CN114480530B - 促进mtr1核酶催化反应的方法及mtr1核酶的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及酶工程技术领域,公开了一种促进MTR1核酶催化反应的方法及MTR1核酶的应用,其中促进的方法包括:通过促进底物RNA、辅助因子O6‑甲基鸟嘌呤、MTR1核酶三者之间的邻近效应和/或定向效应,及促进MTR1特异位点胞嘧啶介导的一般酸催化,以及使催化反应位于酸环境下进行等多个方式。通过本发明提供的优化方式,解决MTR1核酶低效率和序列限制等问题。不仅能够高效地对RNA底物进行序列特异性甲基/烷基化修饰、荧光修饰等,还可以序列特异性修饰DNA,使MTR1的适用范围更加广泛。
Description
技术领域
本发明涉及酶工程技术领域,更具体地,涉及促进MTR1核酶催化反应的方法及MTR1核酶的应用。
背景技术
RNA的甲基化修饰是生命科学研究领域最热门的方向之一,几乎所有编码和非编码RNA都经历转录后修饰,绝大多数甲基化以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作为通用甲基供体,通过本质为蛋白质的甲基转移酶进行甲基化组装。甲基转移酶和甲基化核苷酸都被认为是在进化上非常古老的存在。
核酶是自然界中存在的一类具有催化功能的RNA分子,可催化RNA多种关键反应,例如核糖体催化的蛋白质酰胺键的形成等。化学多样性的核酶似乎已在自然界中消失,但通过体外选择重建、运用体外筛选技术仍能获得具有活性的核酶,在此基础上,研究者发现了多种新型RNA核酶,这其中就包括甲基转移核酶。如,最近,Flemmich等人表明,pre-Q1核糖开关可表现出一些甲基转移酶活性;Murchie和同事最近通过体外筛选技术,获得了一种RNA,其可将S-腺苷甲硫氨酸的甲基转移到RNA中特定鸟嘌呤的N7位。
发明内容
本发明旨在克服上述现有技术的至少一种不足,提供一种促进MTR1核酶催化反应的方法及MTR1核酶的应用,用于解决现有MTR1甲基转移核酶低效率和序列限制的问题,使MTR1能够更广泛的应用于核酸甲基/烷基化修饰。
本发明的一个目的在于提供一种促进MTR1核酶催化反应的方法,包括以下三种处理步骤中的一种或多种:
(1)促进底物RNA、辅助因子O6-甲基鸟嘌呤、MTR1核酶三者之间的邻近效应和/或定向效应;
(2)促进MTR1特定位点胞嘧啶介导的一般酸催化;在本发明的一个实施例中发现,甲基转移酶核酶的活性中心与O6-甲基鸟苷结合,在特定胞嘧啶的一般酸催化下,将其甲基转移到修饰位点腺嘌呤的N1上;
(3)置催化反应于酸环境下进行;
进一步地,促进MTR1核酶催化反应包括促进MTR1核酶催化效率和扩大MTR1核酶的底物适用范围。
进一步地,所述MTR1核酶含有核心序列:5’-UGACCGACCCCCCGAGUUCGCUCGGGGACAACUAGACAUA-3’。
进一步地,特定位点胞嘧啶为MTR1核心序列5’-UGACCGACCCCCCGAGUUCGCUCGGGGACAACUAGACAUA-3’序列中第4位的胞嘧啶。
进一步地,酸环境包括pH为5~6.5之间的酸环境。
本发明的再一目的在于提供MTR1核酶在制备核酸甲基/烷基化修饰的试剂中的用途,核酸甲基/烷基化修饰包括RNA甲基/烷基化修饰、DNA甲基/烷基化修饰,MTR1核心序列:5’-UGACCGACCCCCCGAGUUCGCUCGGGGACAACUAGACAUA-3’。
进一步地,核酸含有以甲基化位点腺嘌呤为中心的三个连续碱基,三个连续碱基中腺嘌呤两侧碱基为A、T、C、G、U中的任意一种。
更进一步地,三个连续碱基包括GAG、CAG、AAG、UAG、GAA、GAC、GAU和CAC。
进一步地,甲基化修饰包括m1A甲基化修饰和m6A甲基化修饰。
进一步地,MTR1的5’端添加有GCG修饰碱基。
进一步地,MTR1核心序列5’端添加有与底物3’端互补的序列,核心序列3’端添加有与底物5’端互补的序列。以实现与底物RNA的特异性结合。
本发明的再一目的在于提供MTR1核酶在制备用于核酸标记的试剂中的用途。
进一步地,核酸标记通过包括携带标记物BG-NH2、MTR1核酶、待标记底物核酸多个组分反应形成。进一步地,标记物包括含有NHS活化酯的荧光分子;进一步地,标记载体为BG-NH2,标记物包括Cy3、Cy5。
本发明的再一目的在于提供一种利用MTR1核酶标记核酸的方法,包括步骤:
A1、使标记物连接于BG-NH2上;
A2、将携带标记物的BG-NH2加入含MTR1核酶、底物核酸的烷基化反应体系中;
A3、步骤A2反应完成后即获得携带标记物的底物核酸。
本发明的再一目的在于提供一种核酸标记试剂盒,含有MTR1核酶、标记物、BG-NH2。
进一步地,前述核酸包括DNA、RNA。
本发明的再一目的在于提供一种试剂盒,包括MTR1核酶,及促进底物RNA、辅助因子O6-甲基鸟嘌呤、MTR1核酶三者之间的邻近效应的药剂和/或促进底物RNA、辅助因子O6-甲基鸟嘌呤、MTR1核酶三者之间的定向效应的药剂和/或促进MTR1特异位点胞嘧啶介导的一般酸催化的药剂和/或辅助因子O6-甲基鸟嘌呤和/或调节MTR1核酶催化环境为酸环境的药剂。
现有技术中已知核酶其化学催化范围有限,而体外选择则能产生催化化学范围更为广泛的物种,其中就包含及其同事利用体外RNA选择产生的MTR1新型RNA核酶,可以催化甲基从O6-甲基鸟嘌呤转移到RNA中特定腺嘌呤的N1(如图1A所示),其是目前发现的第一个甲基转移酶核酶,有望基于该酶进一步提供核酶的广泛应用和研究。但目前对于该选择核酶的结构、催化机制研究较少。
为此,本发明人对其结构和催化机制进行研究,以获取可提高其催化反应的方法。更进一步地,本发明人发现核酶利用反应物的接近性和方向性来促进反应物进行在线SN2反应等。在本发明的一个以上实施例中,为对MTR1核酶的晶体结构进行研究,且通过RNA与O6-甲基鸟嘌呤进行核酶的共结晶。在实施例观察到的结晶体中,甲基转移反应已经完成,因此结构是含有结合外源鸟嘌呤的产物复合物,目标腺嘌呤已转化为N1-甲基腺嘌呤。
进一步地,本发明人已经以的分辨率解析了这种核酶的晶体结构,显示了复合体如何折叠以生成甲基供体底物的特异性结合位点。且该结构表明了一种催化机制,涉及邻近效应和定向效应的组合,以及碱基介导的一般酸催化。且该机制有催化速率的pH依赖性支持。即甲基转移酶核酶可以采用相对复杂的催化机制,并具有提高催化反应效率的可能性,基于该核酶有利于拓宽已知的RNA催化化学的范围。在本发明的一个实施例中也证实,基于本申请提出的优化机制,能够扩大MTR1修饰范围,即克服传统的GAG连续碱基限制,适用的序列、底物更为广泛。
本发明的再一目的在于提供一种促进MTR1核酶结晶的方法,在与底物RNA结合的核酶5’端或3’端添加GAAA帽。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
1、本发明提供的甲基转移核酶MTR1,能以m6G为甲基供体,酶通过和底物序列互补配对实现序列特异性m1A和m6A修饰。
2、本发明所述的甲基转移核酶MTR1经过系列优化,不仅能够高效地对RNA底物进行序列特异性甲基/烷基化修饰,还可以序列特异性甲基/烷基修饰DNA。因此,本发明为表观遗传层面调控生命过程提供了一个高效的分子工具,对于甲基/烷基化的研究具有里程碑式的意义。
3、解决MTR1甲基转移核酶低效率和序列限制的问题,本发明通过系列条件及序列优化,使得MTR1能够更广泛应用于RNA甲基/烷基化修饰。
附图说明
图1显示甲基转移反应和MTR1核酶的整体结构。A.外源O6-甲基鸟嘌呤的甲基转移到RNA中特定腺嘌呤的N1上的化学反应。B.实施例1中结晶的MTR1核酶序列,RNA为三向螺旋连接,由P1、P2和P3三个臂组成;将GNRA环添加到P3螺旋的末端,使整个核酶由一条单链RNA组成以便于晶体学研究。RNA链分为3个区段,分别命名为J12(绿色)、J23(蓝色)和J31(红色)。C.MTR1核酶完整结构的平行眼立体图像;结合的鸟嘌呤呈青色,甲基化靶标A63呈洋红色;随着甲基转移反应完成,外源O6-甲基鸟嘌呤变为鸟嘌呤,N1-甲基腺嘌呤出现在63位。D.与鸟嘌呤结合的结构示意图;插图(右上)显示了从连接处的小沟侧观察到的连接处链的路径。
图2显示MTR1核酶的核心结构;结合的鸟嘌呤为青色,甲基化位点A63为洋红色。A.从小沟侧看核心区,J12链(绿色)在前面;J12链的碱基A9,C10,C11和G12顺序堆叠。B.从大沟侧看核心区,J23链(蓝色)在前面;J23链呈螺旋状轨迹。C.核酶核心的四个碱基相互作用平面;这四个平面包括(从下到上)G12:C38,C11:G41,C10、U45和A63与外源鸟嘌呤氢键结合,以及三重相互作用A9:A46:A40。
图3显示MTR1核酶的鸟嘌呤结合位点和活性中心;鸟嘌呤反应产物分别与C10和U45的碱基形成三个氢键,鸟嘌呤N7和A63 N6有一个氢键连接;氢键以黑色表示;红色虚线表示鸟嘌呤O6和A63 N1的矢量连接,即SN2反应的预期轨迹;活动中心的A63以两种方式建模:A.数据已经在63位置用腺嘌呤进行了拟合,在差异电子密度图中清楚地显示甲基与A63N1结合;甲基对应的峰标记为m。B.63位已被建模为N1-甲基腺嘌呤;这就为甲基转移到A63N1提供了很好的拟合依据。
图4显示MTR1和活性中心变异体的甲基转移活性;使用Scheitl等人开发的电泳测定法,使用示意图所示的两段式核酶进行测量;在50mM HEPES(pH 7.5)、120mM KCI、5mMNaCl、40mM MgCl2和50μM O6-甲基鸟嘌呤存在下,用50nM同位素磷-32[5'-32P]标记的底物链与1μM核酶链孵育,在37℃下进行反应;A.底物和反应产物通过凝胶电泳分离,以放射自显影图显示,因此仅可见磷-32标记链;泳道1和泳道2为合成的底物链,分别在位置63处具有腺嘌呤和N1-甲基腺嘌呤;泳道6含有相同两种寡核苷酸的混合物;核酶反应的产物显示在泳道3,4和5中;在泳道3中,未突变的核酶与放射性底物一起孵育28小时,产生大量转化为含N1甲基腺嘌呤的RNA;相比之下,U45C或C10U变体严重损害了核酶活性。B.未突变的MTR1和C10U或U45C变体的反应进程图。在不同时间取出等分样品,并通过放射自显影定量底物链和产物链;反应进程已拟合为单指数函数;C10U或U45C进行了更长的时间反应(图14),数据显示U45C变体的活性比未突变的核酶慢30倍,即使孵育四天,也无法检测到C10U的活性。
图5显示MTR1可能的催化机制;为了更清楚地呈现,将机制分为三个步骤展示(实际上步骤顺序可调换,也可能是部分步骤或全部步骤同时进行的);在第1步中,C10的碱基被质子化,在第2步中,O6-甲基鸟嘌呤加入并结合;甲基转移反应发生在步骤3,包括A63 N1对O6-甲基鸟嘌呤的甲基的亲核攻击和鸟嘌呤O6-C键的协同断裂;这涉及一系列电子转移,质子从C10 N3到鸟嘌呤N1的移动以及伴随的质子从C10到甲基腺嘌呤63N1的移动。所提出的机制与MTR1核酶结构以及C10和U45取代对活性的影响完全一致(图4)。C10U变体的甲基化活性完全丧失与所提出的“C10除了结合配体外还作为一般酸的作用”这一机制完全一致。
图6显示MTR1催化烷基转移的pH依赖性;使用荧光测定法(参见图14)在pH值在5和8.5之间多次测量烷基转移速率;将观察到的速率常数的平均值绘制为反应pH的函数,其中误差线是标准偏差。
图7显示MTR1可进行m6A修饰。A.m1A RNA通过Dimroth重排反应变成m6A RNA示意图。B.经过m1A修饰后的RNA,与缓冲液25mM Na2CO3,pH10,1mM EDTA混合,65℃水浴1小时,通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳观察可见m1A RNA转变为m6A RNA。
图8显示RNA荧光标记;NHS活化酯(N-羟基琥珀酰亚胺酯,N-hydroxysuccinimideester,succinimidyl ester)是生物标记反应中最常用的活化基团。它可以活化Cy3、Cy5等分子中的羧基,让它可以和BG-NH2[O6-(4-Aminomethyl-benzyl)guanine]的胺基反应生成稳定的酰胺键。进一步通过MTR1的烷基转移酶活性可将含有Cy3、Cy5等与苄基连接的整个分子转移到A63上,进而完成RNA的标记。
本实验采用Cy3(λmax=566nm;εmax=1.5×105M-1cm-1)Cy5(λmax=664nm;εmax=2.5×105M-1cm-1)。A.Cy3-NHS活化酯、Cy5-NHS活化酯在缓冲液50mM Na3BO3,pH 8.5中与BG-NH2混合,避光反应5h,再以标记上Cy染料的BG-NH2作为烷基供体,参与MTR1催化的烷基转移反应。B.在MTR1催化下荧光基团可转移到目的RNA的腺嘌呤上,从而让目的RNA标记上荧光。
图9显示MTR1也可催化非GAG序列底物;Cy5.5_Lin8_A76G_17_AAG,Cy5.5_Lin8_A76G_17_GAC,Cy5.5_Lin8_A76G_17_GAG以及Cy5.5_Lin8_A76G_17_UAG,Cy5.5_Lin8_A76G_17_CAC分别在所对应的MTR1酶催化下进行烷基化反应,在不同时间点加入EDTA终止,通过变性聚丙烯酰胺凝胶观察烷基化产物,将产物进行定量,并将数据拟合为单指数函数,得出烷基转移速率分别为kobs(AAG)=0.49min-1,kobs(GAC)=0.23min-1,kobs(GAG)=0.18min-1,kobs(UAG)=0.043min-1,kobs(CAC)=0.0056min-1
图10显示MTR1可烷基化修饰DNA;DNA和RNA,在同反应条件下由同一MTR1酶催化,分别在不同时间点取样加入EDTA终止反应,通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳观察烷基化产物量,反应包括恒定量的5'-标记荧光素的30nt DNA作为内参,且产物的荧光为除以DNA标准品的荧光,绘制RNA产物/DNA比率,并将其拟合为单指数函数,得出Kobs(DNA)=0.003min-1,Kobs(RNA)=0.008min-1
图11显示MTR1结构中核苷酸相互作用的网格;标准G:C或A:U顺式Watson-Crick配对由黑色方块表示;非标准碱基对用橙色方块表示,碱基配对使用Leontis-Westhof名称表示。
图12显示MTR1三向连接的全局结构;P2和P3与结构的核心同轴,P1垂直于它们;但是P2-核心-P3轴有一个平缓的曲率。
图13显示MTR1 U45C和C10U的进一步反应;采用同样的两段式的核酶+底物和未突变的MTR1核酶的条件(图5);反应在50mM HEPES(pH 7.5),120mM KCl,5mMNaCl,30mMMgCl2,50μM O6-甲基鸟嘌呤,50nM[5'-32P]底物链和1μM核酶链中进行,37℃反应。对凝胶进行放射自显影(A);即使在更长的时间(超过4天),MTR1 C10U变体也没有检测到腺嘌呤甲基化,而MTR1 U45C变体观察到低水平的反应,将数据拟合为单指数函数(B)得到反应速率kobs=2.7x10-5 min-1。
图14显示荧光分析法测量烷基转移与pH值的关系;A.使用荧光基团Atto488(λmax=500nm;εmax=9.0×104M-l cm-1)通过O-【4-(氨基甲基)-苯基】键(AABG)与鸟嘌呤O6连接;该反应将底物链中的Atto488转移到A63上,产生荧光产物条带,可通过荧光成像进行定量;所有反应均包括恒定量的5'-标记荧光素的19nt DNA标准品,且产物的荧光为除以DNA标准品的荧光。B.pH 6.0的反应示例;反应在25mM MES(pH 6.0)、100mM KCl、40mM MgCl2、1μM核酶链、1μM底物链和50μMAABG中进行,温度为37℃,使用带有FITC滤光片的473nm激光激发,通过荧光成像扫描凝胶。C.绘制RNA产物/DNA比率并将其拟合为单指数函数,得出烷基转移速率kobs=0.077min-1。
图15显示MTR1核酶中鸟嘌呤结合与某些核糖开关结构中鸟嘌呤相关配体结合的比较;配体的方向(以青色突出显示)在所有图像中都是相似的;A.MTR1核酶(本发明)。B.鸟嘌呤核糖开关,PDB ID 6UBU;鸟嘌呤配体与胞嘧啶和尿嘧啶的结合与在MTR1中发现的非常相似。C.PreQ1-I核糖开关,PDB ID 3Q50;pre-queuosine1(preQ1)配体的Watson-Crick边缘与胞嘧啶结合,而糖边缘与腺嘌呤的N1和N6结合,并与尿嘧啶O4形成单氢键。D.PreQ1-II核糖开关,PDB ID 4JF2;preQ1配体的糖边缘以与MTR1类似的方式与尿嘧啶结合,只是O2和O4的作用相反;Watson-Crick边缘由胞嘧啶的O2和N3结合;E、F:环状di-GMP核糖开关,PDB ID3IRW;配体由两个鸟嘌呤碱基组成,在不同的环境中结合;E部分显示的鸟嘌呤的Watson-Crick边缘再次与胞嘧啶结合,而糖边缘与腺嘌呤的N1和N6结合;相比之下,另一个鸟嘌呤(F)仅Hoogsteen边缘有结合,在N1和N2处与鸟嘌呤的Watson-Crick边缘形成两个氢键。
图16显示MTR1 P1螺旋的平行眼立体图。
图17显示:数据收集与细化统计(SAD);原子座标等相关数据已提交到PDB,ID为7V9B。
图18显示MTR1与鸟嘌呤结合的方式以及甲基转移的机制;在MTR1核酶中,鸟嘌呤Watson-Crick面与C10形成氢键,糖边与U45形成氢键,C10和U45紧紧固定外源鸟嘌呤,使Hoogsteen面的O6指向底物RNA上的A63;鸟嘌呤O6上连接的甲基基团几乎完全对齐于A63的N1以进行亲核攻击,同时甲基转移机制还涉及C10胞嘧啶介导的一般酸催化作用,质子从C10 N3移动到鸟嘌呤N1位为恢复N1和C6之间的单键以转移甲基,基于此,甲基得以从外源O6-甲基鸟嘌呤转移到底物核酸特异位点腺嘌呤的N1位。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是例示性的,旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是,这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式,而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式也意图包括复数形式,此外,还应当理解的是,当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时,其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
现结合具体实例对本发明作进一步的说明,以下实施例仅是为了解释本发明,但不构成对本发明的限制。在以下实施例中所用到的试验样本及试验过程包括以下内容(如果实施例中未注明的实验具体条件,通常按照常规条件,或按照试剂公司所推荐的条件;下述实施例中所用的试剂、耗材等,如无特殊说明,均可从商业途径得到)。
本实施例涉及的材料和方法如下:
1、化学制品
O6-甲基鸟嘌呤(0837914)购自Macklin,Atto 488NHS-酯来自Atto-Tec,O-【4-(氨基甲基)-苄基】鸟嘌呤来自Biosynth Carbosynth,BG-NH2购自Macklin,Cyanine系列染料来自武汉荧探生工科技有限公司。
2、RNA转录
最终得到晶体结构的序列为69nt MTR1 RNA(所有序列均写为5'至3'):GCGGGCUGACCGACCCCCCGAGUUCGCUCGGGGACAACUAGACAUACAGUAUGAAAUACUGAGCCCGC,该RNA是体外选择的核酶MTR1和底物RNA通过GAAA连接成的一条单链。转录制备过程包括:采用T7 RNA聚合酶在37℃下体外转录6小时,然后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化,UV下切下条带,使用Elutrap电洗脱系统(GE Healthcare)在200V,4℃下0.5×TBE缓冲液中电洗脱12小时;最后用异丙醇沉淀RNA,用70%乙醇洗涤一次并溶于双蒸水中。
采用体外转录的序列还包括用于GAG突变实验的MTR1酶:
M_Lin8_GAG:
GCGUCAACGUCUGACCGACCCCCCGAGUUCGCUCGGGGACAACUAGACAUACCGCUGCA
M_Lin8_AAG:
GCGUCAACGUCUGACCGACCCCCCGAGUUCGCUCGGGGACAACUAGACAUAUCGCUGCA
M_Lin8_CAG:
GCGUCAACGUCUGACCGACCCCCCGAGUUCGCUCGGGGACAACUAGACAUAGCGCUGCA
M_Lin8_UAG:
GCGUCAACGUCUGACCGACCCCCCGAGUUCGCUCGGGGACAACUAGACAUAACGCUGCA
M_Lin8_GAA:
GCGUCAACGUUUGACCGACCCCCCGAGUUCGCUCGGGGACAACUAGACAUACCGCUGCA
M_Lin8_GAC:
GCGUCAACGUGUGACCGACCCCCCGAGUUCGCUCGGGGACAACUAGACAUACCGCUGCA
M_Lin8_GAU:
GCGUCAACGUAUGACCGACCCCCCGAGUUCGCUCGGGGACAACUAGACAUACCGCUGCA
具体的,用于m6A实验的MTR1酶:
M_m6A14_9A:
GCGATAGCGGGTGACCGACCCCCCGAGTTCGCTCGGGGACAACTAGACATACTCCCCGCATA
3、RNA的化学合成
使用t-BDMS磷酰胺化学合成寡核苷酸,应用Applied Biosystems 394DNA/RNA合成仪,使用具有2'O-叔丁基二甲基硅酰(t-BDMS)保护的UltraMILD磷酸核糖核酸合成RNA(Link Technologies)。
含有N1-甲基腺嘌呤(Glen Research)的寡核糖核苷酸用无水2M氨的甲醇溶液(Sigma-Aldrich)脱保护24小时。未修饰的序列在1:1氨水/甲胺中60℃脱保护20分钟。蒸发至干后,将所有寡核苷酸重新溶解在115μl无水DMSO、60μl三乙胺和75μl三乙胺三氢氟酸中以去除t-BDMS基团,并在65℃避光下搅拌2.5h,然后丁醇沉淀。
具体地,用于甲基转移酶活性动力学测定的RNA序列:
MTR1:
GCGGGCUGACCGACCCCGAGUUCGCUCGGGGACAACUAGACAUACAGUAU
MTR1 C10U:
GCGGGCUGAUCGACCCCGAGUUCGCUCGGGGACAACUAGACAUACAGUAU
MTR1 U45C:
GCGGGCUGACCGACCCCCCGAGUUCGCUCGGGGACAACUAGACACACAGUAU
MTR底物:
AUACUGAGCCCGC
MTR产物:
AUACUG(1mA)GCCCGC,(1mA)表示N1-甲基腺嘌呤的位置。
具体地,用于荧光研究烷基转移酶活性的RNA序列:
MTR1:
GCGUCUUAAGGCUGACCGACCCCCCGAGUUCGCUCGGGGACAACUAGACAUACAGUAUGUCACG
MTR底物:
CGUGACAUACUGAGCCUUAAGACGC
4、结晶、结构确定和细化
使用单链或双链设计多种RNA序列用于结晶试验。双链设计未产生晶体。使用基于单链的构建体,P1和P3末端均考虑加上GAAA环,并探索了不同长度(5-8bp)的P1和P3。本研究中得到的良好衍射晶体为P1和P3螺旋均为6bp且P3末端加GAAA环的RNA序列。
将0.5mM MTR1 RNA(69nt)溶于5mM HEPES(pH 7.5)、100mM KCI溶液,95℃加热1分钟。缓慢冷却至20℃,加入MgCl2至终浓度为5mM。将O6-甲基鸟嘌呤加入到最终浓度为5mM。使用0.8μLRNA配体复合物与0.8μL晶体池液混合制备的液滴,在18℃下通过悬滴法生长晶体,该池液包含40mM sodium cacodylate,pH 7.0、0.08M KCl、0.02M BaCl2、30%v/v(+/-)-2-甲基-2,4-戊二醇和0.012M四盐酸精胺(spermine tetrahydrochloride)。3天后出现晶体。用合适大小的尼龙环将晶体从液体中捞出并迅速的放入液氮中进行保存。
衍射数据采集于上海同步辐射装置(SSRF)线站BL02U1,波长100K。使用Aquarium处理数据。通过CC1/2和密度图检查确定数据的分辨率截止值。晶体在空间群P2221中生长,晶胞尺寸/>和/>在PHENIX的AutoSol功能中识别出11个钡(II)位点并用于单波长反常色散(SAD)定相位。使用RESOLVE进行密度修正得到可解释的电子密度图(图16)。
结构是在PHENIX中确定的,模型使用Coot手动调整,并使用Coot、phenix.refine和PDB_REDO进行了多轮调整和优化。使用MOLPROBITY和Coot中的验证工具监测模型键长、键角等参数对电子密度图的拟合。原子坐标和结构因子振幅已保存在PDB中,登录代号为PDB ID 7V9E。晶体统计数据可见于图17所示表1。
5、MTR1活性的动力学测定
按照Sheitl等人的方法进行single-turnover测定,并稍作修改。将20pmol MTR1核酶链加至8μl缓冲液(150mM KCI、6.25mM NaCl和62.5mM HEPES(pH 7.5))中,80℃快速冷却退火,再加入2μl400mM MgCl2,使其与经1pmol放射性[5’-32P]标记的目标RNA结合。在37℃下平衡,加入等体积的100μM O6-甲基鸟嘌呤,在120mM KCI、5mM NaCl和50mM HEPES(pH7.5)中引发反应。反应物在矿物油下孵育以防止蒸发,每隔一段时间取出2μl等分试样,加至13μl 95%甲酰胺、50mM EDTA终止混合物中。5μl样品在20%变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳~35cm,通过磷光成像定量条带强度,反应进程拟合为单指数函数:y=y0+A(1-e-kt),其中A是反应幅度,k是反应速率。
6、MTR1活性的荧光动力学测定
本发明人试图开发一种基于荧光而非修饰RNA迁移率变化的更方便的分析方法,并选择荧光团Atto488(λmax=500nm;εmax=9.0×104M-1cm-1)在O6处通过O-[4-(氨基甲基)-苄基]键(Atto488-BG)连接到鸟嘌呤。该反应将底物链中的Atto488转移至A63,从而产生荧光产物带,该荧光产物带可通过473nm激光和FITC滤光片激发的荧光成像进行量化(图14)。所有反应均包括恒定量的19nt 5'-标记荧光素DNA茎环(Flu-ATATATATGAAATATATAT),且产物的荧光值为除以DNA标准品所得。
为了合成Atto488-BG,将1.5μMO-[4-(氨基甲基)-苄基]鸟嘌呤和0.25μM Atto488NHS活化酯溶于20μl DMSO中,再加入0.5μl三乙胺。在室温下孵育过夜后,加入480μl0.1M TEAA水溶液,并通过HPLC在C18反相柱上使用乙腈梯度分离反应物,通过荧光团的吸光度定量,将含有Atto488-BG的馏分干燥,溶解在水中至200μM,-20℃储存。
7、测定烷基化率与pH值的关系
使用较长的RNA链进行single-turnover测定,P1和P3各有12bp。反应如前所述进行,20pmol MTR1在8μl125 mM KCl、10μM Flu-DNA中与20pmol靶RNA从80℃快速退火,再加入2μl 400mM MgCl2,并且通过在100mM KCl和50mM缓冲液中加入等体积的100μM AABG来引发反应。具体的,使用的缓冲液为MES(pH 5.0to pH 6.5),MOPS(pH 7.0and pH 7.5)和TAPS(pH 8.0and pH 8.5)。每个pH值的速率和不确定性是至少四个独立实验的平均值和标准偏差。
将观察到的反应的pH依赖性拟合成双电离模型:y=Kint/(1+10B-pH+10pH-A+10B-A),其中Kint是反应的固有速率,A 是反应的pKa活性需要质子化的部分(例如一般酸),B是去质子化形式活跃的部分的pKa。虽然动力学的模糊性阻止了将特定函数分配给每个电离常数,但在这种情况下,我们假设较高的电离常数是由C10作为一般酸产生的,因为其pKa位移很容易解释。
8、MTR1可进行m6A修饰
合成底物RNA序列:
m6A14_9A GCGGGGAGACCCGC;
根据底物序列设计对应MTR1序列:
M_m6A14_9A:
GCGATAGCGGGTGACCGACCCCCCGAGTTCGCTCGGGGACAACTAGACATACTCCCCGCATA
反应体系:底物RNA 260μM,MTR1 260μM,缓冲液(120mM KCl、5mM NaCl和5mM,Sodium Cacodylate PH6.0),m6G8mM,Mg2+40mM,在37℃下反应9h,异丙醇沉淀后通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离底物与酶,回收底物RNA后进行Dimroth重排反应,RNA在25mMNa2CO3,pH10,1mM EDTA中65℃条件下反应1小时,通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳观察。
9、MTR1甲基/烷基化底物序列不受GAG限制
MTR1对催化的RNA底物有一定选择性,即以甲基/烷基化位点腺嘌呤为中心的三个连续碱基为GAG。本发明人认为在本研究优化PH条件下,MTR1甲基/烷基化底物的范围能扩大,就此展开该实验过程。合成Cy5.5标记长度为17nt的WT(GAG)及相应突变底物RNA序列共8条:
Cy5.5_Lin8_A76G_17_GAG UGCAGCGGAGACGUUGA
Cy5.5_Lin8_A76G_17_CAG UGCAGCGCAGACGUUGA
Cy5.5_Lin8_A76G_17_AAG UGCAGCGAAGACGUUGA
Cy5.5_Lin8_A76G_17_UAG UGCAGCGUAGACGUUGA
Cy5.5_Lin8_A76G_17_GAA UGCAGCGGAAACGUUGA
Cy5.5_Lin8_A76G_17_GAC UGCAGCGGACACGUUGA
Cy5.5_Lin8_A76G_17_GAU UGCAGCGGAUACGUUGA
Cy5.5_Lin8_A76G_17_CAC UGCAGCGCACACGUUGA
反应体系:Cy5.5_RNA0.4μM,MTR1 1.6μM,缓冲液(120mM KCl、5mM NaCl和5mM,Sodium Cacodylate PH6.0),BG-NH2500μM,Mg2+40mM,37℃下反应,在不同的时间点加EDTA终止反应,通过变性聚丙烯酰胺凝胶观察烷基化产物量,并通过公式Y=Ymax×(1-e-kt)计算Kobs,与WT(GAG)比较。
10、荧光标记RNA
本发明人用荧光染料Cy3(λmax=566nm;εmax=1.5×105M-1cm-1)、Cy5(λmax=664nm;εmax=2.5×105M-1cm-1)标记BG-NH2,以BG-Cy3、BG-Cy5为供体,通过MTR1的烷基转移酶活性可将含有Cy3、Cy5等与苄基连接的整个分子转移到A63上,进而完成RNA的标记。
标记反应过程:从冰箱中取Cy染料放置室温后加入DMSO溶解,配置30mM的染料母液,并且准备母液浓度为30mM的BG-NH2溶液,按BG-NH2:Cy3/5-NHS活化酯摩尔比为1:1.67在缓冲液50mM Na3BO3,pH 8.5中进行标记反应,避光反应5h。用标记产物BG-Cy作为甲基供体进行烷基化反应,反应体系为:底物链(40μM)与酶链(52μM)混合,在120mM KCl、5mM NaCl和5mM HEPES和100μM BG-Cy5,40mM Mg2+存在下,37℃反应12h,用EDTA终止反应,在变性聚丙烯酰胺凝胶上观察。
11、MTR1可对DNA进行甲基/烷基化修饰
设计合成17nt底物DNA及RNA序列:DNA:TGCAGCGGAGACGTTGA。(所有序列均写为5'至3'),RNA作为对照,序列为:UGCAGCGGAGACGUUGA,对应MTR1酶:GCGUCAACGUCUGACCGACCCCCCGAGUUCGCUCGGGGACAACUAGACAUACCGCUGCA。反应体系:底物RNA/DNA10μM,MTR1 13μM,缓冲液(120mM KCl、5mM NaCl和5mM,Sodium Cacodylate PH6.0),Cy5-BG-NH2 100μM,Mg2+40mM,37℃下反应指定时间,通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳观察烷基化产物量,反应包括恒定量的5'-标记荧光素的30nt DNA(Cy5.5-CACACACACACACACACACACACACACACA)作为内参,且产物的荧光为除以DNA标准品的荧光,绘制RNA产物/DNA比率,Kobs由公式Y=Ymax×(1-e-kt)计算所得。
实施例1
一、MTR1的结晶
本实施例中,发明人设计了大量体外转录RNA构建体,以便在O6-甲基鸟嘌呤存在下结晶,并获得了含69个核苷酸的RNA晶体,该晶体在两个螺旋的末端有发夹环(图1B)。在这个结构中,核酶的核心区结构保持不变。核酶序列的5'端被改为GCG,以提高转录的准确性,同时对RNA的3'端进行互补性改变。此外,在P3螺旋末端加入了一个GAAA环,以促进结晶。收集的衍射数据分辨率达使用结合钡离子的反常衍射来解析结构。晶体结构已保存于PDB,ID号为7V9B,晶体学统计数据列于图17所示表中。
二、MTR1的全局结构
MTR1具有三向螺旋连接的全局结构(图1C、D)。三个臂分别命名为P1、P2和P3,其组成链分别为J12(绿色)、J23(蓝色)和J31(红色)。J31含有作为甲基化靶标的腺嘌呤(A63)。使用IUB命名法,该结是一个HS1HS5HS8结。反应物结合位点和核酶的活性位点包含在连接的核心内。MTR1的二级结构以图形形式显示在图11中。P2、核心和P3是同轴的,呈现连续的基底堆叠,但在核内存在一些平缓的曲率,P2和P3从共线处相互弯曲约40°(如图12所示)。P1螺旋近似垂直于P2和P3,并且不与其中任何一个堆叠。P1、P3臂为底物RNA两端与核酶两端互补配对形成的稳定双螺旋结构;即代表即使底物序列不同,但基于互补配对,两端含互补序列的MTR1核酶+底物RNA以及GAAA帽形成的复合体结构仍然具备该全局结构。
三、MTR1的核心结构
螺旋连接处有两个化学性质不同的侧面,具有大沟和小沟特征。两侧的视图如图2A、B所示。J12链位于连接处的小沟侧,而J23链位于大沟侧。J12链在连接处保持近似螺旋状,碱基A9到G12堆叠,且在G8和A9之间有一个急剧弯曲。相比之下,J23链遵循左手螺旋状的路径。
该结构的中心核可以简单地用四个碱基相互作用平面来描述,四个平面依次堆叠,平均间距为(图2C)。具体涉及到J12链核苷酸G12、C11、C10和A9在连续平面中有序的相互作用。J23链的核苷酸在每个平面上都有,但是是无序的。这是由J23链螺旋性质引起的,该点在大沟侧面的视图中可清楚地看到(图2B)。外源性鸟嘌呤和靶标A63密切参与第三平面相互作用。从P2螺旋向上上升的四个相互作用平面是:
平面1:G12:C38顺式Watson-Crick碱基对
平面2:C11:G41顺式Watson-Crick碱基对
平面3:外源鸟嘌呤与碱基C10,U45和A63形成氢键(图3)
平面4:A9:A46:A40三重相互作用,其中中心A46与A9和A40形成氢键。
第三个平面包括反应物和靶点,构成核酶的活性中心。
四、外源鸟嘌呤与核酶活性中心的结合
外源性鸟嘌呤(O6-甲基鸟嘌呤去甲基化产物)与核心第三平面的C10、U45和A63(图3)共面。鸟嘌呤是这些相互作用的中心;这个平面上的所有氢键都涉及鸟嘌呤:
C10:与鸟嘌呤形成顺式Watson-Crick配对,具有三个标准氢键
U45:与鸟嘌呤形成反式Watson-Crick-sugar配对,具有三个氢键
A63:与鸟嘌呤形成顺式Watson-Crick-Hoogsteen配对,具有从A N6到G N7的单氢键。
外源鸟嘌呤几乎最大程度地形成氢键。此外,它在两个面上堆叠,C11:G41碱基对构成下面的第二个平面,而三重碱基相互作用的中心A46位于上面的顶平面。因此,鸟嘌呤在该位点受到严格限制。图3A、B中的红色虚线显示了SN2攻击的预期方向。表明鸟嘌呤和A63保持在甲基转移反应的最佳方向。事实上,晶体结构表明反应已经完成。如果我们在A63处建模为未修饰的腺嘌呤,我们会发现距离N1原子的未建模电子密度,该密度与鸟嘌呤N6共线,与甲基的存在于N1原子吻合(图3A),并且对应的鸟嘌呤O6上的没有甲基电子密度。将63位建模为N1-甲基腺嘌呤,与电子密度非常吻合(图3B)。这证实了:MTR1将甲基从外源O6-甲基鸟嘌呤转移到A63 N1。晶体结构观察到反应已经完成,也证实了核酶是充分活跃的。
五、MTR1的结构与原子突变分析一致
Scheitl等人对靶标A63的甲基化活性进行了广泛的原子突变分析,所有结果与我们在晶体中观察到的结构一致。腺嘌呤不能被嘌呤或2-氨基嘌呤取代。因此,6-氨基基团很重要,与观察到的外源鸟嘌呤N7的氢键一致。A63 N7或N3被CH取代(即deaza取代)对活性的影响很小,两者都不会在晶体中观察到相互作用。他们还表明,外源O6-甲基鸟嘌呤上的环外2-NH2基团是活性所必需的。这使得晶体结构中的C10和U45都形成氢键。
C10和U45碱基分别与晶体中结合的鸟嘌呤形成三个氢键。我们分别将其突变为C10U和U45C,并检测了由此产生的甲基转移酶活性。为此,我们使用Scheitl等人描述的测定法,使用两段式核酶-底物复合物,该复合物具有对应于J31链的单独13nt底物链(图4A)。含有带正电荷的N1-甲基腺嘌呤的产物链的迁移率略低于未经修饰的底物。未突变的MTR1核酶表现出良好的甲基转移酶活性,即在pH 7.5时以kobs=9.2±0.3×10-4.min-1的速率产生明显的产物(图4B)。相比之下,C10U和U45C变体的甲基转移酶活性显著受损,这与在晶体结构中观察到的它们在结合O6-甲基鸟嘌呤中的作用一致。延长的反应时间过程表明,U45C变体产生了一些N1-甲基腺嘌呤,速率为kobs=2.8±0.2×10-5min-1,比未突变MTR1序列慢30倍(图13)。相比之下,即使在孵育4天后,C10U变体也没有检测到甲基转移,这表明C10的作用特别重要。
六、甲基转移的机制
MTR1核酶将甲基从甲基鸟嘌呤O6转移到A63 N1,前述结构证实了这一点。因此,该反应涉及A63 N1对甲基碳原子的亲核攻击,留下C6位上带有酮氧原子的鸟嘌呤。与大多有机化学中常见的分子间SN2反应不同,在核酶的参与下,甲基转移反应变成了分子内的反应。反应物被固定在适当的位置,提高了它们的有效局部浓度并降低了熵活化损失。本实施例结构表明,这两种反应物在反应中排列得非常好(图3)。G O6-A63 N1-A63 C6定义的夹角为118°,与包含孤对电子的氮sp2轨道几乎完美对应。因此,说明局部浓度和方向将使催化速率有所提高。
从O6转移甲基需要恢复N1和C6之间的单键,因此使N1在生成的鸟嘌呤中质子化。这表明需要酸来使N1质子化,且唯一的候选者是C10。因此,根据晶体中观察到的结构提出了一种反应机制(图5)。C10在N3处质子化(步骤1),这是结合O6-甲基鸟嘌呤的核酶的形式(步骤2)。这允许在胞嘧啶和O6-甲基鸟嘌呤之间形成三个氢键,包括从C10 N3到O6-甲基鸟嘌呤N1的氢键。甲基转移(步骤3)涉及甲基到A63 N1和质子从C10 N3翻转到鸟嘌呤N1的协同运动,从而恢复中性非质子化的C10,在63位留下带正电荷的N1-甲基腺嘌呤。理论上,核酶可以通过释放鸟嘌呤来恢复,尽管这需要解离J31链,因为N1-甲基腺嘌呤不能进一步反应。此外,没有证据表明反应后的核酶会释放产物,这也不是体外筛选策略所要求的。总而言之,本实施例提出:核酶使用两种催化策略来加速反应,即接近/定向和一般酸催化。尽管为了清楚起见,本发明人将反应分为三个单独的步骤说明,但实际上该类步骤可能以协调的方式发生,尤其是C10的质子化和O6-甲基鸟嘌呤的结合可能基本上是同时进行的。碱基对的形成预计会使胞嘧啶的pKa从其正常值4.2提高。C10碱基在底物结合和一般酸催化中的作用与本发明的活性数据一致。MTR1 U45C活性水平较低,而C10U变体活性完全检测不到。这表明C10的作用不仅仅是结合O6-甲基鸟嘌呤,这与C10可能参与一般酸催化的推测吻合。
七、反应速率的pH依赖性与所提出的机制一致
晶体结构分析表明,如果胞嘧啶在N3处质子化,则O6-甲基鸟嘌呤与C10的Watson-Crick面的结合会更强,并且该质子转移到O6-甲基鸟嘌呤的N1上可能是催化机制中不可或缺的一部分。就此而预测在较低的pH值下甲基转移速率应该会增加,该点在C10的pKa上也应有所表现。因此,本实施例开始通过测量观察到的反应速率关于pH的函数来检验该预测。本实施例设计了一种新的荧光检测方法,使用荧光团Atto488在O6处通过O-[4-(氨基甲基)-苄基]键连接到鸟嘌呤(图14)。这与最初体外筛选核酶时使用的化合物非常相似,预计会发生烷基转移,将荧光团转移到底物链中的A63 N1上。这可以使用聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分析,因此非常适合在5.0和8.5之间的八个pH值下执行多次重复实验。
反应速率对pH的依赖性绘制在图6中。反应速率确实强烈依赖于pH,在pH=5.5时反应速率最大。在pH高于6.0的反应中,反应速率呈对数线性降低,pKa值为6.2。这与胞嘧啶由于其局部环境,特别是与外源性修饰的鸟嘌呤的相互作用而导致pKa升高是一致的。这些数据支持前述内容提出的催化机制,包括通过促进邻近、定向效应以及胞嘧啶介导的一般酸催化以实现催化反应的促进,即通过反应速率与pH的依赖关系进一步验证前述能够促进MTR1核酶催化的多种处理步骤。如所观察到的结构所示,涉及从C10的N1质子转移。在pH=5.7以下,反应速率降低,数据可以拟合到两个电离,pKa=5.0和6.2。在低pH值下导致活性降低的原因可能是A63 N1的质子化,其会阻止甲基/烷基转移。目前,还未发现有体外筛选核酶使用一般酸催化作用。
总体上,本发明一个以上实施例至少体现有以下内容:
本实施例中的MTR1结晶体总体结构是三向螺旋连接结构,连接接头近端保持螺旋状,继续延伸至活性中心所在的接头核心。三向螺旋接头倾向于采用两臂同轴且第三臂背离轴线的结构,MTR1接头遵循了这种一般行为。该结构的长距离接触相对较少,且延伸的P2螺旋包含连续的未配对核苷酸,形成一个“气泡”。RNA的关键区域位于连接的核心,J12和J23链之间四个相互作用的平面创造了结合外源性O6-甲基鸟嘌呤的环境,使其作为甲基供体在特定位置发挥作用。P2和P3螺旋的同轴堆叠和P1螺旋的偏离在J31链A63位置处形成明显的扭结,因此呈现出该碱基进行攻击。
MTR1与鸟嘌呤结合的方式;鸟嘌呤可以提供多达4个质子,并具有3个潜在的氢键受体。在MTR1中,它与RNA形成七个氢键,主要在其Watson-Crick边缘与C10形成,其糖边与U45形成。已经在许多核糖开关中确定了12个不同的鸟嘌呤结合位点的结构(图15)。鸟嘌呤核糖开关的结合与MTR1中观察到的非常相似,胞嘧啶结合Watson Crick面,尿嘧啶结合糖边缘。事实上,在preQ1 I,2'-脱氧鸟苷、ppGpp和环状di-GMP核糖开关中观察到,与胞嘧啶形成有效的Watson-Crick碱基对是较常见的。与糖边缘相互作用的性质更为多样,而Hoogsteen边缘的接触则较少。在MTR1核酶中,C10和U45紧紧固定外源鸟嘌呤,使Hoogsteen边缘的O6指向目标A63。
甲基转移的机理;鸟嘌呤O6上连接的甲基基团几乎完全对齐于A63的N1以进行亲核攻击。因此,部分催化速率提高来自有效的局部浓度和定向。催化作用的第二个因素来自C10胞嘧啶介导的一般酸催化作用,其N3上的质子转移到外源O6-甲基鸟嘌呤的N1上。晶体中配合物的结构以及反应速率对pH值的依赖性都有力地证明了这一点。在pH大于6时,反应速率降低,对应的表观pKa为6.2。这与本发明人提出的机制一致,即pKa升高的胞嘧啶碱基在反应中提供质子。
实施例2
一、MTR1可进行m6A修饰
合成底物RNA序列:m6A14_9A GCGGGGAGACCCGC;
根据底物序列设计对应MTR1序列:
M_m6A14_9A:
GCGATAGCGGGTGACCGACCCCCCGAGTTCGCTCGGGGACAACTAGACATACTCCCCGCATA
反应体系:底物RNA 260μM,MTR1 260μM,缓冲液(120mM KCl、5mM NaCl和5mM,Sodium Cacodylate PH6.0),m6G8mM,Mg2+40mM,37℃下反应9h,异丙醇沉淀后通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离底物与酶,回收底物RNA后进行Dimroth重排反应,RNA在25mM Na2CO3,pH10,1mM EDTA中65℃条件下反应1小时,通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳观察。在本实施例中,观察到Dimroth重排反应后m1A转变为m6A;如图7所示。
二、RNA荧光标记
首先利用Cy3-NHS活化酯、Cy5-NHS活化酯标记BG-NH2,标记反应过程:从冰箱中取Cy染料放置室温后加入DMSO溶解,配置30mM的染料母液,并且准备母液浓度为30mM的BG-NH2溶液,按BG-NH2:Cy3/5-NHS活化酯摩尔比为1:1.67在缓冲液50mM Na3BO3,pH 8.5中进行标记反应,避光反应5h。再以标记上Cy染料的BG-NH2作为烷基供体,参与MTR1催化的烷基转移反应。反应体系:40μM RNA,52μM MTR1,PH7.5的缓冲液(120mM KCl、5mM NaCl和5mMHEPES),100μM Cy5-BG-NH2和40mM Mg2+,在37℃下反应12h,用EDTA终止反应。在变性聚丙烯酰胺凝胶上观察。如图8所示,本实施例中,RNA成功被标记上Cy3和Cy5。
三、MTR1对于底物非GAG序列修饰效率
合成Cy5.5标记的WT(GAG)及相应突变底物RNA序列8条:
Cy5.5_Lin8_A76G_17_GAG UGCAGCGGAGACGUUGA
Cy5.5_Lin8_A76G_17_CAG UGCAGCGCAGACGUUGA
Cy5.5_Lin8_A76G_17_AAG UGCAGCGAAGACGUUGA
Cy5.5_Lin8_A76G_17_UAG UGCAGCGUAGACGUUGA
Cy5.5_Lin8_A76G_17_GAA UGCAGCGGAAACGUUGA
Cy5.5_Lin8_A76G_17_GAC UGCAGCGGACACGUUGA
Cy5.5_Lin8_A76G_17_GAU UGCAGCGGAUACGUUGA
Cy5.5_Lin8_A76G_17_CAC UGCAGCGCACACGUUGA
在本实施例中,基于本申请优化的条件,克服了现有技术MTR1的局限性:甲基/烷基化位点腺嘌呤为中心的三连续碱基通常为GAG才能实现甲基/烷基化。本实施例中示例的包括野生型GAG底物以及突变非GAG底物等8个底物均在优化条件下均能实现有效的烷基化修饰,如图9所示,以GAG、AAG、GAC、UAG、CAC为例表明了其均能实现有效的烷基化修饰,即实际说明了通过本申请提供的优化条件,对甲基/烷基化修饰位点腺嘌呤两侧的碱基具有广谱性,MTR1不再局限于特定连续碱基。更具体地,以Cy5.5_Lin8_A76G_17_AAG,Cy5.5_Lin8_A76G_17_GAC,Cy5.5_Lin8_A76G_17_UAG,Cy5.5_Lin8_A76G_17_CAC为例,以Cy5.5_Lin8_A76G_17_GAG作为对照同时进行反应,反应体系:Cy5.5_RNA 0.4μM,MTR1 1.6μM,缓冲液(120mM KCl、5mM NaCl和5mM,Sodium Cacodylate PH6.0),BG-NH2500μM,Mg2+40mM,37℃下反应。分别在特定时间点加EDTA终止反应,通过变性聚丙烯酰胺凝胶观察烷基化产物,将产物进行定量,并数据拟合为单指数函数,得出kobs(AAG)=0.49min-1,kobs(GAC)=0.23min-1,kobs(GAG)=0.18min-1,kobs(UAG)=0.043min-1,kobs(CAC)=0.0056min-1,且通过Kobs可知,底物AAG,GAC比WT(GAG)更高烷基化修饰效率。同时UAG,CAC也可被催化证实了:通过本发明优化的条件,可突破现有技术局限于GAG三连续碱基底物的缺陷,扩大MTR1甲基/烷基化底物范围。
四、MTR1可甲基/烷基化修饰DNA
设计合成17nt底物DNA及RNA序列:DNA:TGCAGCGGAGACGTTGA。(所有序列均写为5'至3'),RNA作为对照,序列为:UGCAGCGGAGACGUUGA,对应MTR1酶:GCGUCAACGUCUGACCGACCCCCCGAGUUCGCUCGGGGACAACUAGACAUACCGCUGCA。反应体系:底物RNA/DNA 10μM,MTR1 13μM,缓冲液(120mM KCl、5mM NaCl和5mM,Sodium Cacodylate PH6.0),Cy5-BG-NH2 100μM,Mg2+40mM,37℃下反应,分别在15min,30min,60min,120min,240min,480min加入EDTA终止反应,通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳观察烷基化产物量,反应包括恒定量的5'-标记荧光素的30nt DNA作为内参,且产物的荧光为除以DNA标准品的荧光,绘制RNA产物/DNA比率,Kobs由公式Y=Ymax×(1-e-kt)计算所得,结果如图10所示,虽然DNA修饰效率略低于RNA,但是证明了MTR1对DNA同样能进行甲基/烷基化修饰,不局限于RNA。
显然,本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明技术方案所作的举例,而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种促进MTR1核酶催化反应的方法,其特征在于,置促进MTR1核酶催化的烷基化反应于pH为5~6.5之间的酸环境下进行;反应底物为RNA和AABG,RNA序列:CGUGACAUACUGAGCCUUAAGACGC,MTR1核酶序列:GCGUCUUAAGGCUGACCGACCCCCCGAGUUCGCUCGGGGACAACUAGACAUACAGUAUGUCACG。
2. MTR1核酶在制备用于核酸标记的试剂中的用途,核酸标记具体为:标记上Cy染料的烷基供体参与MTR1催化的烷基转移反应,在RNA上标记上Cy3和Cy5;其中烷基供体为BG-NH2,RNA序列:GCGGGGAGACCCGC,MTR1核酶序列:GCGATAGCGGGTGACCGACCCCCCGAGTTCGCTCGGGGACAACTAGACATACTCCCCGCATA。
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