CN114441417B - 基于流式细胞仪的微量细胞磷酸化蛋白表达的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于细胞胞内蛋白检测技术领域，具体涉及一种基于流式细胞仪的微量细胞蛋白表达的检测方法。该检测方法是将待检测细胞与辅助沉降细胞混合后使用流式细胞检测仪检测所述待检测细胞的蛋白表达水平；所述辅助沉降细胞与所述待检测细胞大小不同。该检测方法可以对细胞起始量低(低至百级以下的细胞量)的样本进行胞内总蛋白和磷酸化蛋白的检测，对细胞来源困难的样本尤其适用。既可以大量节约起始细胞样本，又可以针对某些特殊样本里的微小细胞亚群进行分析。
Description
技术领域
本发明属于细胞胞内蛋白检测技术领域，具体涉及一种基于流式细胞仪的微量细胞磷酸化蛋白表达的检测方法。
背景技术
流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)是一种在单细胞层面对生物大分子进行定性和定量分析，并可对特异细胞群体进行分选与富集，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。流式细胞术能够快速测定单个细胞或细胞器的生物学性质，并把特定的细胞或细胞器从群体中加以分类收集。与传统的荧光镜检查相比，流式细胞术可以高速分析上百万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数。传统流式细胞术分析胞内蛋白表达水平，所需起始细胞数至少为10万级，对于发育，生殖以及干细胞研究领域，获取细胞难度大，细胞数少，难以用普通流式技术检测细胞内蛋白表达情况。
发明内容
有鉴于此，本发明目的在于提供一种基于流式细胞检测仪的微量细胞磷酸化蛋白表达的检测方法，该方法可以检测低至百级以下的细胞蛋白表达。
所述检测方法包括：将待检测细胞与辅助沉降细胞混合后使用流式细胞检测仪检测所述待检测细胞的磷酸化蛋白表达水平。
优选地，所述辅助沉降细胞的阴性或阳性与所述待检测细胞的阴性或阳性相反，可以更进一步将辅助沉降细胞分离出来。
优选地，所述辅助沉降细胞选自能携带标记的细胞，也是为了后续更好的分离出所述辅助沉降细胞，
优选地，所述待检测细胞为小鼠骨髓细胞，所述辅助沉降细胞选择293T细胞；或所述待检测细胞为小鼠骨髓造血祖细胞，所述辅助沉降细胞选择293T细胞；或所述待检测细胞为GFP阴性K562细胞，所述辅助沉降细胞选择GFP阳性细胞；或所述待检测细胞为K562 细胞，所述辅助沉降细胞选择GFP阴性细胞；或所述待检测细胞为GFP阳性的K562细胞，所述辅助沉降细胞选择A2780细胞。
进一步，所述待检测细胞与所述辅助沉降细胞的比例为1：1-1：1000000。
优选地，所述检测方法包括以下步骤：
(1)将所述待检测细胞进行固定处理；
(2)将步骤(1)中固定后的待检测细胞与所述辅助沉降细胞进行混合；
(3)将步骤(2)得到的混合细胞进行通透处理；
(4)将步骤(3)通透处理后的混合细胞使用抗体进行标记并进行孵育；
(5)使用所述流式细胞检测仪去除所述辅助沉降细胞后检测所述待检测细胞的磷酸化蛋白表达水平。
进一步，步骤(1)中，所述待检测细胞使用标记抗体标记后再进行固定；步骤(5)中，所述流式细胞检测仪去除所述辅助沉降细胞后，使用靶细胞特异性识别步骤(1)中的标记抗体，然后再检测所述待检测细胞的磷酸化蛋白表达水平。
进一步，步骤(4)中，在某些实施例中，使用p-ERK抗体作为一抗进行标记，使用羊抗兔IgG-Alexa647作为二抗进行标记。
进一步，步骤(5)中，在检测所述待检测细胞的磷酸化蛋白表达水平之前，根据细胞DNA倍数，排除不完整细胞的干扰。
优选地，所述检测方法适用于干细胞磷酸化总蛋白蛋白表达检测；或循环肿瘤细胞磷酸化蛋白表达检测。
优选地，所述磷酸化包括ERK磷酸化、p38磷酸化或rps6磷酸化。
优选地，所述检测方法适用于骨髓细胞或骨髓造血祖细胞磷酸化蛋白表达检测。
进一步，所述辅助沉降细胞使用磁珠进行替换，辅助沉降。
在某些具体实施例中，基于流式细胞检测仪的微量细胞磷酸化蛋白表达的检测方法包括以下步骤：
(1)将1-10000个细胞加入到尖底96孔板，以终浓度2％PFA固定，RT，15min；
(2)每孔分别加入辅助沉降细胞，离心(1000g)5min；
(3)去上清，用-20°的甲醇悬浮细胞，-20°，10min；
(4)离心(1000g)5min，去上清；
(5)以PBS洗两次；
(6)以PBS悬浮细胞(水化)，4°过夜；
(7)离心(1000g)5min，去上清，加入1:200-1:1000的一抗室温下1小时或者4°过夜；
(8)以PBS洗两次，1:2000的二抗室温下孵育30min；
(9)PBS洗两次，DAPI染细胞，室温30min；
(10)流式细胞仪分析：首先将辅助沉降细胞划出分析颗粒之外，同时分析靶细胞中DNA含量，以确定细胞完整，再针对靶蛋白抗体进行流式画门分析。
本发明中，术语“阴性”是指不表达所需检测指标，“阳性”指表达所需检测指标。
本发明有益效果在于
本发明提供的基于流式细胞检测仪的微量细胞蛋白表达的检测方法可以对细胞起始量低(万级以下的细胞量，最低可以达到百级以下)的样本，进行胞内总蛋白磷酸化检测，对细胞来源困难的样本尤其适用。既可以大量节约起始细胞样本，又可以针对某些特殊样本里的微小细胞亚群进行分析。
附图说明
图1为流式细胞仪检测小鼠骨髓细胞中剔除辅助沉降293T细胞情况。
图2为流式细胞仪检测小鼠骨髓细胞中靶细胞特异标识CD45.2-FITC后情况。
图3为流式细胞仪检测小鼠骨髓细胞中根据细胞DNA倍数排除不完整细胞干扰后情况。
图4为流式细胞仪检测小鼠骨髓细胞中根据细胞的荧光确定靶细胞群中ERK的磷酸化程度情况，其中，红色为IgG,蓝色为p-ERK。
图5为流式细胞仪检测小鼠骨髓造血祖细胞中剔除辅助沉降293T细胞情况。
图6为流式细胞仪检测小鼠骨髓造血祖细胞中靶细胞特异标识Ckit-APC后情况。
图7为流式细胞仪检测小鼠骨髓造血祖细胞中根据细胞DNA倍数排除不完整细胞干扰后情况。
图8为流式细胞仪检测小鼠骨髓造血祖细胞中根据细胞的荧光确定靶细胞群中p38 的磷酸化程情况。
图9为辅助沉降细胞与靶细胞混合后流式细胞仪上机后的情况。
图10为流式细胞仪检测GFP阴性的K562靶细胞情况。
图11为流式细胞仪检测K562细胞中根据细胞的荧光确定K562细胞群中rps6磷酸化(APC)程度。
图12为用GFP阴性的K562为辅助沉降细胞，靶细胞为饥饿诱导后的K562细胞混合后流式细胞仪上机后的情况。
图13为肌饿诱导后K562细胞rps6磷酸化(APC)程度。
图14为选用与K562细胞大小不一致的A2780细胞为沉降细胞，与50个GFP阳性的K562细胞混合后上机的情况，框出为K562细胞。
图15为流式细胞仪检测K562细胞中根据细胞的荧光确定K562细胞群中ERK磷酸化(APC)程度。
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1 293T细胞作为辅助沉降细胞检测小鼠骨髓细胞ERK的磷酸化蛋白表达
(1)取小鼠骨髓细胞(预先用CD45.2-FITC标记)10000个，用终浓度为2％的PFA，室温固定15分钟；
(2)管中加入293T细胞，室温离心(1000g)5分钟；
(3)去上清后，用-20°预冷的甲醇，于-20°处理10分钟；
(4)室温离心(1000g)5分钟；
(5)加入1ml预冷PBS，室温离心(1000g)5分钟后，去上清；
(6)重复步骤(5)一次后，加入1ml预冷PBS，4°过夜；
(7)离心1000g，5min，去上清，加入1:200的一抗室温下1小时或者4°过夜(该示例p-ERK抗体)；
(8)PBS洗两次后，1:2000的二抗室温下30min(该示例为羊抗兔IgG-Alexa647)；
(9)PBS洗两次后，DAPI染细胞核，室温30分钟；
(10)流式细胞仪上进行逐步分析：先利用细胞大小，剔除辅助沉降293T细胞(如图1所示)；再用靶细胞特异标识CD45.2-FITC，进一步排除辅助沉降细胞的干扰(如图2 所示)；然后根据细胞DNA倍数，排除不完整细胞干扰(如图3所示)；最后根据细胞的荧光(Alexa 647/APC)，确定靶细胞群中ERK的磷酸化程度(如图4所示)。
实施例2 293T细胞作为辅助沉降细胞检测小鼠骨髓造血祖细胞p38的磷酸化蛋白表达
(1)取小鼠骨髓造血祖细胞(预先用Ckit-APC标记)10000个，用终浓度为2％的PFA，室温固定15分钟；
(2)管中加入293T细胞，室温离心(1000g)5分钟；
(3)去上清后，用-20°预冷的甲醇，于-20°处理10分钟；
(4)室温离心(1000g)5分钟；
(5)加入1ml预冷PBS，1000g，室温离心5分钟后，去上清；
(6)重复步骤(5)一次后，加入1ml预冷PBS，4°过夜；
(8)PBS洗两次后，1:2000的羊抗兔IgG-Alexa647(二抗)室温下30min；
(9)PBS洗两次后，DAPI染细胞核，室温30分钟；
(10)流式细胞仪上进行逐步分析：先利用细胞大小，剔除辅助沉降细胞293T细胞(如图5所示)；再用靶细胞特异标识Ckit-APC，进一步排除辅助沉降细胞的干扰(如图6 所示)；然后根据细胞DNA倍数，排除不完整细胞干扰(如图7所示)；最后根据细胞的荧光(Alexa 647/APC)，确定靶细胞群中p38的磷酸化程度(如图8所示)。
实施例3 GFP阳性细胞作为辅助沉降细胞检测K562细胞rps6磷酸化蛋白表达
(1)取GFP阴性K562细胞50个，用终浓度为2％的PFA，室温固定15分钟；
(2)管中加入GFP阳性细胞，室温离心(1000g)5分钟；
(3)去上清后，用-20°预冷的甲醇，于-20°处理10分钟；
(4)室温离心(1000g)5分钟；
(5)加入1ml预冷PBS，室温离心(1000g)5分钟后，去上清；
(6)重复步骤(5)一次后，加入1ml预冷PBS，4°过夜；
(7)离心1000g，5min，去上清，加入1:200的p-ERK抗体(一抗)室温下1小时或者4°过夜；
(8)PBS洗两次后，1:2000的羊抗兔IgG-Alexa647(二抗)室温下30min；
(9)PBS洗两次后，DAPI染细胞核，室温30分钟；
(10)流式细胞仪上进行逐步分析：先利用细胞大小，剔除GFP阳性细胞(如图9 所示)；再用靶细胞特异标识GFP，进一步排除辅助沉降细胞的干扰(如图10所示)；然后根据细胞DNA倍数，排除不完整细胞干扰；最后根据细胞的荧光(Alexa 647/APC)，确定靶细胞群中rps6磷酸化(APC)程度(如图11所示)。
实施例4 GFP阴性细胞作为辅助沉降细胞检测K562细胞rps6磷酸化蛋白表达
(1)取饥饿的K562细胞50个，用终浓度为2％的PFA，室温固定15分钟；
(2)管中加入GFP阴性细胞，室温离心(1000g)5分钟；
(3)去上清后，用-20°预冷的甲醇，于-20°处理10分钟；
(4)室温离心(1000g)5分钟；
(5)加入1ml预冷PBS，室温离心(1000g)5分钟后，去上清；
(6)重复步骤(5)一次后，加入1ml预冷PBS，4°过夜；
(7)离心1000g，5min，去上清，加入1:200的p-ERK抗体(一抗)室温下1小时或者4°过夜；
(8)PBS洗两次后，1:2000的羊抗兔IgG-Alexa647(二抗)室温下30min；
(9)PBS洗两次后，DAPI染细胞核，室温30分钟；
(10)流式细胞仪上进行逐步分析：先利用细胞大小，剔除GFP阳性细胞；再用靶细胞特异标识K562细胞，进一步排除辅助沉降细胞的干扰(如图12所示)；然后根据细胞 DNA倍数，排除不完整细胞干扰；最后根据细胞的荧光(Alexa 647/APC)，确定靶细胞群中rps6磷酸化(APC)程度(如图13所示)。
实施例5 A2780细胞为沉降细胞检测GFP阳性的K562细胞中ERK磷酸化蛋白表达
(1)取GFP阳性的K562细胞50个，用终浓度为2％的PFA，室温固定15分钟；
(2)管中加入A2780细胞，室温离心(1000g)5分钟；
(3)去上清后，用-20°预冷的甲醇，于-20°处理10分钟；
(4)室温离心(1000g)5分钟；
(5)加入1ml预冷PBS，室温离心(1000g)5分钟后，去上清；
(6)重复步骤(5)一次后，加入1ml预冷PBS，4°过夜；
(7)离心1000g，5min，去上清，加入1:200的p-ERK抗体(一抗)室温下1小时或者4°过夜；
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(9)PBS洗两次后，DAPI染细胞核，室温30分钟；
(10)流式细胞仪上进行逐步分析：先利用细胞大小，剔除GFP阳性细胞；再用靶细胞特异标识K562细胞，进一步排除辅助沉降细胞的干扰(如图14所示)；然后根据细胞 DNA倍数，排除不完整细胞干扰；最后根据细胞的荧光(Alexa 647/APC)，确定靶细胞群中 ERK磷酸化(APC)程度(如图15所示)。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围。
Claims (8)
1.基于流式细胞检测仪的微量细胞磷酸化蛋白表达的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将待检测细胞进行固定处理；
（2）将步骤（1）中固定后的待检测细胞与辅助沉降细胞进行混合，离心得到混合细胞；
（3）将步骤（2）得到的混合细胞进行通透处理；
（4）将步骤（3）通透处理后的混合细胞使用抗体进行标记并进行孵育；
（5）使用流式细胞检测仪去除所述辅助沉降细胞后，检测所述待检测细胞的磷酸化蛋白表达水平；
所述辅助沉降细胞与所述待检测细胞大小不同；所述辅助沉降细胞的阴性或阳性与所述待检测细胞的阴性或阳性相反；所述阴性是指不表达所需检测指标，所述阳性是指表达所需检测指标。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述辅助沉降细胞选自能携带标记的细胞。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述待检测细胞与所述辅助沉降细胞的比例为1：1-1：1000000。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述待检测细胞为小鼠骨髓细胞，所述辅助沉降细胞选择293T细胞；或所述待检测细胞为小鼠骨髓造血祖细胞，所述辅助沉降细胞选择293T细胞；或所述待检测细胞为GFP阴性K562细胞，所述辅助沉降细胞选择GFP阳性细胞；或所述待检测细胞为K562细胞，所述辅助沉降细胞选择GFP阴性细胞；或所述待检测细胞为GFP阳性的K562细胞，所述辅助沉降细胞选择A2780细胞。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（1）中，所述待检测细胞使用标记抗体标记后再进行固定；步骤（5）中，所述流式细胞检测仪去除所述辅助沉降细胞后，使用靶细胞特异性识别步骤（1）中的标记抗体，然后再检测所述待检测细胞的磷酸化蛋白表达水平。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（5）中，在检测所述待检测细胞的磷酸化蛋白表达水平之前，排除不完整细胞的干扰。
7.根据权利要求1述的检测方法，其特征在于，所述磷酸化包括ERK磷酸化、p38磷酸化或rps6磷酸化。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法适用于干细胞磷酸化总蛋白表达检测；或循环肿瘤细胞磷酸化蛋白表达检测。
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