CN114487444A - 一种测定血清中抗穆勒氏管激素含量的检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种测定血清中抗穆勒氏管激素含量的检测试剂盒，本发明的试剂盒，包括试剂R1和试剂R2及标准品，R1试剂包括缓冲液、促进剂、防腐剂、阻断剂，R2试剂包括缓冲液、稳定剂、偶联有抗穆勒氏管激素抗体脂质体微球、防腐剂；本发明的测定抗穆勒氏管激素浓度的试剂盒，采用脂质体微球连接兔抗人抗穆勒氏管激素多克隆抗体Fab片段，该检测试剂盒可适用于各类全自动生化仪，具有高通量、操作简便、高精密度等优点。

Description

一种测定血清中抗穆勒氏管激素含量的检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种测定血清中抗穆勒氏管激素含量的检测试剂盒。

背景技术

抗缪勒管激素(anti-Müllerian hormone,AMH),又抗缪勒氏管激素(AMH)是转化生长因子β超家族的成员之一，由Professor Alfred Jost于1974年首先发现。AMH检查能够可靠、快速地评价卵巢储备功能：正常值界于2-6.8ng/ml之间，数值越高，代表卵子数量越丰沛。

女性的生育能力与其卵巢储备功能和体内的各类生殖激素具有密切的关系。卵巢储备能力的不足，会导致女性衰老提前，出现月经周期延、心血管问题加重，甚至会导致绝经、更年期、不孕等症状。

正确评价卵巢储备功能是预防女性衰老、防治不孕症的关键，AMH检测在临床中有如下应用：

评估卵巢储备功能：

相比较其他传统的生物学指标，AMH在评估卵巢储备方面有很多明显的优点，是卵巢衰老最准确的生物标志物。AMH比FSH、雌二醇(estradiol,E2)、抑制素B(inhibinB,inhB)和窦卵泡计数(antra1 follicle count,AFC)更早反映卵巢储备随年龄下降的趋势，且其水平不受月经周期、激素类避孕药和怀孕的影响[12]。虽然有研究显示，女性尤其是年轻女性月经周期内AMH存在一定波动，但其波动远小于其他性激素，故现有指南多支持在月经周期任意时间检测AMH。另外，Fanchin等比较了AMH和其他卵巢储备标志物在不同月经周期间的重复性，AMH是满足组内相关系数>0.8的激素，说明AMH在月经周期之间的变异也较小。因此，AMH是卵巢储备功能指标中最为稳定和可靠的一个。

评估肿瘤患者卵巢储备：

手术、化疗、放疗都有可能影响肿瘤患者的卵巢储备功能。10年的跟踪研究显示，儿童肿瘤幸存者的AMH水平显著低于健康同龄人，且伴随不孕比例不断增加。在乳腺癌患者中，术前AMH水平较低的患者术后一年内恢复月经的概率更低。接受卵巢囊肿剥除术的患者中，使用电凝术止血患者的AMH水平较使用缝合或止血材料的患者更低。此外，化疗前评估血清AMH的水平可用于预测化疗后卵巢功能。一项前瞻性研究显示，早期乳腺癌患者治疗前AMH水平越低越易在化疗之后闭经。肿瘤患者化疗后AMH水平恢复的速度与化疗药物的卵巢毒性成反比。由此可见，AMH水平可以预测肿瘤患者的卵巢功能，帮助希望保留生育功能的患者选择药物和手术方式。

辅助生殖：

AMH水平可准确预测患者对控制下卵巢刺激(controlled ovarianstimulation,COS)的反应，并据此选择个性化治疗方案。Broer等的一项Meta研究显示，AMH水平用于预测卵巢低反应(poor ovarian response,POR)的曲线下面积为0.81，显著高于年龄、基础FSH水平和AFC。卵巢过度刺激综合征(ovarian hyperstimulation syndrome,OHSS)是辅助生殖促排卵技术的主要并发症之一，而AMH水平可较好预测OHSS。一项多中心前瞻性研究建立了中国人群使用AMH水平预测促排卵患者发生卵巢低反应的切点值为1.1ng/mL，预测卵巢过度刺激的切点值为2.6ng/ml。

Nelson等发表了MERIT和MEGASET两项多中心研究结果，其中19家使用促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasinghormone,GnRH)激动剂长方案的中心和18家使用GnRH拮抗剂方案的中心中，各有15家显示了AMH与获卵数的斯皮尔曼相关系数显著高于AFC，说明AMH预测获卵数的能力强于AFC。La Marca等的Meta研究则建议了以AMH为依据的个体化促排卵方案，即当患者AMH水平较高，卵巢过度刺激风险较大时，应采用GnRH拮抗剂+最小剂量FSH刺激方案；当患者AMH水平较低，卵巢低反应风险较大时，可采用GnRH拮抗剂+最大剂量FSH刺激方案。但AMH在预测排卵应用中也存在一定的局限性，即虽然可以很好地预测卵母细胞的数量，但不能反映卵子的质量。

诊断多囊卵巢综合征：

与健康排卵妇女相比，排卵多囊卵巢综合征(poly-cystic ovarian syndrome，PCOS)患者卵泡液中AMH的浓度比正常值高出5倍。此外，与正常卵巢的颗粒细胞相比，无排卵PCOS的颗粒细胞中每个颗粒细胞产生的AMH平均增加75倍。另一项研究显示，PCOS女性的血清AMH水平较正常排卵女性升高2～3倍，且血清AMH水平越高，PCOS确诊率越高，当AMH水平>10ng/mL时，PCOS的确诊率可达到97％～100％。由于检测方法和受试人群的差异，AMH水平用于诊断PCOS的切点值尚不统一，从2.8～8.4ng/mL不等。

预测绝经期及诊断卵巢早衰：

Broer等检测了257例年龄在21～46岁且月经正常女性的AMH、AFC和FSH水平，11年后其中48例绝经，将绝经年龄与以上各因素进行Cox回归，经年龄调整后的数据显示仅AMH水平可以很好地预测绝经年龄。Dolleman等的研究则提示AMH是比母亲绝经年龄更好预测女性绝经年龄的指标；其另一项研究则显示，在包含了年龄、体重指数、年吸烟量和月经周期状态的多因素预测模型中加入AMH，可以显著提高这一模型预测10年内绝经概率的能力。Knauff等的研究显示，卵巢早衰人群中仍有相当一部分血清FSH水平低于诊断切点值40IU/mL，而血清AMH水平几乎100％低于绝经参考浓度，说明AMH能够比FSH更好地区分卵巢早衰。

胶乳颗粒增强比浊法是近年来出现的一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法。PETIA法大体分为两种。一种是散射比浊检测法；另一种是透射比浊检测法。这两种方法的基本原理非常相似，都是在高分子胶乳微球的表面交联单克隆抗体，当交联有抗体的微球与抗原结合后，在短时间内会迅速聚集在一起，改变了反应液的散光性能或透光性能。而且，反应液散光性能或透光性能(即吸光度)的改变与被测抗原的浓度有较强的相关性,在一定范围内可以反映被测抗原的浓度。PETIA检测方法是在均相反应体系中进行抗原、抗体反应及结果的测定。抗原、抗体反应后，直接测定反应液的吸光度值，省却了ELISA法反复孵育和洗板等烦琐操作步骤，几分钟就能获得结果，省时省力。此外，纳米免疫比浊法操作步骤的简化也相应地避免了许多人为操作因素和试剂、环境等外界因素的干扰，稳定性和重复性都较好，能较真实地反映被测物质的含量。免疫比浊法的灵敏度虽然比ELISA法差一些，但足于检测到健康人血浆中许多标志蛋白的下限值，可完全满足临床检测要求。

目前检测抗缪勒管激素的方法主要有化学发光法、酶联荧光分析法、放射性免疫法和酶联免疫法。但是这些方法都有其局限性，如，化学发光法和酶联荧光分析法价格昂贵，需要专门仪器和专业人员操作，只适合中心实验室使用；放射性免疫法会对环境造成污染；而酶联免疫法测定周期长，不适合急诊的快速检测。

专利CN 112180079 A公开一种稳定的脂质体颗粒及其在免疫比浊检测中的应用，所述脂质体纳米颗粒为球形、且平均粒径50-250nm的脂质双层结构，所述脂质体纳米颗粒的密度为1.0-1.03g/cm³。然而，存在球体韧性不够，脂质体易受试剂渗透压的影响，脂质体制备过程中难以控制。试剂长期保存过程中会发生球体变形导致试剂沉降等问题。

发明内容

鉴于此，本发明的目的是提供一种测定血清中抗缪勒管激素含量的检测试剂盒，它操作简便、灵敏度高、特异性好，能快速的测定结果、且测定结果准确性高。

为了解决背景技术所存在的问题，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一种测定血清中抗穆勒氏管激素含量的检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2和校准品；

所述试剂R1为磷酸盐缓冲体系；

所述试剂R2包括交联抗穆勒氏管激素抗体的致敏颗粒溶液；

所述标准品包括抗穆勒氏管激素、缓冲液、保护剂、防腐剂。

所述的磷酸盐缓冲体系包括磷酸盐缓冲液、聚合物、乙二胺四乙酸二钠、氯化钠、牛血清白蛋白以及阻断剂。

所述阻断剂为兔IgG片段。

所述防腐剂选自叠氮化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、硫柳汞、Proclin-300或苯酚中的一种或多种。

优选的，所述试剂R1包括的组分及含量如下：

优选的，所述聚合物种类为：聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、葡聚糖10000-40000Kd，其中一种或几种。

优选的，所述试剂R2包括的组分及含量如下：

优选的，所述标准品包括的组分及含量如下：

按体积比，所述试剂R1、R1及标准品的体积比为15-20：120-135：30-45。

优选地，按体积比，所述试剂R1、R1及标准品的体积比为15：135：45。

所述交联抗穆勒氏管激素抗体的致敏颗粒是经过将抗穆勒氏管激素抗体通过化学交联的方法固定到纳米脂质体颗粒表面制备获得。

所述抗穆勒氏管激素抗体通过木瓜蛋白酶酶切。

所述的抗穆勒氏管激素抗体经过蛋白酶酶切处理的过程如下：

称取10mg抗穆勒氏管激素抗体和0.5mg木瓜蛋白酶粉，加入40uL半胱氨酸溶液(0.5mol·L)和20ul EDTA溶液(0.1mol/L，pH 7.0)，并加入1mL 0.1mol/L磷酸盐缓冲液，置于37℃、250r·min恒温金属浴中酶解2h，酶解结束后加入100uL碘乙酰胺溶液(0.2mol/L)冰浴半小时以终止反应。

所述纳米脂质体颗粒是直径250-320nm的表面磺基化的脂质体微球，其表面带负电荷，具有良好的悬浮稳定性。

所述纳米脂质体颗粒的制备方法包括如下步骤：

S1，将卵磷脂和胆固醇溶于无水乙醇，超声处理，形成稳定的膜材悬浮液；

S2，PBS缓冲液置于容器中水浴，加入亚硫酸钠溶液，搅拌的同时将步骤1的膜材悬浮液注入容器中，制备成脂质体悬液；

S3，将脂质体悬液进行水浴超声处理，得到白色半透明脂质体悬浮预备液，过滤去除大颗粒杂质后，获得所述脂质体颗粒。

优选的，所述纳米脂质体颗粒的制备方法包括如下步骤：

S1，将卵磷脂和胆固醇溶于无水乙醇，超声处理，形成稳定的膜材悬浮液；

S2，PBS缓冲液置于容器中水浴，加入亚硫酸钠溶液，搅拌的同时以每秒1-2滴的速率将步骤1的膜材悬浮液注入容器中，制备成脂质体悬液；

S3，将脂质体悬液进行水浴超声处理，每进行5s超声暂停5s，超声时间总计30min后得到白色半透明脂质体悬浮预备液，用微孔滤膜除去大颗粒杂质后，获得脂质体颗粒。

作为本发明的又一实施方式，所述纳米脂质体颗粒的制备方法包括如下步骤：

称取0.4g卵磷脂和0.1g胆固醇，溶于10ml无水乙醇，水浴超声处理5min后形成稳定的淡黄色均匀的膜材悬浮液放入酸式滴定管中。用量筒取40mlPBS缓冲液(pH6.8)于100mL烧杯中置于40℃水浴，再加入5ml浓度为2.5mol/L的亚硫酸钠溶液，搅拌的同时以每秒1滴的速率将滴定管的膜材悬浮液注入该烧杯中，注入过程持续20min左右，制备成脂质体悬液，将脂质体悬液装入茄形瓶中水浴超声处理，每进行5s超声暂停5s，超声时间总计30min后得到白色半透明脂质体悬浮液，用微孔滤膜除去大颗粒杂质后，获得脂质体颗粒，置于2-8℃保存。

所述交联抗穆勒氏管激素抗体的致敏颗粒的制备方法包括如下步骤：

A、取所述脂质体颗粒离心，取上清液后，用缓冲液复悬，超声分散，得复悬液；

B、将复悬液中加入NHS溶液混匀，再加入EDC溶液混匀后，室温搅拌，然后离心，经离心后的沉淀用缓冲液溶解悬浮，超声，然后加入抗穆勒氏管激素多克隆抗体，搅拌后离心；离心后的沉淀悬浮于封闭液中，超声，即得所述抗体脂质体致敏颗粒。

封闭液组分如下：MOPSO 0.2mol/L pH7.4、牛血清白蛋白1-2％，。

所述抗穆勒氏管激素多克隆抗体的加入量与脂质体颗粒的比为5-20mg/10ml。

进一步，将抗穆勒氏管激素抗体通过化学交联的方法固定到纳米脂质体颗粒表面的方法包括如下步骤：

①、取脂质体颗粒离心，取上清液后，用甘氨酸缓冲液(0.1mol/L，pH5.2)复悬，超声分散，得复悬液；

②、将复悬液中加入NHS溶液混匀，再加入EDC溶液混匀后，室温搅拌，然后离心；

③、将经步骤②离心后的沉淀用甘氨酸缓冲液(0.1mol/L，pH5.2)溶解悬浮，超声，然后加入兔抗人抗穆勒氏管激素多克隆抗体，室温搅拌后离心；

④、将经步骤③离心后的沉淀用甘氨酸缓冲液(0.1mol/L，pH5.2)溶解悬浮，超声，然后离心；

⑤、将经步骤④离心后的沉淀用甘氨酸缓冲液(0.1mol/L，pH5.2)溶解悬浮，超声，然后离心；

⑥、将经步骤⑤离心后的沉淀悬浮于封闭液中，超声，即得所述抗体脂质体致敏颗粒。优选地，步骤③中，所述抗穆勒氏管激素多克隆抗体的加入量与脂质体颗粒的比为5-20mg/10ml。

本发明提供的试剂盒是由试剂R1、试剂R2及校准品三部分组成，试剂R1为磷酸盐缓冲体系，试剂R2的组成为交联抗缪勒管激素的致敏颗粒溶液，校准品为重组抗缪勒管激素溶于磷酸缓冲液中，同时添加甘油、蔗糖、BSA、甘露醇、山梨醇作为保护剂，叠氮钠作为防腐剂。

所述的校准品包含抗缪勒管激素浓度分别为0，3，6，12，24ng/ml的5支校准品。

本发明的试剂盒具有操作简便、灵敏度高、特异性好，能快速的测定结果、且测定结果准确性高等优点。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.IgG是由Fab片段和Fc片段组成，Fab段：抗原结合片段(fragment of antigenbinding，Fab)，相当于抗体分子的两个臂，由一个完整的轻链和重链的VH和CH1结构域组成。Fc段：可结晶段(fragment crystallizable，Fc)相当于Ig的CH2和CH3结构域，是Ig与效应分子或者细胞相互作用的部位。IgG经过酶切除掉Fc片段，剩下抗原结合区域Fab片段。这样Fab片段结合到微球上，暴露了可结合抗原的部位，增加了与抗原结合的概率。本发明通过采用抗体酶切Fc片段技术特征，解决了抗体与抗原结合空间位阻的问题，实现了提高试剂反应灵敏度的有益效果。

2.本发明用于酶解的蛋白酶为木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶是一种含巯基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力。蛋白酶对所作用的反应底物有严格的选择性，一种蛋白酶仅能作用于蛋白质分子中一定的肽键。

3.通过添加胆固醇的技术特征，解决了脂质体微球韧性不够而易变性沉淀的问题，实现了提高脂质体微球制备成功率，实现了提高试剂反应稳定性的有益效果。

4.通过添加亚硫酸钠的技术特征，解决了脂质体表面电荷不够而易积聚的问题，实现了提高试剂稳定性的有益效果。

5.通过R1中添加了阻断剂，解决了抗原非特异性结合的问题，实现了降低试剂假阳性率的有益效果。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为验证例1中检测试剂的相关性检验结果；

图2为验证例4中实施例1的线性图；

图3为验证例4中对比例4的线性图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。

抗穆勒氏管激素抗体：来源于日本特殊免疫研究所株式会社。

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述：

实施例1

1.抗体酶切

将抗穆勒氏管激素抗体经过蛋白酶酶切处理，具体步骤如下：

称取10mg兔抗人抗穆勒氏管激素抗体和0.5mg木瓜蛋白酶粉，加入40uL半胱氨酸溶液(0.5mol/L)和20uL EDTA溶液(0.1mol/L，pH 7.0)，加入1ml pH7.8的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，置于37℃、250r·min恒温金属浴中酶解2h；酶解结束后加入100uL碘乙酰胺溶液(0.2mol/L)冰浴半小时以终止反应，获得酶切后的兔抗人抗穆勒氏管激素抗体。

2.制备纳米脂质体颗粒

具体步骤如下：

称取0.4g卵磷脂和0.1g胆固醇，溶于10ml无水乙醇，水浴超声处理5min后形成稳定的淡黄色均匀的悬浮液放入酸式滴定管中。用量筒取40mLPBS缓冲液(pH6.8)于100mL烧杯中置于40℃水浴，再加入5mL浓度为2.5mol/L的亚硫酸钠溶液，搅拌的同时以每秒1滴的速率将滴定管的膜材注入恒温于40℃的PBS缓冲液中，注入过程持续20min左右。将制备的脂质体悬液装入茄形瓶中水浴超声处理，每进行5s超声暂停5s，超声时间总计30min后得到白色半透明脂质体悬浮液预备液，用微孔滤膜除去大颗粒杂质后，获得脂质体颗粒悬浮液，置于2-8℃保存。

3、交联抗穆勒氏管激素抗体的致敏颗粒的制备方法，步骤如下：

①取上述脂质体颗粒悬浮液离心，去除上清液后，用甘氨酸缓冲液(0.1mol/L，pH5.2)复悬，超声分散，得复悬液；

②将复悬液中加入NHS溶液混匀，再加入EDC溶液混匀后，室温搅拌，然后离心；

③将经步骤②离心后的沉淀用甘氨酸缓冲液(0.1mol/L，pH5.2)溶解悬浮，超声，然后加入上述酶切后的兔抗人抗穆勒氏管激素抗体，室温搅拌后离心；

④将经步骤③离心后的沉淀用甘氨酸缓冲液(0.1mol/L，pH5.2)溶解悬浮，超声，然后离心；

⑤将经步骤④离心后的沉淀用甘氨酸缓冲液(0.1mol/L，pH5.2)溶解悬浮，超声，然后离心；

⑥将经步骤⑤离心后的沉淀悬浮于封闭液中，超声，即得交联抗穆勒氏管激素抗体的致敏颗粒；

其中，步骤③中，所述抗穆勒氏管激素多克隆抗体的加入量与脂质体颗粒的比为12mg/10ml。

4、本实施例试剂盒配方及含量如下：

R1：配制表1：

R2：配制表2：

校准品配制表3：

表1-3中，所述百分比均为质量百分比。

上述各种成分可以室温下依次添加，或者同时添加，或者是分别单独包装并于检测之前再即时配制，R1、R2、及标准品的体积比为15μl：135μl：45μl。

实施例2

本实施例提供一种试剂盒，与实施例1的区别仅在于：R1、R2、及标准品的用量比20μl：135μl：45μl。

对比例1

本对比例提供一种AMH试剂盒，与实施例1不同之处仅在于：步骤③中加入的是未经过蛋白酶切处理的兔抗人AMH多克隆抗体。

对比例2

本对比例提供一种AMH试剂盒，与实施例1不同之处仅在于，抗体酶切步骤中，蛋白酶替换为胰蛋白酶。

对比例3

本对比例提供一种AMH试剂盒，与实施例1不同之处仅在于，抗体酶切步骤中，蛋白酶替换为胃蛋白酶。

对比例4

本对比例提供一种AMH试剂盒，与实施例1不同之处仅在于，R2配制表表2中交联抗穆勒氏管激素抗体的致敏颗粒溶液替换为胶乳微球包被抗体的致敏颗粒，所述胶乳微球包被抗体的致敏颗粒的制备方法包括如下步骤：

1.抗体酶切步骤同实施例1。

2.致敏乳胶微球的制备，其过程如下：

①、取买自美国Bangslab的乳胶微球离心，去上清液后，用甘氨酸缓冲液(0.1mol/L，pH5.2)复悬，超声分散，得复悬液；

②、将复悬液中加入NHS溶液混匀，再加入EDC溶液混匀后，室温搅拌，然后离心；

③、将经步骤②离心后的沉淀用甘氨酸缓冲液(0.1mol/L，pH5.2)溶解悬浮，超声，然后加入兔抗人抗穆勒氏管激素多克隆抗体，室温搅拌后离心；

④、将经步骤③离心后的沉淀用甘氨酸缓冲液(0.1mol/L，pH5.2)溶解悬浮，超声，然后离心；

⑤、将经步骤④离心后的沉淀用甘氨酸缓冲液(0.1mol/L，pH5.2)溶解悬浮，超声，然后离心；

⑥、将经步骤⑤离心后的沉淀悬浮于封闭液中，超声，即得所述乳胶微球致敏颗粒。优选地，步骤③中，所述抗穆勒氏管激素多克隆抗体的加入量与乳胶微球的比为12mg/10ml。

对比例5

本对比例提供一种AMH试剂盒，与实施例1不同之处仅在于：R1试剂中，未加入阻断剂兔IgG。

对比例6

本对比例提供一种AMH试剂盒，与实施例1不同之处仅在于：R1试剂中，阻断剂为羊IgG(兔IgG)。

对比例7：

将罗氏诊断公司Roche Diagnostics GmbH购买的AMH检测试剂盒(电化学发光法)作为对比试剂盒与本专利实施案例进行性能比对。

效果验证

验证例1：检测试剂盒的相关性比较

使用本发明试剂盒(实施例1)和罗氏诊断公司Roche Diagnostics GmbH的AMH试剂盒(对比例7)，按各自参数同时进行测定对50份人血清(包括正常和异常标本)进行检测，同时对测定值进行相关性分析。

由图1的结果看出，两种试剂盒的相关系为R²＝0.999，回归方程为y＝1.0106x-0.0856。结果表明本试剂盒与进口试剂盒测定人血清相关性良好，具有很好的特异性和准确性。结果准确度达到99.1％。

验证例2：试剂盒检测灵敏度比较

本实验目的是检测试剂盒在测试临床样本时的最小检出感度。

采用实施例1的试剂盒、对比例1、对比例2、对比例3的试剂盒、标准品、空白溶液(一般是生理食盐水和精制水)、正常人血清样本。

机器：日立7170自动生化分析仪。

操作步骤：使用生理食盐水或是去离子水溶解样本，然后50％稀释成5个点，和零点一起每一个样本测试5次，计算平均值，求得SD数值。

结果解析：如表3所示，根据检测数据，计算SD数值和CV数值，分别计算1SD，2SD，从最小的开始，其平均值－2SD的数值在零点平均值+2SD以上的就是试剂盒的最小检出感度。

表1.试剂盒灵敏度比较(单位：ng/mL)

实验结果表明，对比例3定标不成功，是因为蛋白全部被酶切了；本发明提供的AMH试剂盒(实施例1)灵敏度可以到达0.6ng/mL，而对比例1和对比例2提供的只能达到5ng/mL，说明本发明试剂盒采用木瓜蛋白酶切处理可以提高试剂盒灵敏度。

验证例3：试剂盒检测精密度比较

采用本发明提供的AMH试剂盒检测低值样本和高值样本个10次，计算Mean、SD、CV。对该试剂盒的精密度进行评估，结果如表2所示。

表2.实施例1和对比例4精密度测试结果

本实验结果表明实施例1提供的试剂盒较对比例4于精密度表现更优。

验证实验例4：试剂盒检测线性范围比较

本实验目的是检测本发明提供的试剂盒的线性范围。

取浓度约为24.00ng/mL的高值样本，用0.9％NaCl作为稀释液。按0.025、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8的比例稀释成6个点，加上高值样本，共7个样本按标准实验操作步骤各测定3次，分别求测定均值(yi)。以7个样本的稀释浓度(xi)为自变量，以测定均值(yi)为因变量求出线性回归方程及相关系数(r)，样本数量(n)。按公式(1)计算相关系数(r)，所得结果应符合相关规定。

用上述方法中稀释浓度xi代入线性回归方程，计算yi的估算值及yi与yi估算值的相对偏差或绝对偏差，应符合相关的规定。

实验结果：

实施例1的线性结果如表4和图2所示。

表4.实施例1的线性范围(单位：ng/mL)

对比例4的线性结果如表5和图3所示。

表5对比例4线性范围(单位：ng/mL)

本实验结果表明，实施例1的AMH试剂盒较对比例4试剂盒线性范围更广。

验证实验例5：试剂盒检稳定性比较

本实验目的是检测本发明提供的试剂盒37℃稳定性。

将实施例1和对比例4提供的试剂盒放置37℃的烘箱3天，三天后取出在日立7170自动生化分析仪上测量质控。

实验结果：

表6在37℃下L质控结果(单位：ng/mL)

表7在37℃下H质控结果(单位：ng/mL)

从验证实验例3、4、5结果，可以看出采用脂质体微球相对于传统的纳米微球胶乳在试剂盒线性、精密度、稳定性等方面性能显著提高。

验证实验例6：试剂盒特异性评估比较

验证本发明提供的AMH检测试剂盒(实施例1)和对比例5、6分析特异性实验效应。

收集50个AMH阴性样本用实施例1、对比例5、对比例6、对比例7提供的AMH试剂盒进行检测，比较阳性率的结果

实验结果如表7所示：

表7特异性评估结果(单位：ng/mL)

实验结果表明R1加入了阻断剂兔IgG的试剂盒(实施例1)在检测正常样本出现假阳性的情况为0，而未加入阻断剂的试剂盒(对比例5)在检测中假阳性的概率达到了12％，而加入阻断剂羊IgG的试剂盒(对比例6)在检测中假阳性的概率达到了20％说明本发明提供的AMH试剂在特异性方面性能优良。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (10)

1.一种测定血清中抗穆勒氏管激素含量的检测试剂盒，其特征在于，包括试剂R1、试剂R2和校准品；

所述试剂R1为磷酸盐缓冲体系；

所述试剂R2包括交联抗穆勒氏管激素抗体的致敏颗粒溶液；

所述标准品包括抗穆勒氏管激素、缓冲液、保护剂、防腐剂。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1包括的组分及含量如下：

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R2包括的组分及含量如下：

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述标准品包括的组分及含量如下：

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，按体积比，所述试剂R1、R1及标准品的体积比为15-20：120-135：30-45。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述交联抗穆勒氏管激素抗体的致敏颗粒是通过将抗穆勒氏管激素抗体经过化学交联的方法固定到纳米脂质体颗粒表面制备获得。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述抗穆勒氏管激素抗体通过木瓜蛋白酶酶切。

8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述纳米脂质体颗粒的制备方法包括如下步骤：

S1、将卵磷脂和胆固醇溶于无水乙醇，超声处理，形成稳定的膜材悬浮液；

S2、PBS缓冲液置于容器中水浴，加入亚硫酸钠溶液，搅拌的同时将步骤S1的膜材悬浮液注入容器中，制备成脂质体悬液；

S3、将脂质体悬液进行水浴超声处理，得到白色半透明脂质体悬浮预备液，过滤后，获得所述纳米脂质体颗粒。

9.根据权利要求6、7或8所述的试剂盒，其特征在于，所述交联抗穆勒氏管激素抗体的致敏颗粒的制备方法包括如下步骤：

A、取纳米脂质体颗粒离心，去上清液后，用缓冲液复悬，超声分散，得复悬液；

B、复悬液中加入NHS溶液混匀，再加入EDC溶液混匀后搅拌，然后离心，离心后的沉淀用缓冲液溶解悬浮，超声，然后加入抗穆勒氏管激素多克隆抗体，搅拌后离心；离心后的沉淀悬浮于封闭液中，超声，即得所述交联抗穆勒氏管激素抗体的致敏颗粒。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述抗穆勒氏管激素多克隆抗体的加入量与纳米脂质体颗粒的用量比为5-20mg：10ml。

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