CN114487437A - 一种胶乳免疫比浊法测定白介素23的试剂盒 - Google Patents

一种胶乳免疫比浊法测定白介素23的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种胶乳免疫比浊法测定白介素23的试剂盒包含试剂R1、试剂R2和白介素23校准品，该试剂盒说明简单、易操作，能够直接采用全自动生化分析仪进行样本检测，能满足临床实验室高通量快速检测样本的需求，同时可减少人为误差使检验效率明显提高；试剂盒采用胶乳免疫比浊法，使得试剂稳定性有进一步提高，通常在2‑8℃环境下可稳定存放一年及以上，因此在临床上有较大的应用空间，可广泛推广应用大多数临床实验室。

Description

一种胶乳免疫比浊法测定白介素23的试剂盒
技术领域
本发明属于体外诊断试剂技术领域，尤其涉及一种胶乳免疫比浊法测定白介素23的试剂盒。
背景技术
白介素23(IL-23)是Oppmann等人于2000年发现的白介素12(IL-12)细胞因子家族的一个新成员。它与IL-12一样,都是含有亚单位p40和IL-12R1受体的异源二聚体细胞因子,它们的功能部分重叠而又有所不同。IL-23是一个由亚单位p19和p40通过二硫键形成的异源二聚体分子,结构为p19/p40,任何一个单独的亚单位都不具有生物学活性,只有2个亚单位结合在一起时,才能发挥它的生物功能。作为IL-12家族的新成员,IL-23主要作为一种促炎症细胞因子而发挥作用,它作用于记忆性T细胞,具有影响免疫反应的作用,还具有潜在的抗肿瘤、抗感染作用。过去认为IL-12是某些疾病的作用因子,而现在则认为IL-23才是真正的作用因子。
IL-23主要通过与其受体相互作用，激活下游信号通路发挥生物学功能。
IL-23主要作用于Th17细胞，在Th17细胞的增殖与稳定中发挥重要作用，并能促进Th17细胞产生IL-23、IL-17F及IL-22等细胞因子，这些炎症因子作用于角质形成细胞，导致角质形成细胞活化和过度增殖。活化的角质形成细胞又通过产生大量细胞因子、趋化因子和抗菌肽等，募集并激活T细胞等免疫细胞，形成免疫应答的级联效应，引起银屑病损害的发生。IL-23在关节自身免疫炎症中，也是一个促进因子，如在风湿性关节炎中，IL-23促进IL—17的分泌，从而导致了关节的破坏。因此血液中IL-23的检测及其水平变化就显得尤为重要，
现有的白介素23的检测试剂盒较少，而且价格昂贵，传统的酶联免疫检测白介素23的(ELISA)方法，该方法虽较为传统，应用较为普遍，但测定过程操作繁琐、操作时间长、自动化程度低、重复性和批间差相对较大，不能适应大体量样本的筛查，且该方法应用时需配备多种专用设备，在一定程度上也增加使用成本。
为了解决现有技术中存在的以上问题，我们提出一种胶乳免疫比浊法测定白介素23的试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于提供一种胶乳免疫比浊法测定白介素23的试剂盒。，其操作简便快捷、检测稳定性和重复性好、可应用于全自动生化仪，实现自动化操作和自动化分析、且使用成本相对降低，从而弥补上述背景技术中的不足。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种胶乳免疫比浊法测定白介素23的试剂盒包含试剂R1、试剂R2和白介素23校准品，其中，
所述试剂R1包括：缓冲液10～500mmol/L、稳定剂10.1～10g/L、稳定剂20.1～10g/L、无机盐1～50g/L、表面活性剂0.5～50g/L、促凝剂1～100g/L、抗氧化剂0.01～10g/L、防腐剂0.5～10g/L，pH值为6.0～9.0；
所述试剂R2包括：缓冲液10～500mmol/L、抗人白介素23抗体包被胶乳颗粒5～500mg/L、表面活性剂0.5～50g/L、稳定剂10.1～10g/L、稳定剂20.1～10g/L、无机盐1～50g/L、抗氧化剂0.01～10g/L、防腐剂0.5～10g/L，pH值为6.0～9.0；
所述白介素23校准品包括：缓冲液10～500mmol/L、抗人白介素23抗原100-500ng/mL、稳定剂0.1～10g/L、抗氧化剂0.01～10g/L、防腐剂0.5～10g/L，pH值为6.0～9.0。
优选的，所述缓冲液选自三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCL)缓冲液、3-吗啉丙磺酸(MOPS)缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液、哌嗪-1,4-二乙磺酸(PIPES)缓冲液、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液、3-(环己氨基)2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO)缓冲液、甘氨酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、巴比妥钠缓冲液、硼酸缓冲液、磷酸盐缓冲液中的一种或几种。
优选的，所述稳定剂1和稳定剂2选自乙二胺四乙酸二钠、牛血清白蛋白、山梨醇、葡萄糖、海藻糖中的一种或几种；
所述无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸镁中的一种或几种。
优选的，所述表面活性剂选自Tween系列、Triton系列、月桂醇聚氧乙烯醚(Brij-35)、脂肪醇聚氧乙烯醚(AEO)、槐糖脂中的一种或几种；
优选的，所述促凝剂选自聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、聚乙二醇20000中的一种或几种；
优选的，所述防腐剂选自叠氮钠、proclin300、硫柳汞钠、苯酚、尼泊金乙酯中的一种或几种；
优选的，所述抗人白介素23抗体选自羊抗人、鼠抗人、兔抗人抗体中的一种。
优选的，所述抗氧化剂选自L-抗坏血酸、硫代二丙酸二月桂酯(DLTP)、2，6二叔丁基对甲酚(BHT)、丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)、特丁基对苯二酚(TBHQ)中的一种或几种。
优选的，所述试剂盒包括以下组分，
所述试剂R1：pH值为7～8
Figure BDA0003483679630000031
Figure BDA0003483679630000041
所述试剂R2：pH值为6～8
Figure BDA0003483679630000042
所述白介素23校准品：pH值为7.5
Figure BDA0003483679630000043
优选的，所述抗人白介素23抗体包被胶乳颗粒的制备方法为：取1ml～2ml表面羧基化、直径200nm的聚苯乙烯胶乳溶液加入到10ml的MES缓冲液中，使胶乳颗粒终浓度为1.0％；然后加入0.1～1mg抗人白介素23抗体抗体以及活化剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)，在37℃孵育2-4小时，通过活化的羧基与胶乳颗粒溶液进行化学交联，形成共价抗体胶乳复合物；然后，加入适量的0.1％的BSA溶液在37℃条件下封闭0.5～2小时，封闭胶乳颗粒表面未结合抗体的表面活性基团，再以12000rpm离心30～50分钟，去除上清，所得沉淀加入含0.1％BSA的50mmol/L的Tris-HCl缓冲液洗涤、分散即得抗人白介素23抗体包被胶乳颗粒。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：与现有的检测技术相比较，本发明提供的抗人白介素23抗体检测试剂盒说明简单、易操作，能够直接采用全自动生化分析仪进行样本检测，能满足临床实验室高通量快速检测样本的需求，同时可减少人为误差使检验效率明显提高；试剂盒采用胶乳免疫比浊法，使得试剂稳定性有进一步提高，通常在2-8℃环境下可稳定存放一年及以上，因此在临床上有较大的应用空间，可广泛推广应用大多数临床实验室。
具体实施方式
除有明确定义外，以下实施例中所用的技术术语与本发明所属领域技术人员普遍理解的含义相同。以下实施例中所用的实验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例来详细说明本发明。
1、具体实施例
实施例1：
试剂R1：pH值为7.4
Figure BDA0003483679630000051
试剂R2：pH为7.5
Figure BDA0003483679630000052
Figure BDA0003483679630000061
实施例2：
试剂R1：pH值为7.5
Figure BDA0003483679630000062
试剂R2：pH为7.5
Figure BDA0003483679630000063
实施例3：
试剂R1：pH为7.5
Figure BDA0003483679630000071
试剂R2：pH为7.5
Figure BDA0003483679630000072
实施例1-3的校准品均选用以下组分配方：校准品：PH7.5
Figure BDA0003483679630000073
Figure BDA0003483679630000081
将抗人白介素23抗原添加到上述校准品溶液中，制备得到抗人白介素23高浓度校准品，再用生理盐水稀释到不同浓度点。
实施例1-3均配制5个不同浓度的校准品，分别为：0ng/mL、6.25ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL。
实际交付时可以带一个高值校准品，客户按说明自己倍比稀释；也可以配制多个不同浓度的校准品直接放在试剂盒里，用校准品这6个点做校准曲线，实例中测值是仪器测试样品在校准曲线上计算得出。
上述实施例1-3所提到的抗人白介素23抗体包被胶乳颗粒的制备方法为：取适量的表面羧基化、直径200nm的聚苯乙烯胶乳溶液加入到10ml的MES缓冲液中，使胶乳颗粒终浓度为1.0％；然后加入适量抗人白介素23抗体抗体以及活化剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)，在37℃孵育3小时左右，通过活化的羧基与胶乳颗粒溶液进行化学交联，形成共价抗体胶乳复合物。然后，加入适量的0.1％的BSA溶液在37℃条件下封闭1小时，封闭胶乳颗粒表面未结合抗体的表面活性基团，再以12000rpm离心40分钟，去除上清，所得沉淀加入含0.1％BSA的50mmol/L Tris-HCl缓冲液洗涤、分散即得抗人白介素23抗体包被胶乳颗粒。
2、检测方法
以上实施例所述试剂盒，在使用时，其测定方法均是采用佳能TBA-120FR全自动生化分析仪，利用终点法进行测定，检测主波长为450nm，操作程序如表1：
表1试剂盒检测方法
Figure BDA0003483679630000082
Figure BDA0003483679630000091
3、结果计算
抗人白介素23含量(ng/mL)＝(ΔA样本/ΔA校准品)×校准品浓度。
4、性能验证
4.1重复性和准确度：
以各实例的校准品和标示值为15ng/ml的人血清作为样本，对各实例中的试剂盒进行重复性考察，按要求测定方法分别重复测定10次，分别计算测定平均值X、标准偏差SD及变异系数CV，以对各实例中的试剂盒进行重复性进行考察，测定结果见表2。
表2试剂盒重复性测定结果
Figure BDA0003483679630000092
Figure BDA0003483679630000101
根据表2结果可以看出，实例1、实例2、实例3的CV均＜5％。
以各实施例的校准品和试剂盒与对照试剂盒(市售某厂家的酶联免疫法抗人白介素23检测试剂盒，简称“ELISA试剂盒”)同时测试检测40个正常人血清样本，统计检测结果，计算两者的相关系数，并进行线性回归，对检测结果进行相关性分析，以对各实例中的试剂盒进行准确度考察，测定结果见表3。
表3试剂盒准确度测定结果
Figure BDA0003483679630000102
Figure BDA0003483679630000111
Figure BDA0003483679630000121
根据表3结果可以看出，实例1、实例2、实例3的相关系数均小于0.975，说明本发明各实例的试剂盒具有较高的准确性。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种胶乳免疫比浊法测定白介素23的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含试剂R1、试剂R2和白介素23校准品，其中，
所述试剂R1包括：缓冲液10～500mmol/L、稳定剂10.1～10g/L、稳定剂20.1～10g/L、无机盐1～50g/L、表面活性剂0.5～50g/L、促凝剂1～100g/L、抗氧化剂0.01～10g/L、防腐剂0.5～10g/L，pH值为6.0～9.0；
所述试剂R2包括：缓冲液10～500mmol/L、抗人白介素23抗体包被胶乳颗粒5～500mg/L、表面活性剂0.5～50g/L、稳定剂10.1～10g/L、稳定剂20.1～10g/L、无机盐1～50g/L、抗氧化剂0.01～10g/L、防腐剂0.5～10g/L，pH值为6.0～9.0；
所述白介素23校准品包括：缓冲液10～500mmol/L、抗人白介素23抗原100-500ng/mL、稳定剂0.1～10g/L、抗氧化剂0.01～10g/L、防腐剂0.5～10g/L，pH值为6.0～9.0。
2.根据权利要求1所述的胶乳免疫比浊法测定白介素23的试剂盒，其特征在于：所述缓冲液选自三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、哌嗪-1,4-二乙磺酸缓冲液、2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液、3-(环己氨基)2-羟基-1-丙磺酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、巴比妥钠缓冲液、硼酸缓冲液、磷酸盐缓冲液中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的胶乳免疫比浊法测定白介素23的试剂盒，其特征在于：所述稳定剂1和稳定剂2选自乙二胺四乙酸二钠、牛血清白蛋白、山梨醇、葡萄糖、海藻糖中的一种或几种。
所述无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸镁中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的胶乳免疫比浊法测定白介素23的试剂盒，其特征在于：所述表面活性剂选自Tween系列、Triton系列、月桂醇聚氧乙烯醚、脂肪醇聚氧乙烯醚、槐糖脂中的一种或几种。
5.根据权利要求1所述的胶乳免疫比浊法测定白介素23的试剂盒，其特征在于：所述促凝剂选自聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、聚乙二醇20000中的一种或几种。
6.根据权利要求1所述的胶乳免疫比浊法测定白介素23的试剂盒，其特征在于：所述防腐剂选自叠氮钠、proclin300、硫柳汞钠、苯酚、尼泊金乙酯中的一种或几种。
7.根据权利要求1所述的胶乳免疫比浊法测定白介素23的试剂盒，其特征在于：所述抗人白介素23抗体选自羊抗人、鼠抗人、兔抗人抗体中的一种。
8.根据权利要求1所述的胶乳免疫比浊法测定白介素23的试剂盒，其特征在于：所述抗氧化剂选自L-抗坏血酸、硫代二丙酸二月桂酯、2，6二叔丁基对甲酚、丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、特丁基对苯二酚中的一种或几种。
9.根据权利要求1所述的胶乳免疫比浊法测定白介素23的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括以下组分，
所述试剂R1：pH值为7～8
Figure FDA0003483679620000021
所述试剂R2：pH值为6～8
Figure FDA0003483679620000031
所述白介素23校准品：pH值为7.5
Figure FDA0003483679620000032
10.根据权利要求1所述的胶乳免疫比浊法测定白介素23的试剂盒，其特征在于：所述抗人白介素23抗体包被胶乳颗粒的制备方法为：取1ml～2ml表面羧基化、直径200nm的聚苯乙烯胶乳溶液加入到10ml的MES缓冲液中，使胶乳颗粒终浓度为1.0％；然后加入0.1～1mg抗人白介素23抗体抗体以及活化剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺，在37℃孵育2-4小时，通过活化的羧基与胶乳颗粒溶液进行化学交联，形成共价抗体胶乳复合物；然后，加入适量的0.1％的BSA溶液在37℃条件下封闭0.5～2小时，封闭胶乳颗粒表面未结合抗体的表面活性基团，再以12000rpm离心30～50分钟，去除上清，所得沉淀加入含0.1％BSA的50mmol/L的Tris-HCl缓冲液洗涤、分散即得抗人白介素23抗体包被胶乳颗粒。
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