CN114480493B - 一种Caspase8报告基因细胞系及其构建方法和应用 - Google Patents

一种Caspase8报告基因细胞系及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提出了一种Caspase8报告基因细胞系及其构建方法和应用，涉及生物技术领域。通过该方法构建得到的报告基因细胞系能够应用于肿瘤细胞、细胞凋亡、细胞模型、Caspase相关基因以及药物筛选等方面的研究。

Description

一种Caspase8报告基因细胞系及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种Caspase8报告基因细胞系及其构建方法和应用。
背景技术
肿瘤的发生不仅仅是细胞增殖和分化异常的疾病，同时也是细胞凋亡异常的疾病。细胞的存活和凋亡之间是平衡的，这种平衡功能失调会增加患肿瘤的风险。而细胞凋亡(Apoptosis)是有机体为了维护自身内环境的稳定状态，而通过基因调控激活内源性核酸内切酶，由基因调控的细胞有序的，自主的程序化的死亡。目前已经确定半胱天冬蛋白酶(Caspase)在凋亡过程中是起着举足轻重的作用，同时，至少已有11种Caspase被发现，而Caspase分子间结构很相似，并且同源性很高，都同属于一个家族的蛋白酶。在这其中，Caspase8的活化在哺乳动物细胞的凋亡途径中表现尤为明显。Caspase8是细胞凋亡重要调节因子，是凋亡执行的重要效应分子，广泛表达于正常人体组织及多种肿瘤组织中。Caspase8基因变异可能扰乱Caspase8功能，进而影响细胞凋亡的执行，从而促进肿瘤的发生和发展。
报告基因是生物研究中的一种重要工具，常用作标记所要研究的目标基因，使得报告基因的表达水平与目标基因的表达水平相一致，从而可以通过对报告基因的表达来观察目标基因的表达调控。
基因编辑技术使我们能对特定目标基因进行敲入及敲除的“编辑”，通过利用CRISPR-Cas9基因编辑系统来构建Caspase8报告基因细胞系，对细胞凋亡及肿瘤的相关研究具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种Caspase8报告基因细胞系的构建方法，其包括如下步骤：
(1)设计Caspase8基因上游位点特异性Caspase8-sgRNA序列并鉴定；
(2)利用步骤(1)中的序列构建pcDNA3.1/Hygro-Caspase8-sgRNA质粒；
(3)整合Caspase8基因的同源重组序列和报告基因片段，得到报告基因蛋白整合片段；
(4)将步骤(2)中上述质粒和步骤(3)中上述报告基因蛋白整合片段按1:1的比例共转染到肺癌细胞中；
(5)筛选EGFP表达的细胞，并扩增单克隆细胞系，得到EGFP表达的细胞系；
(6)筛选得到的EGFP表达的细胞系并鉴定，得到Caspase8报告基因细胞系。
本发明的另一目的在于提供一种Caspase8报告基因细胞系，其通过上述Caspase8报告基因细胞系的构建方法构建而成。
本发明还有一目的在于提供一种上述Caspase8报告基因细胞系在下述(1)-(4)中任一的应用：
(1)在肿瘤细胞发生、发展及细胞凋亡研究中的应用；
(2)在细胞模型中的应用
(3)在研究Caspase相关基因中的应用；
(4)在药物筛选中的应用。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
第一方面，本发明实施例提供一种Caspase8报告基因细胞系的构建方法，其包括如下步骤：
(1)设计Caspase8基因上游位点特异性Caspase8-sgRNA序列及序列鉴定；
(2)通过CRISPR-Cas9技术，构建pcDNA3.1/Hygro-Caspase8-sgRNA质粒；
(3)通过受体效应体复合物荧光成像技术，整合Caspase8基因的同源重组序列和EGFP片段；
(4)通过电转染技术将上述质粒和EGFP片段按1:1的比例共转到肺癌细胞中；
(5)通过流式细胞仪单细胞筛选EGFP表达的细胞，并扩增单克隆细胞系，得到EGFP表达的细胞系；
(6)筛选得到的EGFP表达的细胞系，通过基因组PCR及免疫印迹方法鉴定，得到Caspase8报告基因细胞系。
步骤(4)中，肺癌细胞可以为A549，NCI-H446，NCI-H460，NCI-H292，95-D，SPCA-1，中的任意一种，优选A549细胞。
其中，质粒组合物包括CRISPR-Cas9基因编辑系统和荧光蛋白表达元件供体；CRISPR-Cas9基因编辑系统包括Cas9表达载体和sgRNA表达载体；荧光蛋白表达元件供体从5’端到3’端包括第一Caspase8基因同源臂、荧光蛋白表达元件和第二Caspase8基因同源臂。sgRNA包括靶向Caspase8外显子上游的第一sgRNA和靶向荧光蛋白表达元件供体同源臂外侧的第二sgRNA。sgRNA的5’端含有启动子同源臂，3’端含有sgRNA表达载体同源臂。优选地，质粒组合物还包括凋亡抑制基因载体，有利于提高细胞的存活率和基因编辑效率。
进一步的，在本发明的一些实施例中，上述Caspase8-sgRNA的序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
进一步的，在本发明的一些实施例中，上述绿色荧光蛋白整合片段的核苷酸序列序列如SEQ ID NO.3，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
进一步的，在本发明的一些实施例中，检测Caspase8表达量所用的引物组包括如SEQ ID NO.4所示的上游引物和SEQ ID NO.5所示的下游引物。
进一步的，在本发明的一些实施例中，检测Caspase8-DED表达量所用的引物组包括如SEQ ID NO.6所示的上游引物和SEQ ID NO.7所示的下游引物。
进一步的，在本发明的一些实施例中，上述肺癌细胞为A549、NCI-H446、NCI-H460、NCI-H292、95-D或SPCA-1。
进一步的，在本发明的一些实施例中，上述报告基因为GFP、EGFP、Luciferase或RFP。
第二方面，本发明实施例提供了一种Caspase8报告基因细胞系，其通过上述Caspase8报告基因细胞系的构建方法构建而成。
第三方面，本发明实施例提供了一种Caspase8报告基因细胞系在下述(1)-(4)中任一的应用：
(1)在肿瘤细胞发生、发展及细胞凋亡研究中的应用；
(2)在细胞模型中的应用；
(3)在研究Caspase相关基因中的应用；
(4)在药物筛选中的应用。
在本发明提供的实施例中，利用CRISPR-Cas9基因编辑系统将绿色荧光蛋白基因敲入到细胞Caspase8基因的终止密码子前，使其和Caspase8基因融合表达，其荧光强度与Caspase8表达量成正相关，实现了利用荧光强度直接指示Caspase8表达水平的效果，构建的Caspase8报告基因细胞系可用于Caspase8的表达调控研究；具有便捷、直观的特点，尤其适用于大规模筛选高效能sgRNA；该报告基因细胞系在发现Caspase8的表达调控因子、筛选靶向细胞周期的小分子药物、检测CRISPR-Cas9切割效率等方面提供了有力工具。
在药物筛选的应用中，将构建得到的Caspase8报告基因细胞系传代至96孔板，同时加入不同调控细胞周期的小分子药物，根据小分子药物不同的作用时间，换液去除小分子药物，48小时后，消化细胞，流式分析检测荧光蛋白的表达比例。Caspase8基因报告细胞系可以用于快速筛选鉴定抗肿瘤药物的效力和特异性。
进一步的，在本发明的一些实施例中，上述细胞模型为肿瘤细胞模型；上述药物为靶向抗肿瘤细胞小分子药物、检测病毒载体毒性、筛选抗病毒药物以及大规模筛选调控载体转导毒性的小分子化合物。
序列对照如表1所示。
表1
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为绿色荧光蛋白靶基因敲入机理示意图；
图2为Cas9载体构建示意图；
图3为筛选获得的阳性Caspase8报告基因细胞系表达绿色荧光蛋白
图4为qPCR鉴定Caspase8基因细胞系；
图5为免疫印迹法鉴定Caspase8基因细胞系；
图6为shRNA敲减Caspase8流式细胞仪筛选绿色荧光蛋白表达；
图7为筛选的绿色荧光蛋白表达Caspase8的单克隆细胞系。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考具体实施例来详细说明本发明。
实施例1
Caspase8报告基因细胞系的建立(如图1)，包括如下步骤：
(1)设计Caspase8基因上游位点特异性Caspase8-sgRNA序列及序列鉴定；
实施sgRNA设计和sgRNA载体构建。根据设计的sgRNA，在两端增加同源臂，人工合成寡核苷酸后，PCR扩增得到～70bp产物；sgRNA克隆载体用BbsI酶切后，跑胶回收克隆载体骨架；将PCR产物和sgRNA载体骨架组装形成sgRNA载体pU6-sgRNA，对于每个载体，挑选2～4个克隆，小提后进行DNA测序分析。
Caspase8-sgRNA1：CACCGAGGATCCTTCAAATAACTTC，如SEQ ID NO.1所示。
Caspase8-sgRNA2：CACCGAAGGATCCTTGAGACTCTTT，如SEQ ID NO.2所示。
(2)利用CRISPR-Cas9技术，选用Caspase8-sgRNA2，构建pcDNA3.1/Hygro-Caspase8-sgRNA质粒；
构建Cas9载体复合物(如图2)；根据pcDNA3.1/Hygro-Caspase8-sgRNA的序列，经生物公司合成后直接获得正确的sgRNA序列的质粒pcDNA3.1/Hygro-Caspase8-sgRNA。
(3)利用受体效应体复合物荧光成像技术(REFI)，整合Caspase8基因的同源重组序列和EGFP片段；
根据Caspase8基因的同源臂和EGFP序列，经生物公司合成后直接获得正确的整合片段.
(4)通过电转技术将上述质粒pcDNA3.1/Hygro-Caspase8-sgRNA和EGFP片段按1:1的比例共转到A549细胞中，发现大多数细胞带有绿色荧光(如图3)；
利用电转仪的电转程序，将电转质粒组合导入细胞中，电转后的细胞置于37℃、5％CO2培养箱中，电转后48～72h加入1μg/ml潮霉素进行阳性克隆筛选，连续筛选2～3次。
(5)通过流式细胞仪单细胞筛选EGFP表达的细胞，并扩增单克隆细胞系(如图7)；
先用96孔板在流式细胞仪单细胞筛选，每个96孔板可获得8-10个具有EGFP表达的细胞株，EGFP敲进效率达到7-10％，比本领域通常1％的敲进效率有显著提高。
扩增培养挑选的单克隆细胞系，提取并获得具有EGFP表达的细胞的基因组DNA，进行基因组PCR，获得阳性扩增说明插入成功，为Caspase8报告基因细胞系。PCR鉴定引物序列如下所示：
Caspase-8：
上游引物GAATTCCATATGATGGACTTCAGCAGAAATCTTT
下游引物ACGCGTCGACATCAGAAGGGAAGACAAG
Caspase-8-DED：
上游引物CATGCATGGGTTTCAGCAGAAATC
下游引物CCCAAGCTTTTCTTCATAGTCGTTG
其中，Caspase-8-DED是与受体结合的位点，形成FADD复合物。
(6)筛选获得的EGFP表达的细胞系进一步通过基因组PCR及免疫印迹方法鉴定Caspase8报告基因细胞系；
通过PCR鉴定比对结果如图4所示，获得了Caspase8基因细胞系，最后再将筛选获得的EGFP表达的细胞通过免疫印迹方法进一步鉴定阳性Caspase8报告基因细胞系，鉴定结果如图5所示，最终获得了5株Caspase8报告基因细胞系。图5a表明，在过表达组，Caspase8蛋白条带与低表达组比较明显加深；图5b表明，实验组与对照组Caspase8蛋白表达有统计学差异，且过表达组与低表达组之间也有明显表达差异P＜0.05。
(7)高内涵筛选药物拍照、获取图片；
Caspase8基因细胞系稳定传代20代后，测序显示，基因敲进序列依然保持遗传稳定。收集细胞用于流式分析的表达比例和高通量测序检测。
高内涵筛选方法如下：
1).将收集的约2×105个细胞用含1％蛋白酶K的Tris缓冲液(100mM NaCl、10mMTris、5mM EDTA、0.5％吐温20、10mg/mL蛋白酶K，pH＝8)重悬混匀，56℃孵育60min、95℃孵育10min使细胞充分裂解释放基因组DNA；短暂离心后，取1μL上清液进行PCR扩增；
3).利用PCR正向引物引入用于Illumina测序后数据分流的条形码，PCR热循环程序为：98℃2min，98℃5s、64℃5s、68℃5s、72℃15s，30个循环；PCR产物(200～300bp)采用1％琼脂糖凝胶电泳检测，混合来自不同样品的100ng PCR产物，使用150PE IlluminaHiSeq×10双端测序技术(Novogene)进行高通量测序；
4).处理荧光细胞，头一天将荧光细胞种到黑色底透的96孔板中，每孔8000个细胞，按一定浓度加入对应的孔中；
5).处理结束后，用凉的PBS处理细胞3次，再用4％的多聚甲醛使细胞稳固20min；
6).用DAPI给细胞染色15min，使细胞核着色，再用PBS洗3次；
7).加入少量PBS，使细胞处于湿润的环境中，长期保存；
8).高内涵拍照、获取图片，打开机器、电脑和显示屏电源开关；HCS Studio Scan；
9).按照以上顺序将孔板的A1孔对应机器A1标记处放入样品板，然后点击CTRL+OK；
10).等进入Configure Acquisition项时按照下列步骤设置对应的所需参数：选择相应的客观目标倍数；
11).点击物镜倍数,选光通道数，点击每个光通道，根据自己所需的劳光染料；
12).从屏幕的右上侧选择所对应的Form Factor(孔板类型)，用鼠标在孔板示意图中点击实际有待测样品的单孔；
13).点击屏幕右侧的获取图像；点击自动对焦；点击Auto Exposure，自动曝光，直到获得清晰的图像；
14).扫板结束后，点击Launch View查看本次拍照结果；
15).浏览、导出图片保存；
16).测序完成后，将原始数据进行质控处理，获得双端测序的高质量数据(cleandata)，用FLASH工具合并、并用Barcode splitter工具区分不同样品的数据；
17).使用CRISPR分析工具Cas-Analyzer对每个样本的编辑效率和各DNA修复事件进行分析：将每个扩增子的.fastq文件上传到Cas-Analyzer网页，分析结果包括总读取、不同插入缺失的读取数以及比例；俥
18)根据绿色荧光强度和百分比筛选具有功能的小分子化合物。
实施例2
Caspase8报告基因细胞系的功能验证：
设计特异靶向Caspase8基因小分子干扰RNA，分别转染Caspase8报告细胞系，48小时后，转录水平分析显示相对于未敲减对照，两条特异小分子干扰RNA均有效降低Caspase8基因表达水平；同时EGFP基因表达也随着Caspase8基因敲减而相应的降低了70-80％。实验结果如图6a和图6b所示，流式细胞仪检测表明，实验组与对照组凋亡发生率有一定的变化；该实验结果从分子水平证明了本发明构建的肺癌Caspase8报告基因细胞系中报告基因EGFP与Caspase8基因能够同步共表达，受到shRNA同步抑制，可以用于Caspase8基因的抑制或过表达的示踪。
如图3所示，采用不同浓度梯度的慢病毒刺激Caspase8报告基因细胞系48h后，荧光表达显著上调，且慢病毒用量越大，荧光的表达上调越显著。该实验结果从分子水平证明了本发明构建的肺癌Caspase8报告基因细胞系中报告基因EGFP与Caspase8基因能够同步共表达，受到shRNA同步抑制，可以用于Caspase8基因的抑制或过表达的示踪。图3中，上方横排的图示为低表达的Caspase8分别在100倍白光倒置显微镜及100倍荧光显微镜下的细胞表达图片；下方横排的图示为高表达的Caspase8分别在倒置显微镜及荧光显微镜下的细胞表达图片，实验表明，在A549细胞系中，Caspase8表达成功。
综上所述，本发明实施例提供了一种Caspase8报告基因细胞系及其构建方法和应用，该方法以Caspase8基因、利用CRISPR-Cas9基因编辑系统将绿色荧光蛋白基因敲入到细胞Caspase8基因的终止密码子前，表达荧光强度与Caspase8表达量成正相关、指示Caspase8的表达水平，构建的Caspase8报告基因细胞系可以用于Caspase8的表达调控研究，为发现Caspase8的表达调控因子、筛选靶向抗肿瘤小分子药物等提供了有力工具。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
序列表
<110> 左晖
云南省第一人民医院
<120> 一种Caspase8报告基因细胞系及其构建方法和应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caccgaggat ccttcaaata acttc 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caccgaagga tccttgagac tcttt 25
<210> 3
<211> 666
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgtctgctg aagtcatcca tcaggttgaa gaagcacttg atacagatga gaaggagatg 60
ctgctctttt tgtgccggga tgttgctata gatgtggttc cacctaatgt cagggacctt 120
ctggatattt tacgggaaag aggtaagctg tctgtcgggg acttggctga actgctctac 180
agagtgaggc gatttgacct gctcaaacgt atcttgaaga tggacagaaa agctgtggag 240
acccacctgc tcaggaaccc tcaccttgtt tcggactata gagtgctgat ggcagagatt 300
ggtgaggatt tggataaatc tgatgtgtcc tcattaattt tcctcatgaa ggattacatg 360
ggccgaggca agataagcaa ggagaagagt ttcttggacc ttgtggttga gttggagaaa 420
ctaaatctgg ttgccccaga tcaactggat ttattagaaa aatgcctaaa gaacatccac 480
agaatagacc tgaagacaaa aatccagaag tacaagcagt ctgttcaagg agcagggaca 540
agttacagga atgttctcca agcagcaatc caaaagagtc tcaaggatcc ttcaaataac 600
ttcaggatga taacacccta tgcccattgt cctgatctga aaattcttgg aaattgttcc 660
atgtga 666
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaattccata tgatggactt cagcagaaat cttt 34
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acgcgtcgac atcagaaggg aagacaag 28
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
catgcatggg tttcagcaga aatc 24
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cccaagcttt tcttcatagt cgttg 25
<210> 8
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Met Ser Ala Glu Val Ile His Gln Val Glu Glu Ala Leu Asp Thr Asp
1 5 10 15
Glu Lys Glu Met Leu Leu Phe Leu Cys Arg Asp Val Ala Ile Asp Val
20 25 30
Val Pro Pro Asn Val Arg Asp Leu Leu Asp Ile Leu Arg Glu Arg Gly
35 40 45
Lys Leu Ser Val Gly Asp Leu Ala Glu Leu Leu Tyr Arg Val Arg Arg
50 55 60
Phe Asp Leu Leu Lys Arg Ile Leu Lys Met Asp Arg Lys Ala Val Glu
65 70 75 80
Thr His Leu Leu Arg Asn Pro His Leu Val Ser Asp Tyr Arg Val Leu
85 90 95
Met Ala Glu Ile Gly Glu Asp Leu Asp Lys Ser Asp Val Ser Ser Leu
100 105 110
Ile Phe Leu Met Lys Asp Tyr Met Gly Arg Gly Lys Ile Ser Lys Glu
115 120 125
Lys Ser Phe Leu Asp Leu Val Val Glu Leu Glu Lys Leu Asn Leu Val
130 135 140
Ala Pro Asp Gln Leu Asp Leu Leu Glu Lys Cys Leu Lys Asn Ile His
145 150 155 160
Arg Ile Asp Leu Lys Thr Lys Ile Gln Lys Tyr Lys Gln Ser Val Gln
165 170 175
Gly Ala Gly Thr Ser Tyr Arg Asn Val Leu Gln Ala Ala Ile Gln Lys
180 185 190
Ser Leu Lys Asp Pro Ser Asn Asn Phe Arg Met Ile Thr Pro Tyr Ala
195 200 205
His Cys Pro Asp Leu Lys Ile Leu Gly Asn Cys Ser Met
210 215 220

Claims (4)

1.一种Caspase8报告基因细胞系的构建方法，其特征在于，其包括如下步骤：
(1)设计Caspase8基因上游位点特异性Caspase8-sgRNA序列并鉴定；
(2)利用步骤(1)中的序列构建pcDNA3.1/Hygro-Caspase8-sgRNA质粒；
(3)整合Caspase8基因的同源重组序列和EGFP报告基因片段，得到报告基因蛋白整合片段；
(4)将步骤(2)中所述质粒和步骤(3)中所述报告基因蛋白整合片段按1:1的比例共转染到肺癌细胞中；
(5)筛选EGFP表达的细胞，并扩增单克隆细胞系，得到EGFP表达的细胞系；
(6)筛选得到的EGFP表达的细胞系并鉴定，得到Caspase8报告基因细胞系；
所述Caspase8-sgRNA的序列如SEQ ID NO .2所示；
所述肺癌细胞为A549、NCI-H446、NCI-H460、NCI-H292、95-D或SPCA-1。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，检测Caspase8表达量所用的引物组包括如SEQ ID NO .4所示的上游引物和SEQ ID NO .5所示的下游引物。
3.一种Caspase8报告基因细胞系，其特征在于，其通过如权利要求1所述的Caspase8报告基因细胞系的构建方法构建而成。
4.一种如权利要求3所述的Caspase8报告基因细胞系在制备肺癌细胞模型中的应用。
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RNA干扰 caspase-8 基因及抑制细胞凋亡的作用;陈栋 等;实用医学杂志;第24卷(第3期);第340页右栏第3段-第241页右栏第1段 *

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