、本发明的6基因风险评分可作为评估预后的独立因素；4、最后，我们开发了一个列线图来指导临床实践，包括 AJCC 分期、HRD 评分、T 分期和 N分期和风险评分来构建列线图来预测 TNBC 患者的 3 年和 5 年生存率；与TNM分期相比，6基因风险评分在ROC分析中显示出更好的预测能力。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为HRD 样本的 Kaplan-Meier 曲线与总生存时间。

图2为热图显示的 HRD 肿瘤样本和非 HRD 肿瘤样本之间的差异表达基因。

图3 a为差异表达基因的 WGCNA 分析中：各种软阈值功率的拓扑分析；左侧面板显示无标度拟合指数（y 轴）作为软阈值功率（x 轴）的函数，右侧面板显示作为软阈值功率（x 轴）的函数的平均连通性（度数，y 轴），4 是最适合的功效值。

图3 b为差异表达基因的 WGCNA 分析中：基于拓扑重叠的不同基因的聚类树状图，连同指定的模块颜色；构建了 5 个共表达模块并以不同颜色显示。

图3 c为差异表达基因的 WGCNA分析中：模块中 DEG 与转移之间的关联程度（基因特征显着性，GS）。

图3 d为差异表达基因的 WGCNA 分析中：模块-特征关系,模块特征基因与 TNBC临床特征之间的相关性热图，该表根据颜色图例通过相关性进行颜色编码。

图4 为基于某些预后基因（MUCL1、IVL、FAM46C、CHI3L1、PRR15L 和 CLEC3A）的单变量 COX 回归的Forrest图。

图5a为TCGA-BRCA 队列中 6 个预后基因的多变量 Cox 回归分析。

图5b为偏似然偏差图，LASSO 回归与五重交叉验证使用最小 lambda 值获得 6个预后基因。

图6a为六基因特征的Kaplan-Meier生存分析，上图显示了高风险和低风险组的Kaplan-Meier曲线；中图显示了高危组和低危组中随时间推移的风险人数；下图显示了高风险组和低风险组随时间变化的删失次数。

图6b为模型评价的风险因素联动图，上图为风险评分曲线；中图显示了高危组和低危组随时间变化的存活患者数量；下图显示了低风险和高风险组中六个预后基因的表达谱的热图。

图7a为验证 6 基因风险评分的稳定性中N0 分期，分层的亚组中 OS 的Kaplan-Meier 生存率。

图7b为验证 6 基因风险评分的稳定性中N1-N3 分期，分层的亚组中 OS 的Kaplan-Meier 生存率。

图7c为验证 6 基因风险评分的稳定性I 期- II 期中，分层的亚组中 OS 的Kaplan-Meier 生存率。

图7d为验证 6 基因风险评分的稳定性T1-T2分期中，分层的亚组中 OS 的Kaplan-Meier 生存率。

图8为6基因评分与 HRD 评分之间的相关性。

图9为确定独立预后参数、与总生存期相关的临床因素的单变量和多变量 Cox 回归分析：a、TNBC 中单变量 Cox 回归分析的 Forrest 图；b、TNBC 中多元 Cox 回归分析的Forrest 图。

图10为6基因验证: GSE103091 被视为外部验证集，外部验证集中 6 基因特征的Kaplan-Meier 生存分析。

图11a为由AJCC 阶段、HRD 评分、T 阶段、N 阶段和基于六基因特征的风险评分组成的列线图。

图11b为用于预测 6 基因评分和 AJCC 阶段之间的1年总生存率的 ROC 曲线。

图11c为用于预测 6 基因评分和 AJCC 阶段之间的3年总生存率的 ROC 曲线。

图11d为用于预测 6 基因评分和 AJCC 阶段之间的5年总生存率的 ROC 曲线。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

在本研究中，从 TCGA 数据库中收集了 123 个 TNBC 肿瘤样本的临床特征和RNA 测序数据，并根据基因组数据确定了 HRD 分组，然后构建了一个 HRD 转录组的预后模型，并将其与基因组 HRD 评分进行比较。

1 数据采集与预处理

S1.从数据库获取三阴性乳腺癌样本数据，作为训练集：

TCGA（癌症基因组图谱）BC mRNA 表达谱（TCGA-BRCA 队列）和相关临床信息从基因组数据共享数据门户（https://portal.gdc.cancer.gov/）下载。使用 R（版本 3.6.0）软件对数据进行标准化和处理。肿瘤样本的HRD信息可从HRD相关数据中获取（HRD评分见：PMID：29617664，TCGA_DDR_Data_Resources.xlsx格式：DDR足迹），肿瘤样本分为HRD肿瘤样本（HRD评分≥42）和非HRD肿瘤样本（HRD 评分<42）。 GSE103091 数据集从 GeneExpression Omnibus (GEO, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) 获得，作为验证集，用于验证。

TCGA-BRCA 训练集由 1104 个肿瘤样本（123 个 TNBC 和 981 个非 TNBC 样本）和 114 个正常样本组成。结合HRD数据库，筛选出110份TNBC样本中具有HRD评分的样本，并根据HRD评分将其分为HRD肿瘤样本和非HRD肿瘤样本（≥42为HRD肿瘤样本）。Kaplan-Meier生存分析表明，TNBC 患者的 HRD 肿瘤样本与较差的总体生存率相关（图 1）。

S2.R语言limma包（http://www.r-project.org/）用于分析HRD肿瘤样本和非HRD肿瘤样本之间差异表达的基因，显着差异的阈值被指定为P值<0.005，分析筛选出三阴性乳腺癌样本的HRD肿瘤样本和非HRD肿瘤样本之间的差异表达基因；共筛选出417个差异基因（图2），包括203个上调基因和214个下调基因，基于S1中的差异表达基因，通过WGCNA识别与三阴性乳腺癌的预后相关的关键模块，共199个关键模块（图3a-图3d）；用WGCNA将本研究的数据进行归纳和整理，系统地反馈样本中的基因间相互作用模式，有助于筛选与三阴乳腺癌临床指标强相关的模块，从而显著提高基因筛选。

S3.基于步骤S2中的关键模块，通过LASSO-Cox回归分析识别用于构建风险评分模型的预后基因，具体为：单变量Cox回归分析了199个关键模块基因，提取WGCNA结果中brown和blue模块内的基因，确定了一组P值小于0.1的与三阴性乳腺癌预后显著相关的29个候选基因，对29个候选基因进行LASSO-Cox分析，确定预后基因，最终筛选出6个预后基因及这些预后基因的预HR值（图4、图5a、图5b），预后基因具体为：MUCL1、IVL、FAM46C、CHI3L1、PRR15L和 CLEC3A。

附表1：部分基因单变量Cox回归结果

项目	HR (95% CI)	P-值	临界值
				CHI3L1	0.78 (0.64-0.96)	0.018	9.241414
CLEC3A	1.3 (1.1-1.6)	0.0023	1.876011
				FAM46C	0.69 (0.47-1)	0.057	7.500264
IVL	1.2 (1-1.5)	0.035	3.095136
				MUCL1	1.3 (1.1-1.5)	0.0028	4.78792
PRR15L	1.7 (1.1-2.5)	0.0095	7.098303

S4.基于S3步骤的6个预后基因，将Cox LASSO回归模型的系数作为权重，构建出一个基于包含MUCL1、IVL、FAM46C、CHI3L1、PRR15L和CLEC3A6个基因为标志物的三阴性乳腺癌预后预测风险评分模型，基因模型具体为：

患者风险评分=（0.53×PRR15L表达水平）+（0.23×MUCL1表达水平）+（0.2×IVL表达水平）-（0.38×FAM46C表达水平）-（0.3×CLEC3A表达水平）-（0.25×CHI3L1表达水平）

粘蛋白样1（MUCL1）是一种编码与唾液腺粘蛋白具有高度相似性的低分子量糖蛋白的基因，仅在唾液腺和乳腺组织中表达。它被鉴定为乳腺癌微转移的乳腺特异性基因，有研究发现MUCL1高表达与三阴性乳腺癌患者的高复发率和死亡率显着相关。

外皮蛋白 (IVL) 是角质形成细胞交联包膜的一种成分，存在于细胞质中，并通过转谷氨酰胺酶与膜蛋白交联。该基因被定位到 1q21，包括钙蛋白酶蛋白 I 轻链、透明质蛋白、聚蛋白原、loricrin 和钙周期蛋白。最近，IHL 已被确定为一种新的枢纽基因，与正常组织相比，该基因在结肠腺癌中显示出显着的上调。目前，关于 TNBC 中 IVL 的研究很少。

FAM46C在肝细胞癌（HCC）中下调并通过调节Ras/MEK/ERK通路诱导细胞凋亡。此外，FAM46C在前列腺癌中被下调以抑制细胞增殖和细胞周期进程并通过PTEN/AKT信号通路促进细胞凋亡。但是，TNBC 中没有关于 FAM46C 的研究。

CHI3L1 位于人类染色体 1q32.1 上，编码一种称为 YKL-40 的分泌糖蛋白，它在炎症、血管生成、放射抗性和癌症进展中起着重要作用。 CHI3L1 的过度表达已在各种类型的癌症中得到描述，包括少突胶质细胞、胶质母细胞瘤、骨肉瘤、乳腺癌和小细胞肺癌。YKL-40 表达在 NSCLC 组织中显着上调，并与不良预后和较短生存期相关。

PRR15L，也称为ATAD4，它编码一种功能未知的蛋白质，迄今为止，还没有关于该基因的这种功能的报道。

C 型凝集素域家族3 成员A (CLEC3A) 属于 C 型凝集素超家族，已知与影响肿瘤细胞增殖和转移结果的细胞粘附有关。据报道，CLEC3A 最初在软骨中表达，并与骨关节炎有关。

实施例2：验证所述风险评分模型的预测性能：

2.1与验证集对比：

根据基因表达水平和每个基因的风险系数，计算每个患者的风险评分，以每个模型的风险评分中位数作为阈值，将样本分为高风险和低风险组绘制Kaplan-Meier曲线和模型评价的危险因素连锁图，与低危组相比，判断所述高风险组和所述低风险组的预后差异，Kaplan-Meier生存分析显示高危组预后明显较差(P<0.0001) (图6a、图6b)。从基因表达综合（GEO）数据库中获得了 GSEGSE103091 数据集，作为验证集，使用本发明的风险评分模型进行生存分析，绘制Kaplan-Meier曲线（图10），其结果与训练组一致。

2.2 验证本发明的风险评分模型是否可以作为独立的预后因素：

单变量Cox分析中的本发明的风险评分模型与总生存期(OS) 显著相关（HR =0.074，95% CI = 0.017–0.032，P = 0.00056）；多变量分析显示本发明的风险评分模型是一个独立的预后指标（HR = 39.373，95% CI = 7.059–219.624，P < 0.001）（图9）。

2.3 验证本发明的风险评分模型的预测能力：

分析风险预测模型的稳定性，Kaplan-Meier生存曲线分析表明，低风险组与N0期（P=0.0032）、N1-N3期（P=0.00033）的较好OS显著相关（图7a-图7d）。

分析准确性：本发明整合了 TNBC 的风险评分模型和临床因素（AJCC 分期、HRD评分、T 分期和 N 分期）构建复合列线（图11a），采用1年、3年、5年时间依赖性ROC曲线评价本发明风险评分模型的预测能力（AUC=1年0.957、3年0.835、5年0.847），其预测能力比AJCC 阶段更好（图11b、图11c、图11d）。

2.4 基因风险评分模型的交互和验证：

进行了 Spearman 相关性测试以评估 HRD 评分与 6 基因风险评分之间的相关性。 6 基因风险评分和 HRD 评分的散点图显示了两个变量之间的负线性关系（Pearson相关系数 = -0.22）（图 8）。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (7)

1.一种三阴性乳腺癌预后的基因模型的构建方法，其特征在于，包括：

从数据库中获取三阴性乳腺癌患者的样本数据，结合HRD评分筛选出差异基因，基于差异基因，筛选出与三阴性乳腺癌预后相关的关键基因，基于关键基因，构建风险评分模型；具体步骤为：

S1.从数据库获取三阴性乳腺癌样本数据，根据HRD评分，将获得的三阴性乳腺癌样本数据分为两组：HRD评分≥42的HRD肿瘤样本和HRD评分＜42的非HRD肿瘤样本；

S2.分析并筛选HRD肿瘤样本和非HRD肿瘤样本之间差异表达的基因；基于所述差异表达基因，通过WGCNA识别与三阴性乳腺癌的预后相关的关键模块；

S3.基于步骤S2所述关键模块，通过LASSO-Cox回归分析识别用于构建风险评分模型的6个预后基因；

S4.基于S3所述6个预后基因，构建三阴性乳腺癌预后的风险评分模型。

2.如权利要求1所述的一种三阴性乳腺癌预后的基因模型的构建方法，其特征在于，所述6个预后基因具体为：MUCL1、IVL、FAM46C、CHI3L1、PRR15L 和 CLEC3A。

3.如权利要求2所述的一种三阴性乳腺癌预后的基因模型的构建方法，其特征在于，所述风险评分模型为：患者风险评分=（0.53×PRR15L表达水平）+（0.23×MUCL1表达水平）+（0.2×IVL表达水平）-（0.38×FAM46C表达水平）-（0.3×CLEC3A表达水平）-（0.25×CHI3L1表达水平）。

4.如权利要求1所述的一种三阴性乳腺癌预后的基因模型的构建方法，其特征在于，所述关键基因为199个。

5.如权利要求3所述的一种三阴性乳腺癌预后的基因模型的构建方法的应用，其特征在于，根据基因表达水平和每个基因的风险系数，以所述风险评分模型计算每个患者的风险评分，以计算所得的风险评分中位数作为阈值，将样本分为高风险和低风险组绘制Kaplan-Meier曲线和模型评价的危险因素连锁图，判断所述高风险组和所述低风险组的预后差异。

6.如权利要求5所述的一种三阴性乳腺癌预后的基因模型的构建方法的应用，其特征在于，所述低风险组预后优于所述高风险组。

7.如权利要求5所述的一种三阴性乳腺癌预后的基因模型的构建方法的应用，其特征在于，所述风险评分模型是预后评判的一个独立的预后指标。

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