CN114480662A - 一种对未知检材进行组织来源推断的方法和系统 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种对未知检材进行组织来源推断的方法和系统，该方法包括提取未知检材DNA，对所述DNA进行甲基化转化，对经甲基化转化的DNA的3个位点进行扩增，所述3个位点为cg25373595，cg18121066和cg17283169，对所述3个位点的扩增产物进行焦磷酸化测序以获得测序结果，根据所述测序结果推断所述未知检材的组织来源。本发明方案能实现对未知检材的组织来源推断。
Description
技术领域
本发明涉及一种组织来源推断的方法和系统，尤其涉及一种对未知检材进行组织来源推断的方法和系统。
背景技术
近年来，随着我国依法治国体系的不断完善和法制进程的不断进步，犯罪现场的体液斑迹鉴定，尤其是其组织来源的鉴定，不仅是案件侦破的关键，也成为法庭诉讼的关键。“以审判为中心”的刑事诉讼制度改革在提高了物证在证据中地位的同时，也为法庭科学从业人员提出了更高的要求。
对犯罪现场中提取到的体液斑迹进行组织来源鉴定，有助于建立作案人与犯罪行为之间的联系，可以为案件定性、后续侦查、犯罪现场重建等提供重要线索，提升生物物证的证据价值。犯罪现场某些体液的存在与特定案件类型有一定关联。例如，搏斗、攻击或谋杀现场往往存在大量血迹，精液或阴道液体提示案件可能与性侵有关。在法庭诉讼层面，体液斑迹的确定可以避免控辩双方对于体液斑迹来源的质疑，完善生物物证相关的证据链条，提升法医DNA鉴定结果作为证据的可信度和法律效力，为案件诉讼审判和维护司法公正提供强有力的科学支撑。血液、精液和唾液是犯罪现场最为常见的体液斑迹，目前针对血液和精液常规检验方法是金标试纸条，分别针对血液中的血红蛋白和精液中的PSA蛋白检验。此外，还可在显微镜中观察检材中是否有精子来进行精斑的检验鉴定。上述方法具有简便、快速的优点，但也有一定的局限性，如腐败降解的检材检测灵敏度低，容易出现假阴性、假阳性等不足。随着科学技术以及分子生物技术的发展，包括光谱法和基于mRNA、microRNA或DNA甲基化差异的分子生物学方法已经应用到组织来源鉴定中。这些方法以其各自具有的优势，适用于不同情况、不同条件的体液斑迹检测，越来越为人们所关注。有诸多研究表明，利用mRNA进行体液类型的推断是比较可靠的。一般来说mRNA不如DNA稳定，对于一份样本来说，常规STR的检测对象是DNA，若利用DNA在检出STR分型的基础上，再通过DNA甲基化信息确定体液的类型，则既可以满足陈旧降解检材的检验要求，又解决了技术平台兼容性的问题。由此可见，DNA甲基化进行体液斑迹鉴定相对于mRNA的方法具有更强的技术优势。
DNA甲基化是表观遗传学的一种形式，在人体中，80％以上的甲基化发生在胞嘧啶的5’碳原子上，它调控着基因的表达和关闭，影响着生物的生长发育，还有研究证明DNA甲基化也和一些疾病相关，比如肿瘤。DNA甲基化可在体内受到环境，年龄，疾病等因素的影响，在体外稳定不易发生改变。不同组织中存在甲基化差异位点，Watanabe,K.等人利用实时PCR和荧光探针定量分析甲基化状态的技术，检测了先前报道的DACT1基因，分析了储存长达29年的精液和血迹，表明在体液鉴定中，DNA甲基化状态的稳定性及适用性。目前国内尚无成熟的面向法庭科学应用的DNA甲基化体液鉴定方法。
如何提供一种基于DNA甲基化位点的方法和系统，实现对体液斑迹，例如唾液斑、精液和静脉血区分，从而实现对未知检材进行组织来源推断成为有待解决的问题。
发明内容
本发明提供了一种对未知检材进行组织来源推断的方法，通过获得未知检材的经甲基化转化的DNA的3个位点的测序结果，实现对未知检材的组织来源推断。
本发明还提供一种对未知检材进行组织来源推断的系统，通过该系统实现对未知检材进行组织来源推断。
本发明还提供了一种扩增体系，所述扩增体系能实现对未知检材(即未知组织来源斑迹)的经甲基化转化的DNA的3个位点的扩增。
本发明还提供了一种检测试剂盒，包括所述的扩增体系。
本发明提供的一种对未知检材进行组织来源推断的方法，该方法包括：
1)提取未知检材的DNA；
2)对所述DNA进行甲基化转化；
3)对经甲基化转化的DNA的3个位点进行扩增，所述3个位点为cg25373595，cg18121066和cg17283169；
4)对步骤3)的扩增产物进行焦磷酸化测序以获得测序结果；以及
5)根据所述测序结果推断所述未知检材的组织来源。
在本发明的方案中，所述3个位点是申请人通过对中国人群的生活环境、种族起源及人体不同组织的基因表达差异等进行综合分析，考察中国人群不同组织来源体液的特征差异，针对这些差异进行文献和网络数据库调研，在已有研究的基础上获得的能进行组织来源推断的组织特异性位点组合。
在本发明的一个具体实施方式中，所述2)包括亚硫酸化所述DNA以对所述DNA进行甲基化转化。
在本发明的另一个具体实施方式中，其中3)包括采用与所述3个位点一一对应的3对扩增引物对其进行扩增以获得扩增产物的步骤；所述扩增引物为序列表中SEQ ID No.1至SEQ ID No.6的核苷酸序列。
本发明提供的一种对未知检材进行组织来源推断的系统，所述系统包括DNA提取体系，甲基化转化体系，扩增体系，测序体系和推断体系；所述DNA提取体系用于提取所述未知检材的DNA；所述甲基化转化体系用于对所述DNA进行甲基化转化，所述扩增体系用于对经甲基化转化的DNA的3个位点进行扩增，所述3个位点为cg25373595，cg18121066和cg17283169；所述测序体系用于对扩增产物进行焦磷酸化测序以获得测序结果；以及所述推断体系用于根据所述测序结果推断所述未知检材的组织来源。
在本发明的一个具体实施方式中，所述甲基化转化体系用于亚硫酸化所述DNA以对所述DNA进行甲基化转化。
更进一步的，所述扩增体系用于采用与所述3个位点一一对应的3对扩增引物对其进行扩增以获得扩增产物；所述扩增引物为序列表中SEQ ID No.1至SEQ ID No.6的核苷酸序列。
在本发明的一个实施例中，焦磷酸化测序的测序引物为SEQ ID No.7至SEQ IDNo.9的核苷酸序列。
本发明提供的一种扩增体系，所述体系包括未知检材的经甲基化转化的DNA，以及用于扩增所述经甲基化转化的DNA的3个位点的扩增引物，所述3个位点为cg25373595，cg18121066和cg17283169；所述扩增引物由与所述3个位点一一对应的3对扩增引物组成，所述扩增引物为序列表中SEQ ID No.1至SEQ ID No.6的核苷酸序列。
本发明还提供了一种检测试剂盒，包括所述的扩增体系。
在本发明的方案中，所述3个位点信息如表1所示：
表1
本发明提供的优选扩增引物序列如下。所述3对扩增引物及其相对应的基因座如下表2所示；
表2
本发明方案具有以下的优点：
1、本发明提供的方案能有效从基因水平实现对未知检材斑迹组织来源推断等提供准确的科学依据。
2、本发明的方法和系统适用于广泛的中国汉族人群，可以进一步完善法庭科学DNA检验鉴定的证据价值。
附图说明
图1是参考组样本的焦磷酸化测序结果的聚类图；
图2是测试组样本的焦磷酸化测序结果的聚类图；
图3是参考组样本与测试组样本的焦磷酸化测序结果混合后进行聚类获得的聚类图。
具体实施方式
采集来自无关个体志愿者的唾液斑、精液、静脉血三类生物样本，所有样本均在通过中心伦理审查委员会审查后收集。唾液斑(Saliva，SA)样本用棉签擦拭口腔颊获得口腔拭子，储存在-20℃；精液(Semen stains，SS)储存在-80℃；静脉血(Venous blood，VB)样本存放在含有EDTA抗凝剂的采血管中，储存在-80℃。其中，已知斑迹组织来源的唾液斑样本11例，精液样本10例，静脉血10例用作参考样本；未知斑迹组织来源的唾液斑样本8例，静脉血8例，精液样本8例用作测试组样本；参考组样本与测试组样本均使用本申请的方法和系统获得3个位点cg25373595，cg18121066和cg17283169的测序结果。
实施例1、对本发明的对未知检材(即未知组织来源斑迹)进行组织来源推断的方法和系统准确性的验证
在本实施例中，以测试组样本为例详细说明本申请的方法和系统。
其中，所述未知组织来源斑迹为唾液斑样本8例，即静脉血8例，精液样本8例，已知其组织来源，但在本申请实施例1中设定其组织来源未知，采用本申请方法和系统对其进行组织来源推断，包括：
1)利用本发明的系统中的DNA提取体系提取未知检材的DNA，
2)利用所述甲基化转化体系对所述DNA进行甲基化转化，
3)利用所述扩增体系对经甲基化转化的DNA的3个位点进行扩增，所述3个位点为cg25373595，cg18121066和cg17283169；
4)利用所述测序体系对扩增产物进行焦磷酸化测序以获得测序结果；以及
5)利用所述推断体系根据所述测序结果推断所述未知检材的组织来源。
本实施例中，所述扩增体系包括未知检材的经甲基化转化的DNA，以及用于扩增所述经甲基化转化的DNA的3个位点的扩增引物，所述3个位点为cg25373595，cg18121066和cg17283169；所述扩增引物由与所述3个位点一一对应的3对扩增引物组成，所述扩增引物为序列表中SEQ ID No.1至SEQ ID No.6的核苷酸序列。
具体的，本发明的方法包括以下步骤：
1)使用MagAttract M48 DNA Manual Kit(Qiagen,德国)对唾液斑(口腔拭子)、精液、静脉血提取DNA，提取精液时加入DTT。使用MagNA Pure96(Roche，美国)自动提取仪提取静脉血DNA。
2)对所述DNA进行甲基化转化
使用NanoDrop 2000c(Thermo，美国)对DNA进行定量。DNA转化用量为500ng，使用EpiTect Fast Bisulfite Conversion Kits(Qiagen,德国)试剂盒进行DNA甲基化转化实验。最终使用28ul Nuclease-Free Water洗脱转化后DNA，使用NanoDrop 2000对产物进行定量。
3)对经甲基化转化的DNA的3个位点(cg25373595，cg18121066和cg17283169)进行单独扩增
将对经甲基化转化的DNA作为模板；使用所述扩增引物(SEQ ID No.1至SEQ IDNo.6的核苷酸序列)对经甲基化转化的DNA进行cg25373595，cg18121066和cg17283169的单独PCR扩增反应(将经甲基化转化的DNA分为3份，单独扩增每个位点)，以获得扩增产物。
PCR扩增反应体系如下：
本发明提供的各种引物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。利用PyroMark PCR Kit(Qiagen,德国)试剂盒对甲基化转化后的DNA进行扩增，向各含甲基化转化后的DNA的反应管内加入反应试剂，如下表5所示。
表5
| 试剂名称 | 体积 |
| Master Mix 2× | 12.5μL |
| CoralLoad Concentrate 10× | 2.5μL |
| Primer A | 0.5μL |
| Primer B | 0.5μL |
| RNase-free water | 8.0μL |
| 甲基化转化后DNA | 1.0μL |
| 总计 | 25.0μL |
PCR扩增过程的热循环参数为：95℃15min；95℃30s，56℃30s，72℃60s，共45个循环；72℃延伸10min。
4)对3)的扩增产物进行焦磷酸化测序
使用磷酸分析仪及PyroMark Q48 Advanced Reagents(Qiagen,德国)试剂盒对扩增产物进行测序，焦磷酸化测序的测序引物为SEQ ID No.7至SEQ ID No.9的核苷酸序列。测序时加入3μl PyroMark Q48 Magnetic Beads，10μl扩增产物，2μl测序引物。结果由PyroMark Q48仪器配套软件分析。
4.1、测序结果
所得测试组样本的测序结果如下表6所示。
表6
5)根据所述测序结果推断所述未知检材的组织来源
参考组样本使用同样的方法获得3个位点的测序结果，并通过本领域已知的聚类技术——主成分分析技术(Principal Components Analysis，PCA进行聚类，利用技术对于本领域技术人员来说是可以根据本领域基础知识实现的。主成分分析PCA是一种简化数据集的统计学技术。它将数据变换到一个新的坐标系统中，使得任何数据投影的第一大方差在第一个坐标(第一主成分，PC1)上，第二大方差在第二个坐标(第二主成分PC2)上，通过数据降维实现数据间的分析比较和可视化。样本数据在每个坐标轴上的百分比则反映了其区分度，两个主成分观察值(Observations)的和则是样本数据在两个维度上的总体区分度，观察值越高，区分能力越强。本系统图1、图2和图3的观察值均达到99％以上，且唾液斑、精液及静脉血各自聚成一簇且距离较远，证明本发明的系统在唾液斑、精液、静脉血中具有很强的区分能力。
聚类结果见图1(图1中左上角为唾液斑样本，左下角为精液样本，右中为静脉血样本)，可以看出，通过本申请的方法和系统能将3组样本正确的聚类；并且根据参考样本的结果，如果待检测样本的聚类结果落在左上角则为唾液斑样本，左下角则为精液样本，右中则为静脉血样本。
图2是测试组样本的焦磷酸化测序结果的聚类图，图3是参考组样本与测试组样本的焦磷酸化测序结果混合后进行聚类获得的聚类图，从图2和图3可以看出，未知斑迹组织来源的测试组样本通过本申请的方法和系统也能完全区分，并且各测试组样本的测序结果聚类后所落在的区域代表的组织来源与其已知组织来源一致。
综上，本发明方法可以对未知检材进行组织来源推断，能有效从基因水平实现对未知检材斑迹组织来源推断等提供准确的科学依据。
SEQUENCE LISTING
<110> 公安部物证鉴定中心
<120> 一种对未知检材进行组织来源推断的方法和系统
<130> CNCNP201803891
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<223> 下游引物
<400> 4
aatcctaaaa aaatcatcta ctcctctaaa 30
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 上游引物
<400> 5
gttgggggag aagttgagtg a 21
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 下游引物
<400> 6
caaccaaacc caaaaaaaaa ccacaatacc 30
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 测序引物
<400> 7
tggtatagag gggttagt 18
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 测序引物
<400> 8
gttgatgatt ttattattag ttgg 24
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 测序引物
<400> 9
acccccaatt cttacccta 19
Claims (10)
1.一种对未知检材进行组织来源推断的方法，其特征在于，该方法包括：
1)提取未知检材的DNA；
2)对所述DNA进行甲基化转化；
3)对经甲基化转化的DNA的3个位点进行扩增，所述3个位点为cg25373595，cg18121066和cg17283169；
4)对步骤3)的扩增产物进行焦磷酸化测序以获得测序结果；
5)根据所述测序结果推断所述未知检材的组织来源。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述2)包括亚硫酸化所述DNA以对所述DNA进行甲基化转化。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中3)包括采用与所述3个位点一一对应的3对扩增引物对其进行扩增以获得扩增产物的步骤；所述扩增引物为序列表中SEQ IDNo.1至SEQ ID No.6的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述组织来源为唾液斑、精液和静脉血中的一种或多种。
5.一种对未知检材进行组织来源推断的系统，其特征在于，所述系统包括DNA提取体系，甲基化转化体系，扩增体系，测序体系和推断体系；
所述DNA提取体系用于提取所述未知检材的DNA；
所述甲基化转化体系用于对所述DNA进行甲基化转化，
所述扩增体系用于对经甲基化转化的DNA的3个位点进行扩增，所述3个位点为cg25373595，cg18121066和cg17283169；
所述测序体系用于对扩增产物进行焦磷酸化测序以获得测序结果；
所述推断体系用于根据所述测序结果推断所述未知检材的组织来源。
6.根据权利要求5所述的系统，其特征在于，所述甲基化转化体系用于亚硫酸化所述DNA以对所述DNA进行甲基化转化。
7.根据权利要求5所述的系统，其特征在于，所述扩增体系用于采用与所述3个位点一一对应的3对扩增引物对其进行扩增以获得扩增产物；所述扩增引物为序列表中SEQ IDNo.1至SEQ ID No.6的核苷酸序列。
8.根据权利要求5所述的系统，其特征在于，所述组织来源为唾液斑、精液和静脉血中的一种或多种。
9.一种扩增体系，其特征在于，所述体系包括未知检材的经甲基化转化的DNA，以及用于扩增所述经甲基化转化的DNA的3个位点的扩增引物，所述3个位点为cg25373595，cg18121066和cg17283169；
所述扩增引物由与所述3个位点一一对应的3对扩增引物组成，所述扩增引物为序列表中SEQ ID No.1至SEQ ID No.6的核苷酸序列。
10.一种检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求9所述的扩增体系。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011268855.4A CN114480662A (zh) | 2020-11-13 | 2020-11-13 | 一种对未知检材进行组织来源推断的方法和系统 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011268855.4A CN114480662A (zh) | 2020-11-13 | 2020-11-13 | 一种对未知检材进行组织来源推断的方法和系统 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114480662A true CN114480662A (zh) | 2022-05-13 |
Family
ID=81491209
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202011268855.4A Pending CN114480662A (zh) | 2020-11-13 | 2020-11-13 | 一种对未知检材进行组织来源推断的方法和系统 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114480662A (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104131072A (zh) * | 2014-05-23 | 2014-11-05 | 公安部物证鉴定中心 | 一种对未知检材进行个体识别和亲权鉴定的方法和系统 |
| WO2019159184A1 (en) * | 2018-02-18 | 2019-08-22 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. | Cell free dna deconvolution and use thereof |
-
2020
- 2020-11-13 CN CN202011268855.4A patent/CN114480662A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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