CN114451361A - 一种检测花粉对蜜蜂的营养价值的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及蜜蜂养殖技术领域，具体涉及一种检测花粉对蜜蜂的营养价值的方法。本发明提供的检测花粉对蜜蜂营养价值的方法包括：采用包含基础日粮、待测花粉和5‑乙炔基‑2'‑脱氧尿苷(EdU)的日粮饲喂蜜蜂幼虫，检测蜜蜂幼虫EdU阳性中肠上皮细胞的细胞核大小，根据细胞核大小判断待测花粉对蜜蜂的营养价值高低。本发明的检测方法以蜜蜂幼虫中肠上皮细胞的细胞核面积作为花粉对蜜蜂营养价值的评价指标，具有检测周期短、操作简单、灵敏度和准确性较高的优势，为花粉对蜜蜂营养价值的评价提供了有效的方法，适于推广应用。

Description

一种检测花粉对蜜蜂的营养价值的方法
技术领域
本发明涉及蜜蜂养殖技术领域，具体涉及一种检测花粉对蜜蜂的营养价值的方法。
背景技术
蜜蜂是一种完全变态昆虫，其生长发育需要经历卵—幼虫—蛹—成虫四个阶段。蜜蜂主要的食物是花蜜与花粉，因此花粉对蜜蜂尤其重要。蜂群中工蜂和幼虫生长发育所需的蛋白质主要由花粉提供，花粉对维持蜂群正常的生长、发育和繁殖具有不可替代的作用。蜂群内花粉的短缺会造成蜂群营养供给不足，出现幼虫发育不良或被拖拽出巢、成年蜂生长受阻、泌蜡和泌浆能力下降、蜂王产卵能力下降以及蜂群易感染病害等现象，严重时还会导致蜂王停止产卵，幼虫发育停滞，进一步导致蜂群群势下降等。蜜蜂主要在幼虫和繁殖时期消耗花粉。不同种类花粉对蜜蜂的营养价值不同，如向日葵花粉、玉米花粉和松属花粉会阻碍幼虫的发育，缩短寿命；使用油菜花粉进行饲喂能够延长意大利蜜蜂工蜂的寿命；食用栗属花粉和悬钩子属花粉的幼虫比食用向日葵属和岩蔷薇属花粉的幼虫体重更重。茶花粉和油菜花粉饲喂的6日龄工蜂幼虫虫体蛋白质含量显著高于荷花粉和玉米花粉(高丽娇,刘佳霖,罗文华,等.不同蜂花粉对意大利蜜蜂蜂群繁殖和工蜂发育的影响[J].动物营养学报,2019,31(10):4630-4636.)。芸苔属花粉饲喂的幼虫体型比毛连菜属、常春藤属、苋属、茄属、向日葵属和禾本科花粉饲喂的幼虫体型更大。蒲公英花粉由于缺乏氨基酸而不适合用来饲养幼虫。因此，花粉营养价值的高低直接影响蜜蜂的生长发育，决定了蜂群的盛衰。
目前，国际通用的评价花粉营养价值的方法主要采用蛋白质含量、化学评分(CS)、必需氨基酸指数(EAAI)、氨基酸比值系数分(SRCAA)、生物价(BV)和营养指数(NI)等指标进行综合评价。然而，评价不同花粉对蜜蜂的营养价值不仅仅是评价花粉本身的营养价值，更需要考虑到蜜蜂对花粉营养成分的消化吸收能力，但国际通用的营养价值评价方法没有考虑蜜蜂对花粉的消化吸收效率，无法准确地反映不同花粉对蜜蜂的营养价值。
花粉饲养试验是一种评价不同花粉对蜜蜂营养价值的经典方法，在蜂群饲养试验中以蜂群群势和封盖子量、蜂群采集活性来评价不同蜂花粉对蜂群的影响。实验室花粉饲养试验包括对幼虫的饲养和成蜂的饲养，进行花粉营养价值评价所用指标通常是与蜜蜂生长发育相关的指标，在蜜蜂的成蜂方面包括评估工蜂寿命、工蜂初生重、蜂体总蛋白含量、肠道蛋白水解活性、卵巢的发育、营养素含量指标(如蛋白质或氨基酸)、寿命、花粉消耗和消化、血淋巴指数和组织化学方面；在蜜蜂幼虫方面包括幼虫的存活率、预蛹体重、发育程度以及对目标花粉的消化率，但这些实验实验周期较长，饲养蜜蜂幼虫至预蛹期就需要8天左右，而且在饲养试验过程中容易受到包括饲养环境的温度、湿度、污染程度和试验人员的操作技术等多种因素的影响，从而对实验结果的精确度产生不利影响。因此，建立一种快速并准确地评价花粉对蜜蜂的营养价值的方法是非常必要的。
中肠是蜜蜂体内重要的器官之一，是有害细菌、病毒、毒素以及食物和水的入口，同时也是进行消化和吸收的主要部位。昆虫中肠通常分为消化细胞、内分泌细胞和再生细胞。在幼虫时期，幼虫的中肠的生长主要依靠细胞的增大和再生细胞的分化。消化细胞通常为核内多倍体，细胞只复制基因组而不发生分裂。而这种现象有利于细胞对营养物质的吸收储存以及蛋白质的合成(Lee H O,Davidson J M,Duronio R J.Endoreplication:polyploidy with purpose[J].Genes&development,2009,23(21):2461-2477.)。幼虫中肠细胞生长发育受到花粉营养影响较大，因此，花粉的营养会显著影响中肠壁的厚度。研究表明，蜜蜂对茶花粉中的蛋白质消化吸收比油菜花粉多，表现为食用茶花粉比油菜花粉的意大利蜜蜂成年工蜂的中肠壁更厚，围食膜更薄(Wang Y,Ma L T,Hang X B,etal.Digestion of protein of two pollen types in China by the honeybee(Apismellifera L)[J].Apidologie,2014,45(5):590-600.)。然而，测量中肠壁和中肠内围食膜厚度首先需要对中肠进行切片，切片时需要先使用包埋剂进行包埋、经冷冻后放置在切片机内进行切片，操作程序复杂，耗费时间较长，操作难度较高，试验失败率较高，而且日龄较小的幼虫中肠切片样品小，试验操作难度更大。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速检测花粉对蜜蜂的营养价值的方法。
本发明的主要构思如下：蜜蜂在幼虫时期取食的花粉多于成蜂时期，并且幼虫比成蜂对摄入的物质更加敏感，因此本发明选择幼虫饲养试验检测花粉对蜜蜂的营养价值。本发明在进行不同花粉对意大利蜜蜂工蜂幼虫生长发育的研究中发现，即便蛋白质含量相似的花粉，蜜蜂幼虫对不同花粉的消化率也存在明显差异，而且幼虫中肠的大小存在明显差异，表现为幼虫中肠上皮细胞的大小存在差异。但是，检测幼虫中肠大小或中肠上皮细胞大小的步骤较为繁琐且精准性较差，因此需要检测方法更为简便且精准性更高的检测指标。本发明通过进一步研究意外地发现，饲喂不同营养价值的花粉后，蜜蜂幼虫的中肠上皮细胞的细胞核大小也存在明显差异，而且细胞的细胞核大小可采用EdU检测技术进行标记和较为准确的检测，方法简单易行且准确性较高，经验证，蜜蜂幼虫的EdU阳性中肠上皮细胞的细胞核大小可作为蜜蜂中肠发育的衡量指标，用于花粉对蜜蜂营养价值的评价。
基于上述发现，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供蜜蜂幼虫中肠上皮细胞在检测花粉对蜜蜂的营养价值中的应用。
上述应用中，通过检测待测花粉对蜜蜂幼虫中肠上皮细胞的细胞核大小的影响，判断待测花粉对蜜蜂的营养价值。
优选地，通过对蜜蜂幼虫饲喂包含基础日粮、待测花粉和5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EdU)的日粮并检测蜜蜂幼虫EdU阳性中肠上皮细胞的细胞核大小，判断待测花粉对蜜蜂的营养价值。
第二方面，本发明提供蜜蜂幼虫中肠上皮细胞的细胞核大小在作为花粉对蜜蜂的营养价值的检测指标中的应用。
本发明所述的中肠上皮细胞为除再生细胞以外的其他中肠上皮细胞。优选为消化细胞或内分泌细胞。
优选地，所述中肠上皮细胞为采用包含基础日粮、待测花粉和EdU的日粮饲喂蜜蜂幼虫后，EdU阳性的中肠上皮细胞。
蜜蜂幼虫具有在4日龄时才开始食用花粉的特性，因此，上述应用中，所述蜜蜂幼虫为≥4日龄的幼虫。
以上所述的应用中，所述细胞核大小为细胞核面积。优选为在激光共聚焦显微系统下一个细胞核光切面的面积。本发明发现，以细胞核的面积表征细胞核大小更能够准确地反映花粉对蜜蜂的营养价值，蜜蜂幼虫EdU阳性中肠上皮细胞的细胞核面积越大，则饲喂的待测花粉对蜜蜂的营养价值越高，反之，则饲喂的待测花粉对蜜蜂的营养价值较低。
第三方面，本发明提供一种检测花粉对蜜蜂的营养价值的方法，所述方法包括：采用包含基础日粮、待测花粉和5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EdU)的日粮饲喂蜜蜂幼虫，检测蜜蜂幼虫EdU阳性中肠上皮细胞的细胞核大小，根据细胞核大小判断待测花粉对蜜蜂的营养价值高低。
优选地，所述蜜蜂幼虫为≥4日龄的幼虫。
所述细胞核大小为细胞核面积。优选为在激光共聚焦显微系统下一个细胞核光切面的面积。
所述中肠上皮细胞为除再生细胞以外的其他中肠上皮细胞。优选为消化细胞或内分泌细胞。
上述方法中，所述日粮中，待测花粉与基础日粮的比例优选为(1-5)mg：(20-60)μL；EdU与待测花粉和基础日粮的总质量的质量比为1:(800-1500)。
上述方法中，所述基础日粮可为常用的蜜蜂饲养试验的基础日粮，例如：包含蜂王浆和糖溶液的基础日粮。
优选的基础日粮配方如下：蜂王浆48-52％，无水葡萄糖12-18％，无水蔗糖12-18％，酵母提取物2-5％，水余量。
由于细胞在经过G1、S、G2期后能够完成细胞核内DNA的复制和合成，因此可按照上述周期检测幼虫中肠上皮细胞的细胞核大小。
优选地，在每次饲喂后22-26h(优选为24h)，检测蜜蜂幼虫EdU阳性中肠上皮细胞的细胞核大小。
进一步优选地，对4日龄的蜜蜂幼虫，采用包含待测花粉、EdU和基础日粮的日粮饲喂蜜蜂幼虫至6日龄，于每次饲喂后22-26h检测蜜蜂幼虫EdU阳性中肠上皮细胞的细胞核大小。
作为本发明的优选方案，将经卵期孵化后第2日龄的幼虫进行人工饲养，在4日龄前对幼虫饲喂无花粉的基础日粮，从4日龄开始饲喂包含基础日粮、待测花粉和EdU的日粮，于4日龄、5日龄和6日龄各饲喂一次，每次饲喂后22-26h检测蜜蜂幼虫EdU阳性中肠上皮细胞的细胞核大小。
为更好地保证花粉采食，优选在开始饲喂待测花粉的前1天不进行饲喂。
蜜蜂幼虫的人工饲养优选在35℃，95％RH的条件下进行。
上述方法中，所述细胞核大小的检测方法为：对蜜蜂幼虫的中肠进行荧光染色，检测EdU阳性中肠上皮细胞的细胞核面积。
优选地，利用EdU检测技术对中肠上皮细胞进行标记和荧光染色，并使用激光共聚焦显微系统对中肠上皮细胞的细胞核进行观察和拍摄，统计和分析食用不同花粉后幼虫EdU阳性中肠上皮细胞的细胞核面积的差异，并利用细胞核面积的大小差异反映幼虫中肠上皮细胞对营养物质的吸收和储存，从而评价不同花粉对蜜蜂的营养价值。通过EdU检测技术将只食用基础日粮的幼虫与食用添加待测花粉的基础日粮的幼虫的EdU阳性中肠上皮细胞的细胞核面积进行比较，可以高效快速地评价待测花粉对蜜蜂的营养价值。
上述方法以每一日(24h)作为一个阶段来观察幼虫EdU阳性中肠上皮细胞的细胞核大小，并进行多个阶段的实验。完成EdU标记后的幼虫24h后可进行固定并荧光染色，1.5-2h即可完成对中肠上皮细胞的荧光染色，不再需要中肠切片这一步骤，有效缩短了检测所需时间，同时避免了切片步骤对样品带来的损害。
上述方法中，对蜜蜂幼虫的中肠进行荧光染色包括：将蜜蜂幼虫置于固定液中进行固定，固定完成后解剖幼虫，取出中肠并将内容物清理干净，使用EdU检测试剂盒对中肠进行荧光染色，再使用DAPI荧光染色试剂对中肠进行复染。
在荧光染色结束后，使用激光共聚焦显微系统对染色完成的中肠行进行观察和拍摄。EdU试剂盒可以将中肠上皮细胞的细胞核染成荧光绿色，通过激光共聚焦显微系统的GFP通道可进行观察和拍摄；而DAPI试剂可以将所有细胞核染成荧光蓝色，通过激光共聚焦显微系统的DAPI通道可以进行观察和拍摄。为了避免假阳性的出现，两个通道共同叠加的细胞核为EdU阳性的细胞。
上述方法中，待测花粉对蜜蜂的营养价值的判断标准如下：蜜蜂幼虫EdU阳性中肠上皮细胞的细胞核面积越大，则饲喂的待测花粉对蜜蜂的营养价值越高。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的方法首次基于评估蜜蜂幼虫中肠上皮细胞的EdU阳性细胞来评价花粉对蜜蜂的营养价值，首次以蜜蜂幼虫EdU阳性中肠上皮细胞的细胞核面积作为花粉对蜜蜂营养价值的评价指标。本发明提供的花粉对蜜蜂营养价值的检测方法具有以下优势：
1、检测周期短、操作简单：完成EdU标记后的幼虫24h后可以进行固定并对细胞荧光染色，1.5-2h则可以完成对中肠上皮细胞的荧光染色，蜜蜂幼虫的饲养周期缩短且评价指标检测所需时间也明显缩短，而且不涉及中肠切片的制备步骤，操作更加简便，适于推广应用。
2、灵敏度高和准确性高：被EdU标记的细胞只要发生DNA复制，经荧光染色的细胞核既可被观察到，荧光染色的准确度高，被荧光染色的细胞核更容易清晰地进行观察，假阳性染色概率低，使得细胞核的面积大小检测结果更为灵敏、准确，为花粉对蜜蜂营养价值的评价提供了有效的方法。
附图说明
图1为本发明实施例1的花粉对蜜蜂营养价值的检测方法的流程示意图。
图2为本发明实施例1中在激光共聚焦显微系统下拍摄的蜜蜂EdU阳性中肠上皮细胞的细胞核荧光染色图，其中，rn为再生细胞巢，n为细胞核。
图3为本发明实施例1中蜜蜂EdU阳性中肠上皮细胞的细胞核荧光染色的DAPI通道图(DAPI)、GFP通道图(EdU)以及两者的叠加图(Merge)示例图。
图4为本发明实施例2中油菜花粉、杏花粉、梨花粉组和无花粉组的幼虫中肠前部EdU阳性细胞的图像对比(40X)。
图5为本发明实施例2中油菜花粉、杏花粉、梨花粉组和无花粉组的幼虫中肠前部EdU阳性细胞的平均细胞核面积的分析统计柱状图，其中，不同的小写字母表示组间具有显著性差异(P<0.05)，相同的小写字母表示组间无显著性差异(P>0.05)。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中涉及的仪器与试剂的信息如下：激光共聚焦显微镜系统(Leica TCSSP8990000)，德国Leica公司；
Figure BDA0003520909190000083
EdU Cell Proliferation Kit for Imaging，美国Invitrogen公司；PBS溶液，中国索莱宝科技有限公司；BSA牛血清白蛋白，中国索莱宝科技有限公司；4％细胞组织固定液，中国索莱宝科技有限公司；DAPI，德国Merck KgaA集团。
实施例1
本实施例提供一种检测花粉对蜜蜂营养价值的方法，具体步骤如下(流程示意图如图1所示)：
1、饲喂和标记：选取意大利蜜蜂工蜂幼虫为实验对象，从意大利蜜蜂蜂箱中将从卵期孵化后第2日龄的幼虫随机移至放置有基础日粮A的无菌的孔板内并放置于35℃，95％RH的饲养箱内进行饲养。由于基础日粮A的饲喂量较充足，并为了使幼虫第4日龄开始食用花粉，并能够尽量多地摄入待测花粉，对孵化后第3日龄的幼虫不进行任何饲喂。对4日龄的幼虫饲喂添加待测花粉的基础日粮B，无花粉组的幼虫只饲喂基础日粮B，同时以1:1000的比例混入
Figure BDA0003520909190000082
EdU Cell Proliferation Kit for Imaging中的EdU试剂并饲喂给幼虫。以24h为一次检测时间，在饲喂添加了EdU试剂的日粮后24h，同时取出各组已被EdU试剂标记的幼虫，将幼虫放入4％的细胞组织固定液中进行固定。
上述日粮的配方及其饲喂方法分别如表1和表2所示。
表1基础日粮配方表(参考Karin et al.,2015)
Figure BDA0003520909190000081
Figure BDA0003520909190000091
表2幼虫饲喂表(参考Karin et al.,2015)
Figure BDA0003520909190000092
2、解剖：对已固定的幼虫进行解剖，将中肠完整取出，除掉中肠内容物。
3、荧光染色:
(1)每个1.5ml离心管放置1个中肠样品；
(2)每个离心管中加入1ml 3％BSA in PBS(pH 7.2-7.6)洗涤液对中肠进行清洗，除去固定液；
(3)去除洗涤液，每个离心管加入1ml 0.5％Triton in PBS溶液，黑暗条件下渗透20min；
(4)去除渗透液，每个离心管加入1ml 3％BSA in PBS(pH7.2-7.6)洗涤液，洗涤两次，去除洗涤液；
(5)根据
Figure BDA0003520909190000093
EdU试剂盒的比例和顺序制备Click-iT荧光染液，每个离心管加入200μL含有荧光染液的Click-iT反应液。黑暗条件下染色30min；
(6)去除Click-iT反应液，加入1ml 3％BSA in PBS(pH7.2-7.6)洗涤液，洗涤两次；
(7)去除洗涤液，加入1ml PBS缓冲液进行洗涤，洗涤两次；
(8)去除PBS缓冲液，加入1X DAPI染液，黑暗条件下染色30min；
(9)去除DAPI染液，加入1ml PBS缓冲液进行洗涤5min，重复两次；
(10)将染色完成的中肠样品平铺在载玻片上，滴加GD(70％甘油与2.5％三乙烯二胺混合)防荧光猝灭溶液，盖片并使用透明甲油封片。
4、观察和拍摄：使用激光共聚焦显微镜系统的DAPI和GFP通道分别去观察EdU阳性中肠上皮细胞(消化细胞或内分泌细胞)的细胞核大小，用Leica Application Suite X(LAS X)软件进行扫描拍摄，图片尺寸40X，分别拍摄DAPI通道图、GFP通道图和两者的叠加图(图2和图3)。
为了对EdU阳性中肠上皮细胞的细胞核面积大小进行更准确的对比，选择幼虫的中肠前部区域进行对比。使用激光共聚焦显微系统对幼虫中肠前部区域进行随机拍照，每个花粉组重复10只幼虫，每个中肠样品随机拍照5张。通过GFP通道可以观察到显示绿色荧光的EdU阳性细胞的细胞核，通过DAPI通道可以观察到显示蓝色荧光的所有细胞核。为了避免假阳性，所统计的EdU阳性细胞的细胞核为GFP和DAPI通道重叠的细胞核。
5、数据处理：使用ImageJ软件计算边缘清晰的EdU阳性中肠上皮细胞的细胞核面积。幼虫EdU阳性中肠上皮细胞的细胞核面积的差异使用正态性检验(K-S检验)后的单因素方差分析(ANOVA)。
6、花粉对蜜蜂营养价值的判断：根据幼虫EdU阳性中肠上皮细胞的细胞核面积的差异大小判断花粉对蜜蜂的营养价值。
实施例2
本实施例利用实施例1提供的检测花粉对蜜蜂营养价值的方法进行不同花粉对蜜蜂营养价值的评价，待测花粉分别为油菜花粉、杏花粉和梨花粉，具体如下：
饲喂组分为油菜花粉组、杏花粉组、梨花粉组和无花粉组。将基础日粮、各待测花粉与EdU试剂混合，在幼虫孵化后第4日龄分别饲喂给幼虫，饲喂后24h将幼虫放置于4％组织固定液中进行固定。与上述饲喂方法一样，在孵化后第5日龄、孵化后第6日龄同一时间分别饲喂基础日粮、各待测花粉与EdU试剂的混合物，并在饲喂后24h将幼虫放入固定液中进行固定，可以分别得到共三个幼虫发育阶段EdU阳性中肠上皮细胞被标记的幼虫样本，三个幼虫发育阶段的幼虫样本分别记作Sample 1(S1)、Sample 2(S2)和Sample 3(S3)。
各时间段幼虫EdU阳性中肠上皮细胞的细胞核面积大小的统计结果如表3所示。
表3食用不同花粉的幼虫EdU阳性中肠上皮细胞的平均细胞核面积的变化
Figure BDA0003520909190000111
对于油菜花粉(图4和图5)，在S1阶段中，油菜花粉组的幼虫EdU阳性中肠上皮细胞的平均细胞核面积为(1268.19±48.06)μm2，无花粉组为(990.52±12.98)μm2。与无花粉组相比具有显著差异(P<0.05)。油菜花粉组的幼虫比无花粉组幼虫的EdU阳性中肠上皮细胞的细胞核面积大28.03％。幼虫食用油菜花粉后比不食用花粉的幼虫EdU阳性中肠上皮细胞的细胞核更大，在第一天饲喂花粉后能够更明显地体现出来，说明孵化后第4日龄幼虫在食用油菜花粉1天后其积累的营养比不食用花粉的幼虫更好。
对于杏花粉(图4和图5)，在S1、S2、S3这三个阶段中，杏花粉组的幼虫EdU阳性中肠上皮细胞的细胞核面积与无花粉组的幼虫相比均没有出现显著性差异(P>0.05)。幼虫食用杏花粉后EdU阳性中肠上皮细胞的细胞核大小与不食用花粉的幼虫相差极小，说明幼虫在食用杏花粉后其生长发育与不食用花粉的幼虫相同。
对于梨花粉(图4和图5)，在S3阶段中，梨花粉组的幼虫EdU阳性中肠上皮细胞的细胞核面积为(1592.75±177.77)μm2，无花粉组为(2598.64±107.56)μm2。与无花粉组相比具有极显著性差异(P<0.01)。梨花粉组的幼虫比无花粉组幼虫的EdU阳性中肠上皮细胞的细胞核面积小63.15％。幼虫食用梨花粉后EdU阳性中肠上皮细胞的细胞核比不食用花粉的幼虫更小，在经三次饲喂花粉后能够更加明显地体现出来，表明幼虫在食用梨花粉后积累的营养物质更少，与不食用花粉的幼虫相比，食用梨花粉的幼虫其生长发育受到不利影响。
综上所述，幼虫在首次食用花粉后的S1阶段中发现油菜花粉组的幼虫比其他花粉组的幼虫EdU阳性中肠上皮细胞的细胞核面积显著增大(P<0.05)，这一结果说明了饲喂油菜花粉的幼虫中肠在对营养物质的吸收和储存，以及在蛋白质的合成方面比其他花粉组的幼虫更好，在幼虫早期阶段饲喂花粉日粮，饲喂油菜花粉能够促进幼虫对油菜花粉中营养物质的积累；在对幼虫饲喂花粉三次后的S3阶段中发现食用梨花粉的幼虫EdU阳性中肠上皮细胞的细胞核面积显著小于其他花粉组的幼虫(P<0.05)。这一结果说明了幼虫对梨花粉中营养物质的积累较差，而这种负面的影响在多次饲喂后能够更明显地体现出来。食用杏花粉后的幼虫与只食用基础日粮的幼虫没有差异。相对于杏花粉、梨花粉和基础日粮来说，油菜花粉对蜜蜂的营养价值要更高。梨花粉则对蜜蜂具有较差的营养价值，不利于蜜蜂幼虫的生长和发育。
已有研究报道相对于梨花粉，意大利蜜蜂工蜂更偏向取食杏花粉，取食杏花粉的工蜂卵巢发育的程度也比取食梨花粉的工蜂卵巢发育更成熟(Lan J,Ding G L,Ma W H,etal..Pollen source affects development and behavioral preferences in honeybees[J].Insects,2021,12,130.)。上述结果证实了幼虫对杏花粉中营养物质的吸收和储存比梨花粉更好，这可能是蜜蜂更偏爱取食杏花粉的重要原因之一。油菜花粉已被证实相对于其他花粉更能延长蜜蜂的寿命和增加蜜蜂的体重(盖琴宝,周志勇,张红,等.地熊蜂蜂群发育性状评价及其饲料花粉配比优化[J].应用昆虫学报,2015,52(2):10.高丽娇,刘佳霖,罗文华,等.不同蜂花粉对意大利蜜蜂蜂群繁殖和工蜂发育的影响[J].动物营养学报,2019,31(10):7.)。上述结果证实了与杏花粉和梨花粉相比，油菜花粉的营养价值更高。因此，本发明的检测花粉对蜜蜂营养价值的方法对于花粉营养价值的检测结果具有较高的准确性，且具有操作简单、检测周期短等优势。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.蜜蜂幼虫中肠上皮细胞在检测花粉对蜜蜂的营养价值中的应用。
2.蜜蜂幼虫中肠上皮细胞的细胞核大小在作为花粉对蜜蜂的营养价值的检测指标中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述中肠上皮细胞为除再生细胞以外的其他中肠上皮细胞，和/或，所述蜜蜂幼虫为≥4日龄的幼虫。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述细胞核大小为细胞核面积。
5.一种检测花粉对蜜蜂的营养价值的方法，其特征在于，包括：采用包含基础日粮、待测花粉和5-乙炔基-2'-脱氧尿苷的日粮饲喂蜜蜂幼虫，检测蜜蜂幼虫EdU阳性中肠上皮细胞的细胞核大小，根据细胞核大小判断待测花粉对蜜蜂的营养价值高低。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述蜜蜂幼虫为≥4日龄的幼虫；
和/或，所述细胞核大小为细胞核面积；
和/或，所述中肠上皮细胞为除再生细胞以外的其他中肠上皮细胞。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述日粮中，待测花粉与基础日粮的比例为(1-5)mg：(20-60)μL；5-乙炔基-2'-脱氧尿苷与待测花粉和基础日粮的总质量的质量比为1:(800-1500)。
8.根据权利要求5～7任一项所述的方法，其特征在于，在每次饲喂后22-26h检测蜜蜂幼虫EdU阳性中肠上皮细胞的细胞核大小；
优选地，对4日龄的蜜蜂幼虫，采用包含待测花粉、5-乙炔基-2'-脱氧尿苷和基础日粮的日粮饲喂蜜蜂幼虫至6日龄，于每次饲喂后22-26h检测蜜蜂幼虫EdU阳性中肠上皮细胞的细胞核大小。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述细胞核大小的检测方法为：对蜜蜂幼虫的中肠进行荧光染色，检测EdU阳性中肠上皮细胞的细胞核面积。
10.根据权利要求5～9任一项所述的方法，其特征在于，所述判断待测花粉对蜜蜂的营养价值高低的标准如下：蜜蜂幼虫EdU阳性中肠上皮细胞的细胞核面积越大，则待测花粉对蜜蜂的营养价值越高。
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