CN114441767B - 一种thbs1和thbs3蛋白作为检测急性心肌梗死的生物标志物的用途 - Google Patents

一种thbs1和thbs3蛋白作为检测急性心肌梗死的生物标志物的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种THBS1和THBS3蛋白作为检测急性心肌梗死的生物标志物的用途，属于生物医学技术领域，本发明通过蛋白质组学结果显示，外周血浆中THBS1与THBS3蛋白在急性心梗患者中低表达，并通过扩大患者的样本数量来验证THBS1与THBS3蛋白质组学的结果，明确以上两种蛋白可以作为诊断急性心肌梗死的分子标志物。本发明的优点在于：(1)外周血的标本易获得，省时省力；(2)实验简单易操作；(3)寻找到诊断治疗急性心肌梗死新的干预靶点；(4)为今后急性心肌梗死的治疗和改善预后提供了新的方向；(5)为精准医学提供了新的思路。

Description

一种THBS1和THBS3蛋白作为检测急性心肌梗死的生物标志物 的用途
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，特别是涉及一种THBS1和THBS3蛋白作为检测急性心肌梗死的生物标志物的用途。
背景技术
心血管疾病是人类发病率和死亡率的主要原因，急性心肌梗死(AMI)是世界范围内发生的最严重的心血管疾病之一。同时AMI也被认为是全世界心血管疾病致残和死亡率的主要原因之一，并且是人类健康的主要威胁。近年来，心血管发病率仍持续升高，目前心血管病死亡占城乡居民总死亡原因的首位。因此，提高AMI的防治和诊疗已经刻不容缓。
AMI是由多种因素相互作用的结果，包括遗传、环境因素等。此外，AMI的发病表现出明显的家族聚集性，遗传因素在其发生和发展中发挥重要作用。因此，早期获取准确的急性心肌梗死遗传生物标志物可以使患者及时地进行早期诊断，从而做出正确的治疗决策。因此，寻找新的分子标志物对于AMI的早期诊断、及时预警、早期干预和改善AMI预后具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种THBS1和THBS3蛋白作为检测急性心肌梗死的生物标志物的用途，以解决上述现有技术存在的问题，通过检测患者外周血浆中THBS1和THBS3蛋白的表达，可为AMI患者的早期诊断、及时治疗提供可靠的依据，并为疾病今后的治疗提供了干预靶点。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种THBS1和/或THBS3蛋白用于制备急性心肌梗死的诊断产品的用途。
血小板反应蛋白1(THBS1)与血小板反应蛋白3(THBS3)都属于血小板反应蛋白(THBS)家族。二者均属于糖蛋白，可参与血管壁的许多过程，包括平滑肌细胞增殖、内皮细胞增殖和迁移。本发明蛋白质组学结果显示，外周血浆中THBS1与THBS3蛋白在急性心梗患者中低表达，并通过扩大患者的样本数量来验证THBS1与THBS3蛋白质组学的结果，明确以上两种蛋白可以作为诊断急性心肌梗死的分子标志物。
进一步地，所述THBS1和/或THBS3蛋白作为生物标志物。
进一步地，所述急性心肌梗死的诊断产品用于急性心肌梗死的判断、治疗方案的选择、和/或预后评估。
进一步地，所述急性心肌梗死的诊断产品包括急性心肌梗死检测试剂，所述急性心肌梗死检测试剂为特异性检测THBS1和/或THBS3蛋白的试剂。
进一步地，所述THBS1和/或THBS3蛋白为外周血血浆来源。
进一步地，所述THBS1和/或THBS3蛋白在急性心肌梗死患者中呈现低表达。
本发明还提供一种急性心肌梗死检测试剂盒，所述急性心肌梗死检测试剂盒中至少包括急性心肌梗死检测试剂，所述急性心肌梗死检测试剂选自特异性检测THBS1和/或THBS3蛋白的试剂。
进一步地，所述急性心肌梗死检测试剂盒为ELISA检测试剂盒。
进一步地，所述特异性检测THBS1和/或THBS3蛋白的试剂包括：人THBS1和/或THBS3蛋白捕获抗体、HRP标记的检测抗体。
本发明公开了以下技术效果：
本发明的优点在于：(1)外周血的标本易获得，省时省力；(2)实验简单易操作；(3)寻找到诊断治疗急性心肌梗死新的干预靶点；(4)为今后急性心肌梗死的治疗和改善预后提供了新的方向；(5)为精准医学提供了新的思路。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为THBS1蛋白标准曲线；
图2为THBS3蛋白标准曲线；
图3为THBS1蛋白表达量；
图4为THBS3蛋白表达量；
图5为THBS1蛋白ROC曲线；
图6为THBS3蛋白ROC曲线；
图7为外周血白细胞中THBS1、THBS3基因的RT-PCR扩增曲线；
图8为外周血白细胞中THBS1、THBS3基因的RT-PCR溶解曲线；
图9为THBS1蛋白组学结果；
图10为THBS3蛋白组学结果；
图11为蛋白质热图；其中，T2为稳定型冠心病组，T3为急性心肌梗死组，C1为健康组。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
1.实验对象
本研究中，选取了2017年1月-2019年1月在吉林大学中日联谊医院心内科住院的112名急性心肌梗死(AMI)患者为实验组。
AMI的诊断基于欧洲心脏协会2017年发布的全球心肌梗死定义，即冠状动脉造影证实存在明确的血管病变，主冠状动脉(左冠状动脉和右冠状动脉等)和主要分支(回旋支和前降支等)严重狭窄和闭塞。
AMI的排除标准如下：(1)继发于缺血性失衡的心肌梗塞；(2)血清生化标志物(肌钙蛋白和肌红蛋白)无法获得的心肌梗塞；(3)经皮冠状动脉介入治疗或支架内血栓形成相关的心肌梗死；(4)冠状动脉旁路移植相关的心肌梗塞。
选取111名稳定型冠状动脉疾病(SCAD)为对照组，SCAD的纳入标准符合加拿大心血管疾病协会关于定义SCAD的4级标准，如下所示：I级，一般体力活动(例如，步行和爬楼梯)不受限制，但在强烈、快速或持续运动时会发生心绞痛；II级，一般体力活动略有限制，心绞痛会在快步走时、饭后、寒冷的条件下、精神紧张时或醒来后数小时内发作；一般来说，体力活动仅限于步行200m以上或爬一段楼梯；III级，一般体力活动明显受限，步行200米以内或爬楼梯都会引起心绞痛；IV级，轻度活动或休息时可发生心绞痛。SCAD组患者接受心脏常规彩超检查排除心脏血栓形成和心力衰竭。
2.实验方法
实验组与对照组患者入院后采集患者的外周血，放入含EDTA的抗凝管中，采集后30分钟内通过离心分离出血浆，放-80℃冰箱保存。
按照ELISA试剂盒(上海酶连生物)的步骤进行后续实验。操作流程如下：
(1)从室温平衡60min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
(2)设置标准品孔、空白孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL。
(3)样本孔中加待测样本50μL，空白孔加样本稀释液50μL。
(4)空白孔、标准品孔、样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃恒温箱温育60min。
(5)弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液(350μL)，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸拍干，重复5次。
(6)每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
(7)每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。
根据空白孔、标准品孔OD值绘制标准曲线，应用标准曲线得到样品的蛋白质浓度。实验组与对照组每个样本均重复3次。
3.统计分析方法
数据分析使用SPSS25.0统计软件。组间比较采用独立t检验和秩和检验。符合正态分布的测量数据表示为均值±标准差，不符合正态分布的计量资料用中位数和四分位数表示。采用二元logistic回归分析方法分析AMI的相关危险因素。
4.结果
THBS1和THBS3蛋白的标准曲线如图1和图2所示。ELISA检测结果如图3和图4所示。
ELISA实验结果表明AMI患者中THBS1蛋白的表达是SCAD组的0.79倍(P＝0.000)，THBS3蛋白的表达是SCAD组的0.82倍(P＝0.000)，THBS1与THBS3均在AMI中呈现低表达。二元逻辑回归分析表明人外周血浆中THBS1与THBS3在蛋白水平的低表达是AMI的独立危险因素。
5.THBS1和THBS3蛋白指标敏感性和特异性检验
(1)外周血淋巴细胞cDNA合成：
血液总RNA试剂盒用于提取淋巴细胞的总RNA。为避免RNA降解或污染，提取过程严格按照试剂盒说明书进行。RNA溶液的质量通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。可见28S和18SrRNA条带，28S rRNA条带的亮度约为18S rRNA的2倍。标准样品的浓度和吸光度由酶标仪测定。满足要求后进行逆转录。
按照逆转录试剂盒说明书，对符合实验要求的总RNA进行逆转录，并在每个样品中加入一致浓度的RNA。获得的DNA样品储存在-80℃下，用于后续的荧光、定量、聚合酶链反应检测。
(2)逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)检测
将得到的DNA样品稀释20倍后，使用SYBR荧光定量试剂盒进行PCR扩增。GAPDH作为内参基因，FFAR2作为靶基因。扩增条件的特异性通过使用ABI-FAST7500仪器的软件溶解曲线确定。使用的RT-PCR引物的序列见下表：
Figure BDA0003451073170000051
RT-PCR实验结果如图5-8，ROC结果统计如下表：
Figure BDA0003451073170000061
THBS1与THBS3的基因分析：①RT-PCR产物的鉴定：本发明中内参基因和THBS1、THBS3基因的扩增曲线为明显平滑的“S”形曲线，溶出曲线为单峰，无多峰，表明扩增的引物特异性强，反应条件适宜，无非特异性扩增。②THBS1、THBS3基因表达水平分析：每个样品重复3次RT-PCR，标准差符合RT-PCR要求。AMI组和对照组进行独立样本t检验，满足p<0.05的要求。
结果显示，AMI组与对照组的THBS1基因的相对表达(即PCR定量测量的2-ΔCt值)分别为0.054(0.030-0.074)和0.132(0.049-0.310)。两组之间存在显着差异(p<0.05)。AMI患者外周血THBS1基因的相对表达量显着低于对照组(0.41倍)。AMI组与对照组的THBS3基因的相对表达(即PCR定量测量的2-ΔCt值)分别为0.014(0.009-0.039)和0.030(0.019-0.098)。两组之间存在显着差异(p<0.05)。AMI患者外周血THBS3基因的相对表达量显着低于对照组(0.47倍)。
实施例2蛋白组学实验
根据性别和年龄随机分组，分别选取健康组、稳定型冠心病对照组及急性心肌梗死实验组患者，采用串联质量标记(TMT)定量蛋白质组学技术分析外周血血浆标本的蛋白质谱的变化，筛选差异表达蛋白。随后通过扩大样本量，选取稳定型冠心病对照组及急性心肌梗死实验组患者分别为19、20例，采用PRM实验进行验证，并对其生物学功能进行分析，结果如图9-11。
由图9-11可知，THBS1、THBS3蛋白在稳定型冠心病对照组和急性心梗患者实验组中存在显著差异，差异具有统计学意义。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (2)

1.特异性检测THBS3蛋白和THBS1蛋白的试剂在设计/制备区分急性心肌梗死和稳定型冠心病的诊断产品中的用途，其特征在于，所述THBS3蛋白和THBS1蛋白为外周血血浆来源。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述THBS3蛋白和THBS1蛋白在急性心肌梗死患者中呈现低表达。
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